CN116474160A

CN116474160A - 一种促损伤修复、抗瘢痕材料及其制备方法

Info

Publication number: CN116474160A
Application number: CN202310204722.8A
Authority: CN
Inventors: 高秀伟; 郑红霞; 高秀岩; 姜红; 任孝敏; 董平格
Original assignee: Shandong Junxiu Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shandong Junxiu Biotechnology Co ltd
Priority date: 2023-02-28
Filing date: 2023-02-28
Publication date: 2023-07-25
Anticipated expiration: 2043-02-28
Also published as: CN116474160B

Abstract

本发明公开了一种促损伤修复、抗瘢痕材料及其制备方法，包括如下步骤：将具有生物活性的共轭亚油酸与碱金属溶液和可溶性盐(钙或锌)的混合溶液混合反应，制得共轭亚油酸盐溶液，并用酸调节共轭亚油酸盐溶液的pH值至5‑8；所述可溶性盐为可溶性钙盐或可溶性锌盐；将所述共轭亚油酸盐溶液加入生物源类凝胶材料中，共轭亚油酸盐与生物源类凝胶材料质量比为1:10～50，混合均匀反应后得到共轭亚油酸盐凝胶。

Description

一种促损伤修复、抗瘢痕材料及其制备方法

技术领域

本发明属于皮肤修复材料技术领域，具体涉及一种促损伤修复、抗瘢痕材料及其制备方法。

背景技术

这里的陈述仅提供与本发明相关的背景技术，而不必然地构成现有技术。

皮肤大面积损伤，如刀割伤以及烧伤后瘢痕增生严重影响病人愈后的形态与功能恢复，是临床医学的难题之一。胶原代谢失衡、成纤维细胞增殖和收缩、真皮基质中蛋白多糖成分比例改变等因素是烧伤后增生性瘢痕形成的基础。目前有关学者正积极地寻找人工或天然的拮抗因子，例如抗TGF因子-干扰素等。但结果并不令人满意或尚未用于临床。

现有技术中的伤口愈合敷料和修复材料，能在一定程度上促进表皮新组织长出，但新组织往往逐渐长成瘢痕，拉伸强度和表观样貌与原皮肤组织相差较大，且创面愈合时间依然较长，尤其是在用于大面积及较深的伤口修复时，愈后的明显瘢痕可能给患者生活造成不良影响。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种促损伤修复、抗瘢痕材料及其制备方法，该种材料不仅可以促进伤口愈合，还能抑制增生性瘢痕的形成。

为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：

第一方面，本发明提供一种促损伤修复、抗瘢痕材料的制备方法，包括如下步骤：

将具有生物活性的共轭亚油酸与碱溶液和可溶性盐(钙或锌)的混合溶液混合反应，制得共轭亚油酸盐溶液，并用酸调节共轭亚油酸盐溶液的pH值至5-8；所述可溶性盐为可溶性钙盐和/或可溶性锌盐；

将所述共轭亚油酸盐溶液加入生物源类凝胶材料中，共轭亚油酸盐与生物源类凝胶材料质量比为1:10～50，混合均匀反应后得到共轭亚油酸盐凝胶。

生物源类凝胶材料为成纤维细胞的增殖提供支架，有助于胶原成分改建，促使成纤维细胞排列分布规则，形成结构形态正常的胶原纤维，此外，还有诱导、调节宿主细胞和新生血管长入，促进上皮形成等作用。此外，细胞外基质蛋白也可以促进表皮细胞的再生。

共轭亚油酸盐具有显著的抗氧化和抗炎特性。此外，实验模型已经证明共轭亚油酸盐能够减少角质形成细胞产生炎症介质，如花生四烯酸、前列腺素和组胺，从而导致在特应性皮炎的情况下减少瘙痒，并具有维持生物源类凝胶材料生物活性的作用。

