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CN116376662A - 空间转录组学分析的生物芯片和其制备方法及应用 - Google Patents

空间转录组学分析的生物芯片和其制备方法及应用 Download PDF

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CN116376662A
CN116376662A CN202211671127.7A CN202211671127A CN116376662A CN 116376662 A CN116376662 A CN 116376662A CN 202211671127 A CN202211671127 A CN 202211671127A CN 116376662 A CN116376662 A CN 116376662A
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CN
China
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nucleic acid
barcode
chip
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probes
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Application number
CN202211671127.7A
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赵海峰
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Seligen Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Yingtai Technology Co ltd
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Publication date
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Abstract

本发明公开了一种用于分析生物样品的核酸信息的芯片，以及制备所述芯片的方法，所述芯片适合用于分析生物组织样品的空间转录组学信息。本发明还提供了分析生物组织样品的空间转录组学信息的方法。本发明的方法和设备能够有效地获得组织样品的细胞中的核酸表达信息，包括空间组学信息。

Description

空间转录组学分析的生物芯片和其制备方法及应用
本申请要求以下中国专利申请的优先权：申请日为2021年12月24日、申请号为202111601551.X、发明名称为“空间转录组学分析的生物芯片和其制备方法及应用”；以及申请日为2022年6月25日、申请号为202210728404.7、发明名称为“空间转录组学分析的生物芯片和其制备方法及应用”，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明涉及生物学与医疗器械领域。具体的，本发明涉及制备用于分析生物样品的细胞的核酸信息的芯片的方法，所述芯片适合用于分析生物组织样品的空间转录组学信息。
背景技术
对生物组织的细胞组织和表达格局的分析，是生物医学研究和诊断学上的里程碑。细胞组织学运用各种染色技术，带来了以免疫组织化学和原位杂交的基因表达来研究蛋白质分布的可能性。
新的研究希望可以在保存关于组织的空间信息的情况下对组织中的转录物组和/或基因组变异进行表征。
现有技术中采用芯片来分析生物样品的细胞的核酸信息，其中提供了用于在玻片等基底上形成识别和结合生物样品的核酸的探针的方法以及携带这些探针的芯片产品。
本领域仍然需要能够在制造用于分析生物样品的细胞的核酸信息的芯片的大规模生产中更方便和更有效地在芯片基底上形成能够结合目标DNA或RNA分子的探针，从而获得质量更优良的芯片，以及使得产率更稳定的制备工艺和产品。
发明内容
本发明提供了一种用于大规模制备适于分析生物组织样品的细胞的核酸信息，特别是适于分析空间转录组学信息的生物芯片的方法。
具体的，在本发明中，提供了一种改进的用于制备具有阵列的生物芯片的方法，其包括以下步骤：
步骤1.提供一种芯片；
步骤2.将芯片表面连接子核酸固定在所述芯片表面，例如固定在整个芯片的表面；
步骤3.通过多条平行设置的微流道将第一组条形码核酸施加到芯片表面，在使得所述芯片表面连接子核酸和第一条形码核酸发生连接反应的条件下，形成第一方向的多条第一条形码带，所述第一组条形码核酸中包括多种具有不同条形码序列的第一条形码核酸，每条第一条形码带上固定一种第一条形码核酸，且每条第一条形码带上固定的第一条形码核酸具有不同的条形码序列；
步骤4.通过多条平行设置的微流道将第二组条形码核酸沿第二方向施加到芯片表面，形成多条第二条形码带，所述第二组条形码核酸中包括多种具有不同条形码序列的第二条形码核酸，每条第二条形码带上具有一种第二条形码核酸，且每条第二条形码带上固定的第二条形码核酸具有不同的条形码序列；
步骤5.在使得第一条形码核酸和第二条形码核酸发生连接反应的条件下，在所述多条第一条形码带与所述多条第二条形码带产生交叉的芯片表面的位置将第二条形码核酸与第一条形码核酸连接，形成探针，所述探针的位置(即所述多条第一条形码带与所述多条第二条形码带产生交叉的位置)构成阵列的阵点，每个阵点具有一种序列相互不同的探针。
在本发明的其中一个方面，所述方法中采用具有多条平行设置的微流道的微流道装置将所述第一组条形码核酸或第二组条形码核酸输送和固定在芯片表面，其中所述微流道与芯片表面接触的一面可容溶液或溶液中的核酸通过。
在本发明的其中一个方面，所述方法中在所述微流道设备的每一条微流道中加入一种具有不同条形码序列的第一组条形码核酸或第二组条形码核酸。
在本发明的其中又一个方面，所述芯片表面连接子核酸可以以化学键连接方式固定在芯片表面上。化学键连接方式例如为选自氨基-醛基反应等的基团连接、共价交联中的任意一种。芯片的表面可以通过表面化学反应用氨基、醛基、环氧基、异硫氰酸基、巯基、硅烷等活性基团等进行包被。所述芯片表面连接子核酸与芯片表面连接的一端(通常为5’端)则具有与包被的活性基团形成化学键的基团。
在本发明的其中又一个方面，所述芯片表面连接子核酸也可以以物理吸附方式固定在芯片表面上，例如通过疏水作用、静电吸引等方式。例如可通过在芯片表面进行多聚赖氨酸(poly-L-lysine,PLL)修饰或进行表面活性剂处理等。
在本发明的其中又一个方面，所述芯片表面连接子核酸的3’端具有与第一条形码核酸连接的连接片段。在本发明的其中一种实施方式中，所述芯片表面连接子核酸的连接片段通过第一单链连接核酸与所述第一条形码核酸连接；所述第一条形码核酸的5’端具有用于通过所述第一单链连接核酸与所述芯片表面连接子核酸连接的连接片段；所述芯片表面连接子核酸的3’端的连接片段和第一条形码核酸的5’端的连接片段分别与所述第一单链连接核酸的两端的序列反向互补。
