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CN115536739B - 一种glp-1受体和gcg受体共激动多肽衍生物的制备方法 - Google Patents

一种glp-1受体和gcg受体共激动多肽衍生物的制备方法 Download PDF

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CN115536739B CN202211175718.5A CN202211175718A CN115536739B CN 115536739 B CN115536739 B CN 115536739B CN 202211175718 A CN202211175718 A CN 202211175718A CN 115536739 B CN115536739 B CN 115536739B
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Abstract

本发明涉及一种GLP‑1受体和GCG受体共激动多肽衍生物的制备方法，通过该制备方法得到的GLP‑1受体和GCG受体共激动多肽衍生物纯度大于95％。

Description

一种GLP-1受体和GCG受体共激动多肽衍生物的制备方法
技术领域
本发明涉及多肽及其衍生物制备技术领域，尤其涉及一种GLP-1受体和GCG受体共激动多肽衍生物的制备方法。
背景技术
现代社会生活中，糖尿病及其并发症逐渐成为继心脑血管疾病和癌症之后又一具有严重危害的慢性非传染性疾病。糖尿病主要分为1型糖尿病和2型糖尿病，其中大多数患者为2型糖尿病患者(据统计，约占90％)，其特征为高血糖、相对缺乏胰岛素、胰岛素抵抗等。此外，研究表明，临床上80-90％的2型糖尿病患者伴有超重或肥胖。
目前，GLP-1衍生物因其具有血糖依赖性的肠促胰岛素分泌作用正逐渐成为2型糖尿病的主要治疗药物和研究热点。同时，GLP-1还具有抑制胃酸分泌、延迟胃排空、抑制食欲等作用，具有部分减重效果。GCG是在胰脏的α细胞中生成的激素，在机体寒冷、饥饿等应激状态下作用于肝脏，将肝脏中的糖原进行分解而提高血糖。此外，GCG在体内还具有促进脂肪降解、脂肪氧化、发热等作用(Diabetologia,2017,60,1851-1861)，长期给药可以通过增加能量代谢量而呈现出体重减轻药效。
胃泌酸调节素(OXM)是人体内的一种内源性GLP-1受体和GCG受体共激动多肽衍生物，其急性生理作用包括抑制胃排空、摄食以及胃和胰腺的外分泌、提升静息能量消耗等，已有研究证明OXM在动物模型中具有良好的降糖减重作用，明显优于现有GLP-1类药物，如索马鲁肽。但胃泌酸调节素存在的一些问题，如稳定性差、受体活性低等，导致其给药剂量偏大，限制了其应用。因此，具有良好的降糖减重作用的GLP-1和GCG受体的共激动多肽及其衍生物目前仍存在巨大的临床需求，正逐渐成为新的降糖减重研究热点。
目前，GLP-1受体和GCG受体共激动多肽衍生物可以通过化学合成方法，也可以通过构建重组工程菌发酵表达后再进行纯化修饰的生物发酵方法制备。专利CN114349828A介绍了一种GLP-1/GCG共激动多肽衍生物的化学合成方法，经过树脂的溶胀，树脂Fmoc保护基的脱除，Fmoc-Ser-Rink amide-MBHA Resin的合成，肽链的延长，Lys侧链的修饰，多肽的裂解，多肽的纯化等7步获得目标多肽衍生物。专利CN114591415提出了一种GLP-1/GCG共激动多肽衍生物的肽链的制备方法，通过在编码多肽基因的5'端添加SUMO标签的基因序列，从而形成融合基因，将该融合基因克隆至原核表达载体，并在大肠杆菌细胞中进行诱导表达，离心收集菌体后，超声破碎并离心取上清，然后通过镍柱纯化获得融合蛋白，最后SUMO蛋白酶酶切处理后，经反相纯化获得目标多肽。
而这些制备方法因其目标多肽的局限性无法直接用于制备具有不同多肽序列的GLP-1受体和GCG受体共激动多肽衍生物，因此，需要提供更多的GLP-1受体和GCG受体共激动多肽衍生物及其制备方法来满足需求。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种GLP-1受体和GCG受体共激动多肽衍生物的制备方法。