钙类用于骨组织修复；锌类用于软组织修复；钙锌类用于同时修复软硬组织，如拔牙后牙槽窝填充，既需要满足牙槽骨再生，又需要实现牙龈软组织快速修复覆盖创面。

瘢痕的形成机制是持续的局部炎症和过度的胶原沉积。创伤组织周围的肥大细胞可以通过释放IL-4、血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)刺激成纤维细胞增殖，导致I型胶原合成增加。在增殖、再上皮化和重塑阶段，创伤组织周围含有大量促进血管生成和胶原沉积的M2巨噬细胞，M2巨噬细胞可通过分泌转化生长因子-β(TGF-β)和血小板衍生生长因子-CC(PDGF-CC)促进成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化，两者都促进胶原沉积和瘢痕形成。TGFβ1介导α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达，α-SMA是肌成纤维细胞的标志物。本发明制备的材料通过上调血管生成基因(bFGF和VEGF)的表达，下调纤维化基因(TGF-β1和α-SMA)的表达，能够快速促进创伤修复，缩短伤口愈合时间，避免瘢痕形成，可生物降解并可吸收。

在一些实施例中，所述可溶性盐为氯化钙和氯化锌的混合物，氯化钙和氯化锌的质量比为1-10:1。

在一些实施例中，所述碱溶液和可溶性盐的混合溶液中，可溶性盐的浓度为1％-10％，％为质量百分比；

碱溶液的浓度为1％-20％；

所述碱溶液选自氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铷、氢氧化铯或氢氧化钫。

优选的，所述碱溶液选自氢氧化钠或氢氧化钾。经过试验发现，当碱溶液为氢氧化钙等其他碱液时，不反应，且分层，无法得到预期的产品。

在一些实施例中，所述酸为盐酸、冰醋酸、柠檬酸或乳酸。

在一些实施例中，所述生物源类凝胶材料选自天然胶原蛋白、重组胶原蛋白、透明质酸钠、细胞外基质中的一种、两种或多种。

在一些实施例中，还包括制备损伤修复、抗瘢痕海绵的步骤：将共轭亚油酸盐凝胶装入模具中梯度冻干，得到共轭亚油酸盐海绵；

将共轭亚油酸盐海绵在100-120℃热交联10-100h，得到所述损伤修复、抗瘢痕海绵。既能满足交联后材料力学性能，又能保证材料生物学活性。

优选的，还包括将制备的共轭亚油酸盐凝胶或损伤修复、抗瘢痕海绵封装于医用包装袋内，用6-20KGy的γ射线灭菌的步骤。

优选的，所述模具的材质为特氟龙材质。

在一些实施例中，所述生物源类凝胶材料为脱细胞外基质凝胶，其制备方法为：将动物腹膜组织刮除组织表面油脂，并清洗至无油脂，并采用丙酮脱水，正己烷脱脂；

将脱脂后的膜组织与胃蛋白酶或核酸酶进行混合酶解，将酶解液进行透析，去除免疫原性，冷冻干燥后得到细胞外基质；

将所述细胞外基质溶于磷酸盐缓冲液中，获得脱细胞基质凝胶。

优选的，所述梯度冻干为：先在-30～-80℃急速冷冻混合物，然后再逐级升温干燥。

优选的，脱脂后的膜组织与胃蛋白酶的质量比为10-100:1；

脱脂后的膜组织与核酸酶的质量比为50-150:1。

优选的，所述透析采用的透析膜为10-50kDa透析膜。

第二方面，本发明提供一种促损伤修复、抗瘢痕材料，由所述制备方法制备而成。

上述本发明的一种或多种实施例取得的有益效果如下：

现有技术以聚二甲基硅氧烷为主要成分瘢痕修复材料产品仅具有抗瘢痕作用，不能用于未愈合伤口，且无促进创口愈合的作用。本发明制备的材料能够快速促进创伤修复，缩短伤口愈合时间，避免瘢痕形成，可生物降解并可吸收；

本发明制备的材料可快速引导组织天然再生，而不是瘢痕愈合；

本发明制备的材料无化学交联剂，采用逐级真空冷冻干燥和热交联技术制备共轭亚油酸盐海绵，保护海绵结构均匀，避免形成晶体结构。同时，化学交联剂残留可能引起机体组织毒性风险，本发明中制备的材料无化学交联剂，减少了生产工艺化学残留验证环节；与紫外或γ射线等交联工艺相比，避免了材料中的活性成分破坏。保护了共轭亚油酸盐海绵有效成分，提高了整体材料的生物相容性和生物活性。

