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CN115135336A - 通过胰岛素类似物的超分子peg化实现的稳定的单体胰岛素制剂 - Google Patents

通过胰岛素类似物的超分子peg化实现的稳定的单体胰岛素制剂 Download PDF

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CN115135336A
CN115135336A CN202080096407.2A CN202080096407A CN115135336A CN 115135336 A CN115135336 A CN 115135336A CN 202080096407 A CN202080096407 A CN 202080096407A CN 115135336 A CN115135336 A CN 115135336A
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insulin
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peg
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凯特琳·麦卡瓦
安东·A·A·史密斯
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Leland Stanford Junior University
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Abstract

通过胰岛素或胰岛素类似物的超分子PEG化，实现了稳定的单体胰岛素制剂，并提供一种治疗糖尿病、管理或降低血糖的方法。

Description

通过胰岛素类似物的超分子PEG化实现的稳定的单体胰岛素 制剂
相关申请
本申请要求于2019年12月13日提交的美国临时申请第62/948,159号的优先权的权益，该申请通过引用被整体并入本文。
政府权利
本发明根据由美国国立卫生研究院(National Institute of Health)授予的批准第R01DK119254号在政府支持下进行。美国政府在本发明中具有某些权利。
技术领域
本文提供了通过胰岛素或胰岛素类似物的超分子PEG化实现的稳定的单体胰岛素制剂，及其在治疗糖尿病或管理或降低血糖水平中的使用方法。
背景
全世界超过4000万患者患有1型糖尿病。在这些患者中，胰岛素产生的损失导致如果没有通过每日皮下注射或通过用泵输注到皮下组织的外源性胰岛素递送就无法处理葡萄糖。保持严格的血糖控制对于防止严重的长期副作用如肾脏疾病、心脏病、视力丧失和截肢至关重要。患者必须在进餐时递送精心计算的胰岛素团注(insulin bolus)，以减少血糖波动(excursion)；然而，皮下施用后胰岛素的药代动力学与餐后生理需求不匹配。即使是目前商业上的“速效”胰岛素类似物制剂Humalog(赖脯胰岛素(insulin lispro))、Novolog(门冬胰岛素(insulin aspart))和Apidra(谷赖胰岛素(insulin glulisine))都表现出延迟起效～20-30分钟，峰值作用在～60-90分钟，并且总作用持续时间～3-4小时。
目前的“快速作用”胰岛素类似物抑制二聚体形成，并通过氨基酸修饰将平衡转移到单体状态。然而，胰岛素单体是不稳定的，并迅速聚集形成淀粉样原纤维。胰岛素主要被配制为六聚体，以防止胰岛素聚集。Novolog(门冬胰岛素)和Humalog(赖脯胰岛素)在磷酸钠缓冲液中配制，相对于胰岛素六聚体，锌离子摩尔过量三倍。含锌的制剂稳定了T6形成中的六聚态，并且已知六聚体的解离是皮下吸收和起效的限速步骤。与之相比，Apidra(谷赖胰岛素)是不含锌的制剂，并且用表面活性剂聚山梨酸酯20作为稳定剂配制。Apidra显示出略微更快的起效，但总体上在体内对葡萄糖水平的控制与Novolog和Humalog相似，表明仅去除锌不足以获得超快速作用的单体胰岛素制剂。
赋形剂是药物制剂中非活性的成分，执行许多功能，并且可以促进改进的蛋白质稳定性、溶解度和吸收。胰岛素类似物的制剂含有多种赋形剂，包括张力剂、防腐剂和稳定剂，这些赋形剂被选择来增强胰岛素的稳定性。甘油或氯化钠通常作为张力剂添加到胰岛素制剂中，而苯酚和/或间甲酚作为肠胃外防腐剂添加。甘油是Humalog和Novolog制剂二者中使用的张力剂，甘油的掺入被证明增加制剂中胰岛素的稳定性。此外，除了抗菌特性外，苯酚和间甲酚通过在二聚体之间形成氢键来稳定R6胰岛素六聚体。这表明即使在没有锌的情况下，酚类防腐剂也可有助于可以减缓胰岛素从皮下空间的吸收的高阶胰岛素结构。
配制单体胰岛素要求新的赋形剂，这些赋形剂不促进R6六聚体，但仍赋予胰岛素足够的稳定性，以防止随着时间聚集和变性。共价PEG化已经成功地作为一种稳定制剂中的胰岛素的策略，然而，与PEG化相关的延长的体内药代动力学是快速作用胰岛素不期望的。最近的研究表明，蛋白质的非共价修饰是增强其在制剂中的稳定性的一种策略。特别地，将聚乙二醇(PEG)链缀合到葫芦[7]脲(cucurbit[7]uril)(CB[7])创建了一种使用赋形剂CB[7]-PEG的主客体结合用于非共价PEG化工具。CB[7]-PEG对末端芳香族氨基酸如胰岛素上发现的N末端苯丙氨酸有强的结合亲和力，使其成为理想的主客体结合候选物。CB[7]-PEG与胰岛素的动态结合有望作为一种稳定胰岛素而不促进胰岛素六聚体的策略。
了解当前商业制剂中赋形剂的选择是设计下一代超快速作用胰岛素制剂的关键的第一步，这些制剂具有更接近地模拟内源性药代动力学的潜力，以解决上述未满足的需求。
概述
本发明涉及一种通过选择促进单体状态的制剂赋形剂而获得的稳定的单体胰岛素制剂。在本发明方法的实施方案中，CB[7]-PEG可用于稳定这些制剂，使得胰岛素/CB[7]-PEG复合物具有比胰岛素六聚体更快的扩散速率。
当前的“快速作用”胰岛素类似物含有氨基酸修饰，旨在抑制二聚体的形成，并将缔合状态的平衡向单体状态转移。然而，胰岛素单体高度不稳定，并且目前的配制技术要求胰岛素主要以六聚体存在，以防止聚集成无活性和免疫原性淀粉样蛋白。因此，胰岛素制剂赋形剂传统上选择为促进胰岛素聚集成六聚体形式，以增强制剂稳定性。本发明的方法开发了一种用于胰岛素类似物(包括门冬胰岛素和赖脯胰岛素)的超分子PEG化的新的赋形剂，以增强制剂中胰岛素单体的稳定性和最大限度地提高其普遍性。利用多种技术，使用制剂赋形剂(张力剂和肠胃外防腐剂)，实现具有70％-80％单体和超分子PEG化灌输赋予的在压力老化下超过100h的稳定性而不改变胰岛素缔合状态的胰岛素类似物制剂。相比较而言，商业“快速作用”制剂含有少于1％的单体，并且在相同的压力老化条件下仅保持稳定10h。本发明的制剂方法实现了具有短作用持续时间的下一代超快速胰岛素制剂，能够有效地降低糖尿病治疗中餐后低血糖的风险。