本发明中术语“GLP-1类似物”是指对人天然GLP-1氨基酸进行修饰获得的多肽，所述修饰包括去除和/或取代(置换)和/或添加(延长)一个或多个氨基酸残基，所述氨基酸可以是天然存在的氨基酸，也可以是人工合成的氨基酸。
本发明中，术语“受体激动剂”可被定义为与受体结合并引发天然配体典型的响应的化合物。完全激动剂可被定义为引发与天然配体相同量级的响应的激动剂(参见，例如，“Principles of Biochemistry”,AL Lehninger,DL Nelson,MMCox,第二版,WorthPublishers,1993,第763页)。因此，例如，“GLP-1受体激动剂”可被定义为能够与GLP-1受体结合并能够将其活化的化合物。
本发明中，术语“GCG受体激动剂”可被定义为能够与GCG受体结合并能够将其活化的化合物。
本发明中，“GLP-1受体和GCG受体共激动多肽”能表现出相对于天然胰高血糖素针对胰高血糖素受体活性的至少约10％-约500％或更大，并亦表现出相对于天然GLP-1针对GLP-1受体活性的约至少10％-约200％或更大。
本发明中，术语“肽”包含3个或更多个氨基酸且通常小于50个氨基酸的序列，其中氨基酸为天然存在的或非天然存在的氨基酸。非天然存在的氨基酸指不在体内天然存在的氨基酸，但其可被引入到本文所述的肽结构中。
本发明中，有关肽(例如GLP-1或GCG)的术语“衍生物”表示经化学修饰(如共价修饰等)的肽或其类似物。典型的修饰包括酰胺、糖类、烷基、酰基、酯等。
本发明中，术语“保护氨基酸”是指氨基酸的功能基团与其它基团反应而封闭了氨基酸功能基团活性的氨基酸衍生物。其中α-位芴甲氧羰基(Fmoc)-保护，末端-叔丁氧羰基(Boc)-保护是最重要的形式。
本发明中，术语“脂肪族二酸”包括直链或支链脂肪族二羧酸，其具有至少两个碳原子并为饱和或不饱和的。脂肪族二酸的非限定实例为琥珀酸、己二酸、辛二酸、癸二酸、十二烷二酸、十四烷二酸、十六烷二酸、十七烷二酸、十八烷二酸和二十烷二酸。
本发明提供了一种GLP-1受体和GCG受体共激动多肽衍生物的制备方法，所述衍生物通过GLP-1受体和GCG受体共激动多肽的第24位的氨基酸K残基上的ε氨基与脂肪酸侧链酰化连接。
所述多肽的氨基酸序列如下式所示：
X1X2X3GTFTSDYSX12YLX15X16X17X18AX20EFVX24WLLEGGPSSX34其中：
X1选自H，X2选自V，X3选自Q，X12选自R，X15选自E，X16选自E，X17选自R，X18选自R，X20选自Q，X24选自K，X34选自G-NH2；
或，X1选自H，X2选自I，X3选自Q，X12选自R，X15选自E，X16选自E，X17选自R，X18选自R，X20选自Q，X24选自K，X34选自G；
或，X1选自H，X2选自S，X3选自H，X12选自S，X15选自D，X16选自S，X17选自Q，X18选自A，X20选自H，X24选自K，X34选自G。
所述脂肪酸侧链选自HOOC(CH2)16CO-γ-Glu-(AEEA)2-或HOOC(CH2)18CO-γ-Glu-(AEEA)2-。
多肽衍生物通过所述多肽的第24位的氨基酸K残基上的ε氨基与脂肪酸侧链酰化连接；即所述多肽的K24的ε氨基与脂肪酸侧链连接。其中，“K数字”表示的是共激动多肽序列“数字”所表示位置的赖氨酸(K)，其ε-氨基与侧链进行连接；如“K24”表示为相应共激动多肽序列第24位的赖氨酸，并表示通过该赖氨酸的ε-氨基与相应脂肪酸侧链连接。
在本发明中，所述共激动多肽序列中尾端的“-NH2”表示在所述尾端，将尾端氨基酸羧基中的羟基替换为“-NH2”，即将尾端氨基酸的COOH修饰为CONH2。具体结构如下所示：
Figure BDA0003864269090000041
按照IUPAC命名法，HOOC(CH2)16CO-γ-Glu-(AEEA)2-可以被称为“[2-(2-[2-(2-[2-(2-)4-(17-羧基十七烷酰胺基)-4(S)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基]”。
按照IUPAC命名法，HOOC(CH2)18CO-γ-Glu-(AEEA)2-可以被称为“[2-(2-[2-(2-[2-(2-)4-(19-羧基十九烷酰胺基)-4(S)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基]”。