通过自制共轭亚油酸盐(钙锌等)与生物源性材料(细胞外基质、透明质酸钠、胶原蛋白等)混合均匀反应制备而成，材料通过上调血管生成基因(bFGF和VEGF)的表达，下调纤维化基因(TGF-β1和α-SMA)的表达，促进损伤修复以及抗瘢痕形成。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1是本发明实施例中制备的产品图，其中，a为共轭亚油酸锌凝胶，b为共轭亚油酸锌海绵；

图2是本发明对比例1中制备的失败的共轭亚油酸锌海绵图片；

图3是本发明实施例中，共轭亚油酸锌海绵体内降解实验1周(a)，4周(b)，13周(c)的创面解剖对比图；

图4是本发明实施例中采用共轭亚油酸锌凝胶处理创面与未经处理创面的对比图；

图5是本发明实施例中，采用共轭亚油酸锌海绵(组一)、胶原材料(组二)和透明质酸钠材料(组三)对大鼠创面愈合试验对比图；

图6是本发明实施例中，采用共轭亚油酸锌海绵(组一)、胶原材料(组二)和透明质酸钠材料(组三)对大鼠的创面愈合试验36天后创面的恢复情况对比图；

图7是本发明实施例中，采用共轭亚油酸锌海绵(组一)对创面进行处理15天后与瘢痕相关基因的RNA表达水平；

图8是本发明实施例中，采用免疫组化法检测各组对创面进行处理15天后bFGF蛋白水平的表达结果，其中，a为组一，表皮下，bFGF，400×；b为组二，表皮下，bFGF，400×；c为组三，表皮下，bFGF，400×；d为创伤组，表皮下，bFGF，400×。

图9是本发明实施例中，采用免疫组化法检测各组对创面进行处理15天后VEGF蛋白水平的表达结果，其中，a为组一，表皮下，VEGF，400×；b为组二，表皮下，VEGF，400×；c为组三，表皮下，VEGF，400×；d为创伤组，表皮下，VEGF，400×；

图10是本发明实施例中，采用免疫组化法检测各组对创面进行处理15天后TGF-β1蛋白水平的表达结果，其中，a为组一，表皮下，TGF-β1，400×；b为组二，表皮下，TGF-β1，400×；c为组三，表皮下，TGF-β1，400×；d为创伤组，表皮下，TGF-β1，400×；

图11是本发明实施例中，采用免疫组化法检测各组对创面进行处理15天后α-SMA蛋白水平的表达结果，其中，a为组一，表皮下，α-SMA，400×；b为组二，表皮下，α-SMA，400×；c为组三，表皮下，α-SMA，400×；d为创伤组，表皮下，α-SMA，400×；

图12是本发明实施例中，采用实施例1制备的共轭亚油酸锌海绵(组一)对创面进行处理后第36天创面组织病理切片HE染色图，40×；

图13是本发明实施例中，采用实施例1制备的共轭亚油酸锌海绵(组一)对创面进行处理后第36天创面组织病理切片Masson染色图，40×；

图14是本发明实施例中，采用胶原材料(组二)对创面进行处理后第36天创面组织病理切片HE染色图，40×；

图15是本发明实施例中，采用胶原材料(组二)对创面进行处理后第36天创面组织病理切片Masson染色图，40×；

图16是本发明实施例中，采用透明质酸钠材料(组三)对创面进行处理后第36天创面组织病理切片HE染色图，40×；

图17是本发明实施例中，采用透明质酸钠材料(组三)对创面进行处理后第36天创面组织病理切片Masson染色图，40×；

图18是本发明实施例中，采用对比例2制备的共轭亚油酸锌海绵(组四)对创面进行处理后第36天创面组织病理切片HE染色图，40×；

图19是本发明实施例中，采用对比例2制备的共轭亚油酸锌海绵(组四)对创面进行处理后第36天创面组织病理切片Masson染色图，40×。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

