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CN116121172A - 一种猪胰腺单细胞悬液制备方法及应用 - Google Patents

一种猪胰腺单细胞悬液制备方法及应用 Download PDF

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CN116121172A
CN116121172A CN202310242897.8A CN202310242897A CN116121172A CN 116121172 A CN116121172 A CN 116121172A CN 202310242897 A CN202310242897 A CN 202310242897A CN 116121172 A CN116121172 A CN 116121172A
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李新平
李泽卿
郑婷婷
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Abstract

本发明提出了一种猪胰腺单细胞悬液制备方法及应用，其中猪胰腺单细胞悬液制备方法包括如下步骤：S1，取猪胰腺组织，去除表面脂肪，并将组织剪碎；S2，清洗组织碎块，然后将组织放入混合酶解离液中进行第一次消化；S3，第一次消化结束后取上清液，管内剩余组织继续加入混合酶解离液进行第二次消化；S4，第二次消化结束后取上清液，并与步骤S3的上清液合并，过滤；S5，过滤后的解离液离心，弃上清液，重悬细胞沉淀，得到细胞悬液；所述混合酶解离液包括胰蛋白酶、胶原酶Ⅰ、弹性蛋白酶、脂肪酶、DNaseI、肝素、硫酸钠和DHanks缓冲液。本发明酶混合液具有去除细胞间质，减少细胞聚团，保护细胞膜形态，减少细胞破损的作用。

Description

一种猪胰腺单细胞悬液制备方法及应用
技术领域
本发明涉及细胞生物技术领域，尤其涉及一种猪胰腺单细胞悬液制备方法及应用。
背景技术
单细胞测序是指获取单个细胞遗传信息的测序技术，即在单个细胞水平上，对基因组或转录组进行提取扩增和高通量测序分析。该技术能够揭示单个细胞独有的基因结构和基因表达状态，包括结构变异、拷贝数变异、RNA表达水平等数据，使不同细胞类型得以精确区分，并有助于科学家在但细胞水平进行分子机制的研究。
对于单细胞转录测序的结果来说，影响最大的就是样本的制备。专利号为CN103436487A的发明专利公开了胰蛋白酶可以酶解溪蟹细胞，专利号为CN114591883A的发明专利公开了胶原酶、透明质酸酶和DNA酶可以酶解主动脉细胞。猪胰腺含有大量的脂肪和纤维成分，导致上述酶在酶解猪胰腺细胞时，细胞容易成团。
发明内容
有鉴于此，本发明提出了一种猪胰腺单细胞悬液制备方法及应用，酶解猪胰腺时，细胞结团率低且单细胞悬液的活率高。
本发明的技术方案是这样实现的：第一方面，本发明提供了一种猪胰腺单细胞悬液制备方法，包括如下步骤：
S1，取猪胰腺组织，去除表面脂肪，并将组织剪碎；
S2，清洗组织碎块，然后将组织放入混合酶解离液中进行第一次消化；
S3，第一次消化结束后取上清液，管内剩余组织继续加入混合酶解离液进行第二次消化；
S4，第二次消化结束后取上清液，并与步骤S3的上清液合并，过筛；
S5，过筛后的解离液离心，弃上清液，细胞沉淀经过两次清洗和离心后，DPBS溶液重悬细胞沉淀，得到细胞悬液；
所述混合酶解离液包括胰蛋白酶、胶原酶Ⅰ、弹性蛋白酶、脂肪酶、DNaseI、肝素、硫酸钠和DHanks缓冲液。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述混合酶解离液包括胰蛋白酶1-5mg/mL、胶原酶Ⅰ0.5-3mg/mL、弹性蛋白酶1-4mg/mL、脂肪酶2-5mg/mL、DNaseI 8-12mg/mL、肝素2-6U/mL和硫酸钠3-6g/L，溶剂为D-hanks缓冲液。
在以上技术方案的基础上，优选的，于冰上将组织剪碎，期间加入含有0.02％-0.05％质量分数BSA的DPBS缓冲液，剪成肉泥状，时间控制在5min以内。
在以上技术方案的基础上，优选的，步骤S2中，采用含有0.02％-0.05％质量分数BSA的DPBS缓冲液清洗组织碎块。
