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CN117384825B - 一种人动脉组织单细胞悬液制备用酶解液、试剂盒、方法及其应用 - Google Patents

一种人动脉组织单细胞悬液制备用酶解液、试剂盒、方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种人动脉组织单细胞悬液制备用酶解液、试剂盒、方法及其应用，所述酶解液，包括第一酶解液、第二酶解液，其中，第一酶解液包括80‑120U/ml透明质酸酶和30‑80U/ml链霉蛋白酶；第二酶解液包括1‑3mg/ml胶原酶II、0.3‑0.8mg/ml分散酶和0.05‑0.1mg/ml弹性蛋白酶；以及利用酶解液制备的试剂盒以及酶解方法，酶解液中包含的胶原酶均为常用的解离酶，获得方便，酶解液配比适用于人动脉组织的单细胞解离，试剂组分相容性较好，无有害成分，安全环保；使用本发明提供的解离方案可以获得高质量的单细胞悬液，可以大幅提升单细胞测序在动脉组织中应用的可行性。

Description

一种人动脉组织单细胞悬液制备用酶解液、试剂盒、方法及其 应用
技术领域
本发明属于单细胞技术领域，具体涉及一种人动脉组织单细胞悬液制备用酶解液、试剂盒、方法及其应用。
背景技术
单细胞转录组测序技术是在单细胞水平对转录组进行扩增与测序的一项新技术。其原理是将分离的单个细胞的微量全转录组RNA进行扩增后进行高通量测序，是研究复杂组织中细胞类型、动态和功能过程的工具。这项技术已广泛应用于动物和植物不同类型组织的研究中，通过对单个细胞的基因表达情况进行测序，可以更好地研究不同类型组织的细胞分化和发育。在癌症生物学、免疫学和临床诊疗等研究领域已有较多成功应用案例，利用单细胞转录组测序技术筛选癌症细胞或特定的免疫细胞，对比分析其与正常细胞内关键基因表达情况以及信号通路，可以更深入地了解疾病的发生机理，为后续相应的治疗方案提供理论依据。
血管是生物运送血液的管道，依运输方向可分为动脉、静脉与毛细血管，人体除了角膜、毛发、指甲以及上皮等地方，其他地方都有密集的血管分布。动脉和静脉的血管由三层结构组成，富含结缔组织、平滑肌、弹性纤维和胶原纤维，在制备单细胞悬液时需要使用胶原酶或胰蛋白酶破坏细胞间紧密连接的蛋白，从而获得高质量的单细胞悬液。但是解离过程中使用的胶原酶类型，将会影响高质量细胞悬液的获得。
探索血管的细胞特异性变化，为寻找治疗相关疾病的潜在细胞靶点提供支持，大幅提升单细胞测序在动脉组织中应用的可行性，获得动脉组织高质量的细胞悬液至关重要，因此，提供一种人动脉组织的单细胞解离方案是很有必要的。
发明内容
为了解决上述问题中的一种，本发明提供了一种人动脉组织单细胞悬液制备用酶解液、试剂盒、方法及其应用，采用该酶解液及解离方法能够对人动脉组织进行充分消化，获得高质量的细胞悬液。
为了达到上述目的，本发明采用了如下技术手段：
本发明的第一方面提供了一种制备人动脉组织的单细胞悬液用酶解液，包括第一酶解液、第二酶解液，其中，第一酶解液包括80-120U/ml透明质酸酶和30-80U/ml链霉蛋白酶；
第二酶解液包括1-3mg/ml胶原酶II、0.3-0.8mg/ml分散酶和0.05-0.1mg/ml弹性蛋白酶。
优选地，第一酶解液包括100U/ml透明质酸酶和50U/ml链霉蛋白酶；
第二酶解液包括2mg/ml胶原酶II、0.5mg/ml分散酶和0.08mg/ml弹性蛋白酶。
本发明的第二方面提供了一种第一方面所述的酶解液在制备人动脉组织的单细胞解离试剂盒中的应用。
