CN105816915A - 间充质干细胞组织工程支架及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物制品领域，公开了一种间充质干细胞组织工程支架及其制备方法和在制备皮肤替代品中应用。本发明的制备方法包括：制备明胶‑壳聚糖多孔支架，然后将间充质干细胞接种至明胶‑壳聚糖多孔支架，并进行孵育培养。本发明的间充质干细胞组织工程支架能够明显有效地促进糖尿病等皮肤难愈合创面的再生、重构、修复与愈合。

Description

间充质干细胞组织工程支架及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物制品领域，具体地，涉及一种间充质干细胞组织工程支架及其制备方法和应用。

背景技术

由于糖尿病患者机体的组织细胞长时间处于高糖环境，使局部皮肤组织细胞、蛋白质等被糖基化，引起血管内皮功能异常，反应受损；巨嗜细胞的功能减弱，炎症反应延长失衡；生长因子缺乏或者受损，明胶组织的减少、表皮屏障功能的失调，以及肉芽组织的减少等，导致溃疡难以修复。其中15％的糖尿病患者有足部溃疡，出现一小块没有治愈的慢性伤口，严重影响着患者的生活质量。且治疗糖尿病引起的皮肤难愈合创面的研究仍未取得重大突破。

以明胶和壳聚糖两种高分子生物为基础的明胶-壳聚糖组织工程支架是运用多学科的方法和手段制备的一种较为完善的工程化组织，是能够恢复、保持或改善皮肤功能的皮肤替代品，它可以模拟细胞外基质，构建组织再生的框架，支架的形态和微观结构直接影响细胞的粘附、生长、迁移、增殖和代谢功能，最终使组织得以重建，完成创面的修复与再生。但是，其治疗糖尿病皮肤难愈合创面的效率较低，不利于促进皮肤难愈合创面的修复进程与皮肤附件的再生。

间充质干细胞(MSCs)是一种可自我更新和扩展的干细胞，是目前治疗糖尿病皮肤难愈合创面的有效手段。大量证据表明，间充质干细胞可以促进伤口表皮细胞增长，加速血管生成、抑制炎症细胞因子的快速增长，加速伤口愈合。但是，由于高浓度的葡萄糖和糖基化终产物的抑制作用，糖尿病会打乱伤口愈合的基本细胞的功能。糖尿病伤口愈合的特点是慢性炎症和血管功能障碍。虽然一些研究表明，间充质干细胞有利于加速慢性伤口的愈合，但是移植间充质干细胞如BM-MSCs的存活率仍然在严酷的伤口环境下面临巨大挑战。

目前，治疗糖尿病引起的难愈合创面研究至今也未取得重大突破。随着难愈合创面研究进一步深入，虽然间充质干细胞的独特作用使它在难愈合创面应用研究上有了逐步发展，但如今的难点之一是间充质干细胞在创面修复与再生的应用上缺乏有效手段，在之前的研究中可以发现，由于慢性小块不治愈伤口的恶劣环境，导致静脉或局部注射的大量细胞无法迁移到伤口，仍然存在着细胞凋亡和功能障碍问题，进而如何安全、稳定、快速、高质量运用间充质干细胞的问题也越来越突出，是亟需解决的难题。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术中的上述缺陷，提供一种间充质干细胞组织工程支架及其制备方法和应用，该间充质干细胞组织工程支架用于治疗糖尿病等皮肤难愈合创面，能够明显、高效、安全的加快其修复进程与皮肤附件再生。

因此，为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种间充质干细胞组织工程支架的制备方法，该方法包括：制备明胶-壳聚糖多孔支架，然后将间充质干细胞接种至明胶-壳聚糖多孔支架，并进行孵育培养。

第二方面，本发明提供了上述方法制备得到的间充质干细胞组织工程支架。

第三方面，本发明提供了间充质干细胞组织工程支架在制备皮肤替代品中的应用。

本发明的间充质干细胞组织工程支架具有以下有益效果：

(1)本发明的间充质干细胞组织工程支架，为一种3D多孔网状支架形式的细胞组织工程皮肤替代物，为治疗糖尿病等皮肤难愈合创面并加快创面再生、重构、修复与生理性愈合提供了有效手段，并且通过低氧浓度下接种、孵育培养的方式，更有利于糖尿病等皮肤难愈合创面的高效安全愈合，提高移植效率，并为慢性小块未治愈伤口的治疗提供了有效手段。

(2)本发明的间充质干细胞组织工程支架，可以有效抑制损伤部位的炎症反应，促进血管新生及再上皮化，促进损伤皮肤生成毛囊等附属结构，从而使损伤部位皮肤结构和功能趋于正常化。