在以上技术方案的基础上，优选的，步骤S2和S3中第一次消化和第二次消化的条件是：在35-37℃下30-60rpm的摇床上消化10-15min。
在以上技术方案的基础上，优选的，步骤S5中，清洗液为0.02％-0.05％质量分数BSA的DPBS缓冲液。
在以上技术方案的基础上，优选的，步骤S5中，离心方法为：4-5℃，200-300rpm条件下离心3-5min。
第二方面，本发明提供了由上述制备方法制备得到的猪胰腺单细胞悬液。
第三方面，本发明提供了猪胰腺单细胞悬液在单细胞转录组测序中的应用。
本发明的一种猪胰腺单细胞悬液制备方法及应用相对于现有技术具有以下
有益效果：
(1)本发明酶混合液中的胰酶、胶原蛋白酶、弹性蛋白酶和脂肪酶可以去除细胞间质；DNase I可以从破裂的细胞中分离DNA，分解这些多余的碎片有助于减少DNA之间的缠绕，即减少细胞聚团；肝素可保护细胞膜形态，减少细胞破损，硫酸钠可以防止细胞成团，促使细胞游离。
(2)本发明结合两步法消化的方法，同时添加牛血清白蛋白，可以起维持渗透压作用、pH缓冲作用、载体作用和营养作用，控制好时间、离心机转速、温度等可控因素，即会达到消化细胞间质的同时保护细胞膜完整性，解离后的猪胰腺细胞活率80％以上，且无成团现象，背景干净，不会堵塞芯片。细胞总量达到10万个以上，满足单细胞转录组测序要求的细胞量。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1的胰腺细胞悬液AO/PI染色图；
图2本发明实施例1的胰腺细胞团簇结果图；
图3为本发明对比例1的胰腺细胞悬液AO/PI染色图；
图4本发明对比例1的胰腺细胞团簇结果图；
图5为本发明实施例1胰腺细胞cDNA片段质检图；
图6为本发明实施例1胰腺细胞文库片段质检图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例的猪胰腺单细胞悬液制备方法包括如下步骤：
S1，取1cm×1cm大小的新鲜猪胰腺组织，尽可能去掉表面脂肪。
S2，配制混合酶解离液：
包括胰蛋白酶1mg/mL、胶原酶Ⅰ0.5mg/mL、弹性蛋白酶1mg/mL、脂肪酶2mg/mL、DNaseI 8mg/mL、肝素2U/mL和硫酸钠3g/L，DHanks定容至100mL。
配制完成后，充分溶解混匀，用0.22μL滤膜过滤除菌，置于37℃预热待用。
S3，于冰上将组织剪碎，期间加入1xDPBS+0.02％BSA，剪成肉泥状，时间控制在5min以内。
S4，用1xDPBS+0.02％BSA清洗2次后，将组织装入37℃预热好的混合酶解离液中，混合酶解离液的用量为组织的5倍，在35℃下30rpm的恒温摇床上第一次消化10min。
S5，第一次消化结束后，将上清液取出，加入10％预冷的FBS终止胰酶反应，置于冰上待用，管内剩余的组织继续加入37℃预热好的混合酶解离液；在35℃下30rpm的恒温摇床上第二次消化10min。
S6，第二次消化结束后取上清液，加入10％预冷的FBS终止胰酶反应，与步骤5的上清液合并，过40μm细胞筛。
S7，将过滤后的解离液分装至1.5mL离心管中，于冷冻离心机中离心，4℃，200rpm条件下离心3min。
S8，去掉上清液，保留底部的细胞沉淀，加入500μL 1xDPBS+0.02％BSA混合液，用扩口枪头轻轻吹打混匀，在4℃，200rpm条件下离心3min。
S9，重复步骤S8一次。
S10，离心后去掉上清液，加入100μL DPBS重悬细胞沉淀，即得到细胞悬液。
实施例2
本实施例的猪胰腺单细胞悬液制备方法包括如下步骤：
S1，取1cm×1cm大小的新鲜猪胰腺组织，尽可能去掉表面脂肪。
S2，配制混合酶解离液：
包括胰蛋白酶2mg/mL、胶原酶Ⅰ1mg/mL、弹性蛋白酶2mg/mL、脂肪酶3mg/mL、DNaseI9mg/mL、肝素3U/mL和硫酸钠4g/L，DHanks定容至100mL。
配制完成后，充分溶解混匀，用0.22μL滤膜过滤除菌，置于37℃预热待用。
S3，于冰上将组织剪碎，期间加入1xDPBS+0.03％BSA混合液，剪成肉泥状，时间控制在5min以内。
S4，用1xDPBS+0.03％BSA混合液清洗2次后，将组织装入37℃预热好的混合酶解离液中，混合酶解离液的用量为组织的5倍，在36℃下40rpm的恒温摇床上第一次消化12min
S5，第一次消化结束后，将上清液取出，加入10％预冷的FBS终止胰酶反应，置于冰上待用，管内剩余的组织继续加入37℃预热好的混合酶解离液；在36℃下40rpm的恒温摇床上第二次消化12min。