本发明的第三方面提供了一种制备人动脉组织单细胞悬液的试剂盒，包括第一方面所述的酶解液。
在本发明的一些具体实施方案中，还包括洗涤缓冲液、稀释缓冲液以及红细胞裂解液；其中，洗涤缓冲液为PBS溶液；稀释缓冲液为1640培养基。
本发明的第四方面提供了一种人动脉组织单细胞悬液的制备方法，利用第三方面所述的试剂盒对人动脉组织进行单细胞解离，解离方法包括如下步骤：
S1、取人动脉组织样本置于含有洗涤缓冲液的器皿中剪碎，剪碎后的组织块样本置于样本管a中用洗涤缓冲液反复清洗；
S2、向样本管a中加入第一酶解液，封口膜密封后进行第一次消化；
S3、用洗涤缓冲液润洗组织及细胞，并吸取S2中的细胞悬液通过细胞筛，并筛，细胞滤液离心后弃上清；筛网上的细胞组织置于样本管b中待用；
S4、加入稀释缓冲液重悬细胞，随后加入红细胞裂解液，冰上裂解，离心后弃上清；用稀释缓冲液重悬细胞沉淀获得第一次酶解单细胞悬液；
S5、向样本管b中加入第二酶解液，封口膜密封后进行第二次消化；
S6、用洗涤缓冲液润洗组织及细胞筛，并吸取S5中的细胞悬液通过细胞筛，并，细胞滤液离心后弃上清；
S7、加入稀释缓冲液重悬细胞，随后加入红细胞裂解液，冰上裂解，离心后弃上清；用稀释缓冲液重悬细胞沉淀获得第二次酶解单细胞悬液；
S8、将第一次酶解单细胞悬液和第二次酶解单细胞悬液混合后即得人动脉组织的单细胞悬液。
在本发明的一些实施方案中，第一次消化和第二次消化的方法为：放入37℃水浴锅中80-120rpm转速条件下消化15-25min，消化完成后轻柔吹打组织。优选地，第一次消化和第二次消化的方法为：放入37℃水浴锅中100rpm转速条件下消化20min，消化完成后轻柔吹打组织
在本发明的一些实施方案中，所述离心方法为：350-450g，4℃，离心5-10min。优选地，离心方法为：400g，4℃，离心5min
在本发明的一些实施方案中，所述细胞筛为70μm-30μm细胞筛。优选地，细胞筛为70μm和30μm的组合细胞筛。
本发明的第五方面提供了采用第四方面所述的方法制备得到的人动脉组织单细胞悬液。
本发明的第六方面提供了第五方面所述的人动脉组织单细胞悬液在单细胞检测中的应用。如应用在单细胞测序，单细胞分选检测等方面。
本发明的有益效果
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：本发明提供了一种人动脉组织单细胞悬液制备用酶解液、试剂盒、方法及其应用，本发明使用的酶解液中包含的胶原酶均为常用的解离酶，获得方便，本发明中的酶解液配比适用于人动脉组织的单细胞解离，试剂组分相容性较好，无有害成分，安全环保；使用本发明提供的解离方案可以获得高质量的单细胞悬液，可以大幅提升单细胞测序在动脉组织中应用的可行性，制备得到的人动脉组织单细胞悬液可应用在单细胞测序，单细胞分选检测等方面。
附图说明
图1示出了本发明实施例1得到的细胞悬液的荧光场图片；
图2示出了本发明实施例1得到的细胞悬液的明场图片；
图3示出了本发明实施例3中单细胞测序的结果图。
具体实施方式
以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。
除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
实施例1-2
按照本发明提供的方案进行两次平行解离实验。
S1、取0.5g样本放入含有PBS溶液的60×15mm培养皿中，使用剪刀将组织剪成3-4mm2左右大小，用巴氏吸管将组织块吸入5mL离心管中，继续剪切成1-2mm2左右大小；用巴氏吸管补加PBS至4mL左右，用巴氏吸管吹打溶液中上部，轻柔吹起组织，静置10s左右，待组织沉降至管底，弃上清，视为一次清洗，共清洗3次，最终将上清吸弃干净；