(3)本发明的间充质干细胞组织工程支架，可以应用于糖尿病溃疡、严重创伤、烧伤患者等缺乏可供移植的自体皮肤，以及创面修复困难、严重影响肢体功能的难愈慢性创面，为促进皮肤创面愈合，解决移植皮源问题提供了新的出路。

(4)本发明的间充质干细胞组织工程支架，拥有合理的孔径、孔隙和三维多孔结构、优良的生物降解率和溶胀属性，在体内可以较好的模拟正常皮肤微环境，有利于细胞增生迁移以及生长因子的浸润，可以有效促进损伤部位移植后的快速血管新生及再上皮化，促进难愈创面修复再生和愈合，提高移植效率。

(5)本发明的间充质干细胞组织工程支架，揭示了糖尿病等皮肤难愈合损伤部位治疗的新的作用机制，为糖尿病皮肤损伤的治疗提供了新思路，也可以作为体外皮肤模型进行一些相关的基础医学领域比如皮肤生理学及皮肤病理学方面的研究。

本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

图1显示的是本发明的明胶-壳聚糖多孔支架的特性，其中，(A)为明胶-壳聚糖多孔支架的肉眼直观图片，(B)、(C)、(D)分别为扫描电镜(标尺长度为100μm)下的实施例6、1和7的明胶-壳聚糖多孔支架的显微图片。

图2显示的是细胞死活实验(Live/Dead实验)的结果图，其中，绿色为活细胞，红色为死细胞。

图3显示的是本发明实施例1的间充质干细胞组织工程支架的苏木精-伊红染色图。

图4显示的是不同处理组在移植后第3、7、14天的糖尿病难愈合皮肤损伤部位的组织学马松染色图。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

第一方面，本发明提供了一种间充质干细胞组织工程支架的制备方法，该方法包括：制备明胶-壳聚糖多孔支架，然后将间充质干细胞接种至明胶-壳聚糖多孔支架，并进行孵育培养。

本发明的制备方法中，对于制备明胶-壳聚糖多孔支架的方法没有特别的限定，可以为本领域常用的各种制备方法。但是，本发明的发明人在研究中发现，在制备明胶-壳聚糖多孔支架时，控制明胶-壳聚糖溶液中明胶和壳聚糖的特定的浓度和明胶-壳聚糖溶液的pH值会得到孔径大小不一的明胶-壳聚糖多孔支架。因此，为了进一步寻求更适于间充质干细胞生长的明胶-壳聚糖多孔支架，优选情况下，制备明胶-壳聚糖多孔支架的方法包括：配制明胶-壳聚糖溶液，使得明胶-壳聚糖溶液中明胶和壳聚糖的浓度均为1-5mg/mL，进一步优选均为2-3mg/mL；然后将明胶-壳聚糖溶液的pH值调节为6-7，进一步优选为6.2-6.4；再将明胶-壳聚糖溶液真空脱泡后注入模具中依次进行孵育处理、第一冷冻干燥处理、化学交联处理和第二冷冻干燥处理。更进一步优选地，明胶-壳聚糖溶液中明胶和壳聚糖的浓度比为1:1。

本发明的制备方法中，对于配制明胶-壳聚糖溶液的溶剂没有特别的限定，可以为本领域常用的各种溶剂，优选情况下，所述溶剂为醋酸溶液，即，明胶-壳聚糖溶液为明胶-壳聚糖的醋酸溶液，进一步优选地，醋酸溶液中醋酸的浓度为0.01-1mol/L。

本发明的制备方法中，对于配制明胶-壳聚糖溶液的方法没有特别的限定，只要能够配制得到前述特定浓度的明胶-壳聚糖溶液即可，例如可以包括：分别将明胶粉末和壳聚糖粉末溶解于醋酸溶液中，配制2-10mg/mL优选3-7mg/mL的明胶溶液和2-10mg/mL优选3-7mg/mL的壳聚糖溶液，然后以适当的体积比例将两种溶液混合。

本发明的制备方法中，在制备明胶-壳聚糖多孔支架时，优选情况下，孵育处理的条件包括：温度为30-38℃，时间为25-40min。

本发明的制备方法中，在制备明胶-壳聚糖多孔支架时，优选情况下，第一冷冻干燥处理为先进行冷冻处理再进行干燥处理，冷冻处理的条件包括：温度为-70～-90℃，时间为18-30h；干燥处理的条件包括：温度为-70～-90℃，时间为8-18h。