作为本发明的一种优选技术方案，本发明提供一组GLP-1受体和GCG受体共激动多肽衍生物，所述多肽衍生物或其药学上可接受的盐的氨基酸序列的通式如下式所示：
X1X2X3GTFTSDYSX12YLX15X16X17X18AX20EFVX24WLLEGGPSSX34，
所述衍生物的具体结构如表1所示：
表1
Figure BDA0003864269090000051
本发明中共激动多肽衍生物的制备方法包括如下步骤：
(1)将Fmoc-Linker-MBHA树脂或王氏树脂置于多肽合成仪的反应柱内进行溶胀去保护反应；
(2)将带有保护基团的甘氨酸和缩合剂加入反应柱，在催化剂的存在下进行偶联反应和脱保护反应，并按照肽链从C端到N端的序列，依次加入相应的带有保护基团的氨基酸，重复偶联反应和脱保护反应的步骤，直至肽链合成完毕，其中，用于连接侧链的氨基酸K在反应中使用的带有保护基团的形式为Fmoc-Lys(dde)-OH；
(3)肽链合成完毕后，脱除第24位的氨基酸K的dde保护基，然后偶联脂肪酸侧链，脂肪酸侧链依次偶联Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-γ-Glu-OTBU、HOOC(CH2)16CO-OTBU或HOOC(CH2)18CO-OTBU；
(4)将制备的多肽衍生物与树脂进行裂解、纯化，得到所述多肽衍生物。
作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤(1)为：将Fmoc-Linker-MBHA树脂或王氏树脂置于多肽合成仪的反应柱内，使用DCM进行溶胀后除去溶液；然后在惰性气体气氛中，加入哌啶/DMF溶液脱除保护基。
作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤(1)为：称取担载量为0.2-0.4左右的Fmoc-Linker-MBHA树脂或王氏树脂(wang resin)放入多肽合成仪的反应柱中，用DCM溶胀树脂25-35min，抽去溶液，用DMF清洗树脂2-3次，抽去溶液；加入适量的20％的哌啶/DMF溶液，在氮气鼓吹下反应3-6min，抽去溶液，再加入适量的20％的哌啶/DMF溶液，在氮气鼓吹下反应5-15min，接着用适量的DMF清洗树脂3-9次，得到脱除保护基的树脂。
作为本发明的一种具体实施方式，所述步骤(1)为：称取担载量为0.3左右的Fmoc-Linker-MBHA树脂或王氏树脂(wang resin)放入多肽合成仪的反应柱中，用DCM溶胀树脂30min，抽去溶液，用DMF清洗树脂2次，抽去溶液；加入适量的20％的哌啶/DMF溶液，在氮气鼓吹下反应5min，抽去溶液，再加入适量的20％的哌啶/DMF溶液，在氮气鼓吹下反应10min，接着用适量的DMF清洗树脂6次，得到脱除保护基的树脂。
作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤(2)为：称取Fmoc-Gly-OH和缩合剂TBTU，加入反应柱，加入适量DMF溶剂和一定量的碱DIEA，在氮气鼓吹下，室温反应1-2h，用Kaiser试剂(茚三酮显色法)监测反应过程；反应结束后，用DMF清洗树脂2-4次；加入适量的20％的哌啶/DMF溶液，在氮气鼓吹下反应3-6min，抽去溶液，再加入适量的20％的哌啶/DMF溶液，在氮气鼓吹下反应5-15min，接着用适量的DMF清洗树脂3-9次，按照序列从C端到N端的顺序，依次偶联；
其中，连接侧链使用的保护氨基酸为Fmoc-Lys(dde)-OH，最后一个保护氨基酸为Boc-His(Trt)-OH。
作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤(2)为：称取Fmoc-Gly-OH和缩合剂TBTU，加入反应柱，加入适量DMF溶剂和一定量的碱DIEA，在氮气鼓吹下，室温反应1-2h，用Kaiser试剂(茚三酮显色法)监测反应过程；反应结束后，用DMF清洗树脂3次；加入适量的20％的哌啶/DMF溶液，在氮气鼓吹下反应5min，抽去溶液，再加入适量的20％的哌啶/DMF溶液，在氮气鼓吹下反应10min，接着用适量的DMF清洗树脂6次，按照序列从C端到N端的顺序，依次偶联；