S6，第二次消化结束后取上清液，加入10％预冷的FBS终止胰酶反应，与步骤5的上清液合并，过40μm细胞筛。
S7，将过滤后的解离液分装至1.5mL离心管中，于冷冻离心机中离心，4.5℃，250rpm条件下离心4min。
S8，去掉上清液，保留底部的细胞沉淀，加入500μL 1xDPBS+0.03％BSA混合液，用扩口枪头轻轻吹打混匀，5℃，250rpm条件下离心4min。
S9，重复步骤S8一次。
S10，离心后去掉上清液，加入100μL DPBS重悬细胞沉淀，即得到细胞悬液。
实施例3
本实施例的猪胰腺单细胞悬液制备方法包括如下步骤：
S1，取1cm×1cm大小的新鲜猪胰腺组织，尽可能去掉表面脂肪。
S2，配制混合酶解离液：
包括胰蛋白酶4mg/mL、胶原酶Ⅰ2mg/mL、弹性蛋白酶3mg/mL、脂肪酶4mg/mL、DNaseI10mg/mL、肝素5U/mL和硫酸钠5g/L，DHanks定容至100mL。
配制完成后，充分溶解混匀，用0.22μL滤膜过滤除菌，置于37℃预热待用。
S3，于冰上将组织剪碎，期间加入1xDPBS+0.04％BSA混合液，剪成肉泥状，时间控制在5min以内。
S4，用1xDPBS+0.04％BSA混合液清洗2次后，将组织装入37℃预热好的混合酶解离液中，混合酶解离液的用量为组织的5倍，在37℃下50rpm的恒温摇床上第一次消化14min
S5，第一次消化结束后，将上清液取出，加入10％预冷的FBS终止胰酶反应，置于冰上待用，管内剩余的组织继续加入37℃预热好的混合酶解离液；在36℃下50rpm的恒温摇床上第二次消化14min。
S6，第二次消化结束后取上清液，加入10％预冷的FBS终止胰酶反应，与步骤5的上清液合并，过40μm细胞筛。
S7，将过滤后的解离液分装至1.5mL离心管中，于冷冻离心机中离心，5℃，300rpm条件下离心5min。
S8，去掉上清液，保留底部的细胞沉淀，加入500μL 1xDPBS+0.04％BSA混合液，用扩口枪头轻轻吹打混匀，5℃，300rpm条件下离心5min。
S9，重复步骤S8一次。
S10，离心后去掉上清液，加入100μL DPBS重悬细胞沉淀，即得到细胞悬液。
实施例4
本实施例的猪胰腺单细胞悬液制备方法包括如下步骤：
S1，取1cm×1cm大小的新鲜猪胰腺组织，尽可能去掉表面脂肪。
S2，配制混合酶解离液：
包括胰蛋白酶5mg/mL、胶原酶Ⅰ3mg/mL、弹性蛋白酶4mg/mL、脂肪酶5mg/mL、DNaseI12mg/mL、肝素6U/mL和硫酸钠6g/L，DHanks定容至100mL。
配制完成后，充分溶解混匀，用0.22μL滤膜过滤除菌，置于37℃预热待用。
S3，于冰上将组织剪碎，期间加入1xDPBS+0.05％BSA混合液，剪成肉泥状，时间控制在5min以内。
S4，用1xDPBS+0.05％BSA混合液清洗2次后，将组织装入37℃预热好的混合酶解离液中，混合酶解离液的用量为组织的5倍，在37℃下60rpm的恒温摇床上第一次消化15min。
S5，第一次消化结束后，将上清液取出，加入10％预冷的FBS终止胰酶反应，置于冰上待用，管内剩余的组织继续加入37℃预热好的混合酶解离液；在37℃下60rpm的恒温摇床上第二次消化15min。
S6，第二次消化结束后取上清液，加入10％预冷的FBS终止胰酶反应，与步骤5的上清液合并，过40μm细胞筛。
S7，将过滤后的解离液分装至1.5mL离心管中，于冷冻离心机中离心，5℃，300rpm条件下离心5min。
S8，去掉上清液，保留底部的细胞沉淀，加入500μL 1xDPBS+0.05％BSA混合液，用扩口枪头轻轻吹打混匀，5℃，300rpm条件下离心5min。
S9，重复步骤S8一次。
S10，离心后去掉上清液，加入100μL DPBS重悬细胞沉淀，即得到细胞悬液。
对比例1
对比例1与实施例1的区别是混合酶解离液中不含肝素和硫酸钠。
对比例2
对比例2与实施例1的区别是混合酶解离液中不含弹性蛋白酶和脂肪酶。
对比例3
对比例3与实施例1的区别是混合酶解离液中不含肝素、硫酸钠、弹性蛋白酶和脂肪酶。
对比例4
对比例4与实施例1的区别是步骤S3、S4、S8清洗液中不含BSA，仅有DPBS缓冲液。
对比例5
对比例5与实施例1的区别是第一次消化时间4h。
对比例6
对比例6与实施例1的区别是步骤S7-S9离心方法为37℃，1000rpm条件下离心10min。
