CN102065884A - 聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及糖尿病领域。更具体地，本发明涉及聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物，其是用高分子量聚(乙二醇)进行了聚乙二醇化的、在生理pH是高度可溶的、具有延长的作用持续时间、和特征在于药物代谢动力学、药物动力学和/或活性峰谷比小于2。本发明还涉及提供此类分子的方法、涉及含有它们的药物组合物、并涉及它们的治疗性用途。

Description

聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物

本发明涉及糖尿病领域。更具体地，本发明涉及高度可溶并具有延长的作用曲线的聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物，涉及提供此类分子的方法，涉及含有它们的药物组合物并涉及此类化合物的治疗性用途。

为了实现正常血糖，设计胰岛素替代疗法旨在尽可能地与正常个体中内源胰岛素分泌的模式平行。胰岛素每日生理需要是波动的并且可以分成两个阶段：(a)要求增加胰岛素以处置就餐相关血糖突增的吸收阶段，和(b)要求持续量的胰岛素以调节肝脏葡萄糖输出用于维持最适空腹血糖的后吸收阶段。因此，糖尿病的有效胰岛素疗法一般涉及联合使用两种类型的外源性胰岛素制剂：通过大丸剂注射提供的速效、就餐时间胰岛素，和通过每日注射一次或两次施用以控制就餐之间血糖水平的更长效的胰岛素。

目前可获得的胰岛素替代疗法在一个或多个临床重要的方面具有缺陷。例如，在每日施用时，常规的中效和长效胰岛素制剂，如基础型胰岛素类似物-地特胰岛素-具有不足以提供全天基础性葡萄糖控制的活性持续期。因而，采用每日单次注射，基础胰岛素的作用持续期往往不足以充分地控制高血糖症并且更具体地不足以满足后吸收阶段要求。此外，省去现有疗法的单次注射可能导致药物的“峰-对-谷”水平明显上升，造成葡萄糖控制受损。另外，利用不溶性策略以延长常规中效和长效胰岛素制剂例如Neutral Protamine Hagedorn(NPH)胰岛素和

的晶体混悬剂中的胰岛素释放或利用甘精胰岛素体内沉淀策略增加了注射内(intra-injection)变动性，从而造成增加的剂量反应曲线变动性。更具体地，NPH和

混悬剂要求机械混合以确保产品均一性，具有增加的受试者内变动性，并倾向于峰化而非提供对维持就餐之间最适空腹血糖持续延长的时间段所必需的理想“平缓(flat)”药物动力学曲线。因此，依赖于不溶状态以延长胰岛素支出的胰岛素制剂比可溶性制剂内在地更不可预测并且导致更不充分的血糖控制和更大的致命性低血糖发作易感性。另外，现代的基础型胰岛素类似物是不与速效或即效胰岛素制剂轻易可混合的。因此，现有胰岛素替代疗法仍使糖尿病患者易遭受致命性低血糖发作、严重的糖尿病长期医学并发症和/或对患者造成巨大不便和生活品质低劣。

名为“非免疫原性多肽”的美国专利号4,179,337公开了与具有分子量约500和约20,000Da之间的线性PEG分子缀合的胰岛素。Hinds和Kim公开了以低分子量(600Da、750Da和2000Da)单甲氧基聚(乙二醇)缀合的胰岛素(Hinds，K.D.和Kim等人，Advanced Drug Delivery Reviews，54：505-530(2002))。在该文章中，作者声称他们使其研究限于低分子量mPEG胰岛素缀合物，“因为[先前]发现较高分子量mPEG(5000Da)的连接大大地抑制该缀合物的生物学活性”。PCT国际专利申请公开号WO2006/079641公开了胰岛素衍生物(包括赖脯胰岛素)与小的分枝聚合物的缀合。PCT国际专利申请公开号WO 2004/091494尤其公开了分别与具有PEG总分子量达约10kDa和约20kDa的线性和分枝PEG分子缀合的胰岛素分子。PCT国际专利申请公开号WO 2008/015099(2008年2月7日公开)和WO 2008/084051(2008年7月17日公开)尤其公开了与具有范围从约200至约40,000Da的标称分子量的PEG分子缀合的多种胰岛素类似物。

显然，仍迫切需要更适用于基础胰岛素替代方案的长效胰岛素。尤其需要这样的可溶性基础胰岛素，其与餐时胰岛素制剂可混合，具有延长的时间-作用曲线(即，以每日一次或更低频率的注射能够充分控制血糖水平)，更平缓的活性、药物代谢动力学曲线(即，较低的“峰/谷”比)、减少的患者内部变动性(即，更可预测的时间-作用曲线，这解释为低血糖症和/或体重增加的发生率降低)和/或注射时更少的注射部位刺激或疼痛。

我们在这里报道以下发现：赖脯胰岛素可以用高分子量聚(乙二醇)衍生物聚乙二醇化以提供聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物，其具有治疗有效的基础胰岛素活性、延长的时间-作用曲线、在生理pH高度可溶和/或与其它的常用餐时胰岛素制剂可混合。

本发明提供式I即P-[(A)-(B)]的化合物或其可药用盐，其中

A是赖脯胰岛素的A链(SEQ ID NO：1)；

B是赖脯胰岛素的B链(SEQ ID NO：3)；并且

P是具有范围从约20kDa至约40kDa的分子量的PEG，并且其中A和B适当地交联并且P通过共价键直接或间接地与A的第1位置处甘氨酸的α-氨基、B的第1位置处苯丙氨酸的α-氨基或B的第28位置处赖氨酸的ε-氨基连接。

本发明也提供包含多种单和双聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物的组合物，其中该组合物中大于约75％的聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物是式I的单聚乙二醇化的化合物。

本发明也提供包含式I的单聚乙二醇化的胰岛素化合物的组合物，其中该组合物中大于约50％的单聚乙二醇化的化合物具有直接或间接地与B链的第28位置处赖氨酸的ε-氨基共价连接的PEG。

本发明也提供包含式I的聚乙二醇化的赖脯胰岛素和一种或多种可药用保存剂、等渗剂、金属离子或缓冲剂的药物组合物。在本发明的某些实施方案中，包含式I的聚乙二醇化的赖脯胰岛素和一种或多种可药用保存剂、等渗剂、金属离子或缓冲剂的药物组合物还包含治疗有效量的胰岛素类似物。

本发明也提供治疗高血糖症、糖尿病或妊娠糖尿病的方法，包括向患者施用治疗有效量的包含本发明聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物的药物组合物。

本发明也包括本发明聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物用于治疗的用途。

本发明也包括本发明的聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物用于制造治疗低血糖症、糖尿病或妊娠糖尿病的药物的用途。

附图简述

图1基于来自大鼠和犬的PK参数的异速增长比率(allometric scaling)，图示地描述了20kDa PEG-B28-赖脯胰岛素、40kDa-PEG-B28-赖脯胰岛素和地特胰岛素的模拟人PK曲线。曲线代表给药一周后的一个给药间隔。数字是平均峰谷比。

图2是PEG_20kDa-B28_{(≥～95％)}/A1_(≤～5％)-赖脯胰岛素(LY；0.225mg/kg)或甘精胰岛素(0.5U/kg)皮下给药后人中葡萄糖输注率(GIR)的曲线。GIR曲线基于观察的数据和Lilly Research Laboratories内部开发的“Loess平滑曲线(loess smooth)”(Splus 2000，专业版，MathSoft，Inc)函数用来拟合观察的数据。

发明详述

本文中使用以下缩写：ACN：乙腈。Boc：叔丁氧羰基。BSA：牛血清白蛋白。DCM：二氯甲烷，氯化亚甲基。DMF：N，N-二甲基甲酰胺。DMSO：二甲基亚砜。DTT：二硫苏糖醇。EDTA：乙二胺四乙酸。Et：乙基。EtOH：乙醇。Fmoc：9-芴甲氧羰基。HCl：氢氯酸。Da：道尔顿。kDa：千道尔顿。Lilly：Eli Lilly and Company(印第安纳波利斯，IN)。mAb：单克隆抗体。Me：甲基。MeOH：甲醇。PBS：磷酸盐缓冲盐水。RP-HPLC：反相高效液相色谱。SEC：大小排阻层析。SEM：均数的标准误。SPA：闪烁邻近测定法。TFA：三氟乙酸。本公开中所用的全部氨基酸缩写是美国专利和商标局接受的如37C.F.R.§1.822(B)(2)所示的那些缩写。

术语“胰岛素”意图包括来自任意物种的野生型胰岛素，包括但不限于猪胰岛素、牛胰岛素和人胰岛素。天然或野生型胰岛素指具有与如自然界中所找到胰岛素的氨基酸序列相对应的氨基酸序列的胰岛素。编码来自众多不同物种的胰岛素的多核苷酸和氨基酸序列是本领域普通技术人员熟知的。例如，人胰岛素具有一条21氨基酸A链和一条30氨基酸B链(分别是SEQ ID NO：1和2)。胰岛素可以是天然的(即，分离自天然来源)、生物合成方式或合成方式产生。术语“胰岛素”也意图包括任何胰岛素衍生物和/或胰岛素类似物。

