CN116033905A - 预防及治疗病毒感染的化合物及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抗病毒化合物。本发明包括通过抑制一病毒内的半胱胺酸蛋白酶及/或一细胞内的牛磺胆酸钠协同转运多胜肽，具体而言是SARS‑COV‑2以及B型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)来预防及/或治疗病毒感染的方法。还提供包含上述任一化合物、其药学上可接受的盐或其混合物用于预防及/或治疗病毒感染的组合物/医药组合物，以及该化合物的用途。

Description

预防及治疗病毒感染的化合物及方法

相关申请的交叉引用

本发明申请主张于2020年8月28日提出申请的美国临时申请第63/071,564号的利益与优先权，出于所有目的其全部内容通过引用合并于本文。

技术领域

本发明提供了一些抗病毒化合物以及用于预防和治疗病毒感染，特别是冠状病毒或肝炎病毒引起的疾病的方法和组合/组合物/药物组合物的。

背景技术

由外壳蛋白内的遗传物质构成的病毒侵入活的、正常的细胞，并利用这些细胞繁殖和生产与其自身相似的其他病毒，这些病毒可能会导致常见的传染病，例如流感及疣，或可能导致严重的疾病，例如天花及后天性免疫缺乏症候群(acquired immune deficiencysyndrome，AIDS)。

例如，有5种不同类型的肝炎病毒，即A、B、C、D及E，以及X与G。A型及E型肝炎病毒是由食用受病毒污染的水及食物所引起的。然而，B型、C型及D型肝炎病毒是由肠胃外引起的，与受感染的体液相邻。此外，C型与D型肝炎病毒感染也在增加，需要有效的治疗。

B型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)在人类中引起急性及慢性病毒性肝炎。HBV感染通常与严重的肝脏疾病有关，包括肝硬化及肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)[1]。全球HBV感染率非常高。尽管已有可用的有效疫苗长达25年以上，但仍有约3.5亿的人口被慢性感染。相较于非带原者，HBV带原者罹患HCC的相对风险增加约100倍[2]。

由于副作用及抗药性的出现，越来越多的HBV感染患者不能使用目前核准的抗HBV药物，包括干扰素α或抑制病毒反转录酶的核苷(酸)类似物[3]。

因此，需要寻找有效、安全且可负担的抗HBV药物，以干扰病毒生命周期中的其他步骤，以改善治疗结果。

HBV为一种小DNA病毒，由保护3.2kb病毒基因组的核鞘所组成[4]。HBV核鞘被包膜包围，包膜由B型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigens，HBsAgs)所组成。HBsAgs在一个开放阅读框中编码，具有三个同相起始密码子。MHBsAg自S结构域具有一个55个胺基酸(amino acid，aa)的延伸部分，称为前S2结构域。LHBsAgs还有一个108-aa的区域，从前S2结构域延伸到前S1结构域。最近，牛磺胆酸钠协同转运多胜肽(sodium taurocholatecotransporting polypeptide，NTCP)被鉴定为HBV受体[5,6]。长期以来，一直有建议将HBV进入未感染的肝细胞作为抗病毒干预的潜在目标[7]。另一方面，HepG2.2.15细胞包含HBV全基因组，广泛用于研究HBV复制、组装及分泌。

长期以来，HBV在感染期间对肝细胞的附着一直被认为是抗病毒干预的潜在目标。人们认为与HBV颗粒特异性结合的分子可能会干扰病毒附着，进而减少或阻止随后的感染[8]。

由于缺乏支持完整复制周期的细胞培养系统，对人类HBV早期感染事件的了解有限。迄今为止，已显示两种细胞类型对HBV感染敏感。一种是人类肝癌细胞株HepaRG，在二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)诱导分化后变得可感染[7,9]，而另一种细胞类型，正常人类原代肝细胞，很容易被HBV感染[10,11]，但体外细胞的有限寿命以及缺乏一致来源严重限制其进一步应用。

此外，单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus，HSV)还由包裹在蛋白质包被中的DNA基因组所组成。单纯疱疹病毒第1型及第2型(HSV-1以及HSV-2)为人类疾病的病原体，包括龈口炎、咽炎、唇疱疹、脑炎、眼睛及生殖器感染[12]。疱疹病毒感染通常涉及轻度或无症状的初步阶段，随后病毒以非复制潜伏状态或临床上检测不到的复制程度持续存在[13]。HSV-1的原发感染最常涉及口腔及/或喉咙，导致龈口炎及咽炎。从原发性口咽部感染中恢复后，个体终生在三叉神经节中保留HSV DNA，并可能遭受唇疱疹的反复发作。研究还揭示疱疹病毒家族的一些成员与牙周病之间可能存在关联[14]。人类疱疹病毒可能发生在牙周炎病变中，发病率相对较高[15]。就临床附着丧失而言，HSV与牙周病的严重程度有关[16]。病毒性牙龈感染可能会损害宿主防御机制，进而创造使口腔致病菌过度生长的条件[15,17]。

HSV通常攻击黏膜、皮肤、眼睛及神经系统，并且能够感染多种细胞[18]。人类牙龈黏膜器官培养可被HSV-1与HSV-2感染[19]。此外，体外培养的人类牙龈角化细胞与牙龈纤维母细胞支持HSV的繁殖[20,21]。HSV-1编码病毒胸苷激酶，其间接将阿昔洛韦(acyclovir)代谢为三磷酸阿昔洛韦，这是HSV DNA聚合酶的链终止受质，并停止病毒DNA复制[22]。然而，据报导，在5-30％的病例中，HSV对阿昔洛韦产生抗药性[23]。抗阿昔洛韦的HSV-1病毒株经常发生在免疫功能低下的患者体内，这可能导致严重的并发症[24]。由于缺乏疫苗，局部使用杀微生物剂可能是预防HSV传播的重要策略。

