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CN115505636A - 用于诊断重症牙周炎及其分期的唾液口腔菌群生物标志物 - Google Patents

用于诊断重症牙周炎及其分期的唾液口腔菌群生物标志物 Download PDF

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CN115505636A
CN115505636A CN202211236975.5A CN202211236975A CN115505636A CN 115505636 A CN115505636 A CN 115505636A CN 202211236975 A CN202211236975 A CN 202211236975A CN 115505636 A CN115505636 A CN 115505636A
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张舒涵
曹成红
张义涛
秦丹蕾
安梓骞
韦佳明
常敏静
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Stomatological Hospital Of Shanxi Medical University
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Abstract

本发明涉及生物医学技术领域，公开了一种用于诊断重症牙周炎及其分期的唾液口腔菌群生物标志物。所述唾液口腔菌群生物标志物包括c_c_Spirochaetia、o_o_Spirochaetales、g_g_Treponema、p_p_Spirochaetota、f_f_Spirochaetaceae、o_o_Bacteroidales。将其用于预测牙周炎患病情况及临床分级的辅助诊断，检测特异性好(100％)，灵敏度高(98％)，具有指示牙周炎组织微生物菌群的状况，能指导牙周炎临床诊断方式及用药的调整以降低临床诊断误诊漏诊的概率；而且将生物标志物的丰度作为输入指标，利用芯片技术，即能够预测牙周炎患病情况，在牙周炎的预防、高效诊断及临床分级等方面的有着重大用途。

Description

用于诊断重症牙周炎及其分期的唾液口腔菌群生物标志物
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体为一种用于诊断重症牙周炎及其分期的唾液口腔菌群生物标志物。
背景技术
牙周炎是一种发生在牙支持组织上的炎症性感染性疾病，发病率高达85％，我国患病人数已达10亿人。从牙龈边缘龈沟处开始，逐渐向深部发展，可以破坏牙周膜牙槽骨以及牙骨质。牙周炎临床表现为牙周溢脓、牙齿松动。牙周炎患者初期症状不明显，疾病发展过程中会出现咀嚼无力、牙龈肿胀、出血牙周袋溢脓、口臭、牙松动以及牙伸长、倾斜、移位等，严重者可发生牙脱落。除了牙周炎对口腔健康的实质性负面影响外，这里还有大量证据证明牙周炎具有全身性影响，以及其是多种全身性疾病的危险因素，包括心脏病(例如动脉粥样硬化、中风)、糖尿病、妊娠并发症、类风湿关节炎以及呼吸道感染。并且重症牙周炎并发全身疾病的风险进一步增大。
而当前的诊断依赖于牙科专业人员对口腔组织情况(颜色、肿胀、探查的出血程度、探查口袋深度的出血程度以及基于口腔X射线的骨脱落)进行不精确的主观临床检查。只能诊断已发生牙周破坏、有临床症状的牙周炎。这些常规方法耗时以及所使用的某些技术(口袋深度、X射线)反映了历史事件，诸如过去的疾病活动，而不是当前的疾病活动或对进一步疾病的敏感性。虽然牙周炎可以在从轻度到晚期疾病的整个严重程度范围内自己表现出来，在目前临床上为了容易地评估病情的严重性，牙科医生经常将患有牙周炎的患者分类为两组——患有轻度牙周炎患者和患有晚期牙周炎患者。然而，进行这种评估的可用方法涉及劳动密集型过程，使得牙科医生无法对每个患者和/或每次就诊进行例行操作，并且这是不可能由用户执行的(自诊断)，因此常会错过早期重症牙周炎的诊断，而使疾病发展到后期引发更加严重的后果。因此，期望更客观、更快、准确、更易于使用的诊断，其被期望优选也可以由非专业人员执行。从而，期待测量现有疾病活动以及可能的对象对进一步的牙周疾病的敏感性。