“胰岛素类似物”或“胰岛素衍生物”在本文中定义为这样的蛋白质，其具有胰岛素活性和与人胰岛素基本上相同的氨基酸序列，但与人胰岛素的差异是相对于人胰岛素的修饰，包括一个或多个氨基酸替换、缺失、倒位或添加。此类化合物是本领域熟知的。参见例如PCT国际专利申请公开号WO 96/15804和WO 03/053339；美国专利号3,528,960、5,514,646、5,618,913、5,750,497、6,011,007、6,251,856；和EP专利号254,516和280,534。本领域技术人员已知的胰岛素类似物的示例但非穷尽性名单包括门冬胰岛素(insulin aspart)、赖脯胰岛素(insulin lispro)、甘精胰岛素(insulin glargine)、地特胰岛素(insulin detemir)和格鲁辛胰岛素(insulin glulisine)。此外，术语“胰岛素”在本文中也涵盖可以视为胰岛素衍生物和胰岛素类似物这两者的化合物。此类化合物的示例在美国专利号5,750,497和6,011,007中描述。本领域技术人员已知的这种化合物的具体示例是地特胰岛素。

多种胰岛素类似物和/或衍生物已知是“快速起效”或“速效”的胰岛素类似物。术语“快速起效”和“速效”在本文可互换地使用。“速效胰岛素类似物”产生(a)在皮下施用后比人胰岛素更早开始，和/或(b)在皮下施用后比人胰岛素显示更短作用持续期的餐时葡萄糖效应。示例性速效胰岛素类似物包括“单体胰岛素类似物”，它们快速起效，原因是它们在生理条件下通常更不易二聚化或自我缔合。单体胰岛素类似物是本领域已知的。参见例如，美国专利号5,700,662和欧洲专利号214826。赖脯胰岛素是快速起效的单体胰岛素类似物，其中在野生型胰岛素B链(SEQ ID NO：2)第28位置处的脯氨酸和在野生型胰岛素B链(SEQ ID NO：2)第29位置处的赖氨酸已经调换。因此，赖脯胰岛素在本领域已知有多种命名，包括但不限于Lys^B28Pro^B29-人胰岛素、LysB28ProB29-人胰岛素和B28Lys，B29Pro人胰岛素。

术语“交联的”意指二硫键存在于半胱氨酸残基之间。例如，正确交联的人胰岛素含有在SEQ ID NO：1第7位置处的半胱氨酸与SEQ ID NO：2第7位置处的半胱氨酸之间、在SEQ ID NO：1第20位置处的半胱氨酸与SEQ ID NO：2第19位置处的半胱氨酸之间、在SEQ ID NO：1第6位置处的半胱氨酸与SEQ ID NO：1第11位置处的半胱氨酸之间的二硫键。类似地，正确交联的赖脯胰岛素化合物含有在SEQ ID NO：1第7位置处的半胱氨酸与SEQ ID NO：3第7位置处的半胱氨酸之间、在SEQ ID NO：1第20位置处的半胱氨酸与SEQ ID NO：3第19位置处的半胱氨酸之间、在SEQ ID NO：1第6位置处的半胱氨酸与SEQ ID NO：3第11位置处的半胱氨酸之间的二硫键。

如本文中所用，“PEG缀合的赖脯胰岛素”或“聚乙二醇化的赖脯胰岛素”指与至少一个PEG共价连接并拥有胰岛素体内活性的人赖脯胰岛素或其衍生物。

胰岛素和赖脯胰岛素的生物学活性已经被充分建立。短语“胰岛素活性”就本发明的聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物而言意指在至少一个通常认可的体内动物模型中明显降低血糖水平的能力，所述的体内动物模型包括但不限于分别在下文实施例5和实施例6中描述的1型和2型糖尿病动物模型。因而，胰岛素活性包括聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物在STZ处理的大鼠中以剂量568nmol/kg单次皮下注射后降低血糖至100mg/dL或以下的水平持续范围从约4小时到至少约36小时时间的能力。

术语“聚乙二醇”或“PEG”指带有或没有偶联剂或与偶联或活化部分衍生化的聚烷撑二醇化合物或其衍生物。在其一般形式下，PEG是带末端羧基的线性聚合物并且具有式HO-CH₂CH₂-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-OH。PEG中重复亚单位的数目“n”近似以道尔顿描述的分子质量。一般而言，用来制备聚乙二醇化的化合物的PEG试剂包含在PEG聚合物中具有不同数目(n)乙二醇亚单位的PEG的异质混合物。PEG的单个乙二醇亚单位(-(CH₂CH₂O))具有约44道尔顿的分子量。因而，PEG聚合物的分子量取决于数目(n)。与本发明的聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物连接的PEG将具有范围从约400至约1000亚单位的n。优选地，与本发明的聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物连接的PEG将具有范围从约400至约750的n。更优选地，与本发明的聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物连接的PEG将具有范围从约400至约550的n。最优选地，与本发明的聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物连接的PEG将具有约400至约500的n。

PEG的许多衍生物和用于制造它们并使其缀合至蛋白质(如胰岛素或赖脯胰岛素)的方法是本领域已知并且适合用于本发明中。参见例如，PCT国际的专利申请公开号WO 01/62827，WO 2006/028745，WO 2006/096535，WO 2006/036825；Zalipsky，S.Bioconjugate Chem.6：150-165，1995；Veronese，等人，Applied Biochem.and Biotech.11：141-152，1985；和Roberts，M.等人Advanced Drug Delivery Reviews，54：459-476，2002。一个特别优选用于本发明中的PEG是使聚合物的一个末端以相对惰性的基团(如低级C_1-6烷氧基)封端的PEG。优选地，该PEG是单甲氧基-PEG(通称为mPEG)，它是线性形式的PEG，其中该聚合物的一个末端是甲氧基(-OCH₃)。甚至更优选地，本发明中所用的PEG是“活化的mPEG”，其中该线性PEG的一个末端以甲氧基封端并且另一个末端以反应基封端，所述的反应基适用于偶联至赖脯胰岛素上或衍生的赖脯胰岛素衍生物上想要的位点，旨在促进以想要的活化mPEG在赖脯胰岛素分子的特定位点处聚乙二醇化。

因为PEG一般作为其分子量在某种程度上变化的聚乙二醇化的化合物的混合物产生和使用，故而本领域普通技术人员通常借助在产生特定聚乙二醇化的化合物的聚乙二醇化反应中所用的PEG试剂的平均大小来描述与该化合物连接的PEG的分子量。在报道平均值的多种可能方式当中，通常使用三种方式：数均分子量、重均分子量和z-平均分子量。如本文中所用，短语“平均分子量”意指可以使用本领域熟知技术(包括但不限于基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱法、凝胶透过层析或其他液体层析技术、光散射技术、超速离心法和粘度测定法)测量的重均分子量。计算重均分子量的式可以表述为∑(M_i ²N_i)/∑((M_iN_i)，其中N_i是混合物中具有分子量M_i的分子的摩尔分数(或数目分数)。计算数均分子量的式可以表述为∑(M_iN_i)/∑(N_i)，其中N_i是混合物中具有分子量M_i的分子的摩尔分数(或数目分数)。重均分子量与数均分子量之比已知为多分散指数(PDI)并且提供对该分布的宽度的大致指示。适用于制备本发明聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物的PEG试剂一般是多分散的(即，该聚合物的数均分子量和重均分子量不是相等的)。优选地，用来制备本发明化合物或组合物的PEG试剂的PDI小于约1.1。更优选地，用来制备本发明化合物或组合物的PEG试剂的PDI小于约1.05。

就本发明的聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物而言，与赖脯胰岛素分子共价连接的PEG具有范围从约17.5kDa至约40kDa(n是在约400至约1000的范围内)的分子量或该PEG具有约17.5kDa至约40kDa的平均分子量。优选地，与赖脯胰岛素分子共价连接的PEG具有范围从约20kDa至约30kDa(n是在约450至约750的范围内)的分子量或该PEG具有约20kDa至约30kDa的平均分子量。更优选地，与赖脯胰岛素分子共价连接的PEG具有范围从约17.5kDa至约25kDa(n是在约400至约550的范围内)的分子量或该PEG具有约17.5kDa至约25kDa的平均分子量。最优选地，与赖脯胰岛素分子共价连接的PEG具有范围从约17.5kDa至约20kDa(n是在约400至约500的范围内)的分子量或该PEG具有从约17.5kDa至约20kDa的平均分子量。

在某些实施方案中，本发明的聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物通过将具有想要的平均分子量的活化mPEG共价连接至赖脯胰岛素来制备。聚乙二醇化的赖脯胰岛素的反应条件将根据所用的具体PEG、赖脯胰岛素上连接的位点、赖脯胰岛素上作为连接的靶的反应基团的具体类型、想要的聚乙二醇化的程度等变动，并且可以由本领域技术人员轻易地确定。特定聚乙二醇化的策略的优化实验条件可以由本领域技术人员轻易地确定，一般通过例行的实验轻易确定。

在优选的实施方案中，本发明的聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物通过下述方式制备：使相对具有硫羟选择性的活化mPEG(如mPEG-马来酰亚胺(mPEG-MAL)或mPEG-硫羟(mPEG-SH))通过缀合这种具有硫羟选择性的活化mPEG至硫羟官能度而与赖脯胰岛素间接缀合，其中所述的硫羟官能度已经利用“胺-至-硫羟”修饰剂(如N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫代丙酸酯(SATP)和N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫代乙酸酯(SATA))导入赖脯胰岛素。更优选地，用来将PEG与赖脯胰岛素上的硫羟基(巯基)共价连接的活化的mPEG是mPEG-马来酰亚胺，如下文显示的(a)、(b)或(c)：

制备本发明聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物的优选方法使用迈克尔加成来形成稳定的硫醚键。该反应是高度特异的并且在温和条件下在其他官能团存在下发生。例如，mPEG-马来酰亚胺用作制备本发明聚乙二醇化的赖脯胰岛素缀合物的活化mPEG。优选地，该聚乙二醇化的方法使用相对于mPEG-马来酰亚胺而言摩尔过量的硫羟衍生化赖脯胰岛素来驱动此反应至完全。优选地，反应也在pH 4.0和9.0之间于室温进行1至40小时。过量的未聚乙二醇化的含巯基的肽通过常规分离方法轻易地与聚乙二醇化的产物分开。在实施例1中描述了利用活化的mPEG-马来酰亚胺使赖脯胰岛素聚乙二醇化所需要的示例性条件。