附图简述
图1A是说明胰岛素缔合状态对吸收动力学的贡献的示意图；图1B和图1C是比较商业“快速作用”胰岛素制剂和根据本发明实施方案的制剂的活性曲线。
图2A-图2C说明赖脯胰岛素与不同制剂赋形剂的缔合状态，其中图2A提供SEC-MALS洗脱图谱；图2B绘制赖脯胰岛素缔合状态的分布的数均分子量；和图2C图解说明每种制剂中单体、二聚体和六聚体的比例。
图3A-图3C说明门冬胰岛素与不同制剂赋形剂的缔合状态，其中图3A提供SEC-MALS洗脱图谱；图3B绘制赖脯胰岛素缔合状态的分布的数均分子量；和图3C图解说明每种制剂中单体、二聚体和六聚体的比例。
图4A和图4B分别是对不同制剂的无锌赖脯胰岛素和门冬胰岛素累积重量归一化的SEC-MALS的图。
图5是每个样品(n＝3个细胞重复)的绘制为[pAKT]/[AKT]比的体外生物活性测定结果的图和EC50回归(log(激动剂)对响应(三参数))。
图6绘制门冬胰岛素与CB[7]-PEG的吖啶橙竞争结合测定结果，表明与CB[7]部分的结合。
图7A-图7E是在CB[7]-PEG:赖脯胰岛素摩尔比为0:1、3:1和5:1的不同制剂条件下，比较赖脯胰岛素与商业Humalog对照的体外稳定性的图，其中图7A显示在含有生理盐水(0.9％)的磷酸盐缓冲液中的赖脯胰岛素；图7B，在含有甘油(2.6％)的磷酸盐缓冲液中的赖脯胰岛素；图7C，在含有甘油(2.6％)和苯酚(0.25％)的磷酸盐缓冲液中的赖脯胰岛素；图7D，在含有甘油(2.6％)和间甲酚(0.315％)的磷酸盐缓冲液中的赖脯胰岛素；和图7E，在含有甘油(2.6％)和苯氧乙醇(0.85％)的磷酸盐缓冲液中的赖脯胰岛素。图7F按聚集时间(tA)提供稳定性的比较。
图8A-图8E是在CB[7]-PEG:门冬胰岛素摩尔比为0:1、3:1和5:1的不同制剂条件下，比较门冬胰岛素与商业Novolog对照的体外稳定性的图，其中图8A显示在含有生理盐水(0.9％)的磷酸盐缓冲液中的门冬胰岛素；图8B，在含有甘油(2.6％)的磷酸盐缓冲液中的门冬胰岛素；图8C，在含有甘油(2.6％)和苯酚(0.25％)的磷酸盐缓冲液中的门冬胰岛素；图8D，在含有甘油(2.6％)和间甲酚(0.315％)的磷酸盐缓冲液中的门冬胰岛素；图8E，在含有甘油(2.6％)和苯氧乙醇(0.85％)的磷酸盐缓冲液中的门冬胰岛素。图8F按聚集时间(tA)提供稳定性的比较。
图9是在禁食糖尿病大鼠中注射商业Novolog和用CB[7]-PEG(5当量)配制的无锌门冬胰岛素后测量的血糖的比较。
图10A-图10D显示在存在锌离子时商业的Humalog和Novolog(图10A)，在存在CB[7]-PEG(0.6当量)时的LGPhE和AGPhE(图10B)的DOSY测量的扩散特性。图10C和图10D分别显示用0.6当量CB[7]-PEG配制的胰岛素LGPhE和AGPhE与商业制剂条件相比的扩散增加。
图11显示使用DOSY测量的在商业制剂条件下的无锌门冬胰岛素的扩散特性。
图12A和图12B分别绘制通过SEC-MALS测量的无锌赖脯胰岛素和门冬胰岛素的重均分子量。
图13显示证明赖脯胰岛素(左)和门冬胰岛素(右)的胰岛素/CB[7]-PEG结合的1H2D DOSY谱。组包括：(i)胰岛素，(ii)胰岛素和游离PEG5K，(iii)CB[7]-PEG和(iv)胰岛素/CB[7]-PEG复合物。
图14显示证明胰岛素/CB[7]-PEG结合的1H 2D DOSY谱。
发明实施方案详述
定义：在描述本发明时，将使用以下术语，并且意图如下所示地定义。
除非上下文另外清楚地指明，否则如本说明书和所附的权利要求书中使用的单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数指示物。因此，例如，提及“一种蛋白”包括两种或更多种这样的蛋白的混合物等。
术语“约”，特别是提及给定数量，意在包括正负百分之五的偏差。
术语“变体”、“类似物”和“突变蛋白(mutein)”是指保留期望活性的参考分子的生物活性衍生物，所述期望活性例如用于治疗本文所述的1型或2型糖尿病的胰岛素或胰岛淀粉素活性。通常，术语“变体”和“类似物”是指具有天然多肽序列和结构的化合物，相对于天然分子具有一个或更多个氨基酸添加、取代(通常在性质上保守)和/或缺失，只要这些修饰不破坏生物活性，并且它们与下面定义的参考分子“基本同源”。通常，当比对两个序列时，此类类似物的氨基酸序列将与参考序列具有高度的序列同源性，例如，氨基酸序列同源性大于50％，通常大于60％-70％，甚至更具体地80％-85％或更多，例如至少90％-95％或更多。通常，类似物将包括相同数量的氨基酸，但将包括如本文解释的取代。术语“突变蛋白”还包括具有一个或更多个氨基酸样分子的多肽，包括但不限于仅包含氨基和/或亚氨基分子的化合物，含有一个或更多个氨基酸类似物(包括，例如，非天然氨基酸等)的多肽，具有取代的键的多肽，以及本领域已知的其他修饰，天然存在和非天然存在(例如，合成)、环化、支化分子等。该术语还包括包含一个或更多个N-取代的甘氨酸残基(“类肽”)和其他合成氨基酸或肽的分子。(类肽的描述参见例如，美国专利第5,831,005号；第5,877,278号和第5,977,301号；Nguyen等人,Chem Biol.(2000)7:463-473；和Simon等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89:9367-9371)。优选地，类似物或突变蛋白具有至少与天然分子相同的胰岛素或胰岛淀粉素生物活性。用于制备多肽类似物和突变蛋白的方法是本领域已知的，并在下面进一步描述。
如上所述，类似物通常包括性质上保守的取代，即发生在其侧链相关的氨基酸家族内的那些取代。具体来说，氨基酸一般分为四个家族：(1)酸性—天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性—赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性—丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；(4)不带电荷的极性—甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被归类为芳香族氨基酸。例如，可合理地预期，用异亮氨酸或缬氨酸单个地替换亮氨酸、用谷氨酸替换天冬氨酸、用丝氨酸替换苏氨酸或用结构相关的氨基酸类似地保守替换氨基酸，将不会对生物活性具有大的影响。例如，感兴趣的多肽可以包括多达约5-10个保守或非保守氨基酸取代，或甚至多达约15-25个保守或非保守氨基酸取代，或5-25之间的任何整数，只要期望的分子功能保持不受影响。本领域技术人员通过参考本领域熟知的Hopp/Woods和KyteDoolittle图可以容易地确定可容忍变化的感兴趣分子区域。