唾液或口腔液长期以来被提倡作为口腔和一般疾病的诊断液，以及随着微型生物传感器的出现，用于快速椅旁测试的床旁检测获得了更大的科学和临床兴趣，特别是对于牙周疾病的检测，口腔中附着的各种菌群的生物标志物可能会由于邻近而容易地遗留在唾液中，且大量的研究表明，口腔菌群的失调是牙周炎患病的主要原因，这表明唾液菌群生物标志物具有用于牙周疾病检测诊断的强大潜力。
生物标志物代表了支持临床表现的生物学指标，以及它们是诊断牙周疾病临床结果的客观测量。最终，经过验证的生物标志物可以被用于评估未来疾病的风险、在最早阶段识别疾病、识别对初始治疗的反应、以及允许实施预防策略。
先前限制针对唾液生物标记物的即时测试(point-of-care test)的发展的因素其中一个就是缺乏准确的生物标记物。期望提供一种更简单的过程以及特别的仅需要从患者获得少量唾液样本的过程(并且可能的，由患者他或她自己获得)。期望将这种样本输入体外诊断设备中，基于测量，其将允许对唾液样本进行分类，从而其可以给出患者是否患有重症牙周炎的判断。
发明内容
针对上述问题本发明提供了一种用于诊断重症牙周炎及其分期的唾液口腔菌群生物标志物。
为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：
第一方面，本发明提供一种用于诊断重症牙周炎及其分期的唾液口腔菌群生物标志物，包括c_c_Spirochaetia、o_o_Spirochaetales、g_g_Treponema、p_p_Spirochaetota、f_f_Spirochaetaceae、o_o_Bacteroidales。
第二方面，本发明提供上述唾液口腔菌群生物标志物在制备诊断重症牙周炎及其分期产品中的应用。
进一步，所述产品包括试剂盒及芯片。
再进一步，所述试剂盒及芯片是用于检测唾液样本中生物标志物c_c_Spirochaetia、o_o_Spirochaetales、g_g_Treponema、p_p_Spirochaetota、f_f_Spirochaetaceae、o_o_Bacteroidales丰度的。
进一步，所述试剂盒包含用于检测唾液样本中生物标志物的试剂。
所述芯片包括固相载体和固定在固相载体上用于检测唾液样本中生物标志物的试剂。
再进一步，所述试剂包括宏基因组测序试剂、16S rRNA扩增子测序试剂、微滴式数字PCR检测试剂、qPCR定量检测试剂中的至少一种。
更进一步，所述试剂还包括所述生物标志物的特异性引物、探针、反义寡核苷酸、适配体，和/或抗体。
第三方面，本发明提供了一种基于上述生物标志物用于诊断重症牙周炎及其分期的系统，所述系统包括核酸样本分离单元、测序单元、数据处理单元和结果判定单元；所述核酸样本分离单元用于从检测对象中分离唾液菌群的核酸样本；所述测序单元用于对核酸样本分离单元分离得到的唾液菌群核酸样本进行测序，以获得测序结果；所述数据处理单元用于根据测序单元得到的测序结果，对唾液菌群中的微生物标志物c_c_Spirochaetia、o_o_Spirochaetales、g_g_Treponema、p_p_Spirochaetota、f_f_Spirochaetaceae、o_o_Bacteroidales的相对丰度进行检测，对所得到的相对丰度值进行分析；所述结果判定单元用于将数据处理单元得到的微生物标志物的相对丰度值与设定诊断值进行比较，得出诊断结果。
第四方面，本发明提供了一种计算机可读存储介质，所述介质上存储有计算机程序，该计算机程序被执行时实现上述系统中核酸样本分离单元、测序单元、数据处理单元和结果判定单元的功能。
与现有技术相比本发明具有以下优点：
1、本发明提供了一种唾液口腔菌群生物标志物，可用于预测牙周炎患病情况及临床分级的辅助诊断，检测特异性好(100％)，灵敏度高(98％)，具有指示牙周炎组织微生物菌群的状况，指导牙周炎临床诊断方式及用药的调整以降低临床诊断误诊漏诊的概率；
2、本发明使用特定的唾液口腔菌群生物标志物c_c_Spirochaetia、o_o_Spirochaetales、g_g_Treponema、p_p_Spirochaetota、f_f_Spirochaetaceae、o_o_Bacteroidales丰度作为输入指标，利用芯片技术，获取微生物丰度值即能够预测牙周炎患病情况。
附图说明
图1为牙周组织微生物群落中关键代谢途径的功能基因在疾病与健康样本间的丰度差异，其中H代表健康，P代表疾病。