在某些实施方案中，本发明的聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物通过缀合对胺具有相对特异性的活化的mPEG制备。主要适合用于赖脯胰岛素的胺特异性聚乙二醇化的活化mPEGs包括mPEG-琥珀酰亚胺丙酸酯(mPEG-SPA)、mPEG琥珀酰亚胺丁酸酯(mPEG-SBA)、mPEG-琥珀酰亚胺α-甲基丁酸酯(mPEG-SMB)、mPEG-琥珀酰亚胺碳酸酯(mPEG-SC)、mPEG-苯并三唑碳酸酯和mPEG-对硝基苯基碳酸酯(mPEG-NPC)。

在本发明的优选实施方案中，用于赖脯胰岛素聚乙二醇化的活化mPEG产生了借助水解稳定的共价键(如酰胺、氨基甲酸乙酯(也称作一种氨基甲酸酯)、胺、硫醚(也称作砜)或脲(也称作尿素)键)与mPEG共价连接的赖脯胰岛素。更优选地，用于赖脯胰岛素聚乙二醇化的活化mPEG是mPEG-SC或mPEG-NPC，它们均产生了通过氨基甲酸乙酯(或氨基甲酸酯)键与PEG共价连接的赖脯胰岛素。在实施例2中描述了使用具有多种分子量的mPEG-NPC使赖脯胰岛素聚乙二醇化的示例性条件。

本发明的聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物一般使用一种或多种纯化技术如离子交换层析、大小排阻析层析、亲和层析、疏水性相互作用层析和/或反相层析纯化。样品中聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物的总体异质性(从聚乙二醇化反应产生的聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物的数目和比例)可以使用一种或多种以下方法：层析法、电泳法、质谱法并且特别是MALDI-MS和核磁共振波谱法评估。

用来制备本发明聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物的赖脯胰岛素可以通过多种认可的肽合成技术(包括液相方法、固相方法、半合成方法和重组DNA方法)中的任意方法制备。例如，美国专利号5,700,662(Chance等人)和欧洲专利号214 826(Brange等人)公开了多种胰岛素类似物的制备。赖脯胰岛素的A链和B链也可以使用重组DNA技术经由胰岛素原样前体分子制备。在优选的实施方案中，胰岛素原样前体用来产生赖脯胰岛素，所述的赖脯胰岛素用来制造本发明的聚乙二醇化的赖脯胰岛素。

本发明提供式I即P-[(A)-(B)]的化合物或其可药用盐，其中

A是赖脯胰岛素的A链(SEQ ID NO：1)；

B是赖脯胰岛素的B链(SEQ ID NO：3)；并且

P是具有范围从约17.5kDa至约40kDa的分子量的PEG，并且其中A和B适当地交联并且P通过共价键直接或间接地与A链第1位置处甘氨酸的α-氨基、B链第1位置处苯丙氨酸的α-氨基或B链第28位置处赖氨酸的ε-氨基连接。本发明的优选化合物是那些化合物，其中(a)P通过氨基甲酸乙酯键或硫醚键与赖脯胰岛素共价连接；并且(b)所述化合物的特征是具有针对人胰岛素受体的约30nM、约20nM、约10nM或约5nM或更小的Ki；在STZ处理的大鼠中以约568nmol/kg施用具有大于约6小时、约8小时、约10小时、约12小时或约14小时的消除半寿期；或具有以剂量约568nmol/kg单次皮下注射该化合物后降低血糖至约100mg/dL或以下的水平持续范围从约4小时到至少约36小时、约48小时、约60小时、约72小时、约84小时、约96小时、约108小时或约120小时时间的活性。甚至更优选的化合物是那些化合物，其中(a)P通过氨基甲酸乙酯键与赖脯胰岛素共价连接；(b)所述化合物的特征是具有针对人胰岛素受体的约10nM或更小的Ki；(c)所述化合物的特征是在STZ处理的大鼠中以约568nmol/kg施用具有大于6小时的消除半寿期；和(d)所述化合物的特征是具有以剂量约568nmol/kg单次皮下注射该化合物后降低血糖至约100mg/dL或以下的水平持续范围从约4小时到至少约48小时、约60小时、约72小时、约84小时、约96小时、约108小时或约120小时时间的活性。最优选的化合物是那些化合物，其中(a)P通过氨基甲酸乙酯键与赖脯胰岛素共价连接；(b)所述化合物的特征是具有针对人胰岛素受体的约10nM或更小的Ki；(c)所述化合物的特征是在STZ处理的大鼠中以约568nmol/kg施用具有大于6小时的消除半寿期；(d)所述化合物的特征是具有以剂量约568nmol/kg单次皮下注射该化合物后降低血糖至约100mg/dL或以下的水平持续范围从约4小时到至少约48小时、约60小时、约72小时、约84小时、约96小时、约108小时或约120小时时间的活性；和(e)所述化合物的特征是在人中以0.225mg/kg施用单次肠胃外剂量时具有大于约24小时、约30小时、约32小时、约34小时、约36小时、约38小时、约40小时或约42小时的消除半寿期。

根据符合本发明的特征和原理，本发明的实施方案提供了包含具有约17.5kDa、约20kDa、约25kDa、约30kDa或约40kDa平均分子量的PEG的单聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物，其中所述的PEG共价地与赖脯胰岛素A链第1位置处甘氨酸的α-氨基(PEG-GlyA1赖脯胰岛素)、赖脯胰岛素B链第1位置处苯丙氨酸的α-氨基(PEG-PheB1赖脯胰岛素)、赖脯胰岛素B链第28位置处赖氨酸的ε-氨基(PEG-LysB28赖脯胰岛素)直接或间接连接。优选地，该单聚乙二醇化的赖脯胰岛素包含具有约17.5kDa、约20kDa、约25kDa、约30kDa或约40kDa平均分子量的PEG，其中所述的PEG与赖脯胰岛素B链第1位置处苯丙氨酸的α-氨基或赖脯胰岛素B链第28位置处赖氨酸的ε-氨基直接或间接连接。更优选地，该单聚乙二醇化的赖脯胰岛素包含具有约17.5kDa、约20kDa、约25kDa、约30kDa或约40kDa平均分子量的与赖脯胰岛素B链第28位置处赖氨酸的ε-氨基连接的PEG。甚至更优选地，该单聚乙二醇化的赖脯胰岛素包含具有约17.5kDa或约20kDa平均分子量的与赖脯胰岛素B链第28位置处赖氨酸的ε-氨基连接的PEG(20kDa-PEG-LysB28赖脯胰岛素)。最优选地，该单聚乙二醇化的赖脯胰岛素包含具有约20kDa平均分子量的与赖脯胰岛素B链第28位置处赖氨酸的ε-氨基连接的PEG(即，PEG_20kDa-LysB28赖脯胰岛素)。

本发明的其他实施方案提供了包含具有约17.5kDa、约20kDa、约25kDa、约30kDa或约40kDa分子量的PEG的单聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物，其中所述的PEG共价地与赖脯胰岛素A链第1位置处甘氨酸的α-氨基、赖脯胰岛素B链第1位置处苯丙氨酸的α-氨基、赖脯胰岛素B链第28位置处赖氨酸的ε-氨基直接或间接连接。优选地，该单聚乙二醇化的赖脯胰岛素包含具有约17.5kDa、约20kDa、约25kDa、约30kDa或约40kDa分子量的PEG，其中所述的PEG与赖脯胰岛素B链第1位置处苯丙氨酸的α-氨基或赖脯胰岛素B链第28位置处赖氨酸的ε-氨基直接或间接连接。更优选地，该单聚乙二醇化的赖脯胰岛素包含具有约17.5kDa、约20kDa、约30kDa或约40kDa分子量的与赖脯胰岛素B链第28位置处赖氨酸的ε-氨基连接的PEG。最优选地，单聚乙二醇化的赖脯胰岛素包含具有约20kDa分子量的与赖脯胰岛素B链第28位置处赖氨酸的ε-氨基连接的PEG并且该PEG-LysB28-赖脯胰岛素的特征是在人中以0.225mg/kg施用单次皮下剂量的该组合物时具有大于约24小时、约30小时、约32小时、约34小时、约36小时、约38小时、约40小时或约42小时的消除半寿期。