其中，连接侧链使用的保护氨基酸为Fmoc-Lys(dde)-OH，最后一个保护氨基酸为Boc-His(Trt)-OH。
作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤(3)为：肽链合成完毕后，利用水合肼/DMF溶液脱除第24位的氨基酸K的保护基团dde，然后按照主链偶联的方式，依次偶联Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-γ-Glu-OTBU、HOOC(CH2)16CO-OTBU或HOOC(CH2)18CO-OTBU。
作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤(3)为：肽链合成完毕后，利用2％的水合肼/DMF溶液脱除第24位的氨基酸K的保护基团dde，然后DMF清洗6-8次，然后按照主链偶联的方式，依次偶联Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-γ-Glu-OTBU、HOOC(CH2)16CO-OTBU或HOOC(CH2)18CO-OTBU。
作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤(4)为：按1g多肽树脂添加5-10mL裂解液的比例，将得到的连接有多肽衍生物的树脂置于预冷的裂解液中反应，反应后抽滤、反沉淀、然后利用色谱柱分离、干燥，得到所述多肽衍生物；所述裂解液的配制比例为：TFA:EDT:苯甲硫醚:苯酚:H2O＝88:4:3:3:2。
作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤(4)为：按1g多肽树脂添加8mL裂解液的比例，将得到的连接有多肽衍生物的树脂置于预冷的裂解液中反应，25-28℃搅拌反应1.5-3h；
反应结束后，反应液抽滤得到清液，缓慢加入预冷无水乙醚中，搅拌、静置15-30min后离心得白色固体，白色固体经常温乙醚离心洗涤3-6次，干燥，得到白色粉末粗肽；所述裂解液的配制比例为：TFA:EDT:苯甲硫醚:苯酚:H2O＝88:4:3:3:2。
作为本发明的一种具体实施方式，所述步骤(4)为：按1g多肽树脂添加8mL裂解液的比例，也可作适当调整，将得到的连接有多肽衍生物的树脂置于预冷60min的裂解液中，在26℃左右条件下搅拌反应2h。将所得的裂解液抽滤得到清液，缓慢加入预冷无水乙醚中，搅拌、静置20min，用离心机离心得到白色固体，再用常温乙醚离心洗涤4次，干燥，得到白色粉末粗肽。
将粗肽洗脱，色谱条件为C18-
Figure BDA0003864269090000081
柱(30mm*250mm)，流动相1：0.05M醋酸铵(氨水调pH值约8.0)，流动相2：乙腈。洗脱梯度为乙腈在25分钟内从31％变化到38％，得到纯度大于95％的样品。
之后用旋转蒸发仪旋去除乙腈，再用冷冻干燥机进行冻干，得到白色固体粉末。
本发明实施例提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点：
本发明提供了一种GLP-1受体和GCG受体共激动多肽衍生物的制备方法，通过该制备方法得到的目的多肽产物纯度大于95％。
本发明制备得到的GLP-1受体和GCG受体共激动多肽衍生物能够用于治疗胰岛素依赖性糖尿病，具有平衡的GLP-1受体和GCG受体激动活性，具备延长的作用时效，具有优异的降糖和减重效果。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面将对本发明的方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1：GLP-1受体和GCG受体共激动多肽的制备
本实施例提供了多种GLP-1受体和GCG受体共激动多肽衍生物及其制备方法，本实施例为化学合成方法，制备方法如下(以C-010为例)：
1 C-010粗肽的合成
1.1树脂的溶胀去保护