图2为正常人(左侧)及牙周炎患者(右侧)属水平上的差异菌
图3为物种进化树图展示各菌群进化关系及不同样本间的差异菌群
图4为LDA值分布柱状图
图5为显示唾液口腔菌群生物标志物c_c_Spirochaetia、o_o_Spirochaetales、g_g_Treponema、p_p_Spirochaetota、f_f_Spirochaetaceae、o_o_Bacteroidales诊断重症牙周炎的ROC曲线结果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例，进一步阐述本发明，但仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。在以下实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
为了评估唾液微生物群的组成能够作为重症牙周炎的诊断标志物，本发明通过收集重症牙周炎及健康人的唾液样本，进行了全基因组测序并采用生物信息学分析方法对测序数据进行了统计分析，发现了重症牙周炎相关的唾液微生物菌群，将唾液微生物菌群与重症牙周炎患者信息整合，最大程度的预测诊断重症牙周炎患者。本发明通过全基因组测序首次发现了唾液中的微生物标志物c_c_Spirochaetia、o_o_Spirochaetales、g_g_Treponema、p_p_Spirochaetota、f_f_Spirochaetaceae、o_o_Bacteroidales在重症牙周炎患者和健康人之间呈现显著性的差异，表明了c_c_Spirochaetia、o_o_Spirochaetales、g_g_Treponema、p_p_Spirochaetota、f_f_Spirochaetaceae、o_o_Bacteroidales可作为诊断重症牙周炎的生物标志物。
本发明的菌群标志物通过新一代三维纳米孔三代测序技术检测牙周炎患者口腔微生物组成，挖掘牙周炎患者口腔内微生态特征，从而确定牙周炎患者口腔菌群的特异性核苷酸序列。
实施例1
筛选重症牙周炎患者和健康者唾液中的差异的菌群
(1)样本采集及处理
在患者就诊过程中，由口腔科医生负责完成唾液样本的收集，保存于唾液样本采集管，并于-80℃冻存。使用蛋白酶K裂解/酚氯仿法从唾液样本中提取DNA，冻存于-80℃。
(2)牙周组织微生物16S rRNA扩增子测序：
提取后的唾液样本微生物DNA使用通用引物357F 5'-ACTCCTACGGRAGGCAGCAG-3'(SEQ ID NO:1)和806R 5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'(SEQ ID NO:2)作为扩增引物，使用UCPMultiplex PCR Kit(Qiagen)进行16S rRNA基因V3-V4区扩增，扩增后采用QIAseqUltralow Input Library Kit进行文库构建。
第一轮PCR反应的总反应体积为25μL，加入1-2μL的DNA模板，250mM dNTPs，上、下游引物各0.25mM，1X反应缓冲液和0.5U Phusion DNA聚合酶；
PCR条件如下：在94℃下预变性2分钟；然后在94℃下变性30秒，在56℃下退火30秒，在72℃下延伸30秒，25个循环；最后在72℃下延伸5分钟。并用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，检测效果较好的样本于2％琼脂糖凝胶电泳切胶回收，以回收产物为模板进行一次8循环的PCR扩增(所述反应条件是94℃3分钟；然后94℃30秒，56℃30秒，72℃30秒，8个循环；最后在72℃延长5分钟)；
将Illumina平台测序所需要的接头，测序引物，标签序列添加到目的片段两端。全部PCR产物采用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)进行回收，并用FTC-3000TMReal-Time PCR仪进行荧光定量，均一化混匀后完成文库构建，在Illumina MiSeq 2x300bp平台上完成测序。
(3)唾液微生态扩增子数据的生物信息学分析：
将测序数据导入ASIC菌群检测芯片分析平台，采用Microbial Genomics Module进行扩增子数据分析。具体分析流程如下：对低质量及嵌合体数据进行过滤后，测序获得的reads比对口腔菌群智能样本数据库，获得牙周组织微生物群落中关键代谢途径的功能基因在疾病与健康样本间的丰度差异(参考图1)。