在另一个实施方案中，本发明提供组合物，其包含其中PEG的连接发生在不同位点处的聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物的混合物和/或单聚乙二醇化的、双聚乙二醇化的和三聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物的混合物。本发明的示例性组合物是包含多于一种聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物的那些组合物，其中所述的聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物选自由i)PEG-GlyA1赖脯胰岛素、ii)PEG-PheB1赖脯胰岛素、iii)PEG-LysB28赖脯胰岛素、iv)二PEG-GlyA1PheB1-赖脯胰岛素、v)二PEG-GlyA1LysB28-赖脯胰岛素、vi)二PEG-PheB1LysB28-赖脯胰岛素和vii)二PEG-GlyA1PheB1-赖脯胰岛素组成的组。更优选地，本发明的组合物包含聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物的混合物，其中大于约80％、约85％、约90％、约95％或约97％的所述聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物是式I的单聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物。甚至更优选地，本发明的组合物包含聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物的混合物，其中大于约80％、约85％、约90％、约95％或约97％的所述聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物是单聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物，并且小于约20％、约15％、约10％、约5％或约3％的总聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物是双聚乙二醇化的。甚至更优选地，本发明的组合物包含聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物的混合物，其中大于约80％、约85％、约90％、约95％或约97％的所述聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物是PEG-LysB28-赖脯胰岛素。甚至更优选地，本发明的组合物包含聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物的混合物，其中大于约80％、约85％、约90％、约95％或约97％的所述聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物是PEG-LysB28-赖脯胰岛素，并且小于约20％、约15％、约10％、约5％或约3％的总聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物是PEG-GlyA1-赖脯胰岛素。甚至更优选地，本发明的组合物包含聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物的混合物，其中大于约80％、约85％、约90％、约95％或约97％的所述聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物是PEG-LysB28-赖脯胰岛素，小于约20％、约15％、约10％、约5％或约3％的总聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物是PEG-GlyA1-赖脯胰岛素，并且小于约10％、约5％或约3％的总聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物是双聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物。甚至更优选地，本发明的组合物包含聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物的混合物，其中约80％的总聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物是PEG-LysB28-赖脯胰岛素，约10％是PEG-GlyA1-赖脯胰岛素，并且约10％是二PEG-GlyA1LysB28-赖脯胰岛素。甚至更优选地，本发明的组合物包含聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物的混合物，其中约90％或更多的总聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物是PEG-LysB28-赖脯胰岛素，约5％或更少是PEG-GlyA1-赖脯胰岛素，并且约5％或更少是二PEG-GlyA1LysB28-赖脯胰岛素。甚至更优选地，本发明的组合物包含聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物的混合物，其中约90％或更多的总聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物是PEG-LysB28-赖脯胰岛素，约5％或更少是PEG-GlyA1-赖脯胰岛素，约5％或更少是二PEG-GlyA1LysB28-赖脯胰岛素，并且其中PEG-LysB28-赖脯胰岛素的特征是在人中以0.225mg/kg施用单次皮下剂量的该组合物时具有大于约24小时、约30小时、约32小时、约34小时、约36小时、约38小时、约40小时或约42小时的消除半寿期。最优选地，本发明的组合物包含聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物的混合物，其中约95％或更多的总聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物是PEG-LysB28-赖脯胰岛素，约5％或更少是PEG-GlyA1-赖脯胰岛素，并且PEG-LysB28-赖脯胰岛素的特征是在人中以0.225mg/kg施用单次皮下剂量的该组合物时具有大于约24小时、约30小时、约32小时、约34小时、约36小时、约38小时、约40小时或约42小时的消除半寿期。

如本文中所用的，术语“碱性条件”指聚乙二醇化的反应的碱度。为了在赖脯胰岛素B链第28位置的赖氨酸处获得更多选择性聚乙二醇化的赖脯胰岛素，该反应当用基本上脱质子化的赖脯胰岛素的α-氨基实施。在含水溶剂或共溶剂中，碱性条件意指反应在大于7.0的pH实施。优选地，聚乙二醇化的反应在从约8.5至约11.5的pH进行。在有机溶剂中，该反应在具有下述脯度的碱存在下实施，其中所述的碱度等同于在水中大于或等于10.75的pKa。

本发明也包括制备式P-[(A)-(B)]的聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物或其可药用盐的方法，其中

A是赖脯胰岛素的A链(SEQ ID NO：1)；

B是赖脯胰岛素的B链(SEQ ID NO：3)；并且

P是具有范围从约20kDa至约40kDa的分子量的PEG，并且其中A和B适当地交联并且P通过氨基甲酸乙酯共价键与B的第28位置处赖氨酸的ε-氨基连接，所述方法包括使B的第28位置处赖氨酸的ε-氨基与具有约20kDa至约40kDa之间重均分子量的单甲氧基聚(乙二醇)对硝基苯基碳酸酯(mPEG-NPC)在含水溶剂中、在约8.5至约11.5之间的pH和在约25℃至约30℃之间的反应温度反应。优选地，该反应的pH维持在约10.5至约11.1之间，该聚乙二醇化的反应在约25℃至约30℃之间的温度进行约2至约12小时之间的时间段，并且mPEG-NPC对赖脯胰岛素的比率在约1.0至约5.0之间的范围内。更优选地，mPEG-NPC的重均分子量是约20kDa，该反应的pH维持在约10.5至约11.1之间，该聚乙二醇化的反应在约25℃和约30℃之间的温度进行约2和约12小时之间的时间段，并且mPEG-NPC对赖脯胰岛素的比率在约1.0和约5.0之间的范围内。甚至更优选地，PEG：赖脯胰岛素摩尔比在约2.5和约4.5之间的范围内，mPEG-NPC的重均分子量是约20kDa，聚乙二醇化反应的pH维持在约10.5和约11.1之间，聚乙二醇化反应的温度维持在约25℃和约30℃之间持续约3和约6小时之间的时间段。最优选地，PEG：赖脯胰岛素摩尔比在约2.6和约4.5之间的范围内，mPEG-NPC的重均分子量是约20kDa，聚乙二醇化反应的pH维持在约10.5和约11.0之间，并且该反应的温度维持在约25℃和约30℃之间持续约3小时。

根据需要，具有不同分子量的本发明聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物可以使用本领域技术人员已知的多种技术(包括但不限于凝胶过滤层析法和/或离子交换层析法)分离。也就是说，凝胶过滤层析法可以用来对单聚乙二醇化的、双聚乙二醇化的和三聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物基于它们的差异性分子量分级(其中所述差异实质上对应于PEG化反应中所用PEG的平均分子量)。例如，在赖脯胰岛素与具有约20kDa平均分子量的活化mPEG缀合的示例性反应中，所得的反应混合物可以含有具有约5,808道尔顿分子量的未修饰的赖脯胰岛素、具有约25,808道尔顿平均分子量的单聚乙二醇化的赖脯胰岛素、具有约45,808道尔顿平均分子量的双聚乙二醇化的赖脯胰岛素和具有约65,808道尔顿平均分子量的三聚乙二醇化的赖脯胰岛素。然而，因为凝胶过滤技术基于流体动力学尺寸分离化合物，所以与具有约20kDa平均分子量的mPEG缀合的单聚乙二醇化的赖脯胰岛素将在凝胶过滤期间作为大约82kDa蛋白质迁移，即便具有约25,808道尔顿的平均分子量。本领域技术人员可以预期用平均分子量约20kDa的mPEG进行聚乙二醇化的二聚乙二醇化的和三聚乙二醇化的种类具有很不同的迁移时间或保留时间，从而允许它们的纯化或定量。

短语“血浆半寿期”指身体内药物的血浆浓度下降一半所花费的时间。备选使用的术语是“消除半寿期”，其对应于消除的终末对数线性速率。本领域技术人员理解，半寿期是作为清除率和分布体积的函数变化的导出参数。血浆半寿期或消除半寿期的语境下所用的术语“延伸的”、“较长的”或“增加的”在本文中互换地使用并且意指相对于如可比较条件下所确定的参考分子(例如，赖脯胰岛素)的半寿期，在试验化合物(例如，聚乙二醇化的赖脯胰岛素)的半寿期方面存在统计显著的增加。

清除率是身体消除药物能力的量度。当清除率例如因对药物的修饰而减少时，半寿期将预期增加。然而，这种相互关系仅在分布体积方面不存在变化时是确切的。终末对数线性半寿期(t1/2)、清除率(CL)和分布体积(V)之间有用的近似关系在方程t1/2～0.693(V/CL)中给出。清除率不表明多少量的药物正在移出，而是通过不得不完全地没有该药物的生物液如血液或血浆的体积来解释该消除作用。清除率表述为体积每单位时间。

如本文中所用的术语“治疗”或“进行治疗”指防治和照顾患有糖尿病或高血糖症或其他病症的患者，其中出于对付或减轻所述病症的症状和并发症目的，指明针对那些病症施用胰岛素。治疗包括施用本发明的化合物或组合物以防止症状或并发症的发作、减轻该症状或并发症或消除疾病、病症或病况。待治疗的患者是哺乳动物并优选地是人类。

式I的聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物通过施用治疗有效量的一种或多种式I化合物至有需要的患者来有效治疗高血糖症。如本文中所用，短语“治疗有效量”指式I的聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物或其组合物的量足以调节患者中的血糖。优选地，式I的聚乙二醇化的赖脯胰岛素的治疗有效量是从约0.01nmol/kg至约100nmol/kg。更优选地，治疗有效量从约0.01至约50nmol/kg。甚至更优选地，治疗有效量从约0.01至约20nmol/kg。甚至更优选地，治疗有效量从约0.01至约10nmol/kg。甚至更优选地，治疗有效量从约0.1至约7.5nmol/kg。甚至更优选地，治疗有效量从约0.1至约5nmol/kg。最优选地，治疗有效量从约0.5至约5nmol/kg。然而，应当理解实际施用的聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物或包含一种或多种聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物的组合物的量将由医师在相关环境影响下决定，所述的相关环境包括正在治疗的病症(即高血糖症的原因)、待施用的聚乙二醇化的赖脯胰岛素的具体种类或聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物的特定混合物、待共同施用的其他药物、胰岛素或其它待共同施用物、所选择的肠胃外施用途径、个体患者的年龄、重量和应答以及患者的综合征的严重性。因而，上述的剂量范围不以任何方式意图限制本发明的范围。

短语“足以调节血糖”意指向患者施用化合物或组合物导致正常的空腹血糖水平。临床正常的空腹血糖水平是70-110mg/dL。临床正常的餐后血浆糖水平是小于140mg/dL。