在本发明的其中又一个方面，所述芯片表面连接子核酸可具有约10-50个核苷酸，优选具有少于30个核苷酸，例如为少于25个核苷酸。
在本发明的其中一个方面，所述方法中所述第一组条形码核酸中的第一条形码核酸包括第一条形码片段。在本发明的其中又一个方面，所述第一组条形码核酸中的第一条形码核酸的5’端具有用于与所述芯片表面连接子核酸连接的连接片段，其3’端具有用于与第二条形码核酸连接的第一连接片段。
在本发明的其中一个方面，其中所述第二组条形码核酸中的第二条形码核酸包括3’端的用于识别和结合生物样品中的目标核酸的捕获片段(例如为识别和结合mRNA或cDNA的片段，例如为poly-T序列)和第二条形码片段。
在本发明的其中一个方面，所述方法中所述第二组条形码核酸中的第二条形码核酸还具有唯一分子标识符(UMI)。
在本发明的其中一个方面，所述方法中所述第一条形码核酸的3’端具有用于通过第二单链连接核酸与第二条形码核酸连接的第一连接片段，所述第二条形码核酸的5’端具有用于通过所述第二单链连接核酸与第一条形码核酸连接的第二连接片段，所述第一连接片段和第二连接片段分别与所述第二单链连接子核酸的两端的序列反向互补。
在本发明的其中一个方面，所述方法中步骤5中形成的探针包括：3’端的用于识别和结合生物样品中的目标核酸的捕获片段，任选的唯一分子标识符(UMI)，第二条形码片段和第一条形码片段，以及5’端的芯片表面连接子核酸片段。在本发明的其中又一个方面，所述芯片表面连接子核酸片段的5’端具有用于扩增反应的引物片段。
在本发明的其中一个方面，所述方法中所述第一组条形码核酸中的每一种第一条形码核酸的第一条形码片段的序列是指定的，和/或所述第二组条形码核酸中的每一种第二条形码核酸的第二条形码片段的序列是指定的。
在本发明的其中一个方面，所述方法中所述探针的第一条形码片段和第二条形码片段的序列是指定的。
在本发明的其中一个方面，所述方法中步骤2中通过将所述芯片表面连接子核酸以约0.1-100uM/L，例如为约1-20uM/L的浓度施加到芯片的表面。
在本发明的其中一个方面，所述方法中步骤3中流道内的核酸浓度为约0.1-100uM，例如为约1-20uM。
在本发明的其中一个方面，所述方法中步骤4中流道内的核酸浓度为约0.1-100uM，例如为约1-20uM。
在本发明的其中一个方面，所述方法中步骤3和步骤4中所述平行设置的微流道的各条微流道的宽度为约2-200μm，优选为约5-50μm，最优选为约5-25μm，例如为约5μm，10μm或50μm。
在本发明的其中一个方面，所述方法中步骤3和步骤4中所述平行设置的微流道的各条相邻微流道之间的间距为约5-400μm，优选为约10-100μm，最优选为约10-50μm，例如为约20μm，50μm或100μm。
在本发明的其中一个方面，所述方法制备得到的芯片的阵点的探针密度为约103-105个/μm2。
在本发明的其中一个方面，所述方法制备得到的芯片的阵点具有的探针的均一性偏差小于20％，优选小于10％，更优选小于6％。
在本发明的其中一个方面，所述方法制备得到的芯片的阵点的尺寸均一性偏差小于10％，优选小于5％，更优选小于2％。
本发明还提供了用于分析生物样品的核酸信息的芯片。在本发明的其中一个方面，所述用于分析生物样品的核酸信息的芯片通过前述方法制备得到。在本发明的其中一个方面，所述用于分析生物样品的核酸信息的芯片的表面具有形成阵列的探针，所述探针阵列包括正交的行和列，所述阵列中的探针各具有不同的条形码序列，可用于体现所述探针的空间位置。在本发明的其中一个方面，所述探针包括第一条形码和第二条形码。在本发明的其中又一个方面，所述探针阵列的每一行探针具有相同的第一条形码以及每一列的探针具有相同的第二条形码；每一行探针具有的第一条形码各不相同以及每一列探针具有的第二条形码各不相同。在本发明的其中一个方面，所述用于分析生物样品的核酸信息的芯片在其整个表面具有芯片表面连接子核酸。在本发明的其中又一个方面，所述探针阵列中的每个探针的5’端为所述芯片表面连接子核酸。在本发明的其中又一个方面，所述探针阵列中的每个探针的序列从5’端到3’端包括所述芯片表面连接子核酸、第一条形码、第二条形码、用于识别和结合生物样品中的目标核酸的捕获片段。在本发明的其中又一个方面，所述探针阵列中的每个探针的序列包括5’端的用于扩增反应的引物片段。在本发明的其中又一个方面，所述探针阵列中的每个探针还包括唯一分子标识符(UMI)。
在本发明的其中一个方面，所述芯片的阵点的探针密度为约103-105个/μm2。在本发明的其中一个方面，所述芯片的阵点具有的探针的均一性偏差小于20％，优选小于10％，更优选小于6％。在本发明的其中一个方面，所述芯片的阵点的尺寸均一性偏差小于10％，优选小于5％，更优选小于2％。
本发明提供的前述芯片或由本发明提供的前述方法制备得到的芯片可用于对组织样品，特别是组织薄切片进行细胞内含分子的分析，包括对核酸和蛋白的分析，例如通过PCR、质谱法、新一代测序、或ELISA进行分析，获得其表达和空间信息。
本发明提供了具有阵列的芯片用于分析生物组织样品的空间转录组学信息的方法，所述方法包括将前述芯片的阵列与组织样品接触，阵列上的探针识别和结合组织中的细胞的核酸，特别是mRNA。在本发明的其中一个方面，组织中的细胞的核酸离开组织与芯片上的探针结合。在本发明的其中又一个方面，当所述组织为经固定和包埋的组织时，通过对所述组织进行透化将核酸从细胞中释放。
在本发明的其中又一个方面，所述方法还包括进行反转录反应。
在本发明的其中又一个方面，所述方法还包括：收集组织/细胞后分离提纯cDNA，例如在将组织与芯片分离后，在一个容器内将组织/细胞分裂以及分离提纯核酸。
在本发明的其中又一个方面，所述方法还包括扩增所述cDNA分子。
在本发明的其中又一个方面，所述方法还包括对扩增得到的核酸进行建库/测序。
在本发明的其中一个方面，所述生物样品为来自受试者的组织样品，例如为手术切除组织样品，优选为通过显微切片术加工得到的组织薄切片。在本发明的其中一个方面，所述组织样品经过固定和包埋(例如包埋在石蜡中)，以及附着在支持物例如玻片上。在本发明的其中一个方面，固定的组织中的细胞的核酸在经过透化处理后，离开组织与芯片上的探针结合。
在本发明的其中一个方面，可对所述组织薄切片进行形态分析和/或组织学分析，该组织学分析是通过H&E染色、IHC染色、ISH染色、以及FISH染色进行。
在本发明的其中一个方面，对该一种或多种生物分子进行分析是通过PCR、质谱法、新一代测序、或ELISA进行。
在本发明的其中一个方面，受试者选自动物、农场动物、宠物、人类受试者。
在本发明的其中一个方面，分析物进一步包括非人细胞、人细胞、非天然蛋白质、核酸、或小分子、染料、病毒、细菌、寄生虫、原生动物或化学物质中的一种或多种。小分子包括半抗原、肽标签、蛋白质标签、荧光标签、核酸标签、及其组合。