“衍生物”是指只要保留天然多肽的期望生物活性，对感兴趣的天然多肽、天然多肽的片段或它们各自类似物的任何适当修饰，如糖基化、磷酸化、聚合物缀合(如与聚乙二醇缀合)或外来部分的其他添加。用于制备多肽片段、类似物和衍生物的方法在本领域中通常可得。
“药学上可接受的赋形剂或载体”是指可任选地被包括在本发明组合物中并且不对患者产生显著不良毒理作用的赋形剂。
“药学上可接受的盐”包括但不限于氨基酸盐，用无机酸制备的盐如氯化物、硫酸盐、磷酸盐、二磷酸盐、溴化物和硝酸盐，或用上述任何一种相应的无机酸形式制备的盐，如盐酸盐等，或用有机酸制备的盐，如苹果酸盐、马来酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、乙基琥珀酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、乳酸盐、甲烷磺酸盐、苯甲酸盐、抗坏血酸盐、对甲苯磺酸盐、棕榈酸盐、水杨酸盐和硬脂酸盐，以及烯醇盐、葡萄糖酸盐和乳糖酸盐。类似地，含有药学上可接受阳离子的盐包括但不限于钠、钾、钙、铝、锂和铵(包括取代的铵)。
“受试者”是指脊索动物门(chordata)的任何成员，包括但不限于人类和其他灵长类动物，包括非人灵长类动物，如黑猩猩和其他猿类和猴物种；农场动物诸如牛(cattle)、绵羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物，如狗和猫；实验动物，包括啮齿类动物诸如小鼠、大鼠和豚鼠；鸟类，包括家养、野生和猎禽，如鸡、火鸡和其他家禽、鸭、鹅等。
参考图1A和图1B，现有的胰岛素制剂含有六聚体、二聚体和单体的混合物，在皮下注射时，它们解离并以不同的速度吸收，在图1A图示。非共价PEG化通过CB[7]-PEG与胰岛素上N末端苯丙氨酸的强特异性结合(KD＝0.5μM)实现。在制剂中的高浓度下，胰岛素将是大于98％结合的，但在皮下注射稀释后，不到1％的CB[7]-PEG将仍与胰岛素结合。这种差异吸收导致这些制剂迅速起效，但作用持续时间长，如图1B的活性曲线所示。相比较而言，完全单体胰岛素制剂可以使起效更快，并且作用持续时间减少，这是创建超快速作用胰岛素制剂的下一步，如图1C所示。本文所述的制剂针对这一目的。
制剂和使用方法
在一种实施方案中，药物组合物包含胰岛素或胰岛素类似物；任选地取代的葫芦[7]脲(CB[7])-聚乙二醇(PEG)缀合物；张力剂；和防腐剂；其中不超过20％的胰岛素或胰岛素类似物作为六聚体存在于药物组合物中。
在另一种实施方案中，药物组合物包含胰岛素或胰岛素类似物；任选地取代的葫芦[7]脲(CB[7])-聚乙二醇(PEG)缀合物；张力剂；和防腐剂，其中所述防腐剂为苯氧乙醇。
在一些实施方案中，胰岛素类似物是门冬胰岛素。在其他实施方案中，胰岛素类似物是赖脯胰岛素。在又其他实施方案中，胰岛素类似物是谷赖胰岛素。
张力剂可以是甘油、氯化钠或甘露醇，或它们的混合物。
在一种实施方案中，CB7-PEG缀合物在Webber等人的PCT申请公布第WO 2017/062622号中描述，其整体通过引用并入本文。
在一种实施方案中，CB7通过接头与PEG缀合，该接头可具有式(L-l)：
Figure BDA0003793563380000081
其中L1和L2的每一个独立地是键、任选地取代的亚烷基或任选地取代的亚杂烷基；并且A是键、任选地取代的杂环基或任选地取代的杂芳基。在一些实施方案中，A是任选地取代的杂芳基。在其他实施方案中，A是任选地取代的三唑部分。
在一种实施方案中，PEG的分子量<1kDa。在一种实施方案中，PEG的分子量介于1kDa-10kDa之间(包括端点)。在一种实施方案中，PEG的分子量为约5kDa。在一种实施方案中，PEG的分子量介于5kDa-10kDa之间(包括端点)。在一种实施方案中，PEG的分子量为约10kDa。在一种实施方案中，PEG的分子量介于10kDa-30kDa之间(包括端点)。在一种实施方案中，PEG的分子量为约30kDa。在一种实施方案中，PEG的分子量>30kDa。在一种实施方案中，PEG的分子量低于100kDa。
在一种实施方案中，药物组合物还包含磷酸盐缓冲液。在一些实施方案中，磷酸盐缓冲液是磷酸钠缓冲液。
在一种实施方案中，药物组合物基本上不含促进胰岛素六聚体的形成或稳定性的稳定剂。
在一种实施方案中，药物组合物不包含有效促进胰岛素六聚体的形成或稳定性的量的稳定剂。
在一种实施方案中，药物组合物基本上不含锌。在一种实施方案中，药物组合物包含不超过痕量的锌。在一种实施方案中，药物组合物包含不超过0.0002wt.％的锌。
在一种实施方案中，药物组合物基本上不含聚山梨酸酯。在一种实施方案中，药物组合物包含不超过痕量的聚山梨酸酯。在一种实施方案中，其中药物组合物包含不超过0.0002wt.％的聚山梨酸酯。
在一种实施方案中，药物组合物包含浓度为约50U/mL至约200U/mL的胰岛素或胰岛素类似物。在一种实施方案中，药物组合物包含浓度为约100U/mL的胰岛素或胰岛素类似物。
在一种实施方案中，药物组合物包含量为药物组合物总重量的约0.5％至约5％的张力剂。在一种实施方案中，药物组合物包含量为药物组合物总重量的约2.6％的张力剂。在一种实施方案中，张力剂是甘油。
在一种实施方案中，药物组合物包含量为药物组合物总重量的约0.2％至约1.5％的防腐剂。在一种实施方案中，药物组合物包含量为药物组合物总重量的约0.85％的防腐剂。在一种实施方案中，防腐剂是苯氧乙醇。
在一种实施方案中，CB[7]-PEG与胰岛素或胰岛素类似物的摩尔比为约1:1至约10:1。在一种实施方案中，CB[7]-PEG与胰岛素或胰岛素类似物的摩尔比为约3:1至约5:1。在一种实施方案中，CB[7]-PEG与胰岛素或胰岛素类似物的摩尔比为至少约3:1。在一种实施方案中，CB[7]-PEG与胰岛素或胰岛素类似物的摩尔比为至少约5:1。
在一种实施方案中，至少50％的胰岛素或胰岛素类似物作为单体存在于药物组合物中。在一种实施方案中，至少60％的胰岛素或胰岛素类似物作为单体存在于药物组合物中。
在一种实施方案中，不超过20％的胰岛素或胰岛素类似物作为六聚体存在于药物组合物中。在一种实施方案中，不超过10％的胰岛素或胰岛素类似物作为六聚体存在于药物组合物中。