已知胰岛素结构中的共价性化学变化在贮存时发生。这可以导致活性更低和潜在具有免疫原性的分子如脱酰胺产物和高分子量转变产物(例如，二聚体、寡聚物、聚合物)形成。对胰岛素的化学稳定性的广泛研究由Jens Brange在“Stability of Insulin”，Kluwer Academic Publishers，1994中给出。胰岛素产品的货架期主要因可溶性聚集物(二聚体、寡聚物和聚合物)随时间推移形成而受损，即便存在以下事实：胰岛素组合物一般贮存在不超过约2-8℃的低温，与例如在室温贮存相比，所述的低温大幅度改善该货架期。此外，胰岛素产品受到因(例如在患者口袋内携带时或运输期间的)震动所致的不溶性聚集物(纤丝)形成影响。对胰岛素产品的质量是重要的是，将因化学或物理影响形成此类可溶性和不溶性聚集物的倾向降低至绝对最小。因而，为了治疗地使用，胰岛素组合物必须展示出可接受的化学和物理稳定性特征。

如本文中所用的术语“稳定性”指聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物的制剂的物理和/或化学稳定性。聚乙二醇化的赖脯胰岛素制剂的物理不稳定性可能因蛋白质分子聚集以形成更高阶聚合物或甚至析出所致。“稳定的”制剂是这样的制剂，其中蛋白质聚集的程度被可接受地控制并且没有随时间不可接受地提高。在本发明的某些实施方案中，如果聚集的程度是在起始物中所观察到的聚集程度的约1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％或30％范围内，将聚乙二醇化的赖脯胰岛素制剂视为经过某段时间是稳定的。在本发明的某些实施方案中，如果所述多肽的生物学活性是用起始物所观察到的至少约99％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％或50％活性，则将聚乙二醇化的赖脯胰岛素制剂视为经过某段时间是稳定的。

如本文中所用的术语“化学稳定性”指聚乙二醇化的赖脯胰岛素组合物在贮存期间在静态条件(包括在大约2-8℃的低温或大约20-40℃的升高温度贮存)下形成可溶性蛋白质聚集物的倾向性。可以通过在特定条件下(如在特定温度和湿度条件经过某段时间)确定制剂中的分析性属性，测量本发明聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物的化学稳定性。例如使用大小排阻HPLC，可以测量的分析性属性包括高分子量种类的形成。所述结果可以随后加以监测并且与预先指定的参数比较。

如本文中所用的术语“物理稳定性”指聚乙二醇化的赖脯胰岛素组合物因物理作用(如振摇聚乙二醇化的赖脯胰岛素组合物)形成不溶性蛋白质聚集物的倾向。本发明的聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物在多种药物制剂中于多种温度贮存限定的时间段时的物理稳定性可以通过本领域的熟知方法(包括测量样品的表观光衰减(吸光度或光密度))评估。如，对光衰减的测量涉及制剂的浊度。浊度因制剂中蛋白质或复合物聚集或沉淀产生。用于评估物理稳定性的其他方法是本领域熟知的，包括眼观评估粒子的存在或不存在或通过Thioflavin T荧光显微镜检测纤丝/凝胶形成。

本发明的其他实施方案提供了适于施用至患者、尤其施用至人类的药物组合物，其包含治疗有效量的至少一种式I的聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物和一种或多种可药用赋形剂、稀释剂、缓冲剂、金属离子或载体。此类药物组合物在本质上一般(尽管并非必需)是肠胃外的，并且可以通过多种技术中的任意方法，使用针对本领域所熟知肠胃外产品的常规赋形剂、缓冲剂、稀释剂、金属离子或载体制备。

因为本发明的聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物是极为水溶的，本发明的药物组合物包括下述组合物，其包含水作为主要溶剂、至少1mg/mL、至少2mg/mL、至少5mg/mL、至少10mg/mL、至少15mg/mL、至少20mg/mL、至少25mg/mL、至少30mg/mL、至少35mg/mL、至少40mg/mL、至少45mg/mL、至少50mg/mL或更大总浓度的聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物和可药用缓冲液，其中所述药物组合物具有从约4.0至约8.5的pH。优选地，本发明的药物组合物具有约6.0和约8.5之间的pH。更优选地，本发明的药物组合物包含了范围从约2.5mg/mL至约60mg/mL总浓度的聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物和在其中所述组合物具有范围从约6.0至约8.5的pH的缓冲液。更优选地，本发明的药物组合物包含了范围从约5mg/mL至约50mg/mL浓度的聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物和在其中所述药物组合物具有范围从约6.5至约7.5的pH的缓冲液。甚至更优选地，本发明的药物组合物包含了范围从约10mg/mL至约40mg/mL浓度的聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物和在其中所述药物组合物具有范围从约6.5至约7.5的pH的缓冲液。甚至更优选地，本发明的药物组合物包含了范围从约15mg/mL至约40mg/mL浓度的聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物和在其中所述药物组合物具有范围从约7.0至约7.5或从约7.0至约8.0的pH的缓冲液。甚至更优选地，本发明的药物组合物还包含治疗有效量的胰岛素。甚至更优选地，该胰岛素是胰岛素类似物。甚至更优选地，该胰岛素类似物是速效胰岛素类似物。最优选地，这种速效胰岛素类似物是赖脯胰岛素。

术语″缓冲液″指通过其酸-碱缀合物组分的作用抵抗pH变化的溶液。优选地，所用的缓冲液是可药用缓冲液。短语“可药用缓冲液”指一种溶液，其安全用于胰岛素制剂中并且具有控制该药物组合物的pH处在所需pH的作用。在优选的实施方案中，该缓冲液具有范围从约6.0至约8.5的pH。更优选地，该缓冲液具有范围从约7.0至约8.0的pH。用于控制本发明组合物的pH处在这个范围内的可药用缓冲剂包括但不限于物质如磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、精氨酸、TRIS和组氨酸缓冲剂以及其组合。“TRIS”指2-氨基-2-羟甲基-1，3，-丙二醇并指其任何可药用盐。游离碱和盐酸盐形式(即，TRIS-HCl)是TRIS的两种常见形式。TRIS在本领域也称作三羟甲基氨基甲烷、氨丁三醇和三(羟基-甲基)氨基甲烷。优选地，本发明的药物组合物包含约2.5mM至约50mM的磷酸盐或TRIS缓冲剂。更优选地，本发明的药物组合物包含约5mM至约20mM的磷酸盐或TRIS缓冲剂。甚至更优选地，本发明的药物组合物包含约5mM至约10mM的磷酸盐缓冲剂。甚至更优选地，本发明的药物组合物包含约5mM的磷酸盐缓冲剂。甚至更优选地，本发明的药物组合物包含约7.5mM至约50mM之间的TRIS缓冲剂。甚至更优选地，本发明的药物组合物包含约10mM至约25mM之间的TRIS缓冲剂。甚至更优选地，本发明的药物组合物包含约15mM至约20mM之间的TRIS缓冲剂。最优选地，本发明的药物组合物包含约16mM的TRIS缓冲剂。

本发明的聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物和组合物可以用肠胃外地施用至患者的已知胰岛素配方类似地配制。此类配方是本领域技术人员已知的。优选地，式I的聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物用

赖脯胰岛素或

的配方类似地配制。因而，本发明的优选药物组合物可以包含水、式I的聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物、等渗剂和可药用缓冲剂。优选地，本发明的药物组合物还包含可药用的保存剂。更优选地，本发明的药物组合物还包含可以促进胰岛素六聚化的二价阳离子如锌和/或钴。甚至更优选地，本发明的药物组合物还包含至少一种六聚体稳定剂。另外，可以添加氢氯酸和/或氢氧化钠以调节pH。

“等渗剂”是生理上耐受的并且赋予制剂适宜张力以防止水跨细胞膜净流出的化合物，其中所述的细胞膜与施用的药物组合物接触。甘油，也称作丙三醇，通常用作等渗剂。其他等渗剂包括i)其他糖醇，如但不限于甘露醇和山梨糖醇；ii)盐，如但不限于NaCl；iii)单糖，包括但不限于葡萄糖；和iv)二糖，包括但不限于乳糖、蔗糖和海藻糖。本发明的药物组合物可以包括一种或多种等渗剂。优选地，本发明的药物制剂具有一种或多种等渗剂，其中所述的等渗剂产生具有在约270和约330mOsm范围等渗性的制剂。更优选地，等渗剂是甘油、山梨糖醇、蔗糖、NaCl、海藻糖和/或甘露醇。甚至更优选地，等渗剂是甘油、山梨糖醇、蔗糖、NaCl和/或海藻糖。甚至更优选地，甘油、山梨糖醇、蔗糖、NaCl或海藻糖以约100至约200mM的浓度存在于本发明的药物组合物中。甚至更优选地，甘油以约100至约200mM的浓度存在于本发明的药物组合物中。甚至更优选地，甘油以约150至约180mM的浓度存在于本发明的药物组合物中。甚至更优选地，甘油以约130至约175mM的浓度存在于本发明的药物组合物中。甚至更优选地，NaCl以约50至约300mM的浓度存在于本发明的药物组合物中。甚至更优选地，NaCl以约100至约200mM的浓度存在于本发明的药物组合物中。最优选地，NaCl以约150mM的浓度存在于本发明的药物组合物中。

本发明的药物组合物也可以含有六聚体稳定化合物。短语“六聚体稳定化合物”指使本发明的聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物稳定处于六聚体缔合状态的非蛋白质的小分子量化合物。钙离子、锌、钴、铜、镍、铁、镁、锰、阴离子、尤其氯化物、溴化物、碘化物、硫氰酸盐和酚类化合物、尤其酚、酚类保存剂、间苯二酚、4’-羟基乙酰苯胺、4-羟基苯甲酰胺和2，7-二羟基萘已知是胰岛素分子的六聚体稳定化合物。优选地，该六聚体稳定化合物是酚、间甲酚、邻甲酚、对甲酚、氯甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、钙、氯化物或两种或多种这些化合物的组合。更优选地，该六聚体稳定化合物是酚、间甲酚、钙、氯化物或其组合。优选地，本发明的药物组合物包含约1mM至75mM之间的钙、约1mM至约50mM之间的钙、约1mM至约25mM之间的钙、约5mM至约50mM之间的钙、约2.5mM至约30mM之间的钙、约2.5mM至约15mM之间的钙、约2.5mM至约10mM之间的钙、约5mM至约30mM之间的钙、约5mM至约15mM之间的钙。更优选地，本发明的药物组合物包含约2.5mM至10mM之间的钙。