本发明的制备方法中，在制备明胶-壳聚糖多孔支架时，优选情况下，化学交联处理的条件包括：将第一冷冻干燥处理得到的明胶-壳聚糖多孔支架浸泡于交联剂中，浸泡温度为20-30℃，浸泡时间为8-18h。对于交联剂没有特别的限定，可以为本领域常用的各种交联剂，优选地，所述交联剂为EDC/NHS交联剂。

本发明的制备方法中，为了去除残余交联剂，在化学交联处理之后可以用去离子水洗涤支架2-4次，每次5-10min。

本发明的制备方法中，在制备明胶-壳聚糖多孔支架时，优选情况下，第二冷冻干燥处理为先进行冷冻处理再进行干燥处理，冷冻处理的条件包括：温度为-70～-90℃，时间为18-30h；干燥处理的条件包括：温度为-70～-90℃，时间为8-18h。

本发明的制备方法中，在制备明胶-壳聚糖多孔支架时，优选情况下，明胶的来源为猪、牛、羊、猴或鼠，进一步优选为牛，更进一步优选为牛肌腱。制备明胶粉末的方法可以为本领域技术人员所公知的各种方法，在此不再赘述。

本发明的制备方法中，本领域技术人员应该理解的是，所有操作均在无菌条件下进行。

本发明的制备方法中，将间充质干细胞一次接种至明胶-壳聚糖多孔支架的方法，优选情况下，将间充质干细胞接种至明胶-壳聚糖多孔支架的方法包括如下步骤：

(1)将明胶-壳聚糖多孔支架进行灭菌，然后在无菌、氧浓度为2-21％优选2-7％的条件下，将明胶-壳聚糖多孔支架的pH值调节为7-7.5；

(2)向明胶-壳聚糖多孔支架中加入含有间充质干细胞的培养基，在30-38℃、氧浓度为2-21％进一步优选2-7％的条件下孵育4-6h。

对于将明胶-壳聚糖多孔支架进行灭菌的方法没有特别的限定，可以为本领域常用的各种方法，例如可以采用钴-60或电子束辐照灭菌，辐照剂量可以为20-30kGy。

对于将明胶-壳聚糖多孔支架的pH值调节为7-7.5的方法没有特别的限定，可以为本领域常用的各种方法，优选情况下，该方法包括：在无菌、30-38℃、氧浓度为2-21％优选2-7％的条件下，先用1×PBS缓冲液孵育明胶-壳聚糖多孔支架2-4次，每次3-4h，然后弃除PBS，在无菌、30-38℃、氧浓度为2-21％优选2-7％的条件下用低糖DMEM培养基孵育明胶-壳聚糖多孔支架，每3-4h更换一次低糖DMEM培养基，更换2-4次直至低糖DMEM培养基的颜色不发生改变、并测定pH值为7-7.5即可。

本发明的发明人在研究中进一步发现，步骤(2)中，向明胶-壳聚糖多孔支架中接种的间充质干细胞的密度对制备得到的间充质干细胞组织工程支架能否有效促进皮肤难愈合创面的修复再生有重要影响，而间充质干细胞的接种密度为1×10⁵-4×10⁵个间充质干细胞/cm²明胶-壳聚糖多孔支架时，能够有效促进皮肤难愈合创面的修复再生，因此，优选情况下，步骤(2)中，间充质干细胞的加入量为1×10⁵-4×10⁵个间充质干细胞/cm²明胶-壳聚糖多孔支架。

其中，对于含有间充质干细胞的培养基没有特别的限定，可以为本领域中用于培养间充质干细胞的各种培养基，例如可以为低糖DMEM培养基、DMEM培养基。

本发明的制备方法中，优选情况下，孵育培养的方法包括：将接种有间充质干细胞的明胶-壳聚糖多孔支架完全处于培养基环境中，在30-38℃、氧浓度为2-21％进一步优选2-7％的条件下培养2-7天。

本发明的发明人在研究中进一步发现，当在氧浓度为2-7％，进一步优选为5％的条件下进行间充质干细胞的接种和孵育培养时，制备得到的间充质干细胞组织工程支架能够更加有效地促进皮肤难愈合创面的修复再生，因此，上述各步骤的接种、孵育、培养条件中的氧浓度均优选为2-7％，进一步优选为5％。

本发明的制备方法中，优选情况下，间充质干细胞为骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞和脐带间充质干细胞中的一种或多种。骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞可来自SD大鼠，脐带间充质干细胞可来自健康人群。对于SD大鼠骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞以及人脐带间充质干细胞的制备方法没有特别的限定，可以分别为本领域常用的各种制备方法，此为本领域技术人员所公知，在此不再赘述。另外，骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞和脐带间充质干细胞均可通过商购获得。