在本发明的其中一个方面，所述芯片可用于分析样品中标记物的定量和/或定性数据。该标记物包括DNA、蛋白质、RNA、脂质、细胞器、代谢物、或细胞。该标记物包括基因组多态性，药物基因组学单核苷酸多态性(SNP)，基因组SNP，体细胞多态性，以及蛋白质、脂质和/或细胞器的差异表达。该标记物包括单个核苷酸位置；基因内区域或基因间区域；外显子或内含子、或其片段；编码区或非编码区；启动子、增强子、5'非翻译区(5'UTR)、或3'非翻译区(3'UTR)、或其片段；cDNA或其片段；SNP；体细胞突变、种系突变、或两者；点突变或单一突变；缺失突变；框内缺失、基因内缺失、全基因缺失；插入突变；基因内插入；倒位突变；染色体内倒位；连锁突变；连锁插入突变；反转重复突变；串联重复；染色体内串联重复；易位；染色体易位，非相互易位；重排；基因组重排；一个或多个内含子、或其片段的重排；重排的内含子；5'-或3'-UTR、或其组合。其中可通过单细胞测序、单核测序、流式细胞术、免疫组织化学染色、苏木精和伊红染色、全基因组测序、高通量测序、质谱法、DNA微阵列、或其组合对该标记物进行测量。
本发明的芯片可用于分析组织样品。该组织样品包括选自以下项的组的样品：一种或多种恶变前或恶性细胞、来自实体瘤的细胞、软组织肿瘤或转移灶、来自手术边缘的组织或细胞、组织学正常组织、一种或多种循环肿瘤细胞(CTC)、正常邻近组织(NAT)、来自患肿瘤或处于患肿瘤风险的相同受试者的血液样品、或FFPE样品。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例。
图1为本发明提供的制备芯片的方法步骤的流程示意图。
图2为本发明的方法中采用具有多条平行设置的微流道的设备的一种示例性实施方式。
图3为本发明提供的生物芯片的探针点阵荧光信号的观测的图。
图4为根据探针荧光信号对本发明提供的生物芯片的点阵的检测图。图4A和图4B分别显示对点阵的尺寸和荧光强度的测量结果。
图5为通过本发明提供的生物芯片对小鼠脑组织进行空间组分析的组织HE染色图。
图6为通过本发明提供的生物芯片对小鼠脑组织的核酸进行处理和分析过程的质量检测分析图。
图7A为通过本发明提供的生物芯片对小鼠脑组织进行空间组分析可检测的基因数量图。
图7B为通过本发明提供的生物芯片对小鼠脑组织进行空间组分析可检测的UMI数量图。
图7C为通过本发明提供的生物芯片对小鼠脑组织进行空间组分析实际检测基因数与捕获转录本(UMI)数量分布图。
图8为通过本发明提供的生物芯片对小鼠脑组织进行空间组分析的基因聚类分析结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的区间。
实施例1
本发明提供了一种制备适于分析生物样品的细胞的核酸信息的生物芯片的方法。更具体的，本发明提供了一种用于制备具有阵列的生物芯片的方法。在本发明的其中一个方面，本发明提供的芯片适于分析生物组织样品的空间转录组学信息。
图1为本发明提供的制备具有阵列的生物芯片的示例性方法的流程示意图。
如图1所示，所述方法主要包括以下步骤：
步骤1.提供芯片，或称为基底；为了下一步将芯片表面连接子核酸固定在芯片表面，对芯片表面通过表面化学反应用氨基、醛基、环氧基、异硫氰酸基、巯基、硅烷等活性基团等进行包被。
步骤2.将芯片表面连接子核酸固定在芯片表面，例如固定在整个芯片的表面；所述芯片表面连接子核酸可包括3’端的用于与第一条形码核酸连接的连接片段，以及5’端具有用于后续扩增反应的引物片段。
步骤3.通过多条平行设置的微流道将第一组条形码核酸施加到芯片表面，在使得所述芯片表面连接子核酸和第一条形码核酸发生连接反应的条件下，形成第一方向的多条第一条形码带，所述第一组条形码核酸中包括多种具有不同条形码序列的第一条形码核酸，每条第一条形码带上固定一种第一条形码核酸，且每条第一条形码带上固定的第一条形码核酸具有不同的条形码序列。
图2显示通过多条平行设置的微流道将多种条形码核酸分别施加到芯片表面，与芯片表面上的芯片表面连接子核酸进行连接反应和被固定在芯片表面的一种示例性实施方式。图2的左图的下方为芯片。图2的左图的中间显示一种具有多条平行设置的微流道(微流道1至微流道n)的微流道装置，其中微流道与芯片表面接触的一面，即图示的微流道的底部，可容溶液或溶液中的核酸通过(透过)。例如，所述微流道与芯片表面接触的一面不存在微流道壁。将该微流道装置沿第一方向覆盖在芯片表面，然后在微流道内通入指定的溶液，例如含有条形码核酸的溶液。图2的左图的上方为示例性的协助通入溶液的装置，例如为利用负压的真空抽吸装置，其可设置在微流道的出口。图2右图显示在每一条微流道中通过入口加入含有不同条形码序列的条形码核酸(图中的条形码核酸1-n)。在本发明的其中一个方面，所述每一条微流道中通入的条形码核酸的条形码序列具有已知的或指定的核苷酸序列。
如图1所示，所述第一条形码核酸的5’端具有用于通过一个单链连接核酸(第一连接子)与所述芯片表面连接子核酸连接的连接片段；所述芯片表面连接子核酸的3’端的连接片段和第一条形码核酸的5’端的连接片段分别与第一连接子的两端的序列反向互补。
步骤4.移走步骤3中的微流道，通过另一组多条平行设置的微流道将第二组条形码核酸沿第二方向(通常为与第一方向垂直)施加到芯片表面的具有第一方向的所述多条第一条形码带上，形成多条第二条形码带，所述第二组条形码核酸中包括多种具有不同条形码序列的第二条形码核酸，每条第二条形码带上具有一种第二条形码核酸，且每条第二条形码带上固定的第二条形码核酸具有不同的条形码序列。
图示的示例性第二条形码核酸包括3’端的识别和结合mRNA的poly-T序列、唯一分子标识符(UMI)和第二条形码片段。
图示的例子中，第一条形码核酸的3’端具有用于通过一个单链连接核酸(第二连接子)与第二条形码核酸连接的第一连接片段，所述第二条形码核酸的5’端具有用于通过所述第二连接子与第一条形码核酸连接的第二连接片段，所述第一连接片段和第二连接片段分别与所述第二连接子核酸的两端的序列反向互补。在使得第一条形码核酸和第二条形码核酸能够发生连接反应的条件下，在所述多条第一条形码带与所述多条第二条形码带产生交叉的芯片表面将第二条形码核酸与第一条形码核酸连接，形成探针。
步骤5.移走步骤4中的微流道，获得表面具有探针阵列的生物芯片。所述探针阵列上的每个阵点对应所述多条第一条形码带与所述多条第二条形码带产生交叉的位置。每个阵点具有一种探针分子，其包括第一条形码序列和第二条形码序列。各个阵点具有的探针分子包括的第一条形码序列和第二条形码序列的组合各不相同。在本发明的其中一个方面，所述每一条微流道中通入的条形码核酸的第一条形码序列和第二条形码序列是已知的或指定的，由此各个阵点具有的探针分子包括的第一条形码序列和第二条形码序列及其组合也是已知的。由此可通过各个阵点具有的探针分子的第一条形码序列和第二条形码序列获知其在芯片表面的阵列中的空间位置。
步骤1中作为基底的芯片通常是指固体基片，其上可以实施化学，生物，生物物理或生物化学过程等。芯片可具有微观结构或微尺度结构，如通道和孔井，电极元件，电磁元件等利于芯片上发生的化学，生物，生物物理或生物化学过程。芯片表面可以是平的，或不平的。表面不平的芯片可以包括构造在表面的通道或孔。