1.共轭亚油酸钙、共轭亚油酸锌、共轭亚油酸钙锌的制备

(1)共轭亚油酸钙制备：称取20g氢氧化钠和氯化钙混合物(氢氧化钠和氯化钙的质量比为10:1)溶于20mL水中搅拌均匀，待用；另量取100mL共轭亚油酸于250mL烧杯中，缓慢搅拌，少量多次的加入氢氧化钠和氯化钙混合液，1000rpm匀速搅拌，进行乳化反应，搅拌期间观察样品状态和放热现象，温度为36～40℃。

反应14天后，温度降至室温，即达到反应终点，形成膏状共轭亚油酸钙。其pH显碱性，冰醋酸调至中性，密封保存于玻璃瓶中，4℃冰箱储存待用。

(2)共轭亚油酸锌制备：

称取20g氢氧化钠和氯化锌混合物(氢氧化钠和氯化锌的质量比为10:1)溶于20mL水中搅拌均匀，待用；另量取100mL共轭亚油酸于250mL烧杯中，缓慢搅拌，少量多次的加入氢氧化钠和氯化锌混合液，1000rpm匀速搅拌，进行乳化反应，搅拌期间观察样品状态和放热现象，反应时温度为36～40℃。反应14天后，温度降至室温，即达到反应终点，形成膏状共轭亚油酸锌，pH显碱性，冰醋酸调至中性，密封保存于玻璃瓶中，4℃冰箱储存待用。

(3)共轭亚油酸钙锌制备：

称取20g氢氧化钠和氯化锌、氯化钙混合物(氢氧化钠和氯化锌、氯化钙混合物的质量比为10:1，氯化锌和氯化钙的质量比为1:9)溶于20mL水中搅拌均匀，待用；另量取100mL共轭亚油酸于250mL烧杯中，缓慢搅拌的作用下，少量多次的加入氢氧化钠、氯化锌和氯化钙混合液，1000rpm匀速搅拌，进行乳化反应，搅拌期间观察样品状态和放热现象，反应时温度为36～40℃。

反应14天后，温度降至室温，即达到反应终点，形成膏状共轭亚油酸钙锌，pH显碱性，冰醋酸调至中性，密封保存于玻璃瓶中，4℃冰箱储存待用。

2.脱细胞外基质凝胶的制备

(1)前处理：将动物腹膜组织刮除组织表面油脂，采用纯净水洗至无脂油。丙酮脱水，正己烷脱脂。

(2)去除免疫原性：脱脂后的膜组织与胃蛋白酶以50:1比例进行酶解；脱脂后的膜组织与核酸酶以100:1比例反应，10kDa透析膜进行透析，冷冻干燥获得脱细胞外基质。