第二方面，本发明提供了上述方法制备得到的间充质干细胞组织工程支架。

第三方面，本发明提供了上述间充质干细胞组织工程支架在制备皮肤替代品中的应用。

本发明的应用中，对于皮肤替代品没有特别的限定，可以为本领域常用的各种皮肤替代品。

利用本发明的间充质干细胞组织工程支架制备得到的皮肤替代品能够明显促进皮肤难愈合创面的再生、重构、修复与愈合，明显促进皮肤难愈合损伤部位新生血管的再生、再上皮化和减少炎症细胞浸润，以及明显促进真皮毛囊等附属结构再生和明胶重排，在最大程度上促进皮肤难愈合损伤部位皮肤结构和功能趋于正常化。

实施例

以下的实施例将对本发明作进一步的说明，但并不因此限制本发明。

以下实施例和对比例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例和对比例中所用的实验材料，如无特殊说明，均可市售获得。

壳聚糖粉末购自Sigma公司。

扫描电镜购自日本日立公司，型号为TM100。

SD大鼠骨髓间充质干细胞购自天津卫凯生物工程有限公司。

EDC/NHS交联剂的配制方法为：将EDC、NHS分别溶于95％乙醇溶液中至浓度为33nmol/L和8nmol/L，得到EDC溶液和NHS溶液，然后将EDC溶液和NHS溶液等体积混合。

制备例

本制备例用于说明明胶粉末的提取方法。

(1)取新鲜牛肌腱10g，去除周围结缔组织，将牛肌腱剪成1-2mm大小的组织块。

(2)将组织块放入0.1质量％Na₂CO₃溶液中浸泡2h，蒸馏水漂洗3次，每次10min。

(3)将组织块放入含1mol/L NaCl的0.5％Tris-HCl(pH＝7.5)溶液中浸泡12h，蒸馏水漂洗3次，每次10min。

(4)将组织块放入250mL含500mg胃蛋白酶的0.05mol/L的醋酸溶液中，4℃浸泡72h，期间反复搅拌至充分消化成透明糊状。

(5)将混合液在4℃，5000g下离心20min，取上清。

(6)将步骤(5)中的离心沉淀再进行步骤(4)、(5)的操作，重复操作2次。

(7)向所得上清溶液中加入其体积1％的双氧水，4℃静置4h，去除沉淀杂质。

(8)向所得溶液中加入NaCl至沉淀不再析出，4℃静置12h。

(9)将混合液在4℃，5000g下离心20min，收集沉淀。

(10)将步骤(9)中的上清液再进行步骤(8)、(9)的操作一次。

(11)将所得沉淀溶解于100ml浓度为0.05mol/L的醋酸溶液中，加热至60℃，保温6小时。

(12)将所得溶液通过真空冷冻干燥机在-80℃下干燥24h，获得固体粉末明胶。

实施例1

本实施例用于说明本发明的间充质干细胞组织工程支架及其制备方法。

(1)将壳聚糖粉末和制备例制得的明胶粉末分别溶于0.05mol/L醋酸溶液中，得到浓度为5mg/mL的壳聚糖溶液和浓度为5mg/mL的明胶溶液。

(2)将等体积的壳聚糖溶液和明胶溶液混合均匀，获得明胶-壳聚糖溶液，然后用0.01mol/L的NaOH溶液调节明胶-壳聚糖溶液的pH值至6.3。

(3)将明胶-壳聚糖溶液搅拌均匀，真空脱泡后注入模具中，37℃孵育30min。

(4)-80℃冷冻24小时后，置于真空冷冻干燥机中-80℃冻干12h，得到明胶-壳聚糖初级支架。

(5)将明胶-壳聚糖初级支架浸泡于EDC/NHS交联剂中，25℃放置12h，用去离子水洗涤三次，每次5min。

(6)将步骤(5)得到的明胶-壳聚糖支架于-80℃冷冻24小时后，再置于真空冷冻干燥机中-80℃冻干12h，即获得明胶-壳聚糖多孔支架。

(7)将步骤(6)得到的明胶-壳聚糖多孔支架进行钴-60辐照灭菌，辐照剂量为25kGy，然后在37℃、氧浓度为5％、无菌条件下，将灭菌处理得到的明胶-壳聚糖多孔支架放置于12孔板(每孔底表面积约3.5cm²)，先用1×PBS缓冲液孵育明胶-壳聚糖多孔支架3次，每次3h，然后弃除PBS，用低糖DMEM培养基孵育明胶-壳聚糖多孔支架，每3h更换一次低糖DMEM培养基，更换2次直至低糖DMEM培养基的颜色不发生改变，测定明胶-壳聚糖多孔支架的pH值为7.2。