芯片可以由任何合适的材料制成，芯片材料的示例性类型包括玻璃、改性玻璃、功能化玻璃、无机玻璃、微球(包括惰性和/或磁性颗粒)、塑料、多糖、尼龙、硝酸纤维素、陶瓷、树脂、二氧化硅、基于二氧化硅的材料、碳、光纤或光纤束、除上文例示的材料以外的多种聚合物和多孔微量滴定板。示例性塑料的具体类型包括丙烯酸树脂、聚苯乙烯、苯乙烯和其它材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨基甲酸酯和TeflonTM。示例性的基于二氧化硅的材料的具体类型包括硅和改性硅的各种形式。可通过对于本领域技术人员公知的多种方法，对芯片表面做修饰以适应目标生物聚合物的附着。
在本发明中，制备得到的所述芯片表面的阵列上具有探针(或称为捕捉探针)。探针是指可以基因特异性或靶物特异性地识别和结合目标核酸，例如来自组织样品的核酸的单链核苷酸分子，其具有特异性的核苷酸序列，即能够选择性退火到靶定核酸的核苷酸序列，通常为互补的核苷酸序列。组织样品中的分析物的实例包括基因组DNA、甲基化DNA、特定的甲基化DNA序列、信使RNA(mRNA)、多聚A mRNA、线粒体DNA、病毒RNA、微小RNA、原位合成的PCR产物、RNA/DNA杂合物、脂质、碳水化合物、蛋白质。捕捉探针可以是基因特异性捕捉探针，其例如与样品中特异性靶定的mRNA或cDNA杂交。
在本发明中，所述探针具有条形码序列，用于后续的高通量下一代测序(NGS)或合成测序(SBS)进行分析的应用中，例如在进行大通量的测序分析中。在这些测序中，采用条形码序列来标志和鉴定测序获得的核酸序列的核酸的来源。条形码分子用于将来自生物颗粒(例如，细胞)的核酸分子(例如，RNA分子)条形码化，以生成测序文库，随后对所述测序文库进行测序以产生多个测序读长。多个测序读长中的一些或全部包括条形码序列。在这些测序应用中，通常对细胞核酸进行扩增，直到对象中的条形码化重叠片段构成特定部分或全部细胞基因组的至少1X覆盖率、至少2X、至少3X、至少4X、至少5X、至少10X、至少20X、至少40X或更高覆盖率。一旦产生条形码化片段，就可以将它们直接在合适的测序系统上测序，例如Illumina系统。多个序列上相同条形码的存在可以提供关于该序列的起源的信息。
在本发明中，在制备得到的探针中含有两个条形码序列。两个条形码序列可以帮助确定探针在芯片表面的阵列中的位置(分别确定X维度和Y维度的位置)，因此还还具有位置标签的作用。探针上的条形码序列可与芯片上的阵列中的阵点对应，也可指示其识别的组织上的细胞，包括单个细胞，在该组织样品中的位置。可以与核酸标签偶联的其它分子的实例包括抗体、抗原结合结构域、蛋白质、肽、受体、半抗原等。
在本发明中，所述探针还包括一个或多个唯一分子标识符(UMI)。唯一分子标识符是连续的核酸片段或两个或多个非连续的核酸片段，它们充当特定分析物或结合特定分析物的捕获探针的标记或标识符。UMI是基本上不与生物样品中的分析物核酸分子杂交的核酸序列。UMI可为捕获探针的序列内包含约6至约20或更多个核苷酸。
在本发明的方法的步骤2中，芯片表面连接子核酸与芯片的固定可采用领域内各种已知的方法进行。核酸的固定指通过共价或非共价键直接或间接附着在芯片上。在本发明的其中一个方面，固定指在需要核酸扩增和/或测序的等反应中，保持静止或附着于芯片上。在本发明的其中一个发明，固定也可指静止或附着于芯片上的核酸在后续的核酸扩增和/或测序等反应中，在指定的条件下可以脱离芯片表面。示例性的非共价连接包括但不限于非特异性相互作用(例如氢键键合、离子键键合、范德华相互作用等)或特异性相互作用(例如亲和相互作用、受体-配体相互作用、抗体-表位相互作用、抗生物素蛋白-生物素相互作用、链霉亲合素-生物素相互作用、凝集素-碳水化合物相互作用等)。芯片表面连接子核酸也可以以物理吸附方式固定在芯片表面上，例如通过疏水作用、静电吸引等方式。
在本方面的方法的步骤3和4中，芯片表面连接子核酸与第一条形码核酸、以及第一条形码核酸和第二条形码核酸的连接可通过本领域已知的各种方法进行。例如，通过各自与另一单链核酸片段(连接子核酸)的不同末端的序列互补，在可进行连接反应的条件下形成3个核酸片段(第一条形码核酸、第二条形码核酸和连接子核酸)的组合后达到连接的目的。
在本发明的其中一个方面，芯片表面连接子核酸在5’端具有用于后续扩增反应的引物片段，例如为用于已知测序方法中通用引物序列。
在本发明的其中一个方面，所述芯片表面连接子核酸在5’端具有用于与芯片表面连接的基团或序列。例如，芯片表面为醛基修饰，芯片表面连接子核酸在5’端具有氨基基团。在本发明的其中另一个方面，所述芯片表面连接子核酸具有可与芯片上修饰的因子形成特异性相互作用的配子，例如所述因子和配子分别为抗体-表位、抗生物素蛋白-生物素、链霉亲合素-生物素、凝集素-碳水化合物。
在本发明的其中一个方面，所述第一条形码核酸包括第一条形码片段。
在本发明的其中一个方面，所述第二条形码核酸包括第二条形码片段。在本发明的其中一个方面，所述第二条形码核酸在3’端具有用于识别和结合生物样品中的目标的捕获片段，例如为识别和结合mRNA或cDNA的片段，例如为识别mRNA的poly-T序列。
在本发明的其中一个方面，所述第一条形码核酸的3’端具有用于与第二条形码核酸连接的第一连接片段。在本发明的其中另一个方面，所述第二条形码核酸的5’端具有用于与第一条形码核酸连接的第二连接片段。在本发明的其中又一个方面，所述第一连接片段和第二连接片段分别与连接子核酸的一端形成互补，在可连接的条件下(如T4连接酶等的存在下)，第一连接片段和第二连接片段与连接子核酸形成组合，达到第一条形码核酸和第二条形码核酸的连接。
本发明提供的方法制备的芯片可用于对组织样品，特别是组织薄切片进行细胞内含分子的分析，包括对核酸和蛋白的分析，例如通过PCR、质谱法、新一代测序、或ELISA进行分析，获得其表达和空间信息。
本发明的芯片在使用中，包括将组织切片与阵列接触，阵列上的探针可识别和结合组织中的细胞的核酸，特别是mRNA。后续的分析包括逆转录和扩增等，并且可通过高通量下一代测序(NGS)或合成测序(SBS)进行分析。
本发明提供的制备具有探针阵列的芯片的方法，可以在同一基底上，实现多个具有相同的编码区域的阵列的芯片的并行合成。可以根据需要，在芯片基底的第一方向和第二方向上形成多组相同的第一条形码带和第二条形码带，由此得到多个在对应阵点上具有相同的第一条形码和第二条形码序列定义的探针的芯片。
WO/2022/135598公开了一种制备制备具有阵列的生物芯片的方法，该方法中将第一组条形码核酸通过多条平行设置的微流道装置直接固定在经光学环氧基修饰的玻璃片上。在实验室和大规模工业生产环境下，发明人发现，在尝试用微流道将核酸分子与修饰的芯片结合时，由于微流道的特殊的流体力学特性，对流道内发生的核酸与芯片表面的修饰基团的反应条件，包括反应温度、反应物浓度和环境湿度、压力等，都具有极高的要求。在反应过程中，如果出现反应条件的波动，则会极大地影响核酸与芯片表面的修饰基团的反应结果，造成产品的严重品控缺陷，包括在芯片上出现的大面积探针信号减弱甚至出现芯片“空斑”(芯片上无探针信号)等缺陷。