(3)制备7％脱细胞基质凝胶：将7g去除免疫原性冻干的脱细胞基质溶于0.01M磷酸盐缓冲液中，搅拌均匀，获得7％脱细胞基质凝胶。

3.共轭亚油酸锌凝胶制备

(1)将制备的共轭亚油酸锌1g溶于350g 7％脱细胞基质凝胶中，获得共轭亚油酸锌-脱细胞外基质凝胶的混合物(CG-POSTN)，以800rpm转数搅拌均匀。

(2)分装：10mL/瓶；

(3)灭菌：γ射线灭菌；

4.共轭亚油酸锌海绵制备

(2)灌装：10mL/模具；模具采用特制模具(优选特氟龙材质)内径4.5cm×6.5cm；外径7.5cm×5.5cm。

(3)干燥：-80℃急速冷冻混合物；再逐级升温干燥，交联，干燥程序为：-30℃，4h；-10℃，10h；1℃，4h；10℃，4h。

(4)热交联：真空度为-1.0pa条件下，50℃，3h；80℃，30min；100℃，1h；110℃，1h；120℃，24h。

(5)灭菌：采用γ射线灭菌。

对比例1共轭亚油酸锌海绵制备

将实施例1制备的共轭亚油酸锌1g溶于70g 7％脱细胞基质凝胶中，获得共轭亚油酸锌-脱细胞外基质凝胶的混合物(CG-POSTN)，以800rpm转数搅拌均匀。

(3)干燥：-80℃急速冷冻混合物；再逐级升温干燥，交联，干燥程序为：-30℃4h，-10℃10h，1℃4h；10℃4h。

(4)热交联：真空度为-1.0pa条件下，50℃，3h；80℃，30min；100℃，1h；110℃，1h；120℃，24h；

(5)灭菌：采用γ射线灭菌。

所得产品见图2，共轭亚油酸锌比例过高，成膜效果不好。

对比例2共轭亚油酸锌海绵制备

将实施例1制备的共轭亚油酸锌1g溶于850g 7％脱细胞基质凝胶中，获得共轭亚油酸锌-脱细胞外基质凝胶的混合物(CG-POSTN)，以800rpm转数搅拌均匀。

(5)灭菌：采用γ射线灭菌。

实施例2材料理化性能检测

1.材料孔隙率

1.1测定方法

比较实施例1制备的共轭亚油酸锌海绵与胶原海绵(已上市产品)孔隙率，采用排液法，即通过循环抽真空的方法，将材料内部孔隙中的气体排出，并使其充满液体，计算这部分液体重量占材料总重量的百分比。称取干燥后的试样0.1g左右(W1)剪成条状放入盛有水的容量瓶中，循环抽真空至样品表面不再有气泡溢出并且样品沉底，称含有样品与水的容量瓶重量(W2)，再将内部含有水的试样取出，称剩余的容量瓶与水重量(W3)，计算孔隙率(P)，公式为：

P＝(W2-W3-W1)/(W2-W3)×100％。

1.2试验结果见表1。

表1

样品名称	孔隙率(％)
		共轭亚油酸锌膜	94.4
已上市胶原海绵	97.8

1.3小结：二者孔隙率无差异。

2.炽灼残渣

2.1精密称定1g实施例1制备的共轭亚油酸锌海绵材料，置已炽灼至恒重的坩埚中，精密称定，缓缓炽灼至完全炭化，放冷；加硫酸1mL使湿润，低温加热至硫酸蒸气除尽后，在600℃炽灼使完全灰化，移置干燥器内，放冷，精密称定后，再在600℃炽灼至恒重，即得。

2.2试验结果，如表2所示：

表2

样品名称	共轭亚油酸锌海绵	对比例1	对比例2
				硫酸盐含量(％)	0.97	4.92	0.31

2.3小结：依据《YY/T 1511-2017胶原蛋白海绵》4.5硫酸盐灰分应不大于2.0％(质量分数)，实施例1、对比例2制备材料满足要求，对比例1所得材料不符合要求，共轭亚油酸锌含量过高。

3.总蛋白含量

3.1精确称取实施例1制备的共轭亚油酸锌10mg左右，(约相当于含氮量1.0mg～2.0mg)，记为m₁，置于消化管中，加消化剂0.3g，加浓硫酸2.0mL，置电热消化灶上，在通风橱内消化至澄明，呈蓝绿色，继续消化60min。同时做空白消化对照。

3.2取2％硼酸吸收液10mL置250mL锥形瓶内，将定氮仪冷凝管末端浸入硼酸吸收液内。将消化好的样品(m₁)移入定氮管内,用少量水洗涤消化管3～4次，将洗涤液移入定氮管内，再加入50％氢氧化钠10mL，然后进行蒸馏。待接收液总体积约35mL～50mL，将冷凝管末端移出液面，让蒸汽继续冲约1min，用少量蒸馏水冲洗冷凝管末端后停止蒸馏。接收液用0.005mol/L硫酸滴定液进行滴定，至溶液由蓝绿色变为灰紫色，记录所消耗的硫酸滴定液体积V₁。将消化好的样品(m₂)移入定氮管内，重复以上蒸馏、滴定步骤，记录所消耗的硫酸滴定液体积V₂。将空白消化对照移入定氮管内，重复以上蒸馏、滴定步骤，记录所消耗的硫酸滴定液体积V₀，用空白试验进行校正。