(8)弃除步骤(7)的低糖DMEM培养基，向每个孔板的明胶-壳聚糖多孔支架中加入100μl含有9×10⁵个骨髓间充质干细胞的低糖DMEM培养基，在37℃、氧浓度为5％的条件下孵育5h。

(9)在37℃、氧浓度为5％的条件下，向每个孔板的明胶-壳聚糖多孔支架中加入2ml低糖DMEM培养基，将步骤(8)得到的接种有骨髓间充质干细胞的明胶-壳聚糖多孔支架完全处于低糖DMEM培养基环境中液面培养3天。

实施例2

本实施例用于说明本发明的间充质干细胞组织工程支架及其制备方法。

(1)将壳聚糖粉末和制备例制得的明胶粉末分别溶于0.05mol/L醋酸溶液中，得到浓度为4mg/mL的壳聚糖溶液和浓度为6mg/mL的明胶溶液。

(2)将等体积的壳聚糖溶液和明胶溶液混合均匀，获得明胶-壳聚糖溶液，然后用0.01mol/L的NaOH溶液调节明胶-壳聚糖溶液的pH值至6.2。

(3)将明胶-壳聚糖溶液搅拌均匀，真空脱泡后注入模具中，38℃孵育25min。

(4)-70℃冷冻30小时后，置于真空冷冻干燥机中-90℃冻干8h，得到明胶-壳聚糖初级支架。

(5)将明胶-壳聚糖初级支架浸泡于EDC/NHS交联剂中，20℃放置18h，用去离子水洗涤三次，每次5min。

(6)将步骤(5)得到的明胶-壳聚糖支架于-90℃冷冻18小时后，再置于真空冷冻干燥机中-70℃冻干18h，即获得明胶-壳聚糖多孔支架。

(7)将步骤(6)得到的明胶-壳聚糖多孔支架进行钴-60辐照灭菌，辐照剂量为25kGy，然后在37℃、氧浓度为2％、无菌条件下，将灭菌处理得到的明胶-壳聚糖多孔支架放置于12孔板(每孔底表面积约3.5cm²)，先用1×PBS缓冲液孵育明胶-壳聚糖多孔支架3次，每次3h，然后弃除PBS，用低糖DMEM培养基孵育明胶-壳聚糖多孔支架，每3h更换一次低糖DMEM培养基，更换4次直至低糖DMEM培养基的颜色不发生改变，测定明胶-壳聚糖多孔支架的pH值为7.2。

(8)弃除步骤(7)的低糖DMEM培养基，向每个孔板的明胶-壳聚糖多孔支架中加入100μl含有5×10⁵个骨髓间充质干细胞的低糖DMEM培养基，在37℃、氧浓度为2％的条件下孵育6h。

(9)在37℃、氧浓度为2％的条件下，向每个孔板的明胶-壳聚糖多孔支架中加入2ml低糖DMEM培养基，将步骤(8)得到的接种有骨髓间充质干细胞的明胶-壳聚糖多孔支架完全处于低糖DMEM培养基环境中液面培养6天。

实施例3

本实施例用于说明本发明的间充质干细胞组织工程支架及其制备方法。

(1)将壳聚糖粉末和制备例制得的明胶粉末分别溶于0.05mol/L醋酸溶液中，得到浓度为6mg/mL的壳聚糖溶液和浓度为4mg/mL的明胶溶液。

(2)将等体积的壳聚糖溶液和明胶溶液混合均匀，获得明胶-壳聚糖溶液，然后用0.01mol/L的NaOH溶液调节明胶-壳聚糖溶液的pH值至6.4。

(3)将明胶-壳聚糖溶液搅拌均匀，真空脱泡后注入模具中，30℃孵育40min。

(4)-90℃冷冻18小时后，置于真空冷冻干燥机中-70℃冻干18h，得到明胶-壳聚糖初级支架。

(5)将明胶-壳聚糖初级支架浸泡于EDC/NHS交联剂中，30℃放置8h，用去离子水洗涤三次，每次5min。

(6)将步骤(5)得到的明胶-壳聚糖支架于-70℃冷冻30小时后，再置于真空冷冻干燥机中-90℃冻干8h，即获得明胶-壳聚糖多孔支架。

(7)将步骤(6)得到的明胶-壳聚糖多孔支架进行钴-60辐照灭菌，辐照剂量为25kGy，然后在37℃、氧浓度为7％、无菌条件下，将灭菌处理得到的明胶-壳聚糖多孔支架放置于12孔板(每孔底表面积约3.5cm²)，先用1×PBS缓冲液孵育明胶-壳聚糖多孔支架3次，每次3h，然后弃除PBS，用低糖DMEM培养基孵育明胶-壳聚糖多孔支架，每4h更换一次低糖DMEM培养基，更换2次直至低糖DMEM培养基的颜色不发生改变，测定明胶-壳聚糖多孔支架的pH值为7.2。