发明人出乎意料地发现，在本发明提供的改进的制备工艺中，在将所述第一组条形码核酸的核酸固定在芯片表面上时，通过将所述第一组条形码核酸的核酸与已固定在芯片表面(包括整个芯片表面或与第一组条形码位置相同的芯片表面部分)的核酸(即本文中的芯片表面连接子核酸或芯片表面连接子)通过核酸与核酸的连接反应(例如通过核酸连接酶和桥接所述两个核酸的核酸连接子片段)进行相连，能够显著地改进第一组条形码核酸的核酸在芯片上的固定效率，使得在芯片的每个探针构成阵列的阵点上的探针密度显著增加，并且均匀性显著改善。在不受此理论限制的条件下，发明人认为这是由于核酸与核酸的连接反应效率和稳定性比其它核酸与芯片表面固定的方式(如共价键方式等)更强，增加各片段的连接效率等。另外，所述芯片表面连接子核酸或芯片表面连接子的长度可以较短，其通过化学键连接等方式被固定在芯片上的效率更高，结合数量更多。这明显有助于提高制备得到的芯片的探针阵点的尺寸均一性、探针阵点具有的探针量和探针量的均一性(在制备得到的芯片上体现为经荧光显微镜和相机检测由探针携带的荧光信号的强度，在应用中体现为识别样品如组织和细胞中的核酸的转达子数量以及基因数量等)。
本发明由此还提供了用于分析生物样品的核酸信息的芯片。在本发明的其中一个方面，所述用于分析生物样品的核酸信息的芯片通过前述方法制备得到。在本发明的其中一个方面，所述用于分析生物样品的核酸信息的芯片的表面具有形成阵列的探针，所述探针阵列包括正交的行和列，所述阵列中的探针各具有不同的条形码序列，可用于体现所述探针的空间位置。在本发明的其中一个方面，所述探针包括第一条形码和第二条形码。在本发明的其中又一个方面，所述探针阵列的每一行探针具有相同的第一条形码以及每一列的探针具有相同的第二条形码；每一行探针具有的第一条形码各不相同以及每一列探针具有的第二条形码各不相同。在本发明的其中一个方面，所述用于分析生物样品的核酸信息的芯片在其整个表面具有芯片表面连接子核酸。在本发明的其中又一个方面，所述探针阵列中的每个探针的5’端为所述芯片表面连接子核酸。在本发明的其中又一个方面，所述探针阵列中的每个探针的序列从5’端到3’端包括所述芯片表面连接子核酸、第一条形码、第二条形码、用于识别和结合生物样品中的目标核酸的捕获片段。在本发明的其中又一个方面，所述探针阵列中的每个探针的序列包括5’端的用于扩增反应的引物片段。在本发明的其中又一个方面，所述探针阵列中的每个探针的序列还包括唯一分子标识符(UMI)。
本发明提供的方法制备的芯片可用于对组织样品，特别是组织薄切片进行细胞内含分子的分析，包括对核酸和蛋白的分析，例如通过PCR、质谱法、新一代测序、或ELISA进行分析，获得其表达和空间信息。
本发明还提供了用于分析生物组织样品的空间转录组学信息的方法，所述方法包括将前述所述阵列与组织样品接触。适于本发明的“组织样品”包括从受试者获得，固定，切片并且安装在平面表面的组织。组织样品可以是福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)组织样品或新鲜组织样品或冷冻组织样品等。本发明的方法可以在染色组织样品之前或之后进行。例如，在苏木精和曙红染色之后，组织样品可以按照本文提供的方法进行空间分析。方法可以包括分析样品的组织学(例如使用苏木精和曙红染色)，然后空间分析组织。组织切片用福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)通常包括将从受试者获得的组织在甲醛(例如磷酸盐缓冲盐水中的3％-5％甲醛)或Bouin溶液中固定，包埋到蜡中，切成薄切片，然后安装在平面表面，如显微镜载玻片中的生检。本发明的方法在将组织切片与芯片上的探针阵列接触，阵列上的探针可识别和结合组织中的细胞的核酸，特别是mRNA。后续的分析包括逆转录和扩增等，并且可通过高通量下一代测序(NGS)或合成测序(SBS)进行分析。
“测序”通常是指用于确定一种或多种多核苷酸中的核苷酸碱基序列的方法和技术。多核苷酸可以是例如核酸分子例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，包括其变体或衍生物(例如，单链DNA)。测序可以通过目前可用的各种系统执行，例如但不限于通过Illumina、Pacific Biosciences、Oxford Nanopore或Life Technologies的测序系统。可替代地或另外地，可使用核酸扩增、聚合酶链式反应(PCR)(例如，数字PCR、定量PCR或实时PCR)或等温扩增来执行测序。此类系统可以提供对应于受试者(例如人)的遗传信息的多个原始遗传数据，如从受试者提供的样品由系统所产生。在一些实例中，此类系统提供测序读长(在本文中也称为“读长”)。读长可以包括一串核酸碱基，其对应于已经测序的核酸分子的序列。在一些情况下，本文提供的系统和方法可与蛋白质组信息一起使用。
在一些实施方案中，将组织切片(例如福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)组织切片)中的核酸转移到阵列，并通过与捕捉探针杂交捕捉到阵列上。在一些实施方案中，捕捉探针可以是通用捕捉探针，其例如与核酸测序文库中的衔接子区域，或mRNA的多聚-A尾杂交。在一些实施方案中，捕捉探针可以是基因特异性捕捉探针，其例如与样品中特异性靶定的mRNA或cDNA杂交。
在一些实施方案中，将组织切片(例如FFPE切片)中的核酸转移至阵列，并通过与通用衔接子寡核苷酸的单链连接捕捉到阵列上。在其它实施方案中，可将芯片上的核酸转移到组织切片(例如FFPE切片)中。可通过本领域已知的方法使得结合在芯片上的探针在溶液中脱落后进入与其接触的组织上的细胞。例如，可在核酸探针与芯片的结合处加入可光解的接头等，或者是通过pH敏感型接头将核酸探针与芯片结合，然后通过改变溶液的pH值使得核酸探针与芯片分离。
本发明的芯片和对其的使用，可通过各个阵点具有的探针分子的第一条形码序列和第二条形码序列获知其在芯片表面的阵列中的空间位置，也由此可获得核酸分子所在的细胞在所述组织中的位置信息。
在本发明的其中一个方面，所述方法中还包括将所述组织薄切片进行形态分析和/或组织学分析，该组织学分析是通过H&E染色、IHC染色、ISH染色、以及FISH染色进行。
在本发明的其中一个方面，所述方法中可对组织样品中的一种或多种生物分子进行分析，例如可通过PCR、质谱法、新一代测序、或ELISA进行。
在本发明的其中一个方面，所述方法中组织样品来自动物、农场动物、宠物、人类受试者。
在本发明的其中一个方面，所述方法中该生物分子包括非人细胞、人细胞、非天然蛋白质、核酸、或小分子、染料、病毒、细菌、寄生虫、原生动物或化学物质中的一种或多种。
在本发明的其中一个方面，所述方法中该小分子包括半抗原、肽标签、蛋白质标签、荧光标签、核酸标签、及其组合。
在本发明的其中一个方面，所述方法中该分析包括生成标记物的定量和/或定性数据。