3.3结果计算

按下式计算样品中总氮含量：

式中：

W₁：样品中总氮含量，％。

V₁：滴定样品m₁消耗硫酸滴定液体积，mL。

V₀：空白滴定消耗硫酸滴定液体积，mL。

m₁：样品质量，mg。

c：硫酸滴定液浓度，mol/L。

m₀:样品干燥失重，％。

3.4试验结果如表3所示：

表3

项目	共轭亚油酸锌海绵
		蛋白质含量，％	93.3±1.0％

3.5小结：依据《YY/T 1511-2017胶原蛋白海绵》4.7蛋白含量，胶原蛋白海绵中蛋白含量应不小于90％，该样品符合要求。

4.体外降解试验

4.1称取约10mg实施例1制备的共轭亚油酸锌海绵浸入盛水的15mL离心管中，用玻璃棒轻压至完全浸润，取出，用滤纸除去多余的水，再放入离心管中，离心管中已提前装入10mL预热到37℃±1℃质量分数为1％胃蛋白酶的盐酸溶液(盐酸浓度0.1mol/L)。在37℃±1℃，约90转速振摇直至完全消化，观察样品消化的时间。

4.2试验结果如表4所示：

表4

样品名称	共轭亚油酸锌海绵
		消化时间(h)	17.5±1.0

4.3小结：在本次试验条件下，共轭亚油酸锌海绵的消化时间均不大于24小时，支持共轭亚油酸锌海绵的可降解性。

实施例3材料安全性能检测

细胞毒试验

1.1阴性对照试验液：即细胞培养液，含10％胎牛血清的MEM。

1.2样品试验液：取0.08g的实施例1制备的共轭亚油酸锌海绵样品在2mL细胞培养液中，于37℃±1℃条件下，60r/min振荡浸提(24±2)h。

1.3阳性对照试验液：10％DMSO溶液，现配现用。

1.4MTT溶液：MTT粉末配制成质量浓度为1mg/mL的MTT溶液，经注射过滤器(孔径≤0.22μm)无菌过滤除菌备用。

1.5将阴性对照试验液、样品试验液、阳性对照试验液分别放于培养着L929小鼠成纤维细胞的细胞培养板孔内，在5％CO₂，37℃细胞培养箱中培养，24h后显微镜下观察试验样品组、阴性对照组、阳性对照组培养后的细胞形态学改变，小心移除培养基，每孔加入50μL MTT溶液，在细胞培养箱中继续培养2h后弃去孔内液体，每孔加入100μL DMSO，震荡平板后，用酶标仪测定570nm波长下吸光度(参照波长650nm)，按下式计算存活率(％)。

式中：

OD570e-各供试品组(样品组、阳性对照组)吸光度；

OD570b-介质对照组吸光度。

并用MTT法测定各供试品组(样品组、阳性对照组)相对于介质对照组的细胞存活率。

1.6试验结果如下表：

样品名称	阳性对照	共轭亚油酸锌海绵
			存活率(％)	19.8±0.1	115.5±0.3

1.7小结：在本次试验条件下，共轭亚油酸锌海绵细胞存活率为115.5±0.3％，无细胞毒性。

实施例4材料体内降解检测

1.动物试验方法：选取SD大鼠麻醉后，背部剃毛，医用碘伏消毒，沿背部中线两侧做四个皮肤切口，由切口处镊子探入，钝性分离制备皮下囊，囊底部距离切口10mm，分别标记为①，②，③，④。①，②，③每个囊内放入一个实施例1制备的共轭亚油酸锌海绵，裁剪共轭亚油酸锌海绵尺寸1cm×1cm。④为空白对照，不做任何处理。使用可吸收缝合线缝合切口，确保植入物之间互不接触。

植入点位置与植入物取样时间，如下表：

④空白	①-1周
		③-13周	②-4周

2.分别取1周，4周，13周创面组织解剖观察，发现1周后取样明显看到皮下有未降解的材料，4周后取样能观察到一小部分未降解的材料，13周时材料完全降解，见图3。

3.小结：共轭亚油酸锌海绵在13周内可完全降解，支持共轭亚油酸锌海绵的降解性能。

实施例5材料对瘢痕修复性能试验

1.建立家兔耳部瘢痕模型

选取成年健康家兔，使用75％乙醇对家兔的双耳进行消毒，用手术刀对家兔耳朵划伤，伤口大约2cm。术后第6天，创面结痂。使用75％乙醇清理创面，术后第21天在家兔左耳创面处涂抹实施例1制备的共轭亚油酸锌凝胶，右耳未做任何处理。