根据世界卫生组织(World Health Organization，WHO)[25]，2002年11月1日至2003年6月18日爆发的严重急性呼吸道症候群(Severe acute respiratory syndrome，SARS)导致超过29个国家801人死亡以及全球8465个可能的病例。SARS为一种包含正向单股RNA的包膜β冠状病毒，其基因组大小约为30kb，其中开放阅读框(open reading frame，ORF)1a及1b分别编码两种多蛋白(polyproteins，pps)，pp1a与pp1ab[26,27]。为了完成其生命周期，成功的复制及蛋白水解处理是必要的[28]。事实上，在所有冠状病毒中都发现这些病毒编码的蛋白水解蛋白的共同功能，特别是类乳头蛋白蛋白酶(papline-likeprotease，PLpro)以及胰凝乳蛋白酶样蛋白酶(chymotrypsin-like protease，3CLpro)[28]。在pp1a与pp1ab的蛋白水解过程中，PLpro与3CLpro分别切割前三个位点以及其余的11个位置，产生共16个非结构蛋白(nonstructural proteins，nsp1–16)[26,27]。因此，抑制3CLpro被视为抗SARS药物发现及开发中的分子方法[25,29]。

SARS-COV-2为一种新型冠状病毒，已有25个国家报导出现该病毒，实验室确诊病例近72000例，截至2020年2月17日，全球死亡人数达1775例[30]。令人震惊的是，目前还没有任何药物或疫苗被核准用于治疗人类冠状病毒[31]。关于目前SARS-CoV-2的爆发以及SARS及MERS(另一种β冠状病毒)的治疗经验，许多研究广泛检视使用现有用于治疗HIV、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒以及流感感染的抗病毒药物用于治疗或干预SARS-COV-2的可能性[31,32]。与此同时，SARS-CoV-2已被确定特征为一种包膜、正向、单股RNAβ冠状病毒，类似于SARS及MERS[31]。与冠状病毒的特征一致，SARS-CoV-2基因组编码结构蛋白(例如棘糖蛋白)、非结构蛋白(例如，3CLpro、PLpro、解旋酶、RNA依赖性RNA聚合酶)以及辅助蛋白。关于SARS-COV-2、SARS及MERS的可用基因组序列，发现蛋白水解位点以及蛋白水解酶高度保守，因此重新利用SARS及MERS蛋白酶抑制剂治疗SARS-COV-2是值得考虑的[33]。由于3CLpro在SARS中具有关键作用，因此通过以SARS-COV-2的3CLpro而非其PLpro为目标来阻止其生命周期以实现蛋白酶抑制是合理的[25,29,33]。

目前，二硫龙(disulfiram)是一种已获核准的治疗酒精依赖的药物，据报导可抑制细胞培养物中MERS及SARS的PLpro，但尚未进行临床评估[31]。此外，针对SARS-CoV-2患者的HIV蛋白酶抑制剂(洛匹那韦(lopinavir)与利托那韦(ritonavir))的临床试验也已经开始，但尚未确定它们能否有效抑制SARS-CoV-2，因为HIV以及β冠状病毒蛋白酶分别属于天门冬胺酸蛋白酶家族以及半胱胺酸蛋白酶家族[31,34]。另一方面，瑞德西韦(remdesivir，RDV)是一种被核准用于HIV治疗的RNA依赖性RNA聚合酶抑制剂的核苷酸类似物，目前正在SARS-CoV-2患者中进行临床试验，预计完成日期为2020年4月；galidesivir是治疗HCV早期临床研究中RNA依赖性RNA聚合酶抑制剂的另一种核苷酸类似物，在临床前研究中显示出针对严重急性呼吸道症候群(SARS)、中东呼吸道症候群(MERS)的广效抗病毒活性[34,35]。然而，核苷类似物可能会被认为会引起我们不知道的毒性[36]。

目前还没有找到抗病毒药物来预防或治疗人类冠状病毒感染。迫切需要探索并开发安全的抗冠状病毒疗法，特别是针对SARS-COV-2。

仍需开发一种新颖的抗病毒疗法或药物。

发明内容

本发明意外地发现，一些三萜类化合物能有效抑制病毒感染，尤其是对B型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染及/或单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus，HSV)及/或冠状病毒感染，特别是SARS-COV-2病毒感染。

于一目的中，本发明提供一种预防及/或治疗一病毒感染的方法，包括对一有此需要的个体施用一化合物或其一医药上可接受的盐类，其中该化合物选自由下列所组成的群组：

具有式I结构的入地蜈蚣素J及其衍生物：

具有式II结构的入地蜈蚣素N及其衍生物：

具有式III结构的6-(3,4-二羟基苯基)-4-羟基六-3,5-二烯-2-酮及其衍生物：

具有IV结构的2-[(E)-2-(3,4-二羟基苯基)乙烯基]-6-羟基吡喃-4-酮及其衍生物：

具有式V结构的去氢齿孔酸(dehydroeburicoic acid)及其衍生物：

具有式VI结构的3-O-甲基山奈酚及其衍生物：

具有式VII结构的山奈酚-3-O-(3,4-二乙酰-α-L-吡喃鼠李糖苷)及其衍生物：

具有式VIII结构的山奈酚-3-O-(2,4-二乙酰-α-L-吡喃鼠李糖苷)及其衍生物：

具有式IX结构的去氢硫色多孔菌酸(dehydrosulphurenic acid)及其衍生物：

具有式X结构的硫色多孔菌酸(sulphurenic acid)及其衍生物：

具有式XI结构的变孔

孔菌酸D(versisponic acid D)及其衍生物：

具有式XII结构的反式-对-薄荷-6-烯-2,8-二醇及其衍生物：

以及

具有式XIII结构的樟芝酸K(antcin K)及其衍生物：

于一目的中，本发明提供一种预防及/或治疗一病毒感染的方法，包括对一有此需要的个体施用一化合物或其一医药上可接受的盐类，或者两种或更多种上述化合物的组合/组合物/药物组合物。

于本发明的某些特定实施例中，该化合物为选自由下列所组成的群组的一：入地蜈蚣素J、入地蜈蚣素N、6-(3,4-二羟基苯基)-4-羟基六-3,5-二烯-2-酮、2-[(E)-2-(3,4-二羟基苯基)乙烯基]-6-羟基吡喃-4-酮、去氢齿孔酸、3-O-甲基山奈酚、山奈酚-3-O-(3,4-二乙酰-α-L-吡喃鼠李糖苷)、山奈酚-3-O-(2,4-二乙酰-α-L-吡喃鼠李糖苷)、去氢硫色多孔菌酸、硫色多孔菌酸、变孔