在本发明的其中一个方面，所述方法中该标记物包括DNA、蛋白质、RNA、脂质、细胞器、代谢物、或细胞。
在本发明的其中一个方面，所述方法中该标记物包括基因组多态性，药物基因组学单核苷酸多态性(SNP)，基因组SNP，体细胞多态性，以及蛋白质、脂质和/或细胞器的差异表达。
在本发明的其中一个方面，所述方法中与正常的健康组织或细胞相比，在癌组织或癌细胞中该标记物包括对改变的氨基酸序列进行编码的改变的核苷酸序列、染色体易位、染色体内倒位、拷贝数变化、表达水平变化、蛋白质水平变化、蛋白质活性变化、或甲基化状态变化。
在本发明的其中一个方面，所述方法中通过单细胞测序、单核测序、流式细胞术、免疫组织化学染色、苏木精和伊红染色、全基因组测序、高通量测序、质谱法、DNA微阵列、或其组合对该标记物进行测量。
在本发明的其中一个方面，所述方法中还包括将所述组织薄切片进行形态分析和/或组织学分析，该组织学分析是通过H&E染色、IHC染色、ISH染色、以及FISH染色进行。
在本发明的其中一个方面，所述方法中对该一种或多种生物分子进行分析是通过PCR、质谱法、新一代测序、或ELISA进行。
实施例2芯片的制备
图1为本发明提供的制备生物芯片的方法的一种示例性实施方式的流程示意图。
其中，先以玻璃片为芯片基底，通过表面化学反应用氨基、醛基、环氧基、异硫氰酸基、巯基、硅烷等活性基团等芯片表面进行修饰。
在本实施例中，以商购的光学环氧基修饰的玻璃片(
Figure BDA0004016293300000181
Slide E)为芯片基底。
合成1条5’端氨基修饰的具有以下序列的通用芯片表面连接子核酸，其中带下划线的T碱基为FITC修饰：
Figure BDA0004016293300000182
合成100条5’端磷酸化修饰的具有以下序列的第一组条形码核酸：
Figure BDA0004016293300000191
其中，“12345678”表示具有8个核苷酸的条形码片段，其中所述8个核苷酸的序列是已知(指定的)。所述100条第一组条形码核酸的所述条形码片段(称为第一条形码)的序列各不相同，且各条第一组条形码核酸的第一条形码的序列是已知(指定的)。其中带下划线的T碱基为FITC修饰。在本实施例中，采用对条形码片段进行荧光修饰和检测产生的荧光信号来对芯片合成中每个加入条形码片段的步骤进行观察或生产质控。在其它实施方式中，可以不对条形码片段进行荧光修饰。
合成100条具有以下序列的第二组条形码核酸：
Figure BDA0004016293300000192
其中，“87654321”表示具有8个核苷酸的条形码片段，其中所述8个核苷酸的序列是已知(指定的)，所述100条第二组条形码核酸的条形码片段(称为第二条形码)的序列各不相同，且各条第二组条形码核酸的第二条形码的序列是已知(指定的)。其中带下划线的T碱基为Cy3修饰。
合成1条具有以下序列的第一连接子核酸：
5’-AGGGAAAGAGAGATCGGAAG-3’
合成1条具有以下序列的第二连接子核酸：
5’-GCAATCACTCGAAGAGCGT-3’
将细胞培养腔室与玻片贴合，使用框架将腔室与玻片压合以提高密封性。使用移液器向腔室内加入10-20uM的通用芯片表面连接子核酸(溶解于300mM磷酸钠缓冲液pH8.5中)，铺满腔室底面后，将玻片置于恒温混匀仪，40℃，800rpm振荡混匀反应3小时。反应结束后，修饰的玻片依次使用0.1％Triton X-100、1mM HCl、100mM KCl清洗，然后使用0.1MTris pH 9.0、50mM乙醇胺、0.1％的SDS于50℃进行封闭。封闭结束后使用去离子水冲洗基片1分钟，然后用氮气吹干基片。采用荧光显微镜观察通用核酸的FITC荧光信号，确定反应完成和表面修饰效果。
通过软光刻工艺制备由聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成如图2所示的包括多条平行设置的微流道的装置，微流道的底部开口。
微流道的装置包括约50-500条平行设置的微流道。所述平行设置的微流道的各条微流道的宽度为约2-200μm，优选为约5-50μm，最优选为约5-25μm，例如为约5μm，10μm或50μm。各条相邻微流道之间的间距为约5-400μm，优选为约10-100μm，最优选为约10-50μm，例如为约20μm，50μm或100μm。
将所述PDMS微流道装置与玻片贴合，实现流道封闭。用夹持工具对流道顶部与基底玻片进行压合以提高密封性。微流道的一端为溶液入口，另一端通过接口与真空抽吸装置相连接。
将微流道装置与玻片贴合后，在流道内通入缓冲液排出流道内的气体。然后在流道内加入10-20uM的第一组条形码核酸：在每一个流道通入一种第一条形码核酸(每个流道的第一条形码核酸具有与其它流道的第一条形码核酸不同的条形码序列)和第一连接子核酸以及T4连接酶。充满流道后37℃静置反应30分钟。反应结束后使用去离子水冲洗基片1分钟，然后用氮气吹干基片。采用荧光显微镜观察第一条形码核酸的FITC荧光信号，确定反应完成和实现第一组条形码核酸与通用芯片表面连接子核酸在流道覆盖处的芯片的连接反应，形成第一组条形码带。
将另一个PDMS微流道装置与玻片沿与第一个PDMS微流道装置的流道形成正交的方向进行贴合。流道内通入缓冲液排出流道内的气体之后，通入10-20uM的第二组条形码核酸：在每一个流道通入一种第二条形码核酸(每个流道的第二条形码核酸具有与其它流道的第二条形码核酸不同的条形码序列)和第二连接子核酸以及T4连接酶。充满流道后37℃静置反应30分钟。
完成连接反应之后，通入1×PBS缓冲液，超纯水对流道进行清洗。之后取下流道，用去离子水冲洗基片1分钟，然后用氮气吹干基片。采用荧光显微镜观察第二条形码核酸的Cy3荧光信号，确定反应完成和实现第二条形码核酸与第一组条形码核酸在流道交叉点的连接反应，形成条形码阵列，由此完成芯片制备。
制备得到的芯片真空封装，室温或4℃冰箱避光保存。通过对制备得到的芯片上荧光信号的观测来评估各条形码核酸连接反应的效率以及制备得到的芯片的探针的强度(密度)和均匀性。
图3示例性显示在得到的芯片上对由第二组条形码核酸的携带的Cy3修饰的荧光信号进行检测的图。通过荧光显微镜(奥林巴斯IX53)和CCD相机(奥林巴斯DP74)进行拍照和测量。
图4A和图4B显示根据实施例2所述方法分别以宽度为50μm，25μm和10μm的微流道制备得到的芯片(即芯片上探针点阵尺寸分别为50μm x50μm，25μm x 25μm和10μm x 10μm)的探针的检测的结果。对通过荧光显微镜(奥林巴斯IX53)和CCD相机(奥林巴斯DP74)进行拍照和测量得到的图像进行分析，通过ImageJ提取荧光强度值及边界，计算点阵强度均一性及点阵实际宽度。
图4A和图4B分别显示对点阵的尺寸和荧光强度的测量结果。图4A结果显示通过本发明制备得到的芯片上的每个探针点阵的尺寸均一性偏差分别小于0.6％(50μm),1.2％(25μm)和1.3％(10μm)。图4B结果显示探针修饰的均一性偏差分别小于5.5％(50μm),3.4％(25μm)和3.9％(10μm)。可见，本发明制备得到的芯片具有极高的点阵尺寸均一性，以及每个点阵上修饰探针的均一性。