在一种实施方案中，药物组合物还包含胰岛淀粉素或胰岛淀粉素类似物。在一种实施方案中，胰岛淀粉素或胰岛淀粉素类似物是普兰林肽(pramlintide)。
在一种实施方案中，与等效剂量的人类重组胰岛素或胰岛素类似物相比，药物组合物能够减少注射和导致血糖水平下降之间的延迟。
在一种实施方案中，药物组合物在37℃压力老化至少24小时后保持至少80％的活性。
在一种实施方案中，药物组合物适合于皮下施用。
在一种实施方案中，本文提供了一种在有相应需要的受试者中治疗糖尿病或管理或降低血糖水平的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本文提供的药物组合物。在一些实施方案中，受试者是人类。糖尿病可以是1型糖尿病或2型糖尿病。
在一种实施方案中，本文提供了一种药盒、泵或笔，包括本文提供的药物组合物和用于治疗糖尿病或管理或降低血糖水平的说明书。在一种实施方案中，药盒、泵或笔还包括用于将药物组合物递送到受试者的工具。
实施例
实施例1：通过SEC-MALS分析胰岛素缔合状态
赋形剂的选择很重要，因为如在Apidra(谷赖胰岛素)的情况下，锌的缺乏不足以产生超快速作用的胰岛素制剂。为了设计一种促进单体状态的胰岛素制剂，必须了解赋形剂在无锌条件下对胰岛素缔合状态的影响。用尺寸排阻色谱与多角度光散射(SEC-MALS)表征允许我们确定制剂中胰岛素的分子量，并估计制剂条件下六聚体、二聚体和单体的含量。在这些研究中，胰岛素类似物赖脯胰岛素和门冬胰岛素与乙二胺四乙酸(EDTA)一起配制以去除制剂锌。EDTA与锌形成强配合物(KD～10x10-18 M)，并且在胰岛素制剂中加入相对于锌离子一摩尔当量的EDTA快速地隔离锌，防止锌与胰岛素相互作用，并且从而破坏溶液中的胰岛素六聚体。无锌胰岛素在纯水中是完全单体的(Mn＝5.7kDa)。然而，随着缓冲盐的加入，它变成了单体、二聚体和六聚体的混合物。为了选择主要是单体的胰岛素制剂，我们评价了张力剂和防腐剂对胰岛素缔合状态的影响。
图2A-图2C说明当在以下中配制时，无锌赖脯胰岛素缔合状态：(i)磷酸盐缓冲液、氯化钠(0.9％)(LS)、(ii)含有甘油(2.6％)的磷酸盐缓冲液(LG)、(iii)含有甘油(2.6％)和间甲酚(0.315％)的磷酸盐缓冲液(LGM)以及(iv)含有甘油(2.6％)和苯氧乙醇(0.85％)的磷酸盐缓冲液(LGPhE)。将制剂与商业Humalog的制剂进行了比较。图2A绘制SEC-MALS洗脱图谱，而图2B显示了赖脯胰岛素缔合状态的分布的数均分子量。图2C以图表说明每种制剂中单体、二聚体和六聚体的比例。赖脯胰岛素和门冬胰岛素制剂的制剂细节在表1提供。
表1.赖脯胰岛素制剂
Figure BDA0003793563380000111
图3A-图3C说明当在以下中配制时，无锌门冬胰岛素缔合状态：(i)磷酸盐缓冲液、氯化钠(0.9％)(AS)、(ii)含有甘油(2.6％)的磷酸盐缓冲液(AG)、(iii)含有甘油(2.6％)和间甲酚(0.315％)的磷酸盐缓冲液(AGM)以及(iv)含有甘油(2.6％)和苯氧乙醇(0.85％)的磷酸盐缓冲液(AGPhE)。将制剂与商业Novolog的制剂进行比较。图3A绘制SEC-MALS洗脱图谱，而图3B显示了门冬胰岛素缔合状态的分布的数均分子量。图3C以图表说明每种制剂中单体、二聚体和六聚体的比例。门冬胰岛素制剂的制剂细节在表2提供。
表2.门冬胰岛素制剂
Figure BDA0003793563380000121
如所假设的，所有无锌制剂都具有比商业Humalog(Mn＝34.7kDa；99.6％六聚体)或商业Novolog(Mn＝28.8kDa；70.7％六聚体)减少的六聚体组成。无锌制剂主要是单体和二聚体与少量六聚体的混合物。
图4A和图4B分别是对不同制剂的无锌赖脯胰岛素和门冬胰岛素累积重量归一化的SEC-MALS的图。图4A显示当在以下中配制时，无锌赖脯胰岛素缔合状态：(i)含有生理盐水(0.9％)的磷酸盐缓冲液(LS)、(ii)含有甘油(2.6％)的磷酸盐缓冲液(LG)、(iii)含有甘油(2.6％)和间甲酚(0.315％)的磷酸盐缓冲液(LGM)以及(iv)含有甘油(2.6％)和苯氧乙醇(0.85％)的磷酸盐缓冲液(LGPhE)。将制剂与商业Humalog的制剂进行了比较。图4B绘制当在以下中配制时，无锌门冬胰岛素缔合状态：(i)含有生理盐水(0.9％)的磷酸盐缓冲液(AS)、(ii)含有甘油(2.6％)的磷酸盐缓冲液(AG)、(iii)含有甘油(2.6％)和间甲酚(0.315％)的磷酸盐缓冲液(AGM)以及(iv)含有甘油(2.6％)和苯氧乙醇(0.85％)的磷酸盐缓冲液(AGPhE)。将制剂与商业Novolog的制剂进行了比较。
甘油是胰岛素制剂中最常用的张力剂，其次是氯化钠。无锌赖脯胰岛素和无锌门冬胰岛素在含有氯化钠(0.9％)或甘油(2.6％)的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)中配制。与赖脯胰岛素(MW＝8.7kDa；55.0％单体)和门冬胰岛素(MW＝13kDa；4.8％单体)的氯化钠制剂相比，对赖脯胰岛素(MW＝7.6kDa；89.2％单体)和门冬胰岛素(MW＝7.4kDa；91.4％单体)二者，甘油都表现更低的数均分子量和更高的单体百分比。因此，在评价防腐剂对胰岛素缔合状态的影响时，仍以甘油为张力剂。
虽然单独的甘油显示出制剂中的单体比例最高，但胰岛素需要抗微生物防腐剂，因为它是一种多剂量的制剂。商业上使用的肠胃外防腐剂只有几种，最常见的是苯甲醇、氯丁醇、间甲酚、苯酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯氧乙醇和硫柳汞。在这些抗微生物剂中，目前只有苯酚和间甲酚被用于商业胰岛素制剂。然而，苯酚类防腐剂是公认的通过苯酚上的羟基基团和胰岛素二聚体口袋之间的氢键促进R6胰岛素六聚体形成。为了产生胰岛素单体制剂，必须降低苯酚促进的R6六聚体的形成，因此有必要为胰岛素制剂鉴定不同的肠胃外防腐剂。其他研究表明乙醇可能在破坏胰岛素二聚体中发挥作用，从而促进胰岛素单体。这导致了选择苯氧乙醇作为替代抗微生物剂。我们假设，离开酚环的乙醇链会产生空间位阻，破坏导致R6六聚体的形成的分子间力，并且乙醇侧链可以通过破坏胰岛素二聚体进一步促进单体形成。事实上，在单独甘油后，苯氧乙醇显示出在赖脯胰岛素制剂(MW＝8.2kDa；71.5％单体)和门冬胰岛素制剂(MW＝7.4kDa；85.2％单体)二者中数均分子量最低和胰岛素单体比例最高(参见图2B、图2C、图3B、图3C)。与之相比，对于赖脯胰岛素(MW＝9.0kDa；56.7％单体)和门冬胰岛素(MW＝9.4kDa；71.0％单体)，间甲酚制剂与苯氧乙醇制剂相比数均分子量增加。Gast等人的工作表明，苯酚显示出比间甲酚更强的对六聚体的形成的亲和力。因此，预期苯氧乙醇也将具有比基于苯酚的制剂更高的单体含量。尽管苯氧乙醇制剂和间甲酚制剂的六聚体比例相近，但间甲酚制剂的六聚体和二聚体组合的比例更高。由于R6六聚体是通过氢键结合在一起的动态结构，以六聚体形式产生的胰岛素可能会解离并以二聚体形式出现在SEC-MALS中。