(8)弃除步骤(7)的低糖DMEM培养基，向每个孔板的明胶-壳聚糖多孔支架中加入100μl含有1×10⁶个骨髓间充质干细胞的低糖DMEM培养基，在37℃、氧浓度为7％的条件下孵育4h。

(9)在37℃、氧浓度为7％的条件下，向每个孔板的明胶-壳聚糖多孔支架中加入2ml低糖DMEM培养基，将步骤(8)得到的接种有骨髓间充质干细胞的明胶-壳聚糖多孔支架完全处于低糖DMEM培养基环境中液面培养2天。

实施例4

按照实施例1的方法，不同的是，步骤(8)中，向每个孔板的明胶-壳聚糖多孔支架中加入100μl含有2×10⁶个骨髓间充质干细胞的低糖DMEM培养基，在37℃、氧浓度为5％的条件下孵育5h。

实施例5

按照实施例1的方法，不同的是，步骤(2)中，将壳聚糖溶液和明胶溶液以1:3的体积比例混合均匀，获得明胶-壳聚糖溶液。

实施例6

按照实施例1的方法，不同的是，步骤(2)中，将壳聚糖溶液和明胶溶液以3:1的体积比例混合均匀，获得明胶-壳聚糖溶液。

实施例7

按照实施例1的方法，不同的是，步骤(2)中，用0.01mol/L的NaOH溶液调节明胶-壳聚糖溶液的pH值至6。

实施例8

按照实施例1的方法，不同的是，步骤(2)中，用0.01mol/L的NaOH溶液调节明胶-壳聚糖溶液的pH值至7。

实施例9

按照实施例1的方法，不同的是，步骤(7)-步骤(9)中，将氧浓度均改为21％。

对比例1

按照实施例1的方法，不同的是，步骤(8)中用不含骨髓间充质干细胞的低糖DMEM培养基替换含有9×10⁵个骨髓间充质干细胞的低糖DMEM培养基。

试验例1

分别对本发明实施例1-9的步骤(6)得到的明胶-壳聚糖多孔支架的生物学性能和机械性能进行评估，评估内容和方法如下：

(1)明胶-壳聚糖多孔支架的宏观和微观结果评估。本发明的明胶-壳聚糖多孔支架的肉眼直观图片如图1(A)所示，扫描电镜下的实施例1、6和7的明胶-壳聚糖多孔支架的显微图片分别如图1(C)、图1(B)和图1(D)所示。

由图1(B)-(D)可以看出：本发明实施例1的明胶-壳聚糖多孔支架的孔径为120-140μm、孔隙约为95％，为相互交联、高度均一的三维多孔网状结构；本发明实施例5的明胶-壳聚糖多孔支架的孔径为55-85μm、孔隙约为62％，为含有较多竖状纤维的三维多孔结构；本发明实施例6的明胶-壳聚糖多孔支架的孔径为195-225μm、孔隙约为81％，为不均匀的三维多孔片状结构。另外，本发明实施例2和3的明胶-壳聚糖多孔支架的孔径、孔隙和三维多孔结构与实施例1类似，在此不再赘述。本发明实施例7的明胶-壳聚糖多孔支架的孔径为72-92μm、孔隙约为73％，为不均匀的、含有部分竖状纤维的三维多孔结构；本发明实施例8的明胶-壳聚糖多孔支架的孔径为83-105μm、孔隙约为84％，为不均匀的、含有少量絮凝沉淀的三维多孔结构。即本发明的方法得到的明胶-壳聚糖多孔支架均具有合理的孔径、孔隙和三维多孔结构。将实施例1与实施例5-6进行比较可以看出，当明胶-壳聚糖溶液中明胶和壳聚糖的浓度均为2-3mg/mL时，得到的明胶-壳聚糖多孔支架具有更优的孔径、孔隙和三维多孔结构。将实施例1与实施例7-8进行比较可以看出，当将明胶-壳聚糖溶液的pH值调节为6.2-6.4时，得到的明胶-壳聚糖多孔支架具有更优的孔径、孔隙和三维多孔结构。

(2)对实施例1-9的明胶-壳聚糖多孔支架进行支架溶胀率测定，其中，以实施例1的明胶-壳聚糖多孔支架的溶胀率的测定为例，测定方法包括：对实施例1的明胶-壳聚糖多孔支架进行称重，计为W1，在室温下浸泡到去离子水中一定时间(如2h、4h、6h、8h、12h)，然后再称重，计为W2，计算支架溶胀率(％)＝(W2-W1)/W1×100％。