孔菌酸D、反式-对-薄荷-6-烯-2,8-二醇，以及樟芝酸K。

于本发明的某些特定实施例中，该组合为二或多种选自由下列所组成的群组的化合物的组合：入地蜈蚣素J、入地蜈蚣素N、6-(3,4-二羟基苯基)-4-羟基六-3,5-二烯-2-酮、2-[(E)-2-(3,4-二羟基苯基)乙烯基]-6-羟基吡喃-4-酮、去氢齿孔酸、3-O-甲基山奈酚、山奈酚-3-O-(3,4-二乙酰-α-L-吡喃鼠李糖苷)、山奈酚-3-O-(2,4-二乙酰-α-L-吡喃鼠李糖苷)、鱼针草内酯、去氢硫色多孔菌酸、硫色多孔菌酸、变孔

孔菌酸D、反式-对-薄荷-6-烯-2,8-二醇，以及樟芝酸K。

于另一方面，本发明提供用于预防及/或治疗病毒感染，特别是冠状病毒感染，例如SARS-COV-2的组合/组合物/医药组合物，其包含一治疗有效量的本文所公开的任何化合物或其医药上可接受的盐类，或其混合物，与一医药上可接受的载体的组合。

于另一方面，本发明提供一种用于预防及/或治疗一肝炎病毒感染，特别是HBV感染的组合物/医药组合物，其包含一治疗有效量的本文所公开的任何化合物或其医药上可接受的盐类，或其混合物，与一医药上可接受的载体的组合。

可选择地，根据本发明的组合物/医药组合物可包含至少一种额外的抗病毒治疗剂。

于又一方面，本发明提供一种本文所公开的任何化合物或其医药上可接受的盐类，或其混合物在制备用于预防及/或治疗一病毒感染，特别是冠状病毒，例如SARS-COV-2的药物中的用途。

于本发明的一特定实施例中，该病毒是肝炎病毒，尤其是B型肝炎病毒(HBV)。

于本发明的一特定实施例中，该病毒是单纯疱疹病毒(HSV)。

应当理解的是，以上的一般性描述以及以下的详细描述仅为示例性及解释性的，而非对本发明的限制。

附图说明

当结合附图阅读时，将更好地理解前述发明内容以及以下对本发明的详细描述。为了说明本发明，于附图中显示了目前较佳的具体实施例。

于附图中：

图1所示为AR100-DS1+ARH 101-DS2(0.25p/0.6FP)的3CLpro相对活性(％)，IC50＝3.065μM。

图2所示为AR100-DS1+ARH 101-DS3(0.25p/0.6FP)的3CLpro相对活性(％)，IC50＝2.934μM。

图3所示为ARH 020-DS1—SARS-Cov-2的IC50＝14.93μM。

图4所示为ARH 020-DS2—SARS-Cov-2的IC50＝6.329μM。

图5所示为ARH 019-DS1—SARS-Cov-2的IC50＝19.21μM。

图6所示为ARH 019-DS2—SARS-Cov-2的IC50＝2.487μM。

图7所示为ARH 007-DS3—SARS-Cov-2的IC50＝11.61μM。

图8所示为ARH 007-DS4—SARS-Cov-2的IC50＝18.85μM。

图9所示为ARH 007-DS5—SARS-Cov-2的IC50＝48.22μM。

图10所示为AR101-DS2+ARH013-DS1的3CLpro相对活性(％)，IC50＝2.409μM。

图11所示为ARH007-DS3+ARH013-DS1的3CLpro相对活性(％)，IC50＝18.2μM。

图12所示为AR100-DS1+ARH007-DS3的3CLpro相对活性(％)，IC50＝8.646μM。

图13所示为ARH013-DS1—SARS-Cov-2＝32.89μM。

图14所示为0、20以及40μM的AR101-DS2对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg的影响(*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001)。

图15所示为0、20以及40μM的AR101-DS2对HepG2.2.15细胞的培养基中HBV的DNA含量的影响(*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001)。

图16所示为0、20以及40μM的AR101-DS2对HuS-E/2细胞分泌HBsAg的影响(*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001)。

图17所示为0、20以及40μM的AR101-DS2对HuS-E/2细胞的HBV mRNA表现量的影响。

图18所示为0、10、20以及100μM的AR101-DS3对NTCP的抑制效果(*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001)。

图19所示为0、10、20以及100μM的AR101-DS4对NTCP的抑制效果(*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001)。

图20所示为0、40以及80μM的AR101-DS1+AR101-DS3对Hus-E/2细胞分泌HBsAg的影响(*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001)。

图21所示为0、40以及80μM的AR101-DS1+AR101-DS3对Hus-E/2细胞的HBV mRNA表现量的影响(*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001)。

图22所示为0、40以及80μM的AR101-DS1+AR101-DS4对Hus-E/2细胞分泌HBsAg的影响(*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001)。

图23所示为0、40以及80μM的AR101-DS1+AR101-DS4对Hus-E/2细胞的HBV mRNA表现量的影响(*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001)。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的上述内容作进一步说明。但是，不应理解为本发明的内容仅限于以下具体实施例，凡基于本发明上述内容的发明，都属于本发明的保护范围。

除非另有定义，本文使用的所有技术及科学术语与本发明所属领域的技术人员通常理解的含义相同。

如本文所用，单数形式“一”、“一个”以及“该”包括复数所指对象，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“一样品”则包括本领域技术人员已知的多个这样的样品及其等价物。

于本发明中，为了评估待测药物对高生产量蛋白水解加工抑制的影响，采用如同先前研究中所使用的标记荧光共振能量转移(fluorescence resonance energytransfer，FRET)对的合成胜肽，其中在FRET标记的胜肽切割后立即释放淬灭的荧光团，产生可实时监测的荧光信号(Chen等人，2005年；Jean等人，1995年；Jo等人，2020年)。本发明证实，本文所公开的任何化合物或其混合物均能有效抑制半胱胺酸蛋白酶，特别是SARS-CoV-2的3CLpro。