本发明药物组合物的多用途制剂也可以含有保存剂。术语“保存剂”指添加至药物制剂以充当抗微生物剂的化合物。本领域已知有效和在肠胃外制剂中可接受的保存剂当中包括苯扎氯铵、苄索铵、氯己定、酚、间甲酚、苄醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯丁醇、邻甲酚、对甲酚、氯甲酚、硝酸苯汞、硫柳汞、苯甲酸及其多种混合物。某些酚类保存剂(如对羟基苯甲酸甲酯、酚和间甲酚)已知与胰岛素和胰岛素样分子结合并因而已知诱导了增加物理稳定性或化学稳定性或这二者的构象变化(参见例如，Birnbaum，D.T.等人，Pharmaceutical.Res.14：25-36(1997)；Rahuel-Clermont，S.等人，Biochemistry 36：5837-5845(1997))。“酚类保存剂”包括化合物：酚、间甲酚、邻甲酚、对甲酚、氯甲酚、对羟基苯甲酸甲酯，及其混合物。本发明聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物的制剂中所用的保存剂可以是酚类保存剂并且可以与该六聚体稳定化合物相同或不同。优选地，酚类保存剂是间甲酚或酚。更优选地，本发明的药物组合物包含浓度从约0.1至约75mM的酚和/或间甲酚作为pH在约7.0至约pH 8.0的保存剂。甚至更优选地，本发明的药物组合物包含浓度从约1至约60mM的酚和/或间甲酚作为pH在约7.0至约pH 8.0的保存剂。甚至更优选地，本发明的药物组合物包含浓度从约10至约40mM的酚和/或间甲酚作为pH在约7.0至约pH 8.0的保存剂。甚至更优选地，本发明的药物组合物包含pH约7.0至约pH 8.0的浓度约30mM的酚和/或间甲酚。最优选地，本发明的药物组合物包含pH约7.3至约pH 7.5的浓度约30mM的酚和/或间甲酚。如上文所提及，本发明的药物组合物可以包含驱动胰岛素六聚化或另外使胰岛素化合物稳定的二价金属阳离子如锌或钴。“二价金属阳离子”意指参与形成具有多个蛋白质分子的复合物的离子或多个离子。过渡金属、碱金属和碱土金属是已知与胰岛素化合物形成复合物的金属的示例。优选过渡金属。优选地，二价金属阳离子是选自由锌、铜、钴、镍、锰、镁、镉和铁组成的组中的一种或多种阳离子。更优选地，二价金属阳离子是锌。锌已知促进胰岛素六聚体和多种胰岛素类似物和/或衍生物(包括赖脯胰岛素)的六聚体形成。二价阳离子如锌或钴在本发明药物组合物中的主要作用是促进本发明的聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物和/或任何其他胰岛素或胰岛素类似物的六聚体在包含本发明聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物的药物组合物中形成。在酚类保存剂存在下，可以通过在Zn(II)离子存在下使包含本发明药物组合物的溶液的pH至中性范围或者通过在已经调节pH至中性范围后添加Zn(II)来促进六聚体形成。优选地，锌对胰岛素化合物、胰岛素类似物和/或聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物的比率下限约束为约0.33，即每个胰岛素六聚体、胰岛素类似物六聚体和/或聚乙二醇化的赖脯胰岛素六聚体对两个锌原子。更优选地，锌对胰岛素化合物、胰岛素类似物和/或聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物的比率是从约0.33至约0.67。如果与蛋白质竞争锌结合的化合物如柠檬酸盐或磷酸盐存在，可以在加工期间使用甚至更多的锌。可能想要高于六聚化所需要量的过量锌以更强烈地驱动六聚化，例如，从约0.33至约0.83的锌对胰岛素化合物、胰岛素类似物和/或聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物的比率。另外，高于六聚化所需要量的过量锌可以存在于本发明的药物组合物中并且可能是希望的，旨在改善化学和物理稳定性、改善“悬浮能力”和可能进一步延长时间-作用。另一方面，柠檬酸盐或磷酸盐缓冲液中的过量锌可能导致柠檬酸锌或磷酸锌分别析出以及胰岛素析出。

根据本发明，锌可以以每摩尔胰岛素、胰岛素类似物和聚乙二醇化的赖脯胰岛素六聚体约0.3摩尔至约3摩尔的量存在于制剂中。更优选地，锌以每摩尔总胰岛素、胰岛素类似物和聚乙二醇化的赖脯胰岛素六聚体约0.3摩尔至约1摩尔的量存在于本发明的药物组合物中。甚至更优选地，锌以每摩尔总胰岛素、胰岛素类似物和聚乙二醇化的赖脯胰岛素六聚体约0.3摩尔至约0.7摩尔的量存在于本发明的药物组合物中。最优选地，锌以每摩尔胰岛素、胰岛素类似物和聚乙二醇化的赖脯胰岛素六聚体约0.3摩尔至约0.55摩尔的量存在于本发明的药物组合物中。为本发明提供锌的锌化合物可以是任何可药用的锌化合物。本领域中已知添加锌至胰岛素制品，这是锌的可药用来源。优选地，锌作为盐提供，如硫酸锌、氯化锌、乙酸锌、柠檬酸锌、氧化锌或硝酸锌。

在本发明的又一实施方案中，本发明的药物组合物还包含一种或多种表面活性剂。如本文中所用的术语“表面活性剂”包括通过在气-液界面吸附而降低液体表面张力的物质。表面活性剂的示例包括但不限于非离子表面活性剂如聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20)；泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)；Triton^TM(例如，Triton^TM X-100)；聚乙二醇；聚丙二醇；以及乙二醇与丙二醇的共聚物(例如，Pluronics、PF68)。例如，表面活性剂可以以约0.001-0.5％(例如从约0.05-0.3％)的量存在于本发明的药物组合物中。优选地，在本发明药物组合物中所用的表面活性剂是泊洛沙姆188。更优选地，表面活性剂是浓度在约0.5mg/mL至约10mg/mL之间、约1mg/mL至约10mg/mL之间、约2mg/mL至约10mg/mL之间、约3mg/mL至约10mg/mL之间、约4mg/mL至约10mg/mL之间、约1mg/mL至约5mg/mL之间、约2mg/mL至约5mg/mL之间、约3mg/mL至约5mg/mL之间、以及约4mg/mL至约5mg/mL之间的泊洛沙姆188。

本发明也提供用于治疗、优选地在人中治疗低血糖症和/或糖尿病的式I的聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物或其可药用盐。

本发明也提供用于制造药物以治疗、优选地在人中治疗低血糖症和/或糖尿病的式I的聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物或其可药用盐。

包含本发明聚乙二醇化的赖脯胰岛素的药物组合物可以肠胃外地施用至需要这种治疗的患者。肠胃外施用可以通过皮下、肌内或静脉内注射，借助注射器、任选地笔样注射器或机械驱动注射仪进行。备选地，肠胃外施用可以借助输注泵进行。

制备1

GlyA1-HSCH₂CH₂CO-赖脯胰岛素(3)和LysB28-HSCH₂CH₂CO-赖脯胰岛素(4)

Trt-SCH₂CH₂CO-OH、N-羟琥珀酰亚胺(NHS)和二异丙基碳二亚胺(DIC)各1毫摩尔在2mL DMF中混合30分钟以制备Trt-SCH₂CH₂CO-NHS酯。十分之一毫摩尔的赖脯胰岛素溶于10mL在DMSO中的5％三乙胺(TEA)内。向该溶液添加0.2毫摩尔活化的Trt-SCH₂CH₂CO-NHS。在室温2小时后，添加0.2mL乙醇胺以终止该反应。反应混合物随后用90mL的H₂O稀释并施加到用于纯化的RP-C18柱上。汇集并冻干想要的LysB28-Trt-SCH₂CH₂CO-赖脯胰岛素(2)级分。另外，汇集并冻干想要的GlyA1-Trt-SCH₂CH₂CO-赖脯胰岛素(1)级分。十分之一毫摩尔的(1)或(2)溶解于含有0.2mL茴香硫醚和0.4mL三异丙基硅烷的5mL TFA中。30分钟后，TFA通过蒸发除去并且残余肽溶解于50mL在H₂O中的10％ACN中。所得的溶液施加到用于纯化的RP-C18柱上。汇集并任选地冻干想要的级分(3)或(4)。

制备2

PheB1-HSCH₂CH₂CO-赖脯胰岛素(7)