实施例2
筛选牙周炎患者的特征口腔菌群
(1)研究队列的建立
本研究收集的研究对象共62例，其中重症牙周炎患者(PD)34和31例健康对照，重症牙周炎患者经过病理确诊。
(2)筛选重症牙周炎和健康对照样本的唾液中差异的菌群
唾液菌群微生态分析根据实施例1所述方法执行。采用线性判别分析效应大小(linear discriminant analysis effectsize，LEfSe)方法分析牙周炎患者和健康对照的特征菌群。
首先，采用非参数检验Kruskal-Wallis秩和检验来识别患病牙周组织微生物在不同分类学水平的存在的丰度差异，然后使用线性判别分析(linear discriminantanalysis，LDA)来估计每个差异丰度特征的大小。本研究采用P<0.05作为Kruskal-Wallis秩和检验中判断差异存在统计学意义的标准，采用LDA>2.0作为判断将菌群纳入牙周炎特征菌株的标准。LEfSe分析的结果通过柱状图和进化树分支图进行可视化。参考图2，图2展示正常人(左侧)及牙周炎患者(右侧)属水平上的差异菌；图3为物种进化树图展示各菌群进化关系及不同样本间的差异菌群；图4为LDA值分布柱状图。
34例牙周炎患者唾液中菌株c_c_Spirochaetia、o_o_Spirochaetales、g_g_Treponema、p_p_Spirochaetota、f_f_Spirochaetaceae、o_o_Bacteroidales的相对丰度显著高于31例正常人(2.251％vs 0.080％，P＝0.005)。经受试者工作曲线分析(receiveroperating characteristic curve，ROC)发现，采用牙c_c_Spirochaetia、o_o_Spirochaetales、g_g_Treponema、p_p_Spirochaetota、f_f_Spirochaetaceae、o_o_Bacteroidales菌种相对丰度作为检验变量，ROC曲线的曲线下面积(Area under curve，AUC)为最大可达0.815。
实施例3
采用患病牙周组织微生物标记物早期诊断牙周炎患者的诊断效能评估实验
(1)牙周炎患者验证队列的收集与检测
按照实施例2的方案收集115例重症牙周炎患者和34例正常人牙周组织样品。牙周口腔微生态检测方案按实施例1。
(2)采用牙周组织微生物标记物早期诊断牙周炎患者的诊断效能评估。
检测结果提示，115例重症牙周炎患者c_c_Spirochaetia、o_o_Spirochaetales、g_g_Treponema、p_p_Spirochaetota、f_f_Spirochaetaceae、o_o_Bacteroidales的相对丰度明显高于正常人。经受试者工作曲线分析(receiver operatingcharacteristic curve，ROC)发现，采用c_c_Spirochaetia、o_o_Spirochaetales、g_g_Treponema、p_p_Spirochaetota、f_f_Spirochaetaceae、o_o_Bacteroidales的相对丰度作为检验变量，ROC曲线的曲线下面积(Area under curve，AUC)都超0.700
上述结果提示，采用c_c_Spirochaetia、o_o_Spirochaetales、g_g_Treponema、p_p_Spirochaetota、f_f_Spirochaetaceae、o_o_Bacteroidales作为预早期诊断重症牙周炎具有较高的诊断效能。
本发明提供了一种早期诊断重症牙周炎的菌群标志物c_c_Spirochaetia、o_o_Spirochaetales、g_g_Treponema、p_p_Spirochaetota、f_f_Spirochaetaceae、o_o_Bacteroidales，可用于早期诊断重症牙周炎，其检测特异性好(100％)，灵敏度高(98％)，具有指示患病口腔微生物菌群的状况，指导口腔微生态的调整以降低牙周炎患者病情加重的可能性；并且只用特定的牙c_c_Spirochaetia、o_o_Spirochaetales、g_g_Treponema、p_p_Spirochaetota、f_f_Spirochaetaceae、o_o_Bacteroidales丰度作为输入指标，不局限于测量手段，只要能获取微生物丰度值的实验手段，即能够辅助早期诊断重症牙周炎。如宏基因组测序、16S rRNA扩增子测序、微滴式数字PCR检测、qPCR定量检测。