本发明提供一种预防及/或治疗一病毒感染的方法，包括对一有此需要的个体施用一化合物或其医药上可接受的盐类，或其混合物，其中该化合物选自由下列所组成的群组之一：

具有式I结构的入地蜈蚣素J及其衍生物：

具有式II结构的入地蜈蚣素N及其衍生物：

具有式III结构的6-(3,4-二羟基苯基)-4-羟基六-3,5-二烯-2-酮及其衍生物：

具有IV结构的2-[(E)-2-(3,4-二羟基苯基)乙烯基]-6-羟基吡喃-4-酮及其衍生物：

具有式V结构的去氢齿孔酸及其衍生物：

具有式VI结构的3-O-甲基山奈酚及其衍生物：

具有式VII结构的山奈酚-3-O-(3,4-O-二乙酰-α-L-吡喃鼠李糖苷)及其衍生物：

具有式VIII结构的山奈酚-3-O-(2,4-O-二乙酰-α-L-吡喃鼠李糖苷)及其衍生物：

具有式IX结构的去氢硫色多孔菌酸及其衍生物：

具有式X结构的硫色多孔菌酸及其衍生物：

具有式XI结构的变孔

孔菌酸D及其衍生物：

具有式XII结构的反式-对-薄荷-6-烯-2,8-二醇及其衍生物：

以及

具有式XIII结构的樟芝酸K及其衍生物：

本发明提供一种用于预防及/或治疗一病毒感染，特别是冠状病毒，例如SARS-COV-2，的组合/组合物/药物组合物，其包含治疗有效量的本发明所述的化合物以及药学上可接受的载体。

本文所用的“病毒”一词指任何病毒，其为一种仅在生物体的活细胞内复制的小型传染因子，其可感染所有类型的生命形式，从动植物到微生物，包括细菌及古细菌。示例性病毒包括，但不限于，肝炎病毒、流感病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、肠道病毒、轮状病毒、登革病毒、痘病毒、人类免疫缺陷病毒、腺病毒、麻疹病毒、反转录病毒，冠状病毒或诺如病毒。

如本文所用，“肝炎病毒”一词指引起肝炎的病毒，特别是B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)、D型肝炎病毒(HDV)。

如本文所用，“冠状病毒”一词指正冠状病毒亚科、冠状病毒科、网巢病毒目，以及核糖病毒域中的冠状病毒，其为具有正向单股RNA基因组以及螺旋对称核鞘的包膜病毒。其具有从表面突出的特征性的棒状棘，在电子显微照片中产生的影像让人想起日冕，故其名称来源于此。冠状病毒会导致哺乳动物以及鸟类，包括人类的疾病。在人类中，冠状病毒会引起呼吸道感染，包括普通感冒、严重急性呼吸道症候群(SARS)、中东呼吸道症候群(MERS)，以及SARS-COV-2。

如本文所用，“半胱胺酸蛋白酶”一词指硫醇蛋白酶，为降解蛋白质的酵素，具有共同的催化机制，涉及催化三联体或二联体中的亲核半胱胺酸硫醇。病毒中半胱胺酸蛋白酶的一个实例为SARS-CoV-2中的3CLpro。

如本文所用，“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”等词指对一患有疾病、疾病症状或病症或疾病进展的个体给予或施用包含一种或多种活性剂的组合物，目的为治疗、治愈、缓解、减缓、改变、补救、改善、增进或影响疾病、疾病的症状或病症、疾病引起的残疾或疾病的进展。

如本文所用，“预防(prevent)”、“预防(prevention)”或“预防(preventing)”等词指预防病毒感染的复发、发作，或发展，预防病毒感染的一种或多种症状，或与一个体感染冠状病毒相关、由其增强或增强的呼吸病症。

如本文所用，“个体”一词包括人类或非人类动物，例如伴侣动物(例如狗、猫等)、农场动物(例如牛、羊、猪、马等)或实验动物(例如大鼠、小鼠、天竺鼠等)。

如本文所用，“治疗有效量”一词指相较于未接受该量的相应个体，达到治疗、治愈、预防，或改善疾病、障碍或副作用，或降低疾病或障碍进展速度的效果的药剂的量。该术语在其范围内还包括有效增强正常生理功能的量。

为了治疗的用途，将该治疗有效量的该化合物配制为用于给药的医药组合物。因此，本发明进一步提供一医药组合物，包含一治疗有效量的任何本文所公开的这些化合物或其混合物，以及一种或多种医药上可接受的载体。

为了递送及吸收的目的，一治疗有效量的根据本发明的活性成分可与一医药上可接受的载体一起配制成合适形式的医药组合物。根据给药途径，本发明的医药组合物较佳包含该活性成分总重量的0.1重量％至100重量％。

本文使用的“医药上可接受的载体”一词指可接受的载体、稀释剂或赋形剂，意即与制剂的其他成分兼容、对个体无害且与该医药组合物一起施用。根据药物制剂的要求，本领域中通常已知或使用的任何载体、稀释剂或赋形剂均可用于本发明。该载体可为该活性成分的稀释剂、载剂、赋形剂，或基质。一些合适的赋形剂的实例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖、甘露糖、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、黄芪胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、无菌水、糖浆，以及甲基纤维素。该组合物还可包含润滑剂，例如滑石、硬脂酸镁，以及矿物油；润湿剂；乳化剂以及悬浮剂；防腐剂，例如羟基苯甲酸甲酯及丙酯；甜味剂；以及调味剂。

本发明的组合物可在施用于患者后提供该活性成分的快速、持续或延迟释放的效果。根据本发明，该医药组合物可适于通过任何合适的途径施用，包括但不限于口服、直肠、鼻、局部、阴道或肠胃外途径(例如肌肉内、静脉内、皮下，以及腹膜内)、透皮、栓剂，以及鼻内方法。

关于肠胃外给药，较佳以无菌水溶液的形式使用，其可包含其他物质，例如足以使溶液与血液等渗的盐类或葡萄糖。可根据需要将水溶液适当地缓冲(较佳的pH值为3至9)。可以本领域技术人员熟知的标准药理学技术在无菌条件下完成制备合适的肠胃外组合物。

于本发明的一特定实施例中，该医药组合物被配制用于口服给药。此类制剂可通过药学领域已知的任何方法制备。根据本发明，该组合物的形式可为片剂、丸剂、散剂、口含锭、小包、锭剂、酏剂、混悬剂、洗剂、溶液、糖浆、软硬胶囊、栓剂、无菌注射液以及包装粉剂。