实施例2：单体胰岛素与CB[7]-PEG的稳定性
随着胰岛素单体含量的增加，制剂稳定性变得更富有挑战性，并且需要替代的稳定赋形剂(stabilizing excipient)来提高胰岛素在缺乏锌的条件下的稳定性。目前商业的无锌胰岛素类似物Apidra既含有间甲酚，又含有表面活性剂聚山梨酸酯20，这有助于制剂的稳定性，但间甲酚促进了R6六聚体。非共价PEG化具有作为稳定赋形剂的潜力，它不会促进六聚体的形成，并且会使胰岛素单体在体内不被修饰而起作用。以前的研究表明，用葫芦[7]脲-聚(乙二醇)(CB[7]-PEG)非共价PEG化赋予胰岛素长期稳定性而不降低体内的胰岛素活性。在AKT磷酸化的剂量响应测定中，用甘油/苯氧乙醇和3摩尔当量CB[7]-PEG配制的赖脯胰岛素(LGPhE)关于胰岛素显示出与商业Humalog相比相等的体外生物活性(Humalog EC50＝1x10-4mg/mL；LGPhE EC50＝6x10-5mg/mL)。
通过对以下测定AKT上Ser473的磷酸化评价体外活性：(i)Humalog，(ii)用甘油/苯氧乙醇和与胰岛素相比摩尔过量的CB[7]-PEG配制的无锌赖脯胰岛素(LGPhE)，(iii)老化的Humalog(在37℃振荡4天)。LPhE3显示了来自商业Humalog(Humalog EC50＝1x10-4mg/mL；LGPhE EC50＝6x10-5mg/mL；p＝0.3)的未改变的活性，并且二者都显示出与老化对照相比的活性增加(老化EC50＝1x10-3mg/mL；Humalog/老化p＝0.01；LGPhE/老化p＝0.0004)。显示的数据是n＝3个实验重复的平均值±s.d。图5说明了结果，绘制为每个样品(n＝3个细胞重复)的[pAKT]/[AKT]的比，并且EC50回归(log(激动剂)对响应(三参数))用GraphPad Prism8绘制。
CB[7]与门冬胰岛素的结合亲和力为0.54μM(图6)，因此在典型的制剂浓度下，CB[7]-PEG/胰岛素复合物将大于98％结合，但在皮下施用后立即稀释时，不到1％的CB[7]-PEG将保持与胰岛素缔合。
为了证明用CB[7]-PEG的非共价PEG化作为在多种制剂条件下长期稳定单体胰岛素的策略的效用，将无锌的赖脯胰岛素和门冬胰岛素在含有以下的磷酸盐缓冲液中配制：(i)生理盐水(LS)、(ii)甘油(LG)、(iii)甘油/苯酚(LGP)、(iv)甘油/间甲酚(LGM)或(v)甘油/苯氧乙醇(LGPhE)。评价不同的赋形剂组合，以确定哪种赋形剂组合提供最大的稳定性。结果分别在图7A-图7E绘制。CB[7]-PEG以相对胰岛素3摩尔当量过量或5摩尔当量过量添加到制剂中。选择甘油作为张力剂，与防腐剂(包括苯酚、间甲酚、苯氧乙醇)组合，因为在甘油存在时对胰岛素单体的亲和力比在氯化钠存在时增加(图7B-图7E)。无锌赖脯胰岛素在所有制剂条件下的稳定性低于商业Humalog制剂，因此表明需要另外的稳定剂。CB[7]-PEG相对胰岛素三倍过量导致稳定性增加，范围从LGP3制剂的1.5倍增加(图7B)到LS3制剂的6倍增加(图7A)。添加相对赖脯胰岛素五倍过量的CB[7]-PEG使LS5(图7A)和LGPhE5(图7E)制剂二者中赖脯胰岛素的稳定性延长超过100小时。图7F按聚集时间(tA)提供稳定性的比较，聚集时间(tA)定义为应力老化(即在37℃连续搅拌)后透射率(λ＝540nm)变化10％或更大的时间。所示数据为每组n＝3个样品的平均透射率迹线，并且误差条为标准偏差。
无锌门冬胰岛素在与无锌赖脯胰岛素相同的条件下配制：(i)盐水(AS)、(ii)甘油(AG)、(iii)甘油/苯酚(AGP)、(iv)甘油/间甲酚(AGM)或(v)甘油/苯氧乙醇(AGPhE)以评价稳定性。结果分别在图8A-图8E绘制。无锌门冬胰岛素制剂总体上比赖脯胰岛素制剂更稳定，并且AG0、AGP0和AGPhE0制剂(图8B、图8C和图8E)比不添加CB[7]-PEG的商业Novolog制剂更稳定。在除AS3以外的所有制剂条件，三倍过量的CB[7]-PEG稳定门冬胰岛素超过100小时。当CB[7]-PEG过量5倍时，所有制剂稳定100小时以上。图8F按聚集时间(tA)提供稳定性的比较，聚集时间(tA)定义为应力老化(即在37℃连续搅拌)后透射率(λ＝540nm)变化10％或更大的时间。所示数据为每组n＝3个样品的平均透射率迹线，并且误差条为标准偏差。当动物用(i)Novolog或(ii)用CB[7]-PEG5K(相对于胰岛素5当量)配制的无锌门冬胰岛素给药时，没有观察到糖尿病大鼠的血糖耗竭的差异，表明用CB[7]-PEG配制单体胰岛素不改变体内生物活性或药效学。图9提供在禁食糖尿病大鼠(n＝5-6)中，注射商业Novolog(黑色圆圈)或用CB[7]-PEG(5当量)配制的无锌门冬胰岛素(灰色方块)后的血糖曲线。如曲线几乎重叠所示，在无锌门冬胰岛素制剂中添加CB[7]-PEG不改变胰岛素作用的持续时间，并且与商业Novolog相比保持了门冬胰岛素的生物活性。制剂在注射前在磷酸盐缓冲盐水中10X稀释，以调整剂量。
实施例3：通过DOSY分析的胰岛素单体扩散
扩散有序NMR光谱学(Diffusion-ordered NMR spectroscopy，DOSY)用于提供在存在CB[7]-PEG的LGPhE和AGPhE制剂条件下，对赖脯胰岛素和门冬胰岛素的尺寸和扩散特性的洞察。包含CB[7]-PEG的制剂由于胰岛素物质在色谱柱上保留时间和光散射的混杂变化而不能用SEC-MALS进行评价。用CB[7]-PEG配制单体胰岛素类似物，由于CB[7]-胰岛素结合相互作用的高度动态性质，预计可以相比于单独的胰岛素单体可忽略不计地增加在制剂中胰岛素的扩散系数和相应的流体力学半径。将LGPhE或AGPhE无锌制剂中胰岛素分子的扩散率与Humalog和Novolog商业制剂进行了比较。Humalog和Novolog二者表现的胰岛素扩散率为1.13×10-10m2/s，对应于流体力学半径2.2nm(图10A)，这与文献报道值一致。通过使用EDTA去除商业Novolog中的锌，流体力学半径保持不变，为2.2nm，说明仅缺乏锌不足以改变胰岛素缔合状态(图11)。与之相比，包含CB[7]-PEG的无锌LGPhE和AGPhE制剂中的胰岛素分子表现出增加的扩散率，为1.60×10-10m2/s，对应于1.5nm的流体力学半径，这比商业胰岛素类似物制剂显著更小，并且与胰岛素单体的文献报道值大致相同。DOSY对蛋白质/CB[7]-PEG复合物的形成及其在制剂中的扩散速率提供了洞察。扩散特性表明，赖脯胰岛素和门冬胰岛素在存在锌离子的商业Humalog和Novolog中(图10A)和存在CB[7]-PEG(0.6当量)的LGPhE和AGPhE中(图10B)以相似的速率扩散。观察到用0.6当量CB[7]-PEG配制的胰岛素LGPhE(图10C)和AGPhE(图10D)与商业制剂条件相比的扩散增加。这些观察结果表明，虽然CB[7]-PEG稳定了制剂中胰岛素的单体形式，但CB[7]-PEG与胰岛素的高度动态结合可忽略不计地改变胰岛素分子的扩散率。