称取担载量为0.3左右的Fmoc-Linker-MBHA树脂放入反应柱中，用DCM溶胀树脂30min，抽去溶液，用DMF清洗树脂2次，抽去溶液。加入适量的20％的哌啶/DMF溶液，在氮气鼓吹下反应5min，抽去溶液，再加入适量的20％的哌啶/DMF溶液，在氮气鼓吹下反应10min，接着用适量的DMF清洗树脂6次，得到脱除Fmoc保护基的树脂。
1.2接肽反应
称取一定量的Fmoc-Gly-OH保护氨基酸和缩合剂TBTU，加入反应柱，加入适量DMF溶剂，加入一定量的碱DIEA，在氮气鼓吹下，室温反应1h-2h，用Kaiser试剂(茚三酮显色法)监测反应过程。反应结束后，用DMF清洗树脂3次。接着重复去保护步骤：加入适量的20％的哌啶/DMF溶液，在氮气鼓吹下反应5min，抽去溶液，再加入适量的20％的哌啶/DMF溶液，在氮气鼓吹下反应10min，接着用适量的DMF清洗树脂6次，按照序列从C端到N端的顺序，依次偶联。其中连接侧链使用的保护氨基酸为Fmoc-Lys(dde)-OH，最后一个保护氨基酸为Boc-His(Trt)-OH。
1.3侧链的修饰
偶联完所有主链保护氨基酸后，加入2％的水合肼/DMF溶液脱除Lys的侧链dde保护基，然后用DMF清洗树脂6-8次。按照主链偶联的方式，依次偶联Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-γ-Glu-OTBU、HOOC(CH2)18CO-OTBU。
1.4多肽的裂解和干燥
将一定量比例为TFA:EDT:苯甲硫醚:苯酚:H2O＝88:4:3:3:2的裂解液加入试管中，冰浴冷却60min。将合成好的粗肽树脂慢慢加入预冷的裂解液中，在26℃左右条件下搅拌反应2h。可按1g肽树脂需要8mL裂解液，也可作适当调整。
将以上所得的裂解液抽滤得到清液，缓慢加入预冷无水乙醚中，搅拌、静置20min，用离心机离心得到白色固体，再用常温乙醚离心洗涤4次，干燥，得到白色粉末粗肽。
2C-010的纯化
2.1分离
将粗肽洗脱，色谱条件为C18-
Figure BDA0003864269090000101
柱(30mm*250mm)，流动相1：0.05M醋酸铵(氨水调pH值约8.0)，流动相2：乙腈。洗脱梯度为乙腈在25分钟内从31％变化到38％，得到纯度大于95％的样品。
2.2旋蒸冻干
将得到的C-010溶液，用旋转蒸发仪旋去除乙腈，再用冷冻干燥机进行冻干，得到白色固体粉末。
其他尾端为-NH2的衍生物制备方法同C-010；而尾端为正常氨基酸，非尾端为-NH2的，在步骤1.1中选择王氏树脂(wang resin)代替Fmoc-Linker-MBHA树脂，其余步骤与本实施例相同。
实施例2：制备得到的共激动多肽衍生物的活性检测
(1)GLP-1体外活性检测
用Fire-Lumi荧光素酶检测试剂盒检测共激动多肽衍生物的体外GLP-1受体结合活性：选取HEK293/Luc/GLP1R细胞利用0.05％Trypsin消化液消化3分钟终止消化，用DMEM空白培养基调整细胞密度为8.0×105个/mL，50μL/孔接种于96孔细胞培养板中，于37℃、5％CO2条件下培养过夜。
配制测定培养液并稀释至8个梯度，每个稀释度做2个复孔，将稀释好的测定培养液加入培养好的细胞培养板中，每孔50μL，置于37℃、5％CO2条件下孵育6h，检测荧光强度，结果如表2所示：
表2
样品 索马鲁肽 C-003 C-010 B-012
EC50 1.3 5.9 4.8 16.2
(2)体外GCG受体结合活性测定
选取HEK293/GCGR/Ga15细胞加入0.05％TRYPSIN消化液消化，终止消化后用DMEM空白培养基调整细胞密度为8×105个/mL，5μL/孔接种于96孔细胞培养板中。
配制测定培养液(DMEM培养液添加0.5nM IBMX)，并稀释至8个梯度，每个稀释度做2个复孔。
将稀释好的测定培养液加入培养好的细胞培养板中，37℃孵育30min；加入cAMP-d2工作液，每孔5μL，加入cAMP Eu-Cryptate抗体工作液，每孔5μL，96孔板覆盖封板膜，室温孵育60min；培养结束后，去除封板膜，在FRET模式下(665nm，620nm)，用HTRF读取器进行检测，结果如表3所示：
表3
样品 索马鲁肽 C-003 C-010 B-012
EC50 - 5.2 4.8 8.7
(3)DIO小鼠减重效果研究