于本发明中，该方法及组合物/医药组合物通过抑制病毒，特别是RNA依赖性病毒中的半胱胺酸蛋白酶而有效治疗病毒感染。因此，本发明还提供通过抑制病毒内的半胱胺酸蛋白酶来治疗及/或预防病毒感染的方法及组合物/医药组合物，包括使用本文所公开的化合物或其医药上可接受的盐类。

有反应的示例性病毒包括，但不限于，肝炎病毒、流感病毒、单纯疱疹病毒、肠道病毒、轮状病毒、登革病毒、痘病毒、人类免疫缺陷病毒、腺病毒、冠状病毒感染、沙状病毒感染、麻疹病毒、冠状病毒，或诺如病毒。较佳地，该病毒为一肝炎病毒，包括B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)、D型肝炎病毒(HDV)，或SARS-CoV-2。

于另一方面，本发明提供一种通过抑制病毒中的半胱胺酸蛋白酶来治疗或预防一RNA依赖性病毒感染的方法。该病毒的一实例为一RNA依赖性病毒，例如SARS、MERS，以及SARS-COV-2；特别是SARS-COV-2。

于另一方面，本发明提供一种通过抑制病毒内的半胱胺酸蛋白酶来治疗及/或预防一病毒感染的组合物/医药组合物，其包含本文所公开的任何化合物、其医药上可接受的盐类，或其混合物。可选择地，该组合物/医药组合物可包含至少一种额外的抗病毒治疗剂。

于另一方面，本发明提供一种用于通过抑制一细胞内牛磺胆酸钠协同转运多胜肽(NTCP)来治疗及/或预防一病毒感染的组合物/医药组合物，其包含本文所公开的任何化合物、其医药上可接受的盐类，或其混合物。可选择地，该组合物/医药组合物可包含至少一种额外的抗病毒治疗剂。

于另一方面，本发明提供一种本文所公开的任何化合物在制备通过抑制一病毒内的半胱胺酸蛋白酶来治疗或预防病毒感染的药物中的用途。

于另一方面，本发明提供一种本文所公开的任何化合物在制备通过抑制一细胞内的牛磺胆酸钠协同转运多胜肽(NTCP)来治疗或预防病毒感染的药物中的用途。

于另一方面，本发明提供通过抑制一细胞内的牛磺胆酸钠协同转运多胜肽(NTCP)来治疗或预防一DNA依赖性病毒感染的方法。该病毒的一实例为一DNA依赖性病毒，例如B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)，以及D型肝炎病毒(HDV)。

通过以下实施例进一步说明本发明，提供这些实施例是为了演示而非限制。

实施例

1.材料与方法

I.SARS-CoV-2 3CLpro的FRET蛋白酶分析

ED-FRET平台的建立遵循Jo等人(2020年)提供的方法。简言之，末端带有DABCYL及EDANS的订制蛋白水解荧光胜肽DABCYL-TSAVLQSGFRKMG-EDANS(Genomics公司，中国台湾)包含可被SARS-CoV-2的3CLpro识别的共有nsp4/nsp5切割序列。将该胜肽溶解于蒸馏水中，并与SARS-CoV-2的3CLpro一起作用。基于光谱的荧光测量由TECAN公司提供的

多模式酶标仪确定。蛋白水解活性于37℃下通过胜肽水解时EDANS的荧光强度确定为时间的函数，其中λ激发＝340nm，λ发射＝490nm，带宽分别为9、15nm。在测定前，检查测试药物在340nm激发下的发射波长，以确保它不与EDANS的发射光谱重叠。

于黑色96孔微孔盘(Greiner公司)内，在含有0.25μM SARS-CoV-2 3CLpro以及0.6μM订制的IQF基质胜肽的100μL的检测缓冲液(50mM Tris pH 6.5)中进行三次检测。

II.SARS-CoV-2 3CLpro的实时FRET蛋白酶分析以及剂量反应曲线分析。

于添加IQF胜肽基质前，于37℃下将0.25μM SARS-CoV-2 3CLpro与指定浓度(0-100μM)的目标化合物在分析缓冲液中(SC-HM100，晟青企业有限公司)作用1小时。之后，将6μM IQF胜肽基质加入在一黑色96孔微量滴定盘中的该混合物，并立即以一TECAN

多模式微量盘检测仪进行RFU检测。与蛋白质活性分析中使用的参数不同，对测量参数进行微调。在运行期间，在增益值为80的情况下进行10个检测循环，间隔为1.5分钟。通过从最终值中减去条件的初始值来计算荧光强度的变化。之后，以每个分析盘中阴性对照(只有载体)的变化对每个条件下荧光强度的变化进行标准化。对于每种药物，将0–100μM的剂量反应点拟合至GraphPad Prism 7.03(GraphPad Software公司)中给出的标准化剂量反应模型，其中

III.于Arjil药物存在下进行抑制分析。

于37℃下，将待测的13种Arjil药物与SARS-CoV-2 3CLpro预作用1小时。使用GraphPad Prism 7.03(GraphPad Software公司，圣地亚哥市，加州，美国)，在不同浓度下进一步研究对SARS-CoV-2的3CLpro表现出抑制活性的物质，以对其IC50值进行特征描述。下表所示为待测的13种Arjil药物。

预期结果

基于对SARS-CoV-2 3CLpro的知识及序列，对Arjil提供的3CLpro抑制药物的功效进行体外评估，以确定它们对SARS-CoV-2治疗的潜力。有鉴于尚无任何药物或疫苗被核准用来治疗人类SARS-CoV-2感染，开发一种广效抗病毒药物来对抗SARS-CoV-2是极为重要且紧迫的。ED-FRET技术及其工作流程的制定为实验室提供一种强大、高产出量药物发现的方法。同时，由Arjil提出且提供的13项测试中所鉴定出的SARS-CoV-2 3CLpro抑制剂可作为临床评估中可能的治疗剂量的基准，并提示未来的专利申请，有助于抗病毒库的构建。