S2、第一次解离消化：将配制好的第一酶解液：透明质酸酶100U/ml，链霉蛋白酶50U/ml，加入剪切好的样本中，封口膜密封后，放入37℃水浴锅中100rpm转速条件下消化20min，消化完成后使用巴氏吸管轻柔吹打组织；
S3、用PBS溶液润洗组织及细胞筛，并吸取细胞悬液通过70μm与30μm的组合细胞筛，并，400g，4℃，5min，离心；离心完成后，从离心机中取出富集了细胞沉淀的离心管，巴氏吸管弃除上清；加入200μL 1640培养基重悬细胞，加入2mL红细胞裂解液，冰上裂解5min，400g，4℃，5min，离心；
S4、使用200μL 1640培养基重悬细胞沉淀获得第一次解离的单细胞悬液。使用细胞计数仪检测细胞质量；
S5、第二次解离消化：将第二酶解液：胶原酶II 2mg/ml，分散酶0.5mg/ml，弹性蛋白酶0.08mg/ml，加入消化剩余的样本中，封口膜密封后，放入37℃水浴锅中100rpm转速条件下继续消化20min，消化完成后使用巴氏吸管轻柔吹打组织；
S6、用PBS溶液润洗组织及细胞筛，并吸取细胞悬液通过70μm与30μm的组合细胞筛，并，400g，4℃，5min，离心；离心完成后，从离心机中取出富集了细胞沉淀的离心管，巴氏吸管弃除上清；加入200μL 1640培养基重悬细胞，加入2mL红细胞裂解液，冰上裂解5min，400g，4℃，5min，离心；
S7、使用200μL 1640培养基重悬细胞沉淀获得第二次解离的单细胞悬液。使用细胞计数仪检测细胞质量；
S8、将第一次解离的单细胞悬液和第二次解离的单细胞悬液混合收集起来，即得到人动脉组织单细胞悬液。再次使用细胞计数仪检测细胞质量，调至合适浓度用于后续实验。
对比例1-3
实验步骤与实施例1相同，区别在于：步骤S5中第二次解离消化时间延长至40min。
此实验过程进行三次平行实验作为对比例1、对比例2、对比例3。
对比例4-5
实验步骤与实施例1相同，区别在于：步骤S5中第二次解离消化用的第二酶解液为：胶原酶II 2mg/ml，弹性蛋白酶0.08mg/ml。
此实验过程进行两次平行实验作为对比例4、对比例5。
对比例6
实验步骤与实施例1相同，区别在于：步骤S2中第一次解离消化用的第一酶解液为：透明质酸酶100U/ml，链霉蛋白酶50U/ml，胶原酶I 2mg/ml。
对比例7
实验步骤与实施例1相同，区别在于：步骤S2中第一次解离消化用的第一酶解液为：透明质酸酶100U/ml，链霉蛋白酶50U/ml，胶原酶I 2mg/ml；步骤S5中第二次解离消化用的第二酶解液为：胶原酶II 2mg/ml，弹性蛋白酶0.08mg/ml。
对比例8-9
实验步骤与实施例1相同，区别在于：步骤S5中第二次解离消化用的第二酶解液为：胶原酶II 2mg/ml，弹性蛋白酶0.08mg/ml。
第二次解离消化步骤后过滤得到的剩余组织再按照前面S5-S7的步骤，采用浓度0.25％的胰酶进行第三次解离消化。三次解离得到的单细胞悬液混合后即为人动脉组织单细胞悬液。
对上述实施例1-2和对比例1-9制备得到的人动脉组织单细胞悬液进行AO/PI荧光染色计数，Countstar细胞计数仪结果见表1。实施例1的细胞计数图见图1和图2。
表1实施例1-2和对比例1-9得到的单细胞悬液计数结果对比
活率(％) 结团率(％) 总量(W)
实施例1 94 10 35
实施例2 95 12 40
对比例1 92 5 10
对比例2 90 10 13
对比例3 93 4 9
对比例4 91 30 10