实施例1-9的明胶-壳聚糖多孔支架的溶胀率如表1所示，由表1数据可以看出：本发明的方法得到的明胶-壳聚糖多孔支架的溶胀性能良好。

表1

(3)对实施例1-9的明胶-壳聚糖多孔支架进行支架降解率测定，其中，以实施例1的明胶-壳聚糖多孔支架的降解率的测定为例，测定方法包括：对实施例1的明胶-壳聚糖多孔支架进行称重，计为W1，在37℃将实施例1的明胶-壳聚糖多孔支架置于含l mg/mL的I型明胶酶的1×PBS溶液中，一定时间后(如第20h、40h、60h、80h、120h)取出支架，去离子水漂洗后烘干称重，计为W2，计算残余质量(％)＝W2/W1×100％。

实施例1-9的明胶-壳聚糖多孔支架的残余质量如表2所示。生物材料在体内的降解速度，应该满足细胞对支架的降解要求，以促进修复细胞的增殖及迁移。由表2可以看出，本发明的明胶-壳聚糖多孔支架均具有较为优良的生物降解性能以配合组织修复再生。

表2

(4)对实施例1-9的明胶-壳聚糖多孔支架进行机械性能测定，其中，以实施例1的明胶-壳聚糖多孔支架的测定为例，测定方法包括：将实施例1的明胶-壳聚糖多孔支架剪裁为40mm×5mm×0.3mm的条形，采用KES-G1材料试验机测试其干燥状态下的机械性能，拉伸速度为10mm/min。同时将实施例1的明胶-壳聚糖多孔支架在去离子水中浸泡24h后取出，滤纸吸去表面水分后相同条件下测定支架在湿性状态下的机械性能。

本发明实施例1-9中的明胶-壳聚糖多孔支架在干燥状态和湿性状态的拉伸强度如表3所示。由表3中数据可知，本发明的方法得到的明胶-壳聚糖多孔支架均具有较好的机械性能。

表3

试验例2

(1)通过细胞活性实验(活/死细胞染色)检测本发明实施例1-9的间充质干细胞组织工程支架，即步骤(9)得到的接种有间充质干细胞的明胶-壳聚糖多孔支架上的间充质干细胞的生长状况。实施例1的活/死细胞染色图如图2A所示，实施例2-3的活/死细胞染色图与实施例1相似，在此不再赘述。实施例4的活/死细胞染色图如图2B所示，实施例5-6的活/死细胞染色图如图2C所示，实施例7的活/死细胞染色图如图2D所示，实施例8的活/死细胞染色图如图2E，实施例9的活/死细胞染色图如图2F所示。结果显示，实施例1的细胞生长状况更好。

(2)分别将本发明实施例1-9的间充质干细胞组织工程支架，即步骤(9)得到的接种有间充质干细胞的明胶-壳聚糖多孔支架用10％福尔马林溶液中固定24小时，将固定好的支架材料进行脱水处理，放入石蜡进行包埋，包埋好的蜡块固定于切片机上，切成5-8微米厚的薄片，放于45℃恒温箱中烘干待用，进行苏木精-伊红染色，观察间充质干细胞在支架材料中的排列分布情况。实施例1的苏木精-伊红染色图如图3所示，图3显示间充质干细胞均匀分布在材料内部，实施例2-3的苏木精-伊红染色图与实施例1相似，在此不再赘述。

(3)各细胞因子的表达情况

分别收集实施例1-9中步骤(9)的培养上清来检测各细胞因子的表达情况，实验方法包括：ELISA检测方法。各细胞因子的表达情况的结果如表4所示。

表4

由上述(1)-(3)结果可知，接种间充质干细胞的接种密度为1×10⁵-4×10⁵个间充质干细胞/cm²明胶-壳聚糖多孔支架时，细胞在材料中的生长更好。与在常氧浓度下接种、孵育培养相比，将间充质干细胞在低氧浓度下接种、孵育培养，促血管因子分泌更高。

试验例3

分别将实施例1得到的间充质干细胞组织工程支架(即实验组1)、实施例9得到的间充质干细胞组织工程支架(即实验组9)和对比例1得到的明胶-壳聚糖多孔支架(即单纯支架组)移植于糖尿病大鼠下肢缺血皮肤损伤部位(除支架不同外，其他条件均相同)，观察相应的损伤部位的愈合情况，同时对相同条件的损伤部位不进行任何处理，作为空白对照组进行对比。