这13项测试包括：

1.AR100-DS1+AR101-DS2；

2.AR100-DS1+AR101-DS3；

3.ARH 020-DS1(实时)；

4.ARH 020-DS2(实时)；

5.ARH 019-DS1(实时)；

6.ARH 019-DS2(实时)；

7.ARH 007-DS3(实时)；

8.ARH 007-DS4(实时)；

9.ARH 007-DS5(实时)；

10.AR101-DS2+ARH013-DS1；

11.ARH007-DS3+ARH013-DS1；

12.AR100-DS1+ARH007-DS3；以及

13.ARH 013-DS1(实时)。

IV.HepG2.2.15细胞

持续的HBV增殖可以HBV adw2亚型的基因组稳定转染的HepG2.2.15细胞(RRID:CVCL_L855)来实现。使用HepG2.2.15细胞是因为无限量供应且质量稳定，并将细胞维持在Dulbecco氏改良的Eagle培养基(Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM；Invitrogen公司)中，并补充10％热灭活胎牛血清(fetal bovine serum，FBS；Thermo公司)以及100单位的青霉素与100X g每毫升的链霉素(均来自Invitrogen公司)。

V.HuS-E/2细胞

使用即使在长时间培养后仍保留原代肝细胞特征的HuS-E/2细胞进行HBV感染。针对HBV感染，HuS-E/2细胞以2％ DMSO分化7天，收集病毒颗粒以感染HuS-E/2细胞并如本申请发明人先前的研究进行复制[38]。这些细胞可用于检测HBV病毒株的感染性及筛选抗HBV药物。

VI.收集HBV颗粒

药物处理过的HepG2.2.15细胞的培养基于4℃下以1,000X g离心10分钟澄清，然后将上清液铺在20％蔗糖垫(20％蔗糖、20mM HEPES，pH 7.4、0.1％牛血清白蛋白[bovineserum albumin，BSA])，并于4℃下以197,000X g离心3小时以沉淀HBV颗粒，然后将其浓缩100倍以检测HBV的DNA。

VII.分离DNA及RNA、反转录与实时PCR

以基因组DNA分离套组(Nexttec Biotechnologie公司，德国)萃取总DNA。使用

试剂(Invitrogen公司)从培养的细胞中分离总RNA。使用RNA模板、AMV反转录酶(Roche公司)及oligo-dT引子进行反转录。使用特定基因的引子组以及SYBR Green PCRMaster Mix(Bio-Rad公司)对产物进行实时PCR。用于HBV核心、HBsAg、cccDNA以及GAPDH的引子组如参考文献所述[3]。使用iCycler iQ实时PCR检测系统(Bio-Rad公司)分析结果。质体p1.3HBcl以10倍稀释(2*104–2*109复制数/ml)制备，以在平行PCR反应中产生标准曲线。

VIII.酶连结免疫吸附分析(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)

使用HBsAg ELISA套组(General Biologicals公司)按照建议的方法检测B型肝炎表面抗原(HBsAg)。

IX.PreS1-NTCP拉下实验

如先前所述进行重组融合蛋白的表现与纯化以及GST拉下实验[40]。简言之，以0.5mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导大肠杆菌BL21(DE3)中GST融合蛋白的表现，然后于4℃下在含有1％ Triton X-100(PBST)的PBS中以超音波裂解细菌细胞，并通过于4℃下以13,800g离心10分钟将其分离为可溶性及不溶性部分。为了进行GST拉下实验，将含有GST融合蛋白的细菌裂解物的可溶性部分与麸胱甘肽-琼脂糖4B微珠(GE Healthcare Bio-Sciences公司)于4℃下作用3小时，然后以PBST洗涤微珠3次，然后于4℃下将该微珠与Huh7细胞裂解物以及过度表现的HA-NTCP一起作用整夜，该过度表现的HA-NTCP以在含有蛋白酶抑制剂混合物(1mM PMSF、10μg/ml抑肽酶(aprotinin)、1μg/ml胃酶抑素A、1μg/ml亮抑酶肽)的PBST中裂解所制备而来。然后以PBST洗涤微珠，重新悬浮在样品缓冲液(12.5mMTris-HCl，pH 6.8，2％ SDS，20％甘油，0.25％溴酚蓝，5％β-巯基乙醇)中，并进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳以及以西方墨点分析进行检查。

X.统计分析

所有数值皆表示为平均值±SE。每个数值为每个药物体外实验中至少三个实验的平均值。学生氏t检验用于统计比较。*表示数值与对照组显著不同(*，p<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001)。

III.结果

1.抑制剂的半数最大抑制浓度的特征

对SARS-CoV-2 3CLpro的半数最大抑制浓度的特征在于以0μM至100μM的指定浓度的Arjil药物进行处理。Arjil药物/测试对SARS-CoV-2的IC50值如表1所示。每种Arjil药物/测试的IC50值如附图所示。总之，AR100-DS1+AR101-DS2、AR101-DS2+ARH013-DS1、AR100-DS1+ARH007-DS3，以及AR100-DS1+AR101-DS3的组合对SARS-CoV-2 3CLpro的抑制作用突显这些组合用于治疗COVID-19的潜力。此外，ARH 020-DS2、ARH 019-DS2，以及ARH007-DS3为最有希望抑制SARS-CoV-2 3CLpro的化合物。

表1.Arjil药物对SARS-CoV-2 3CLpro的抑制作用

十种示例化合物/测试(AR100-DS1+AR101-DS2、AR100-DS1+AR101-DS3、ARH 020-DS1、ARH 020-DS2、ARH 019-DS1、ARH 019-DS2、ARH 007-DS3、ARH 007-DS4、ARH 007-DS5、ARH101-DS2+ARH013-DS1、ARH007-DS3+ARH013-DS1、AR100-DS1+ARH007-DS3、ARH013-DS1)的IC50值如图1-13所示。

如图1所示，在0.25μM SARS-CoV-2 3CLpro以及0.6μM IQF胜肽基质(FP)存在下，AR100-DS1+AR101-DS2的IC50值为3.065μM。同时，测量0.25μM AR100-DS1+AR101-DS3对SARS-CoV-2 3CLpro以及0.6μM IQF胜肽基质的抑制作用(参阅图2)，AR100-DS1+AR101-DS3对SARS-CoV-2的IC50值为2.934μM。