构建DIO小鼠模型，并依据体重随机分组，每组6只；每天给药一次，给药时间固定，前三天按0.15mg/kg剂量给药，之后按0.3mg/kg剂量给药，每次给药时检测体重，结果如表4所示：
表4
Figure BDA0003864269090000121
(4)C57BL/6J小鼠OGTT降糖效果研究
选取健康的雄性小鼠，适应性饲养7天，对小鼠依据体重随机分组，每组10只，按照2g/kg口服葡萄糖，并腹部皮下注射药物(或空白溶剂)，给药剂量为0.15mg/kg，给药体积为0.1mL/10g，进行血糖值检测，血糖检测前禁食不禁水，禁食16h后获得禁食体重(以计算给药量及葡萄糖剂量)。在给药前测定给药前0h血糖，然后，皮下注射空白溶剂或药物溶液。在给药3h后对动物口服填喂葡萄糖(2g/Kg)，在口服葡萄糖后15min、30min、60min和120min检测血糖，结果如表5所示：
表5
Figure BDA0003864269090000122
Figure BDA0003864269090000131
注：“*”指的是，相对于模型对照组，p＜0.05；“**”指的是，相对于模型对照组，p＜0.01。
按照相同的方法，分别测试了模型对照组、C-010组，降糖实验结果如表6所示：
表6
Figure BDA0003864269090000132
注：“*”指的是，相对于模型对照组，p＜0.05；“**”指的是，相对于模型对照组，p＜0.01。
由此可见，根据本发明方法制备得到的GLP-1受体和GCG受体共激动多肽衍生物纯度高达95％，并能保证产品的降糖和减重活性。
本实验所有数据的统计分析均使用SPSS软件进行。所有数值以均数±标准差(mean±SD)表示。对于正态分布数据，采用单因素方差分析(one-way ANOVA)比较组间差异。对于非正态分布数据，采用Kruskal-Wallis H检验或Mann-Whitney U检验分析组间差异。相关性分析采用Spearman检验。对于所有分析，P<0.05认为有统计学意义。
需要说明的是，在本文中，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种GLP-1受体和GCG受体共激动多肽衍生物的制备方法，其特征在于，所述衍生物通过GLP-1受体和GCG受体共激动多肽的第24位的氨基酸K残基上的ε氨基与脂肪酸侧链酰化连接；
所述脂肪酸侧链选自HOOC(CH2)16CO-γ-Glu-(AEEA)2-或HOOC(CH2)18CO-γ-Glu-(AEEA)2-；
所述制备方法包括如下步骤：
(1)将Fmoc-Linker-MBHA树脂或王氏树脂置于多肽合成仪的反应柱内进行溶胀去保护反应；
(2)将带有保护基团的甘氨酸和缩合剂加入反应柱，在催化剂的存在下进行偶联反应和脱保护反应，并按照肽链从C端到N端的序列，依次加入相应的带有保护基团的氨基酸，重复偶联反应和脱保护反应的步骤，直至肽链合成完毕，其中，用于连接侧链的氨基酸K在反应中使用的带有保护基团的形式为Fmoc-Lys(dde)-OH；
(3)肽链合成完毕后，脱除第24位的氨基酸K的dde保护基，然后依次偶联Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-γ-Glu-OTBU、HOOC(CH2)16CO-OTBU或HOOC(CH2)18CO-OTBU；
(4)将制备的多肽衍生物与树脂进行裂解、纯化，得到所述多肽衍生物；
所述多肽的氨基酸序列如下式之一所示：
HVQGTFTSDYSRYLEERRAQEFVKWLLEGGPSSG-NH2；
HIQGTFTSDYSRYLEERRAQEFVKWLLEGGPSSG；或
HSHGTFTSDYSSYLDSQAAHEFVKWLLEGGPSSG。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)为：将Fmoc-Linker-MBHA树脂或王氏树脂置于多肽合成仪的反应柱内，使用DCM进行溶胀后除去溶液；然后在惰性气体气氛中，加入哌啶/DMF溶液脱除保护基。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)为：称取担载量为0.2-0.4的Fmoc-Linker-MBHA树脂或王氏树脂放入多肽合成仪的反应柱中，用DCM溶胀树脂25-35min，抽去溶液，用DMF清洗树脂2-3次，抽去溶液；加入20％的哌啶/DMF溶液，在氮气鼓吹下反应3-6min，抽去溶液，再加入20％的哌啶/DMF溶液，在氮气鼓吹下反应5-15min，接着用DMF清洗树脂3-9次，得到脱除保护基的树脂。