胰岛素制剂中赋形剂的选择对于决定胰岛素缔合状态、稳定性和体内吸收率是关键的。目前，需要更接近地模拟内源性分泌的胰岛素制剂，这最终要求胰岛素制剂更加单分散且主要含有胰岛素单体。为了设计下一代的单体胰岛素制剂，有必要了解赋形剂的选择对胰岛素缔合状态的影响。本研究中评价了常用的肠胃外防腐剂增加制剂中胰岛素单体比率的倾向，以及在稳定赋形剂CB[7]-PEG的协助下，提高胰岛素稳定性的倾向。我们确定了包含甘油为张力剂和苯氧乙醇为防腐剂的制剂是促进胰岛素单体的最佳组合，其中85％以上的胰岛素处于单体状态。当用CB[7]-PEG配制时，该制剂表现出与商业制剂相比延长10倍以上的稳定性。此外，DOSY NMR突出了CB[7]-PEG与胰岛素结合不会显著影响胰岛素的扩散性或其缔合状态。这些制剂中增加的胰岛素单体组成可潜在地实现胰岛素作用的超快开始与短的作用持续时间组合，以允许餐后响应性和减少餐后低血糖事件。
实施例4：CB[7]-PEG制备
CB[7]-PEG根据已发表的方案制备，并对方法进行了修改，按照报道的方案实现铜“点击”化学。(参见例如，L.Zou等人,“Dynamic Supramolecular Hydrogels Spanning anUnprecedented Range of Host–Guest Affinity”,ACS Appl.Mater.Inter.2019,11,5695-5700.)购买Novolog(Novo Nordisk)和Humalog(Eli Lilly)并按收到的使用。无锌赖脯胰岛素和无锌门冬胰岛素用PD MidiTrap G-10重力柱(GE Healthcare)分离，并且然后用Amino Ultra 3K离心单元(Millipore)浓缩。除另有说明外，所有其他试剂均从Sigma-Aldrich购买。
实施例5：SEC-MALS
用装备有Dawn Heleos II多角度光散射检测器和Optilab rEX折射率检测器的Dionex Ultimate 3000仪器(包括泵、自动进样器和柱室)进行尺寸排阻色谱(SEC)，获得了制剂的数均分子量(MW)和分散度(
Figure BDA0003793563380000171
＝Mw/Mn)。柱是来自GE Healthcare的Superose6Increase 10/300GL。数据使用Astra 6.0软件进行分析。
在以下缓冲条件下评价无锌赖脯胰岛素和门冬胰岛素：(i)氯化钠(0.9％)、(ii)甘油(2.6％)、(iii)甘油(2.6％)和间甲酚(0.315％)和(iv)甘油(2.6％)和苯氧乙醇(0.85％)。对照由以下组成：(v)包含甘油(1.6％)、间甲酚(0.315％)、磷酸氢二钠(0.188％)和锌(0.00197％)的商业Humalog制剂，或(vi)包含甘油(1.6％)、间甲酚(0.172％)、苯酚(0.15％)、氯化钠(0.058％)、磷酸氢二钠(0.125％)和锌(0.00196％)的商业Novolog制剂。赖脯胰岛素和门冬胰岛素以最低36mg/mL蛋白的浓度注入，并且体积为100μL。所有样品使用dn/dc为0.186mL/g。产生的最大峰浓度范围为3.0mg/mL至4.3mg/mL，取决于蛋白质寡聚平衡。
通过将用SEC-MALS确定的实验来源的数均分子量(Mn)和重均分子量(Mw)拟合到等式1和等式2确定单体胰岛素、二聚胰岛素和六聚胰岛素的摩尔分数，其中m、d和h分别代表单体胰岛素、二聚胰岛素和六聚胰岛素的摩尔分数，而I代表单体胰岛素的分子量(5831g/mol)。对求解器进行约束，使m+d+h＝1同时m、d和h保持在0和1之间。
Mn＝m*I+d*2I+h*6I (1)
Figure BDA0003793563380000181
图12A和图12B分别绘制当在以下中配制时，无锌赖脯胰岛素和门冬胰岛素缔合状态的重均分子量：(i)磷酸盐缓冲液、氯化钠(0.9％)(LS、AS)、(ii)含有甘油(2.6％)的磷酸盐缓冲液(LG、AG)、(iii)含有甘油(2.6％)和间甲酚(0.315％)的磷酸盐缓冲液(LGM、AGM)和(iv)含有甘油(2.6％)和苯氧乙醇(0.85％)的磷酸盐缓冲液(LGPhE、AGPhE)。将制剂与商业Humalog或Novolog的制剂进行了比较。
实施例6：体外稳定性
重组人类胰岛素的聚集测定方法改编自Webber等人(P.Nat.Acad.Sci.U.S.A2016,113,14189)的方法。简而言之，将制剂样品以每孔150μL(n＝3/组)铺板在透明的96孔板中，并用光学透明和热稳定的密封物(VWR)密封。立即将板放入读板器中，并伴随在37℃连续振荡孵育。每10分钟在540nm处读取吸光度读数，持续100小时(BioTek SynergyH1酶标仪)。胰岛素的聚集导致光散射，这导致样品透射率降低。聚集的时间定义为透射率从零时的透射率增加>10％。通过加入乙二胺四乙酸(EDTA)通过竞争结合从赖脯胰岛素和门冬胰岛素去除锌(II)，其表现的解离结合常数接近阿托摩尔浓度(KD～10-18M)。[41,42]将EDTA加入到制剂中(相对于锌4当量)以从制剂隔离锌，并且然后使用PD-10脱盐柱(GE Healthcare)除去，并然后使用Amino Ultra 3K离心单元(Millipore)浓缩。然后通过ELISA(Mercodia,Iso-Insulin ELISA)测量赖脯胰岛素或门冬胰岛素浓度，并且然后加入制剂赋形剂。所有的赖脯胰岛素或门冬胰岛素制剂在磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)与下列赋形剂组合中配制：i)氯化钠(0.9％)、ii)甘油(2.6％)、iii)甘油(2.6％)和苯酚(0.25％)、iv)甘油(2.6％)和间甲酚(0.315％)、v)甘油(2.6％)和苯氧乙醇(0.85％)。CB[7]-PEG以相对于胰岛素的3或5摩尔当量加入到制剂中。对照包括Novolog(门冬胰岛素)和Humalog(赖脯胰岛素)的商业制剂。