(1)检测损伤部位在不同时间点愈合面积的动态变化。伤口面积比率(％)＝不同时间点的伤口面积/原始伤口面积×100％。

结果显示：在移植后第3、7、14、21、28天，空白对照组的伤口面积比率分别为85.3％、73.2％、44.6％、38.9％和21.4％；单纯支架组的伤口面积比率分别为79.2％、61.3％、39.9％、31.5％和18.7％；实验组9的伤口面积比率分别为72.2％、52.6％、31.7％、29.6％和15.3％；而实验组1的伤口面积比率分别为60.4％、36.2％、16.5％、7.6％和0％。表明本发明的间充质干细胞组织工程支架能够明显促进糖尿病难愈合皮肤损伤部位的愈合，且在低氧浓度下接种、孵育培养得到的间充质干细胞组织工程支架能够进一步促进糖尿病难愈合皮肤损伤部位的愈合。

(2)分别取移植3、7、14天后的空白对照组、单纯支架组、实验组1、实验组9的皮肤损伤组织，于10％福尔马林溶液中固定24小时。将固定好的组织块进行脱水处理，放入石蜡进行包埋，包埋好的蜡块固定于切片机上，切成5-8微米厚的薄片，放于45℃恒温箱中烘干待用。进行马松染色。电镜观察不同处理组损伤部位的皮肤病理学改变及明胶分布情况。

上述不同处理组在移植后第3、7、14天的糖尿病难愈合皮肤损伤部位的组织学马松染色图如图4所示。组织学观察显示在移植后第14天，本发明的间充质干细胞组织工程支架能够明显促进损伤部位新生血管的再生、再上皮化和减少炎症细胞浸润，以及胶原重排，在最大程度上促进损伤部位皮肤结构和功能趋于正常化，促进糖尿病难愈合皮肤损伤部位的愈合；且在低氧浓度下接种、孵育培养得到的间充质干细胞组织工程支架能够进一步促进糖尿病难愈合皮肤损伤部位的愈合。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.一种间充质干细胞组织工程支架的制备方法，其特征在于，该方法包括：制备明胶-壳聚糖多孔支架，然后将间充质干细胞接种至明胶-壳聚糖多孔支架，并进行孵育培养。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，将间充质干细胞接种至明胶-壳聚糖多孔支架的方法包括：

(1)将明胶-壳聚糖多孔支架进行灭菌，然后在无菌、氧浓度为2-21％优选2-7％的条件下，将明胶-壳聚糖多孔支架的pH值调节为7-7.5；

(2)向明胶-壳聚糖多孔支架中加入含有间充质干细胞的培养基，在30-38℃、氧浓度为2-21％优选2-7％的条件下孵育4-6h。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，步骤(2)中，间充质干细胞的加入量为1×10⁵-4×10⁵个间充质干细胞/cm²明胶-壳聚糖多孔支架。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，孵育培养的方法包括：将接种有间充质干细胞的明胶-壳聚糖多孔支架完全处于培养基环境中，在30-38℃、氧浓度为2-21％优选2-7％的条件下培养2-7天。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，明胶-壳聚糖多孔支架的制备方法包括：配制明胶-壳聚糖溶液，使得明胶-壳聚糖溶液中明胶和壳聚糖的浓度均为1-5mg/mL，优选均为2-3mg/mL；然后将明胶-壳聚糖溶液的pH值调节为6-7，优选为6.2-6.4；再将明胶-壳聚糖溶液真空脱泡后注入模具中依次进行孵育处理、第一冷冻干燥处理、化学交联处理和第二冷冻干燥处理；

优选地，所述明胶-壳聚糖溶液为明胶-壳聚糖的醋酸溶液；

优选地，所述孵育处理的条件包括：温度为30-38℃，时间为25-40min。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述化学交联处理的条件包括：将第一冷冻干燥处理得到的明胶-壳聚糖多孔支架浸泡于交联剂中，浸泡温度为20-30℃，浸泡时间为8-18h，优选地，所述交联剂为EDC/NHS交联剂。

7.根据权利要求5所述的方法，其中，所述第一冷冻干燥处理和第二冷冻干燥处理均为先进行冷冻处理再进行干燥处理，冷冻处理的条件包括：温度为-70～-90℃，时间为18-30h；干燥处理的条件包括：温度为-70～-90℃，时间为8-18h。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞和脐带间充质干细胞中的一种或多种。

9.根据权利要求1-8中任意一项所述的方法制备得到的间充质干细胞组织工程支架。

10.权利要求9所述的间充质干细胞组织工程支架在制备皮肤替代品中的应用。