ARH 020-DS2、ARH 019-DS2，以及ARH 007-DS3的IC50值分别为6.329μM、2.487μM，以及11.61μM。

综上所述，AR100-DS1+AR101-DS2、AR101-DS2+ARH013-DS1、AR100-DS1+ARH007-DS3，以及AR100-DS1+AR101-DS3的组合对SARS-CoV-2 3CLpro的抑制作用突显它们针对COVID-19的治疗潜力。此外，ARH 020-DS2、ARH019-DS2，以及ARH 007-DS3为最有希望抑制SARS-CoV-2 3CLpro的化合物。

以上引用的所有出版物、专利，以及专利文件皆通过引用方式并入本文，如同通过个别引用并入一般。

已参考各种特定且较佳具体实施例及技术来描述本发明。然而，本领域技术人员将理解，在保持在本发明的精神及范围内的情况下，可进行许多变化及修改。

2.抑制剂对HepG2.2.15细胞分泌HBV的影响

为测试上述化合物是否对HBV基因组的复制、组装或分泌有任何影响，将HBV基因组稳定转染的HepG2.2.15细胞与AR101-DS2作用48小时，然后自培养基中收集HBsAg以及HBV DNA，并分别以ELISA与实时PCR测量。结果如图14及15所示。

AR101-DS2对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg的影响如图14所示(0、20以及40μM的AR101-DS2)。以AR101-DS2处理显著抑制了HBsAg的分泌。

AR101-DS2对培养基中HBV DNA含量的影响如图15所示(0、20以及40μM的AR101-DS2)。发现在以20μM AR101-DS2或40μM AR101-DS2处理后，DNA含量显著降低。这些结果显示AR101-DS2抑制了HepG2.2.15细胞分泌HBV。

3.抑制剂对HuS-E/2细胞的HBV感染性的影响

为了评估AR101-DS2对HBV感染性与复制的影响，以源自HepG2.2.15细胞的任何亚型HBV感染HuS-E/2细胞。在HBV感染过程中将AR101-DS2加入培养基中作用18小时，然后洗涤感染的细胞并在新鲜培养基中培养48小时，以ELISA检测培养基中HBsAg，以实时PCR检测HBV mRNA，以作为HBV感染HuS-E/2细胞效率的指标。结果如图16及17所示。

AR101-DS2对HBV进入HuS-E/2细胞的影响如图16及17所示。发现培养基中HBsAg的分泌以及HBV mRNA表现量均未显示出剂量依赖性降低。因此，AR101-DS2不能阻止HBV进入HuS-E/2细胞。

4.对细胞内牛磺胆酸钠共转运多胜肽(NTCP)的抑制作用。

为了评估抑制剂对抑制HBV感染的影响，从以AR101-DS3或AR101-DS4处理的细胞中萃取细胞裂解物。拉下实验显示，随着AR101-DS3的含量增加(0、10、20以及100μM，参见图18)，NTCP的量显示出剂量依赖性增加。

类似地，如图19所示，拉下实验显示，AR101-DS4也造成NTCP的含量显著减少。这些结果显示，抑制剂可通过抑制NTCP来抑制肝炎病毒的感染。

5.抑制剂组合对HuS-E/2细胞中HBV感染能力的影响

为了评估多种抑制剂组合是否会提高抑制HBV感染性及复制的能力，以源自HepG2.2.15细胞的任何亚型HBV感染HuS-E/2细胞。在HBV感染18小时后，将AR101-DS1+AR101-DS3或AR101-DS1+AR101-DS4加入培养基中，然后洗涤感染的细胞并在新鲜培养基中培养48小时，以ELISA检测培养基中的HBsAg，以real-time PCR检测HBV mRNA以作为HBV感染HuS-E/2细胞效率的指标。

AR101-DS1+AR101-DS3对HBV进入HuS-E/2细胞的影响如图20及21所示。发现培养基中HBsAg的分泌以及HBV mRNA表现量皆呈现剂量依赖性降低。因此，AR101-DS1+AR101-DS3可预防HuS-E/2细胞感染HBV。

类似地，AR101-DS1+AR101-DS4对HBV进入HuS-E/2细胞的影响如图22及23所示。发现培养基中HBsAg的分泌以及HBV mRNA表现量皆呈现剂量依赖性降低。因此，AR101-DS1+AR101-DS4可预防HuS-E/2细胞感染HBV。

虽然本文已经显示并描述本发明的较佳具体实施例，但是对于本领域技术人员而言，显而易见的是，这些具体实施例仅提供作为示例，并可组合实施。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现在将想到许多改变、变化以及替换。应当理解的是，在实践本发明时可以采用本发明具体实施例的各种替代方案。以下权利要求目的在于限定本发明的范围，且在这些权利要求的范围内的方法与结构及其等同物由此涵盖。

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Claims (33)

1.一种抑制病毒感染的方法，包括对一有此需要的个体施用包含治疗有效量的一化合物或其药学上可接受的盐或其混合物的药物组合物，其中该化合物选自由下列所组成的群组：

具有式I结构的入地蜈蚣素J及其衍生物：

具有式II结构的入地蜈蚣素N及其衍生物：

具有式III结构的6-(3,4-二羟基苯基)-4-羟基六-3,5-二烯-2-酮及其衍生物：

具有IV结构的2-[(E)-2-(3,4-二羟基苯基)乙烯基]-6-羟基吡喃-4-酮及其衍生物：

具有式V结构的去氢齿孔酸(dehydroeburicoic acid)及其衍生物：

具有式VI结构的3-O-甲基山奈酚及其衍生物：

具有式VII结构的山奈酚-3-O-(3,4-二乙酰-α-L-吡喃鼠李糖苷)及其衍生物：

具有式VIII结构的山奈酚-3-O-(2,4-二乙酰-α-L-吡喃鼠李糖苷)及其衍生物：

具有式IX结构的去氢硫色多孔菌酸(dehydrosulphurenic acid)及其衍生物：

具有式X结构的硫色多孔菌酸(sulphurenic acid)及其衍生物：

具有式XI结构的变孔

孔菌酸D(versisponic acid D)及其衍生物：

具有式XII结构的反式-对-薄荷-6-烯-2,8-二醇及其衍生物：

以及

具有式XIII结构的樟芝酸K(antcin K)及其衍生物：

及其组合。

2.如权利要求1所述的方法，其中对该个体施用两种或多种如权利要求1所述的化合物的组合。

3.如权利要求1所述的方法，其中该化合物选自由下列所组成的群组：入地蜈蚣素J、入地蜈蚣素N、6-(3,4-二羟基苯基)-4-羟基六-3,5-二烯-2-酮、2-[(E)-2-(3,4-二羟基苯基)乙烯基]-6-羟基吡喃-4-酮、去氢齿孔酸、3-O-甲基山奈酚、山奈酚-3-O-(3,4-二乙酰-α-L-吡喃鼠李糖苷)、山奈酚-3-O-(2,4-二乙酰-α-L-吡喃鼠李糖苷)、去氢硫色多孔菌酸、硫色多孔菌酸、变孔