实施例7：NMR DOSY
在下列条件下在蛋白质浓度(赖脯胰岛素或门冬胰岛素)3.4mg/mL和50-60％D2O记录的1H 2D DOSY谱：(i)商业Novolog[甘油(1.6％)、间甲酚(0.175％)、苯酚(0.15％)、氯化钠(0.058％)、磷酸氢二钠(0.125％)、锌(0.00196％)]，(ii)商业Humalog[甘油(1.6％)、间甲酚(0.315％)、磷酸氢二钠(0.188％)和锌(0.00196％)]，(iii)赖脯胰岛素/甘油/苯氧乙醇(LGPhE)[磷酸盐缓冲液、甘油(2.6％)和苯氧乙醇(0.85％)]，和(iv)门冬胰岛素/甘油/苯氧乙醇(AGPhE)[磷酸盐缓冲液、甘油(2.6％)和苯氧乙醇(0.85％)]。胰岛素/CB[7]-PEG复合物的1D 1H-NMR显示胰岛素和CB[7]-PEG信号二者的展宽(图13)。随着CB[7]-PEG与胰岛素比例的增加，这种情况加剧，如图14所示。胰岛素/CB[7]-PEG复合物可以通过出现～6.4ppm的特征峰来追踪。在复合物中观察到所有信号的展宽，可能是由于CB[7]-PEG的快速交换引起的短暂T2弛豫。
因此，对于DOSY，CB[7]-PEG与胰岛素的最佳比确定为0.60mol。采用Varian Inova600MHz NMR仪器采集数据。磁场强度范围为2G cm-1至57G cm-1。DOSY时间和梯度脉冲分别设置为132ms(Δ)和3ms(δ)。所有NMR数据用MestReNova 11.0.4软件处理。
实施例8：统计学分析
胰岛素稳定性实验以n＝3进行，并且数据显示为随时间的平均透射率。将提取的到聚集的时间(tA)绘制为平均值±标准差。用每个治疗组n＝5-6只大鼠进行大鼠研究，并且血糖结果以平均血糖±标准差报告。体外AKT活性测定以n＝3进行，并且数据显示为对总AKT归一化的相对pAKT([pAKT]/[AKT])的平均值±标准差。绘制EC50回归(log(激动剂)对响应(三参数))，并使用GraphPad Prism 8进行额外平方和F检验(alpha＝0.05)。
实施例9：吖啶橙结合亲和力
未修饰的CB[7]从Strem Chemicals购买，并且吖啶橙(AO)从Sigma-Aldrich购买。如以前所述，用AO染料置换测定评估CB[7]与门冬胰岛素的结合。简而言之，将6μM CB[7]和8μM AO与100μL门冬胰岛素样品组合。将门冬胰岛素样品在H2O中稀释到0、0.01、0.1、0.3、0.5、1、1.5、2、3、4μM的浓度。将样品在无光条件下孵育过夜，并在BioTek SynergyH1酶标仪上收集荧光光谱，在485nm激发，并在495nm至650nm收集所得荧光光谱。使用以前报道的CB[7]·AO平衡常数(Keq＝2×105M-1)将AO荧光信号峰的衰减与单位点竞争结合模型(one-site competitive binding model)(GraphPad Prism,version 6.0)拟合，以确定未修饰的CB[7]与胰岛素的结合常数。
实施例10：体外胰岛素细胞活性测定
培养C2C12小鼠成肌细胞(ATCC CRL-1772)，以使用AlphaLISA SureFire Ultra(Perkin-Elmer)试剂盒检测与总Akt1相比的磷酸化AKT1/2/3(pS473)，通过AKT磷酸化途径确认胰岛素功能活性。在使用前，确认细胞没有支原体污染。向含有4.5g/L D-葡萄糖、L-谷氨酰胺和110mg/L丙酮酸钠(Gibco)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)补充10％胎牛血清(FBS)和5％青霉素-链霉素以配制完全培养基。在96孔组织培养板中，细胞以25,000个细胞/孔的密度，以200μl/孔的体积接种，并培养24小时。在胰岛素刺激前，用200μl未补充的DMEM洗涤细胞2次，并在100μl未补充的DMEM中饥饿过夜。然后移除培养基，并用在未补充的DMEM中稀释到所需浓度的100μl胰岛素(i)Humalog、(ii)LisproPhE、(iii)老化Humalog(在37℃振荡4天)刺激细胞30分钟，同时在37℃孵育。将细胞用100μl冷1X Tris缓冲生理盐水洗涤两次，然后在每个孔中加入100μl裂解缓冲液，并在室温振荡至少10分钟，使细胞完全裂解。每次测定将30μL裂解液转移到96孔白色半面积板中。测定根据制造商的方案完成。将板在室温孵育，并在添加最终测定试剂后18-20小时使用Tecan Infinite M1000 PRO读板器读取。结果绘制为每个样品(n＝3个细胞重复)的[pAKT]/[AKT]比，并且EC50回归(log(激动剂)对响应(三参数))用GraphPad Prism 8绘制。
实施例11：链脲佐菌素诱导的大鼠糖尿病模型
使用雄性Sprague Dawley大鼠(Charles River)进行实验。根据实验动物护理和使用指南(the guidelines for the care and use of laboratory animals)进行动物研究；所有方案得到了斯坦福机构动物护理和使用委员会(Stanford Institutional AnimalCare and Use Committee)的批准。用于STZ诱导的方案改编自Kenneth K.Wu和YoumingHuan的方案。简而言之，将雄性Sprague Dawley大鼠160-230g(8-10周)称重，并在STZ处理前禁食6-8小时。STZ注射前立即在柠檬酸钠缓冲液中稀释至10mg/mL。每只大鼠腹膜内注射STZ溶液65mg/kg。注射STZ后，向大鼠给予含10％蔗糖的水24小时。在STZ处理后，经由尾静脉血采集，通过使用手持Bayer Contour Next葡萄糖监测仪(Bayer)每天测试大鼠血糖水平是否有高血糖。糖尿病定义为在非禁食大鼠中连续3次血糖测量>400mg/dL。
实施例12：在糖尿病大鼠中的体内药效学
将糖尿病大鼠禁食6-8小时。大鼠皮下注射商业Novolog或无锌门冬胰岛素与CB[7]-PEG(5:1)，剂量为1.5U/kg。胰岛素在注射前在磷酸盐缓冲盐水中稀释10倍，以允许小体积的准确给药。注射前测量基线血糖。选择基线血糖在400mg/dL-500mg/dL之间的大鼠用于研究。注射后，前30分钟每3分钟采血一次，然后下一个30分钟每5分钟采血一次，然后在75、90、120、150和180分钟采血。使用手持式血糖监测仪(Bayer Contour Next)测量血糖。