实施例3组织样品制备和染色
(一)组织OCT包埋
取新鲜小鼠脑组织样本，迅速用预冷的PBS溶液或者生理盐水冲洗组织表面残留，然后用干净的吸水纸吸干液体。将组织置于包埋槽，添加OCT包埋剂至完全覆盖组织。确认组织周围没有气泡，将包埋槽置于干冰上，直至OCT完全冻结。
(二)冷冻切片
冷冻切片机温度设定为箱体温度：-20℃，样本头温度：-10℃。切片之前将冷冻组织和基片先放入-20℃冷冻切片机箱体中平衡30分钟以上，然后在冷冻切片机箱体中进行冷冻切片，厚度为10μm。
(三)组织固定、HE染色
将切好的组织切片贴附于实施例2制备得到的条形码阵列修饰的基片上，然后置于37℃孵育1分钟。将贴附组织的基片完全浸入预冷的甲醇中，-20℃固定30分钟。固定结束后，取出基片，擦干背面液体，在组织切片上滴加500μl异丙醇，室温孵育1分钟。1分钟后，除去异丙醇，然后室温晾干5-10分钟。
加入1ml苏木精，均匀覆盖基片上的组织切片，室温孵育7分钟。去除苏木精试剂，将基片浸入RNase-free Water中清洗，晾干。加入1ml返蓝液，室温孵育2分钟。去除返蓝液，将基片浸入RNase-free Water清洗后，擦干基片背面液体。加入1ml伊红混合物，室温孵育1分钟。
去除伊红，将基片浸入RNase-free Water清洗，晾干直至组织不透明。在37℃下孵育玻片5分钟后，进行明场成像。
图5为小鼠脑组织切片的HE染色图。
(四)组织透化
将夹具腔室组装至制备得到的组织芯片上，确保每一张组织切片位于对应的腔室内部。向腔室中加入70ul透化酶(0.1N HCl稀释的0.1％胃蛋白酶)37℃透化组织，移除透化酶后用0.1×SSC清洗。
(五)芯片质检
对实施例2制备的芯片，分别在存储6个月和12个月后从-20℃冰箱中取出，对其加入前述步骤(三)组织固定、HE染色和(四)组织透化的反应溶液，在所述反应条件处理后，按实施例2记载的方法检测芯片的探针的强度(密度)和均匀性。
实施例4组织样品切片通过芯片进行逆转录反应
向实施例3中清洗后的腔室中加入70μl反转录混合液。其中，反转录混合液包括：1x第一链缓冲液,5mM DTT,500μM dNTP,0.19μg/μl BSA,1％ DMSO,2.5μM TemplateSwitch Oligo，20U/μl SuperscriptⅢ以及2U/μl RNase inhibitor。
其中Template Switch Oligo序列为：
5’Biotin-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrGrG-3’
Template Switch Oligo中，倒数第1、2、3位碱基进行核糖鸟嘌呤核苷修饰。
使用胶带将腔室密封之后，置于温控板上，调控至约50℃进行反转录，反应16小时。
反转录结束后，吸弃腔室中的反转录混合液。向腔室中加入70μl 0.08M KOH，室温孵育5分钟，然后加入100ul RNase-free Water清洗一次。
向清洗后的腔室中加入cDNA二链合成反应液。其中二链合成反应液包括：1x第一链缓冲液，10U Klenow Exo-，2.5μM Second Strand Primer。使用胶带将腔室密封之后，置于温控板上，调控至约37℃进行cDNA二链合成，反应1小时。
其中Second Strand Primer序列为：
5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACAT-3’
反应结束后，吸弃腔室内二链合成反应液，然后加入100ul RNase-free Water清洗一次。接着向腔室中加入35μl 0.08M KOH，室温孵育10分钟。准备几个新的1.5ml离心管，向其中加入10μl Tris(1M,pH 7.0)。将腔室中的35μl样品转移至相应的含有Tris的离心管内，混匀，即完成cDNA的二链制备。
cDNA扩增
取新的1.5ml离心管置于冰上，配制PCR扩增反应液。其中PCR反应液包括：1×KapaHiFi Hotstart ReadyMix，0.8μM cDNA Forward Primer，0.8μM cDNA Reverse Primer，35μl cDNA template，总体积100μl。通过以下方案进行cDNA扩增：
Figure BDA0004016293300000231
其中cDNA Forward Primer序列为：
5’-CTACACGACGCTCTTCCGATC-3’
cDNA ReversePrimer序列为：
5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG-3’
扩增结束后，使用0.6×AMpure XP Beads纯化扩增产物。纯化产物用于进行建库、测序。
实施例5建库和测序
片段化、末端修复、加A
取新的PCR管置于冰上，配制片段化反应液。其中片段化反应液包括：5μl FEABuffer V2，10μl上一步纯化的DNA，25μl ddH2O，10μl FEA Enzyme Mix V2，总体积50μl。使用移液器吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。将PCR管置于PCR仪中，运行如下程序：
Figure BDA0004016293300000241
由此实现对DNA进行片段化的同时将片段化DNA末端补平，并在5'端进行磷酸化和3'端加dA尾。
接头连接
取新的PCR管置于冰上，配制接头连接反应液。其中接头连接反应液包括：25μlRapid Ligation Buffer V2，50μl上一步纯化的片段化的DNA，15μl ddH2O，5μl Rapid DNALigase V2，5μl接头(10pM)，总体积100μl。使用移液器吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。将PCR管置于PCR仪中，运行如下程序：
热盖105℃ On
20℃ 15min
4℃ Hold
其中接头序列为：
5’磷酸化-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCA*C-3’
5’-GCTCTTCCGATC*T-3’
接头序列中，倒数第1位碱基进行硫代修饰。
连接反应结束后，使用0.6×XP SPRIselect Beads纯化连接产物。
文库扩增
取新的PCR管置于冰上，配制文库扩增反应液。其中文库扩增反应液包括：25μlVAHTS HiFi Amplification Mix，20μl上一步纯化的连接了接头的DNA，5μl Index PCRPrimer Mix(10pM each)，总体积50μl。使用移液器吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。将PCR管置于PCR仪中，运行如下程序：