十分之一毫摩尔的赖脯胰岛素溶于10mL在DMSO中的5％TEA内。向该溶液添加DMSO中的0.2毫摩尔碳酸双-叔丁酯。在室温1小时后，添加0.2mL乙醇胺以终止该反应。反应混合物随后用90mL的H₂O稀释并施加到用于纯化的RP-C18柱上。将想要的Boc-GlyA1，Boc-LysB28-赖脯胰岛素级分汇集并冻干以产生(5)。十分之一毫摩尔的(5)溶于10mL在DMSO中的5％TEA内。向该溶液添加0.2毫摩尔活化的Trt-SCH₂CH₂CO-NHS。在室温2小时后，添加0.2mL乙醇胺以终止该反应。反应混合物随后用90mL的H₂O稀释并施加到用于纯化的RP-C18柱上。将想要的级分汇集并冻干以产生Trt-SCH₂CH₂CO-PheB1，Boc-GlyA1，Boc-LysB28-赖脯胰岛素(6)。十分之一毫摩尔的(6)溶解于含有0.2mL茴香硫醚和0.4mL三异丙基硅烷的5mL TFA中。30分钟后，TFA通过蒸发除去并且残余肽溶解于50mL在H₂O中的10％ACN中。所得的溶液施加到用于纯化的RP-C18柱上。将想要的级分汇集并冻干以产生(7)。

实施例1：硫羟基衍生的赖脯胰岛素中间体的聚乙二醇化

具有约20kDa(b)、30kDa(a)、40kDa(a)或60kDa(c)平均分子量的单甲氧基-PEG-MAL溶解于100mM NH₄Ac缓冲液(pH 4.69)和ACN的1∶1混合物中。将硫羟衍生化赖脯胰岛素(例如化合物(3)、(4)或(7))的冻干粉末添加至该溶液。反应可以随后进行分析性RP-HPLC。反应结束时(通常大约4小时后)，混合物用H₂O稀释并施加到用于纯化的RP-HPLC柱上。将想要的级分汇集并冻干以产生聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物。如实施例1中所述制备的示例性聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物下文显示为(8(a))、(8(b))、(9(a))、(9(b))、(10(a))、(10(b))和(15(c))。优选地，这些聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物将具有范围从约400至约1000的n。更优选地，这些聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物将具有范围从约400至约750的n。更优选地，这些聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物将具有范围从约400至约550的n。甚至更优选地，这些聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物将具有约400和约500的n。甚至更优选地，这些聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物将具有约450和约500的n。最优选地，这些聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物将具有约450的n。

实施例2：使用单甲氧基聚(乙二醇)对硝基苯基碳酸酯(mPEG-NPC)的赖脯胰岛素聚乙二醇化

十分之一毫摩尔赖脯胰岛素溶解于20mL的0.2M硼酸盐缓冲液(pH10.5)中，并将20mL ACN中具有约20kDa平均分子量的1.98gmPEG-NPC在激烈搅拌下添加至该溶液。反应由RP-HPLC和SEC监测。大约4小时后，反应混合物使用乙酸酸化至pH 5-7并施加到用于纯化的RP-HPLC柱上。想要的级分汇集并冻干旨在以范围从20％至45％的产率产生单聚乙二醇化的PEG20K-赖脯胰岛素。身份和纯度由RP-HPLC、SEC和MALDI-MS证实。连接到A链或B链上的mPEG的比率由所得缀合物用盐酸三(2-羧乙基)膦(TCEP)处理后释放的游离A链和B链的面积积分确定。mPEG-NPC对赖脯胰岛素的比率决定单聚乙二醇化的和双聚乙二醇化的种类的产物分布。反应pH控制聚乙二醇化的位点特异性。当pH从约8增加至约12，化合物(11)变成主要产物。当反应在pH 10.5用具有约20kDa平均分子量的mPEG-NPC(n是约450)进行时，(11)对(12)的比率是约85∶15。

上文所述的聚乙二醇化的反应也可以通过连续添加0.2M NaOH维持反应混合物的pH在非缓冲的水溶液中进行。在非缓冲的水溶液中使用具有约20kDa平均分子量的mPEG-NPC进行，同时pH维持在约pH 11.5时，聚乙二醇化的反应产物包括比率为约92∶8的(11)和(12)。优选地，化合物(11)将具有范围从约400至约1000的n。更优选地，化合物(11)将具有范围从约400至约750的n。甚至更优选地，化合物(11)将具有范围从约400至约550的n。甚至更优选地，化合物(11)将具有约400至约500的n。甚至更优选地，化合物(11)将具有约450至约500的n。最优选地，化合物(11)将具有约450的n。

实施例3：体外受体亲和力

受体结合测定法在P1膜进行，其中所述的P1膜从稳定转染的过量表达人胰岛素受体(hIR)或人IGF-1受体(hIGF-1R)的293EBNA HEK细胞制备。从使用人重组(3-[¹²⁵I]碘酪氨酰A¹⁴)-胰岛素(2000Ci/毫摩尔)或人重组[¹²⁵I]胰岛素样生长因子1(2000Ci/毫摩尔)的竞争性放射配体结合测定法测定结合亲和力。该测定法以使用PVT PEI处理的A型麦胚凝集素偶联的SPA珠的SPA方法进行。SPA测定法缓冲液(50mM TRIS-HCl，pH 7.5，150mM NaCl，0.1％BSA)用于全部试剂制品。在测定缓冲液中使用Freedom/Evo机器人(Teean)制备化合物的3倍连续稀释物(100nM至2pM)并将它们添加至带有Multimek(Beckman Coulter)的96孔白色、透明底微量平板(Corning/Costar)。使用多滴头仪(multidrop instrument)(Titertek)，添加放射配体、膜和SPA珠。在室温孵育10小时后，使用Microbeta Trilux闪烁计数器测定放射性活度。包括在每个实验中分别以非标记的赖脯胰岛素和非标记的IGF-1作为阳性对照和阴性对照。从4-参数对数非线性回归分析确定IC₅₀值。亲和常数(Ki)从IC₅₀值基于下述方程Ki＝IC50/(1+D/Kd)计算，其中D等于实验中所用放射配体的浓度并且Kd等于从饱和结合分析所确定的放射配体的平衡结合亲和常数(hIR和hIGF-1R的Kd分别是0.124和0.130nM)。下文报道的几何平均Ki是10^(平均Log Ki)，其中平均Log Ki＝平均(Ki1+Ki2+Ki3...Kin)并且独立实验的数目(n)大于2。然而，在下文就人IGF-1方面指出时，n是2。

如实施例1中所述制备的以下聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物在上文所述的hIR结合测定法中具有小于30nM的几何平均Ki：使用具有约40kDa平均分子量的线性mPEG-MAL所制备的化合物10(a)、使用具有约40kDa平均分子量的线性mPEG-MAL所制备的化合物8(a)、使用具有约40kDa平均分子量的分叉mPEG-MAL所制备的化合物15(c)、使用具有约40kDa平均分子量的线性mPEG-MAL所制备的化合物9(a)、使用具有约40kDa平均分子量的线性mPEG-MAL所制备的化合物9(a)和使用具有20kDa平均分子量的线性mPEG-MAL所制备的化合物9(b)。在hIR和hIGFR结合测定法中，使用具有约40kDa平均分子量的线性mPEG-MAL所制备的化合物9(a)分别具有3.07nM±.32nM(±S.E.M；n＝6)和大于84.3nM(SEM＝未确定；n＝6)的几何平均Ki。另外，使用40、30或20kDa线性mPEG-NPC如实施例2中所述产生的异质性聚乙二醇化的赖脯胰岛素产物在上文所述的hIR结合测定法中也具有小于30nM的几何平均Ki。在上文所述的hIR结合测定法中，赖脯胰岛素具有0.22±.072nM(±SEM；n＝4)的几何平均Ki。在上文所述的hIGFR结合测定法中，前述化合物全部具有大于75nM的几何平均Ki并且人IGF-1具有1.51±.23nM(±SEM；n＝2)的几何平均Ki。这些数据显示，聚乙二醇化的第B28位置减少hIR亲和力约10倍，使赖脯胰岛素的这些聚乙二醇化的种类成为hIR的弱激动剂。聚乙二醇化的赖脯胰岛素种类在该测定法中这些条件下也没有可测量的IGFR-1结合特性。