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)为：称取担载量为0.3的Fmoc-Linker-MBHA树脂或王氏树脂放入多肽合成仪的反应柱中，用DCM溶胀树脂30min，抽去溶液，用DMF清洗树脂2次，抽去溶液；加入20％的哌啶/DMF溶液，在氮气鼓吹下反应5min，抽去溶液，再加入20％的哌啶/DMF溶液，在氮气鼓吹下反应10min，接着用DMF清洗树脂6次，得到脱除保护基的树脂。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)为：称取Fmoc-Gly-OH和缩合剂TBTU，加入反应柱，加入DMF溶剂和碱DIEA，在氮气鼓吹下，室温反应1-2h；反应结束后，用DMF清洗树脂2-4次；加入20％的哌啶/DMF溶液，在氮气鼓吹下反应3-6min，抽去溶液，再加入20％的哌啶/DMF溶液，在氮气鼓吹下反应5-15min，接着用DMF清洗树脂3-9次，按照序列从C端到N端的顺序，依次偶联；
其中，连接侧链使用的保护氨基酸为Fmoc-Lys(dde)-OH，最后一个保护氨基酸为Boc-His(Trt)-OH。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)为：称取Fmoc-Gly-OH和缩合剂TBTU，加入反应柱，加入DMF溶剂和碱DIEA，在氮气鼓吹下，室温反应1-2h；反应结束后，用DMF清洗树脂3次；加入20％的哌啶/DMF溶液，在氮气鼓吹下反应5min，抽去溶液，再加入20％的哌啶/DMF溶液，在氮气鼓吹下反应10min，接着用DMF清洗树脂6次，按照序列从C端到N端的顺序，依次偶联；
其中，连接侧链使用的保护氨基酸为Fmoc-Lys(dde)-OH，最后一个保护氨基酸为Boc-His(Trt)-OH。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)为：肽链合成完毕后，利用水合肼/DMF溶液脱除第24位的氨基酸K的保护基团dde，然后按照主链偶联的方式，依次偶联Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-γ-Glu-OTBU、HOOC(CH2)16CO-OTBU或HOOC(CH2)18CO-OTBU。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)为：肽链合成完毕后，利用2％的水合肼/DMF溶液脱除第24位的氨基酸K的保护基团dde，然后DMF清洗6-8次，然后按照主链偶联的方式，依次偶联Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-γ-Glu-OTBU、HOOC(CH2)16CO-OTBU或HOOC(CH2)18CO-OTBU。
9.根据权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)为：按1g多肽树脂添加5-10mL裂解液的比例，将得到的连接有多肽衍生物的树脂置于预冷的裂解液中反应，反应后抽滤、反沉淀、然后利用色谱柱分离、干燥，得到所述多肽衍生物；所述裂解液的配制比例为：TFA:EDT:苯甲硫醚:苯酚:H2O＝88:4:3:3:2。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)为：按1g多肽树脂添加8mL裂解液的比例，将得到的连接有多肽衍生物的树脂置于预冷的裂解液中反应，25-28℃搅拌反应1.5-3h；
反应结束后，反应液抽滤得到清液，加入预冷无水乙醚中，搅拌、静置15-30min后离心得白色固体，白色固体经常温乙醚离心洗涤3-6次，干燥，得到白色粉末粗肽；
所述裂解液的配制比例为：TFA:EDT:苯甲硫醚:苯酚:H2O＝88:4:3:3:2。
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