实施例4
一种用于诊断重症牙周炎及其分期的系统，包括：
核酸样本分离单元：用于从检测对象中分离唾液菌群的核酸样本；
测序单元：用于对核酸样本分离单元分离得到的唾液菌群核酸样本进行测序，以获得测序结果；
数据处理单元：用于根据测序单元得到的测序结果，对唾液菌群中的微生物标志物c_c_Spirochaetia、o_o_Spirochaetales、g_g_Treponema、p_p_Spirochaetota、f_f_Spirochaetaceae、o_o_Bacteroidales的相对丰度进行检测，对所得到的相对丰度值进行分析；
结果判定单元：用于将数据处理单元得到的微生物标志物的相对丰度值与设定诊断值进行比较，得出诊断结果。
一种计算机可读存储介质，存储有计算机程序，该计算机程序被执行时实现上述系统中核酸样本分离单元、测序单元、数据处理单元和结果判定单元的功能。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种用于诊断重症牙周炎及其分期的唾液口腔菌群生物标志物，其特征在于，所述生物标志物包括c_c_Spirochaetia、o_o_Spirochaetales、g_g_Treponema、p_p_Spirochaetota、f_f_Spirochaetaceae、o_o_Bacteroidales。
2.如权利要求1所述的唾液口腔菌群生物标志物在制备诊断重症牙周炎及其分期产品中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述产品包括试剂盒及芯片。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒及芯片是用于检测唾液样本中生物标志物c_c_Spirochaetia、o_o_Spirochaetales、g_g_Treponema、p_p_Spirochaetota、f_f_Spirochaetaceae、o_o_Bacteroidales丰度的。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述试剂盒包含用于检测唾液样本中生物标志物的试剂。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述芯片包括固相载体和固定在固相载体上用于检测唾液样本中生物标志物的试剂。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于：所述试剂包括宏基因组测序试剂、16SrRNA扩增子测序试剂、微滴式数字PCR检测试剂、qPCR定量检测试剂中的至少一种。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述试剂还包括所述生物标志物的特异性引物、探针、反义寡核苷酸、适配体，和/或抗体。
9.一种基于权利要求1所述生物标志物用于诊断重症牙周炎及其分期的系统，其特征在于：所述系统包括核酸样本分离单元、测序单元、数据处理单元和结果判定单元；所述核酸样本分离单元用于从检测对象中分离唾液菌群的核酸样本；所述测序单元用于对核酸样本分离单元分离得到的唾液菌群核酸样本进行测序，以获得测序结果；所述数据处理单元用于根据测序单元得到的测序结果，对唾液菌群中的微生物标志物c_c_Spirochaetia、o_o_Spirochaetales、g_g_Treponema、p_p_Spirochaetota、f_f_Spirochaetaceae、o_o_Bacteroidales的相对丰度进行检测，对所得到的相对丰度值进行分析；所述结果判定单元用于将数据处理单元得到的微生物标志物的相对丰度值与设定诊断值进行比较，得出诊断结果。
10.一种计算机可读存储介质，其特征在于：所述介质上存储有计算机程序，该计算机程序被执行时实现权利要求8所述系统中核酸样本分离单元、测序单元、数据处理单元和结果判定单元的功能。
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