对比例5 88 33 8
对比例6 88 19 10
对比例7 94 17 10
对比例8 87 17 28
对比例9 87 19 36
由上述结果可知，实施例1-2按照本发明专利步骤进行解离获得的单细胞悬液，两组平行实验的细胞活率和总量都显著高于几种不同处理方式的对比例，说明组织消化完全，并且最终得到的单细胞活率高，结团率低。图1荧光场图片看出细胞活率高；图2明场图片可看出背景干净，细胞碎片及残留红细胞数少。
对比例1-3延长了第二次解离消化时间，最终得到的单细胞悬液中的细胞活率略有下降，结团率有较大幅度的降低，说明延长消化时间有助于降低结团率，但是最终细胞总数是大幅下降的。
对比例4-5没有使用分散酶，获得的单细胞悬液细胞总量下低显著，同时结团率显著升高。
对比例6-7使用了胶原蛋白酶I，获得的单细胞悬液细胞总量、显著低于实施例，对比例7虽然细胞活率增加，但是细胞结团率显著高于实施例。
对比例8-9没有使用分散酶进行解离，但增加了胰酶对组织进行继续消化，结果显示单细胞悬液中细胞总量显著高于其他对比例，与实施例相近，但细胞活率低，并且结团率高于实施例，最终的处理效果不及实施例。
综合实施例和对比例的实验结果可知本发明所提供的解离方案能够对组织进行充分消化，获得高质量的细胞悬液，大幅提升单细胞测序在动脉组织中应用的可行性。
实施例3
采用10×Genomics技术对实施例1制备的单细胞悬液进行单细胞测序实验。参照10×Genomics官方给出的标准流程进行细胞捕获，完成油包水生成以及后续的文库构建等实验。
测序结果如表2和图3所示。
表2单细胞测序结果
测序结果显示：细胞质量较好，表达丰度较高，满足用于后续差异表达基因筛选，功能富集分析等不同类型数据挖掘的需要。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请限定的范围。

Claims (1)

1.一种用于单细胞测序的人动脉组织的单细胞悬液的制备方法，其特征在于，制备方法包括如下步骤：
S1、取人动脉组织样本置于含有洗涤缓冲液的器皿中剪碎，剪碎后的组织块样本置于样本管a中用洗涤缓冲液反复清洗；
S2、向样本管a中加入第一酶解液，封口膜密封后进行第一次消化；
S3、用洗涤缓冲液润洗组织及细胞筛，并吸取S2中的细胞悬液通过细胞筛，并，细胞滤液离心后弃上清；筛网上的细胞组织置于样本管b中待用；
S4、加入稀释缓冲液重悬细胞，随后加入红细胞裂解液，冰上裂解，离心后弃上清；用稀释缓冲液重悬细胞沉淀获得第一次酶解单细胞悬液；
S5、向样本管b中加入第二酶解液，封口膜密封后进行第二次消化；
S6、用洗涤缓冲液润洗组织及细胞筛，并吸取S5中的细胞悬液通过细胞筛，并，细胞滤液离心后弃上清；
S7、加入稀释缓冲液重悬细胞，随后加入红细胞裂解液，冰上裂解，离心后弃上清；用稀释缓冲液重悬细胞沉淀获得第二次酶解单细胞悬液；
S8、将第一次酶解单细胞悬液和第二次酶解单细胞悬液混合后即得人动脉组织的单细胞悬液；
其中，第一酶解液包括100 U/ml透明质酸酶和50 U/ml链霉蛋白酶；
第二酶解液包括2 mg/ml胶原酶II、0.5 mg/ml分散酶和0.08 mg/ml弹性蛋白酶；
洗涤缓冲液为PBS溶液；稀释缓冲液为1640培养基；
第一次消化和第二次消化的方法为：放入37℃水浴锅中100 rpm转速条件下消化20min，消化完成后轻柔吹打组织；
所述离心方法为：400g，4℃，离心5min；
所述细胞筛为70μm与30μm的组合细胞筛。
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