按照实施例和对比例制备猪胰腺单细胞悬液，并用AO/PI荧光染色计数，Bodboge细胞计数仪上计数，结果见表1。
表1猪胰腺单细胞悬液对比
Figure BDA0004124903030000091
Figure BDA0004124903030000101
表1可知，实施例1-4的单细胞悬液总细胞浓度、活细胞率和结团率均优于对比例1-6，其中实施例4最优。
对比例1-3可知，缺少肝素、硫酸钠、弹性蛋白酶和脂肪酶，均会降低活细胞比率，增加结团率，由此证明了胰酶、胶原蛋白酶、弹性蛋白酶和脂肪酶去除细胞间质；肝素保护细胞膜形态，减少细胞破损；硫酸钠防止细胞成团，促使细胞游离的技术效果。
对比例4-6可知，BSA、消化时间和离心方法均会影响总细胞浓度、活细胞率和结团率。
将实施例1制备得到的猪胰腺细胞悬浮液用于10x Genomics 3’单细胞转录组测序，方法如下：
1文库构建：
1.1按照细胞捕获量为10000上机，将制备好的细胞悬液、10X barcode凝胶磁珠和油滴分别加入到Chip G的不同小室，经由微流体“双十字”交叉系统生成GEM。
1.2将生成的GEMs转移，温育，带有PloyA的RNA被反转录为带有10X Barcode和UMI信息的cDNA一链，再以SMART方式合成cDNA二链。
1.3油滴破碎，磁珠纯化cDNA，扩增cDNA。
1.4将扩增后的cDNA进行定量以及Q-SEP1质控，cDNA片段质检图见图5。
1.5构建3’基因表达文库。
1.6将构建好的文库进行定量以及Q-SEP1质控。
1.7Illumina平台测序。
2文库质检
2.1Q-bit定量
文库浓度为8.18ng/μL，体积为40μL。
2.2文库质检
文库质检图见图6。
图5和图6可知，实施例制备的猪胰腺细胞悬浮液细胞总数多，结团率低，不会堵塞芯片，可以用于10x Genomics 3’单细胞转录组测序。对比例1-3由于结团率高，堵塞芯片，不适用于10x Genomics 3’单细胞转录组测序。
以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种猪胰腺单细胞悬液制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1，取猪胰腺组织，去除表面脂肪，并将组织剪碎；
S2，清洗组织碎块，然后将组织放入混合酶解离液中进行第一次消化；
S3，第一次消化结束后取上清液，管内剩余组织继续加入混合酶解离液进行第二次消化；
S4，第二次消化结束后取上清液，并与步骤S3的上清液合并，过筛；
S5，过筛后的解离液离心，弃上清液，细胞沉淀经过两次清洗和离心后，DPBS溶液重悬细胞沉淀，得到细胞悬液；
所述混合酶解离液包括胰蛋白酶、胶原酶Ⅰ、弹性蛋白酶、脂肪酶、DNaseI、肝素、硫酸钠和DHanks缓冲液。
2.如权利要求1所述的一种猪胰腺单细胞悬液制备方法，其特征在于：所述混合酶解离液包括胰蛋白酶1-5mg/mL、胶原酶Ⅰ0.5-3mg/mL、弹性蛋白酶1-4mg/mL、脂肪酶2-5mg/mL、DNaseI8-12mg/mL、肝素2-6U/mL和硫酸钠3-6g/L，溶剂为D-hanks缓冲液。
3.如权利要求1所述的一种猪胰腺单细胞悬液制备方法，其特征在于：于冰上将组织剪碎，期间加入含有0.02％-0.05％质量分数BSA的DPBS缓冲液，剪成肉泥状，时间控制在5min以内。
4.如权利要求1所述的一种猪胰腺单细胞悬液制备方法，其特征在于：步骤S2中，采用含有0.02％-0.05％质量分数BSA的DPBS缓冲液清洗组织碎块。
5.如权利要求1所述的一种猪胰腺单细胞悬液制备方法，其特征在于：步骤S2和S3中第一次消化和第二次消化的条件是：在35-37℃下30-60rpm的摇床上消化10-15min。
6.如权利要求1所述的一种猪胰腺单细胞悬液制备方法，其特征在于：步骤S5中，清洗液为0.02％-0.05％质量分数BSA的DPBS缓冲液。
7.如权利要求6所述的一种猪胰腺单细胞悬液制备方法，其特征在于：步骤S5中，离心方法为：4-5℃，200-300rpm条件下离心3-5min。
8.权利要求1-7任一项所述的制备方法制备得到的猪胰腺单细胞悬液。
9.如权利要求8所述的猪胰腺单细胞悬液在单细胞转录组测序中的应用。
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