Figure BDA0004016293300000251
其中Index PCR Primer序列为：
i5 index primer：5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-【i5 index】
-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTC-3’
i7 index primer：
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-【i7 index】
-GTGACTGGAGTTCAGACGTGT-3’
扩增反应结束后，使用0.9×AMpure XP Beads纯化扩增产物。
文库质检
构建好的文库分别使用Qubit和Agilent Bioanalyzer High Sensitivity chip进行浓度检测和长度分布检测。如图6所示，Qubit测得的文库浓度不低于20ng/μl。长度分布检测：取1μl文库样品，按仪器及试剂盒说明书操作，进行片段分布检测，测得的文库片段应分布在200-600bp之间。
测序
使用illumina NovaSeq 6000对文库进行PE150测序。
数据处理和分析
a)利用umitools(version:1.1.2)等数据处理软件提取Read1中UMI和Barcode。
b)利用STAR(version:2.5.3a)等数据处理软件将read2比对到小鼠参考基因组Mouse reference,mm10(GENCODE vM23/Ensembl 98)
featureCounts(Version 2.0.3)assign gene。
c)利用umitools(version:1.1.2)等数据处理软件生成表达矩阵。
d)用的Adobe illustrator将Barcode分析与HE图片比较。
对小鼠嗅球的转录组分析结果如图7所示。图7A显示通过本发明提供的生物芯片对小鼠脑组织进行空间组分析可检测的基因数量图。图7B为通过本发明提供的生物芯片对小鼠脑组织进行空间组分析可检测的UMI数量图。图7C为通过本发明提供的生物芯片对小鼠脑组织进行空间组分析实际检测基因数与捕获转录本(UMI)数量分布图。
对所得数据做无监督聚类分析，结果如图8所示。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.制备具有阵列的生物芯片的方法，包括以下步骤：
步骤1.提供一种芯片；
步骤2.将芯片表面连接子核酸固定在芯片表面；优选的，所述芯片表面连接子核酸以化学键连接方式固定在芯片表面上，所述化学键连接方式例如为选自氨基-醛基反应的基团连接、共价交联中的任意一种；
步骤3.通过多条平行设置的微流道将第一组条形码核酸施加到芯片表面，在使得所述芯片表面连接子核酸和第一条形码核酸发生连接反应的条件下，形成第一方向的多条第一条形码带，所述第一组条形码核酸中包括多种具有不同条形码序列的第一条形码核酸，每条第一条形码带上固定一种第一条形码核酸，且每条第一条形码带上固定的第一条形码核酸具有不同的条形码序列；
步骤4.通过多条平行设置的微流道将第二组条形码核酸沿第二方向施加到芯片表面，形成多条第二条形码带，所述第二组条形码核酸中包括多种具有不同条形码序列的第二条形码核酸，每条第二条形码带上具有一种第二条形码核酸，且每条第二条形码带上固定的第二条形码核酸具有不同的条形码序列；
步骤5.在使得第一条形码核酸和第二条形码核酸发生连接反应的条件下，在所述多条第一条形码带与所述多条第二条形码带产生交叉的芯片表面的位置将第二条形码核酸与第一条形码核酸连接，形成探针，所述探针的位置构成阵列的阵点，每个阵点具有一种位置特异性条形码序列的探针。
2.权利要求1的方法，其中采用具有多条平行设置的微流道的微流道装置将所述第一组条形码核酸或第二组条形码核酸输送和固定在芯片表面，其中所述微流道与芯片表面接触的一面可容溶液或溶液中的核酸通过。
3.权利要求2的方法，其中在所述微流道设备的每一条微流道中加入一种具有不同条形码序列的第一组条形码核酸或第二组条形码核酸，优选的，其中所述第一组条形码核酸中的每一种第一条形码核酸的条形码片段的序列和所述第二组条形码核酸中的每一种第二条形码核酸的条形码片段的序列是指定的。
4.权利要求1的方法，其中所述第二组条形码核酸中的第二条形码核酸包括3’端的用于识别和结合生物样品中的目标核酸的探针片段(例如为识别和结合mRNA或cDNA的片段，例如为poly-T序列)和第二条形码片段，任选的，其中所述第二组条形码核酸中的第二条形码核酸还具有唯一分子标识符(UMI)。
5.权利要求1的方法，其中所述芯片表面连接子核酸的3’端具有用于通过第一单链连接核酸与第一条形码核酸连接的连接片段，所述第一条形码核酸的5’端具有用于通过所述第一单链连接核酸与所述芯片表面连接子核酸连接的连接片段，所述芯片表面连接子核酸的3’端的连接片段和所述第一条形码核酸的5’端的连接片段分别与所述第一单链连接核酸的两端的序列反向互补。
6.权利要求1的方法，其中所述第一条形码核酸的3’端具有用于通过第二单链连接核酸与第二条形码核酸连接的第一连接片段，所述第二条形码核酸的5’端具有用于通过所述第二单链连接核酸与第一条形码核酸连接的第二连接片段，所述第一连接片段和第二连接片段分别与所述第二单链连接核酸的两端的序列反向互补。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中制备得到的芯片的阵点具有的探针的均一性偏差小于20％，优选小于10％，更优选小于6％；和/或
其中制备得到的芯片的阵点的尺寸均一性偏差小于10％，优选小于5％，更优选小于2％。
8.一种用于分析生物样品的核酸信息的芯片，其中所述芯片的表面具有形成阵列的探针，所述探针阵列包括正交的行和列，所述阵列中每个阵点的探针各具有不同的条形码序列，其中所述探针包括第一条形码和第二条形码，所述探针阵列的每一行探针具有相同的第一条形码以及每一列的探针具有相同的第二条形码；每一行探针具有的第一条形码各不相同以及每一列探针具有的第二条形码各不相同，优选的，所述用于分析生物样品的核酸信息的芯片在其整个表面具有芯片表面连接子核酸，
例如，所述芯片通过如权利要求1-7中任一项所述的方法制备。
9.权利要求8所述的具有阵列的芯片用于分析生物组织样品的空间转录组学信息的方法，所述方法包括将所述芯片的阵列与组织样品接触，阵列上的探针识别和结合组织中的细胞的核酸，特别是mRNA，
其中还包括将组织中的核酸从细胞中释放出来与所述芯片上的探针接触的步骤，优选的，当所述组织为经固定和包埋的组织时，通过对所述组织进行透化将核酸从细胞中释放；
任选的，其中还包括进行反转录反应；
任选的，其中还包括：
扩增所述cDNA分子；
任选的，其中还包括对扩增得到的核酸进行建库/测序。
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