2.共轭亚油酸锌凝胶对瘢痕的修复试验

2.1从术后第21天开始，使用75％乙醇清理创面，对家兔左耳瘢痕创面涂抹实施例1制备的共轭亚油酸锌凝胶，右耳未做任何处理，每天一次。

2.2术后第45天观察左耳与右耳的愈合情况，家兔左耳涂抹共轭亚油酸锌凝胶后瘢痕愈合，右耳未处理创面有明显瘢痕，如图4所示。

2.3小结：本次试验条件下，共轭亚油酸锌凝胶对已形成的瘢痕有修复性能。

实施例6对大鼠缺损皮肤修复性能试验

1.使用直径为1cm的圆形标尺模具在大鼠背部左右两边分别做两个创面标记，用手术刀切去标记好的背部组织，同一只大鼠左右两边填充相同材料，不同大鼠使用不同的材料进行创面愈合试验，同时添加空白对照组和创伤对照组。

2.材料分组如下表：

分组	填充材料
		组一	实施例1制备的共轭亚油酸锌海绵
组二	胶原材料
		组三	透明质酸钠材料
组四	对比例2制备的共轭亚油酸锌海绵

4.试验观察：不同材料分别选取1，4，7，15，21和36天创面愈合情况，大鼠术后第4天，使用软尺测量创面大小，创面大小与手术时尺寸相近，创面基本没有变化。大鼠术后第7天，用软尺对创面进行测量，创面均变小，直径大约0.5cm。大鼠术后第15天，组一创面大约直径0.1cm圆形缺损，组二和组三创面大约直径0.3cm圆形缺损。大鼠术后第21天，组一创面大约0.1cm×0.5cm的线状缺损，组二创面大约0.2cm×0.3cm的圆形缺损，组三创面大约0.2cm×0.3cm圆形缺损，术后第36天取所有创面组织，做病理切片。创面愈合情况如图5所示。

术后第36天，组一、组四皮肤基本恢复，组二和组三有瘢痕形成，如图6所示。

取第15天创面组织，从相关基因表达和蛋白层面评价修复效果。所选基因为：转化生长因子β1(TGF-β1)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)。取第36天创面组织病理切片，进行HE染色。

如图7所示，在表皮形成早中期，各处理组(组一、组二、组三)血管生成基因(bFGF和VEGF)RNA表达量均高于空白对照组和创伤对照组，且组一上调幅度最大，显著高于创伤组；各处理组(组一、组二、组三)纤维化基因(TGF-β1和α-SMA)RNA表达量均低于空白对照组和创伤对照组，且组一下调幅度显著高于创伤组。血管生成基因(bFGF和VEGF)上调，纤维化基因(TGF-β1和α-SMA)的下调，表明在表皮形成过程中材料具有抗瘢痕形成活性。如图8-图11所示，免疫组化结果与相应基因表达结果一致，从基因表达和蛋白层面验证了材料具有抗瘢痕作用。

HE染色结果，见图12-图19。组一切面，均见疮疡愈合，表皮为角化复层扁平上皮；其下为纤维组织，Masson染色，显示主要由胶原纤维组成。组二切面均见疮疡愈合，表皮为角化复层扁平上皮，但局部真皮层见较薄区域，推测为疮疡相邻皮肤；其下为纤维组织，Masson染色，显示主要由胶原纤维组成。组三切面均见疮疡愈合，表皮为角化复层扁平上皮，但局部真皮层见较薄区域，推测为疮疡相邻皮肤；其下为纤维组织，Masson染色，显示主要由胶原纤维组成。组四切面均见疮疡愈合，表皮为角化复层扁平上皮；其下为纤维组织，Masson染色，显示主要由胶原纤维组成。真皮与皮下组织交界处，见炎性细胞局限性浸润(虚线内)。