孔菌酸D、反式-对-薄荷-6-烯-2,8-二醇，以及樟芝酸K。

4.如权利要求2所述的方法，其中该两种或更多种化合物选自由下列所组成的群组：入地蜈蚣素J、入地蜈蚣素N、6-(3,4-二羟基苯基)-4-羟基六-3,5-二烯-2-酮、2-[(E)-2-(3,4-二羟基苯基)乙烯基]-6-羟基吡喃-4-酮、去氢齿孔酸、3-O-甲基山奈酚、山奈酚-3-O-(3,4-二乙酰-α-L-吡喃鼠李糖苷)、山奈酚-3-O-(2,4-二乙酰-α-L-吡喃鼠李糖苷)、鱼针草内酯、去氢硫色多孔菌酸、硫色多孔菌酸、变孔

孔菌酸D、反式-对-薄荷-6-烯-2,8-二醇，以及樟芝酸K。

5.如权利要求1或2所述的方法，其中该病毒为一B型肝炎病毒、一C型肝炎病毒，或一D型肝炎病毒。

6.如权利要求5所述的方法，其中该病毒为一B型肝炎病毒。

7.如权利要求1或2所述的方法，其中该病毒为一单纯疱疹病毒。

8.如权利要求1或2所述的方法，其中该病毒为一冠状病毒。

9.如权利要求8所述的方法，其中该冠状病毒选自由下列所组成的群组：严重急性呼吸道症候群(severe acute respiratory syndrome，SARS)、中东呼吸道症候群(Middle Eastrespiratory syndrome，MERS)，以及SARS-COV-2。

10.如权利要求8所述的方法，其中该冠状病毒为SARS-COV-2。

11.如权利要求1或2所述的方法，其中该化合物能有效抑制一病毒内的半胱胺酸蛋白酶。

12.如权利要求1或2所述的方法，其中该化合物能有效抑制一细胞内的牛磺胆酸钠协同转运多胜肽(sodium taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP)。

13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，进一步包括施用至少一种额外的抗病毒治疗剂。

14.一种通过抑制一病毒内的半胱胺酸蛋白酶以治疗或预防病毒感染的方法，包括对一有此需要的个体施用包含化合物或药学上可接受的盐或其混合物的组合物/药物组合物；其中所述化合物为权利要求1所的定义的化合物。

15.如权利要求14所述的方法，其中该化合物能有效抑制一细胞内的牛磺胆酸钠协同转运多胜肽(NTCP)。

16.一种组合/组合物/药物组合物，于治疗或预防病毒感染，包含抑制病毒中半胱氨酸蛋白酶有效量的化合物或其药学上可接受的盐或混合物以及药学上可接受的载体；其中所述化合物为权利要求1所的定义的化合物。

17.一种组合/组合物/药物组合物，于治疗或预防病毒感染，包含抑制细胞内牛磺胆酸钠协同转运多胜肽(NTCP)有效量的化合物或其药学上可接受的盐或混合物以及药学上可接受的载体；其中所述化合物为权利要求1所的定义的化合物。

18.如权利要求16或17所述的组合/组合物/医药组合物，其中该病毒为一RNA依赖性病毒。

19.如权利要求18所述的组合/组合物/医药组合物，其中该RNA依赖性病毒为一冠状病毒。

20.如权利要求19所述的组合/组合物/医药组合物，其中该冠状病毒为严重急性呼吸道症候群(severe acute respiratory syndrome，SARS)、中东呼吸道症候群(Middle Eastrespiratory syndrome，MERS)，以及SARS-COV-2。

21.如权利要求19所述的组合/组合物/医药组合物，其中该冠状病毒为SARS-CoV-2。

22.如权利要求16或17所述的组合/组合物/医药组合物，其中该病毒为一B型肝炎病毒、一C型肝炎病毒，或一D型肝炎病毒。

23.如权利要求22所述的组合/组合物/医药组合物，其中该病毒为一B型肝炎病毒(HBV)。

24.如权利要求16或17所述的组合/组合物/医药组合物，其中该病毒为一单纯疱疹病毒(HSV)。

25.一种如权利要求1所述的化合物、其药学上可接受的盐或其混合物在制备通过抑制病毒内的半胱胺酸蛋白酶来预防或治疗病毒感染的药物中的用途。

26.一种如权利要求1所述的化合物、其药学上可接受的盐或其混合物在制备通过抑制细胞内牛磺胆酸钠协同转运多胜肽(NTCP)来预防或治疗病毒感染的药物中的用途。

27.如权利要求25或26所述的用途，其中该病毒为一RNA依赖性病毒。

28.如权利要求27所述的用途，其中该RNA依赖性病毒为一冠状病毒。

29.如权利要求28所述的用途，其中该冠状病毒为严重急性呼吸道症候群(severeacute respiratory syndrome，SARS)、中东呼吸道症候群(Middle East respiratorysyndrome，MERS)，以及SARS-COV-2。

30.如权利要求29所述的用途，其中该冠状病毒为SARS-CoV-2。

31.如权利要求25或26所述的用途，其中该病毒为一B型肝炎病毒、一C型肝炎病毒，或一D型肝炎病毒。

32.如权利要求31所述的用途，其中该病毒为一B型肝炎病毒(HBV)。

33.如权利要求25或26所述的用途，其中该病毒为一单纯疱疹病毒(HSV)。

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