本文提供的实施方案在范围上不受实施例中提供的具体实施方案的限制，这些实施例旨在作为所提供的实施方案的若干方面的说明，并且本公开内容涵盖在功能上等效的任何实施方案。事实上，除了本文显示和描述的那些之外，本文提供的实施方案的多种改变对于本领域技术人员来说将变得明显，并且意图落入所附权利要求的范围内。
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Claims (40)

1.一种药物组合物，所述药物组合物包含：
a)胰岛素或胰岛素类似物；
b)任选地取代的葫芦[7]脲(CB[7])-聚乙二醇(PEG)缀合物；
c)张力剂；和
d)防腐剂；
其中不超过20％的所述胰岛素或胰岛素类似物作为六聚体存在于所述药物组合物中。
2.一种药物组合物，所述药物组合物包含：
a)胰岛素或胰岛素类似物；
b)任选地取代的葫芦[7]脲(CB[7])-聚乙二醇(PEG)缀合物；
c)张力剂；和
d)防腐剂，其中所述防腐剂为苯氧乙醇。
3.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其中组分a)是胰岛素。
4.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其中组分a)是胰岛素类似物。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其中所述胰岛素类似物选自由门冬胰岛素、赖脯胰岛素和谷赖胰岛素组成的组。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的药物组合物，其中所述张力剂是甘油、氯化钠或甘露醇，或其混合物。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其中所述张力剂是甘油。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的药物组合物，其中CB7通过接头与PEG缀合。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其中所述接头具有式(L-l)：
Figure FDA0003793563370000021
其中：
L1和L2中的每一个独立地是键、任选地取代的亚烷基或任选地取代的亚杂烷基；和
A是键、任选地取代的杂环基或任选地取代的杂芳基。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其中A是任选地取代的杂芳基或任选地取代的三唑部分。
11.根据权利要求1或权利要求2所述的药物组合物，其中所述PEG具有小于约1kDa、约1kDa至约10kDa、约5kDa至约10kDa、约10kDa至约30kDa、大于约30kDa或小于约100kDa的分子量。
12.根据权利要求1或权利要求2所述的药物组合物，还包含磷酸盐缓冲液。
13.根据权利要求12所述的药物组合物，其中所述磷酸盐缓冲液是磷酸钠缓冲液。
14.根据权利要求1或权利要求2所述的药物组合物，其中所述药物组合物基本上不含促进胰岛素六聚体的形成或稳定性的稳定剂。
15.根据权利要求1或权利要求2所述的药物组合物，其中所述药物组合物基本上不含锌。
16.根据权利要求1或权利要求2所述的药物组合物，其中所述药物组合物基本上不含聚山梨酸酯。
17.根据权利要求1或权利要求2所述的药物组合物，包含浓度为约50U/mL至约200U/mL的胰岛素或胰岛素类似物。
18.根据权利要求17所述的药物组合物，包含浓度为约100U/mL的胰岛素或胰岛素类似物。
19.根据权利要求1或权利要求2所述的药物组合物，包含量为所述药物组合物总重量的约0.5％至约5％的所述张力剂。
20.根据权利要求19所述的药物组合物，包含量为所述药物组合物总重量的约2.6％的所述张力剂。
21.根据权利要求1或权利要求2所述的药物组合物，包含量为所述药物组合物总重量的约0.2％至约1.5％的所述防腐剂。
22.根据权利要求21所述的药物组合物，包含量为所述药物组合物总重量的约0.85％的所述防腐剂。
23.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述防腐剂是苯氧乙醇。
24.根据权利要求1或权利要求2所述的药物组合物，其中CB[7]-PEG与所述胰岛素或胰岛素类似物的摩尔比为约1:1至约10:1。
25.根据权利要求24所述的药物组合物，其中CB[7]-PEG与所述胰岛素或胰岛素类似物的摩尔比为约3:1至约5:1。
26.根据权利要求1或权利要求2所述的药物组合物，其中至少50％的所述胰岛素或胰岛素类似物作为单体存在于所述药物组合物中。
27.根据权利要求26所述的药物组合物，其中至少60％的所述胰岛素或胰岛素类似物作为单体存在于所述药物组合物中。
28.根据权利要求1或权利要求2所述的药物组合物，其中不超过20％的所述胰岛素或胰岛素类似物作为六聚体存在于所述药物组合物中。
29.根据权利要求28所述的药物组合物，其中不超过10％的所述胰岛素或胰岛素类似物作为六聚体存在于所述药物组合物中。
30.根据权利要求1或权利要求2所述的药物组合物，还包含胰岛淀粉素或胰岛淀粉素类似物。
31.根据权利要求30所述的药物组合物，其中所述胰岛淀粉素或胰岛淀粉素类似物是普兰林肽。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的药物组合物，在37℃的压力老化至少24小时后保持至少80％的活性。
33.根据权利要求1至32中任一项所述的药物组合物，所述药物组合物适合于皮下施用。
34.一种在有相应需要的受试者中治疗糖尿病或管理或降低血糖水平的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1至33中任一项所述的药物组合物。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述糖尿病是1型糖尿病。
36.根据权利要求34所述的方法，其中所述糖尿病是2型糖尿病。
37.根据权利要求34至36中任一项所述的方法，其中所述药物组合物皮下施用。
38.根据权利要求34至37中任一项所述的方法，其中所述受试者是人类。
39.一种药盒、泵或笔，所述药盒、泵或笔包含权利要求1至33中任一项所述的药物组合物和用于治疗糖尿病或管理或降低血糖水平的说明书。
40.根据权利要求39所述的药盒，还包括用于将所述药物组合物递送到受试者的装置。
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