可见，组一创面恢复效果优于组二、组三、组四，创面组织愈合更快，抗瘢痕效果更优。组四由于共轭亚油酸锌含量太低，出现炎性细胞浸润，整体修复效果比组一差。该试验证明组一共轭亚油酸锌海绵具有抗瘢痕作用。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种促损伤修复、抗瘢痕材料的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

将具有生物活性的共轭亚油酸与碱溶液和可溶性盐的混合溶液混合反应，制得共轭亚油酸盐溶液，并用酸调节共轭亚油酸盐溶液的pH值至5-8；所述可溶性盐为可溶性钙盐或可溶性锌盐；

将所述共轭亚油酸盐溶液加入生物源类凝胶材料中，共轭亚油酸盐与生物源类凝胶材料质量比为1:10-50，混合均匀反应后得到共轭亚油酸盐凝胶。

2.根据权利要求1所述的促损伤修复、抗瘢痕材料的制备方法，其特征在于：所述可溶性盐为氯化钙和氯化锌的混合物，氯化钙和氯化锌的质量比为1-10:1；

或，所述碱溶液和可溶性盐的混合溶液中，可溶性盐的浓度为1％-10％，％为质量百分比；

碱溶液的浓度为1％-20％。

3.根据权利要求1所述的促损伤修复、抗瘢痕材料的制备方法，其特征在于：所述酸为盐酸、冰醋酸、柠檬酸或乳酸；

或，所述碱溶液选自氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铷、氢氧化铯或氢氧化钫；

优选的，所述碱溶液为氢氧化钠或氢氧化钾。

4.根据权利要求1所述的促损伤修复、抗瘢痕材料的制备方法，其特征在于：所述生物源类凝胶材料选自天然胶原蛋白、重组胶原蛋白、透明质酸钠、细胞外基质中的一种、两种或多种。

5.根据权利要求1所述的促损伤修复、抗瘢痕材料的制备方法，其特征在于：还包括制备促损伤修复、抗瘢痕海绵的步骤：将共轭亚油酸盐凝胶装入模具中梯度冻干，得到共轭亚油酸盐海绵；

将共轭亚油酸盐海绵在100-120℃热交联10-100h，得到所述促损伤修复、抗瘢痕海绵。

6.根据权利要求5所述的促损伤修复、抗瘢痕材料的制备方法，其特征在于：还包括将制备的共轭亚油酸盐凝胶或促损伤修复、抗瘢痕海绵封装于医用包装袋内，用6～20KGy的γ射线灭菌的步骤。

7.根据权利要求5所述的促损伤修复、抗瘢痕材料的制备方法，其特征在于：所述模具的材质为特氟龙材质。

8.根据权利要求1所述的促损伤修复、抗瘢痕材料的制备方法，其特征在于：所述生物源类凝胶材料为脱细胞外基质凝胶，其制备方法为：将动物腹膜组织刮除组织表面油脂，并清洗至无油脂，并采用丙酮脱水，正己烷脱脂；

9.根据权利要求8所述的促损伤修复、抗瘢痕材料的制备方法，其特征在于：脱脂后的膜组织与胃蛋白酶的质量比为10-100:1；

脱脂后的膜组织与核酸酶的质量比为50-150:1；

优选的，所述透析采用的透析膜为10-50kDa透析膜。

10.一种促损伤修复、抗瘢痕材料，其特征在于：由权利要求1-9任一所述制备方法制备而成；

或，所述促损伤修复、抗瘢痕材料为共轭亚油酸盐凝胶，其包括共轭亚油酸盐和生物源类凝胶材料，共轭亚油酸盐和生物源类凝胶材料的质量比为1:10-50；

共轭亚油酸盐为共轭亚油酸钙盐或锌盐；

优选的，所述生物源类凝胶材料为脱细胞外基质凝胶；

或，所述促损伤修复、抗瘢痕材料为共轭亚油酸盐海绵，所述共轭亚油酸盐凝胶经冻干制备而得。