实施例4：使用胰岛素受体磷酸化全细胞测定法评价聚乙二醇化的赖脯胰岛素的效力

使用

(一种市售的异质性时间分辨荧光定量测定方法)(Perkin-Elmer)可以评价本发明聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物的功能活性。简而言之，过量表达人胰岛素受体的293HEK细胞经胰蛋白酶化处理并以60,000个细胞/孔在聚-D-赖氨酸包被的一半面积的Costar 96孔组织培养平板中的无血清培养基(SFM)(具有0.1％无脂肪酸的BSA的DMEM)中铺板。细胞培养平板在37℃于CO₂培养箱中孵育过夜。抗胰岛素受体A链mAb 8314捕获平板也在使用Costar 1/2面积黑色96孔微量滴定平板的前一晚制备，以30-抗胰岛素受体A链mAb 8314(Soos，M.A.等人Biochem J 235：199-208(1986)在4℃处理过夜，其中所述的抗胰岛素受体A链mAb 8314是市售的，包括从Abcam，Inc.，Cambridge，MA)获得，在10mM碳酸钠中稀释至1μg/mL。mAb 8314捕获平板用50mM TRIS，pH 7.5，150mM NaCl和0.1％Tween(TBST)洗涤4次以除去任何未结合的mAb 8314。mAb 8314捕获平板随后在4℃用TBST中的1％BSA封闭超过1小时。封闭后，该捕获平板用TBST洗涤2次以除去过量的BSA溶液。一旦捕获平板处在封闭缓冲液中，则从培养箱取出细胞培养平板并平衡至室温。试验化合物连续地稀释至SFM中。为刺激胰岛素受体的自身磷酸化，将50μL稀释的试验物质添加至细胞单层。在室温30分钟后，反应通过吸去试验化合物并再次添加50μL的2x裂解缓冲液(2％NP40，100mM TRIS，pH 7.4，300mM NaCl，具EDTA的Roche Complete^TM蛋白酶抑制剂，和4mM钒酸盐)来终止。在室温于裂解缓冲液30分钟后，将30μL裂解物转移至封闭的捕获平板，其中所述捕获平板含有在10mMHepes，140mM NaCl和0.1％Tween中稀释至50ng/mL的30μL铕-N1-抗磷酸酪氨酸PY20-抗体Eu-N1-PY20(Perkin Elmer)。混合物在室温孵育1小时，随后用TBST洗涤6次以除去未结合的Eu-N1-PY20和细胞裂解物。随后与50μL增强溶液(Perkin Elmer)孵育10分钟，随信号显现伴以间歇性振摇。使用Wallac Victor，使用时间分辨荧光铕设置定量磷酸化的胰岛素受体。磷酸化水平计算为最大刺激性剂量胰岛素(100nM)的响应％。使用剂量反应的4参数拟合，将胰岛素类似物的效力计算为EC₅₀剂量。如实施例1中所述制备的在实施例4中所述的测定法中具有小于15nM的EC₅₀的聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物包括使用具有约40kDa平均分子量的线性mPEG-MAL所制备的化合物10(a)、使用具有约40kDa平均分子量的线性mPEG-MAL所制备的化合物9(a)、使用具有约30kDa平均分子量的线性mPEG-MAL所制备的化合物9(a)和使用具有约20kDa平均分子量的线性mPEG-MAL所制备的化合物9(b)。在实施例4中所述的测定法中，使用线性mPEG-MAL制备的化合物9(a)具有10.88nM的EC₅₀。使用具有约40、约30或约20kDa平均分子量的线性mPEG-NPC如实施例2中所述产生的异质性聚乙二醇化的赖脯胰岛素产物在实施例4中所述的测定法中也具有小于15nM的EC₅₀。使用具有约40kDa平均分子量的线性mPEG-MAL所制备的化合物8(a)和使用具有约40kDa平均分子量的线性mPEG-MAL所制备的化合物9(a)的50∶50和70∶30混合物在实施例4中所述的测定法中也具有小于15nM的EC₅₀。在相同测定法中，人胰岛素和赖脯胰岛素分别具有2.3和0.7nM的EC₅₀。

该数据显示，聚乙二醇化的第B28位置减少hIR体外活性约10至20倍，使这些聚乙二醇化的赖脯胰岛素种类成为hIR的弱激动剂。聚乙二醇化的赖脯胰岛素种类也没有可测量的结合特性。

实施例5：在1型糖尿病大鼠模型中评价聚乙二醇化的赖脯胰岛素的体内效力和药物代谢动力学曲线

在研究开始前3日，体重250-280g的10周龄雄性Harlan Sprague-Dawley大鼠(Harlan，Indianapolis)用0.5M柠檬酸pH 4.5中的45mg/kg链脲佐菌素(streptozocotin，STZ)经静脉内给药至其尾静脉。在研究开始时，动物基于体重和血糖分组。该研究中包括仅具有400-550mg/dL之间血糖的动物。在研究开始的早晨，动物以几个预定剂量之一接受单次皮下注射试验化合物。定期地，从尾静脉抽取双份血样并收集至含有EDTA二钠的管。血糖水平用血糖仪测量。也从静脉血采样收集血浆，并且市售的大鼠胰岛素放射免疫测定法用来测定血浆中所施用药物的水平。对每只个体动物计算血糖随时间的曲线下面积(mg＊h/dL)并用于4参数对数回归以测定ED₅₀。在本测定法中，使用具有约40kDa平均分子量的线性mPEG-MAL所制备的化合物9(a)、使用具有约30kDa平均分子量的线性mPEG-MAL所制备的化合物9(a)和使用具有约20kDa平均分子量的线性mPEG-MAL所制备的化合物9(b)分别具有来自常见剂量反应曲线的241、138和69nmol/kg效力(ED₅₀)。额外地，单次皮下注射568nmol/kg这些化合物时能够降低STZ处理的大鼠中的血糖至这个品系大鼠中正常的水平(100mg/dL或以下)至少36小时。在另一方面，地特胰岛素在上述测定法中在568nmol/kg单次给药下使葡萄糖正常化5-6小时。

除了评估药物动力学参数外，使用重复血样测定大鼠中试验化合物的平均药物代谢动力学参数值。使用不依赖模型的方法(WinNonlin Pro)计算药物代谢动力学参数。所得的药物代谢动力学参数值作为剂量函数显示非线性。所报道的值的范围对应于测试的最高剂量(568nmol/kg)与最低剂量(5.6nmol/kg)之间所产生的药物代谢动力学参数值。

使用具有约20kDa平均分子量的线性mPEG-MAL所制备的化合物9(b)的药物代谢动力学结果显示范围从6-12小时的时间对最大浓度(T_max)、范围从0.05-0.14L/h/kg的表观清除率(CL/F)、范围从0.6-7.2L/kg的表观分布体积(V/F)和范围从8.5-34.5小时的消除半寿期(t_1/2)。

使用具有约30kDa平均分子量的线性mPEG-MAL所制备的化合物9(a)的药物代谢动力学结果显示12小时的T_max、范围从0.05-0.13L/h/kg的CL/F、范围从0.6-2.0L/kg的V/F和范围从8.3-11.0小时的t_1/2。

使用具有约40kDa平均分子量的线性mPEG-MAL所制备的化合物9(a)的药物代谢动力学结果显示12-24小时的T_max、范围从0.06-0.2L/h/kg的CL/F、范围从1.0-7.5L/kg的V/F和范围从11.1-48.5小时的t_1/2。

当赖脯胰岛素以568nmol/kg类似地施用至STZ-处理的雄性大鼠时，测量到约1小时的t_1/2和约1.2L/h/kg的CL/F。

当地特胰岛素以范围从18.9-568nmol/kg的剂量类似地施用至STZ-处理的雄性大鼠时，观察到范围从1.9-3.1小时的t_1/2和约0.8-1.7L/h/kg的CL/F。

鉴于药物代谢动力学中的复杂性，取决于用于测定的剂量，地特胰岛素与示例性聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物之间的表观CL率是不同的。然而，实施例5中所述的研究显示，与20kDa或40kDa PEG缀合的示例性聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物在STZ诱导的糖尿病大鼠中具有比地特胰岛素慢约5倍至30倍的表观清除率。

实施例6：在2型糖尿病大鼠模型中评价聚乙二醇化的赖脯胰岛素的体内作用持续期和药物代谢动力学特征

在单次皮下注射运载体对照(PBS)或517nmol/kg使用具有约40kDa平均分子量的线性mPEG-MAL所制备的9(a)后的雄性ZDF fa/fa大鼠(n＝4只大鼠/组)中评价具有40kDa线性PEG的化合物9(a)的葡萄糖代谢动力学活性。收集系列样品用于药物代谢动力学和药物动力学表征。单次皮下施用517nmol/kg使用具有约40kDa平均分子量的线性mPEG-MAL所制备的9(a)至雄性ZDF fa/fa大鼠与维持至少7日的统计显著的葡萄糖降低(相对于安慰剂；p＜0.05)相关。也证实了使用具有约40kDa平均分子量的线性mPEG-MAL所制备的化合物9(a)暴露在7天期间的效果。

实施例7：PEG-B28_(92.4％)A1_(7.6％)-赖脯胰岛素、赖脯胰岛素或其混合物(70％PEG_20kDa-B28_(92.4％)A1_(7.6％)-赖脯胰岛素：30％赖脯胰岛素)与酚在钴离子存在下的酚类保存剂滴定

PEG_20kDa-B28_(92.4％)A1_(7.6％)-赖脯胰岛素或赖脯胰岛素溶解于含有20mM KSCN和50mM TRIS-ClO₄的溶液(pH 8.0)中。基于蛋白质含量(ε₂₈₀＝1.05(mg/mL)^-1cm^-1)，两种蛋白质之一的靶浓度是约4mg/mL。氯化钴(41.9mg)用1mL水溶解以产生具有0.176M钴离子浓度的母液。将等分试样的钴母液(约2μL，取决于蛋白质浓度)添加至0.8mL蛋白质溶液，从而钴离子对胰岛素六聚体的最终摩尔比等于4。为评估六聚化，在574nm监测钴配位化学中的扭变作为酚类保存剂浓度的函数。具体地，使用微升等分试样将浓酚溶液(0.564M)滴定入0.8mL蛋白质溶液中，从而终体积在滴定结束时不超过0.84mL。在取得每个等分酚试样后，将最终溶液搅拌最少20分钟，并且从400nm至800nm收集可见光谱的溶液。在574nm记录的吸光度通过吸光度除以His^B10-配位的钴摩尔浓度(即，基于下述认识乘以2的六聚体蛋白质浓度)换算成摩尔消光系数，其中所述的认识是胰岛素六聚体的HisB¹⁰部分配位2个二价金属离子。为制备PEG_20kDa-B28_(92.4％)/A1_(7.6％)-赖脯胰岛素和赖脯胰岛素的70/30混合物(摩尔∶摩尔)制剂，首先混合蛋白质并且随后添加钴，然后用酚类保存剂滴定。

在赖脯胰岛素中，与野生型人胰岛素相比，在第B28位置处的脯氨酸和在第B29位置处的赖氨酸的天然顺序颠倒。这种颠倒导致B链羧基端末端的构象转变，其中所述的构象转变空间地阻碍了赖脯胰岛素单体形成二聚体的能力。因而，二聚体缔合常数与野生型人胰岛素的缔合常数相比降低300倍。表I中所示的结果显示，PEG_20kDa-B28_(92.4％)/A1_(7.6％)-赖脯胰岛素可以在二价金属离子和酚类保存剂存在下在类似于

中所用的配制条件中令人吃惊且出人意料地缔合为六聚体复合物，尽管存在靠近赖脯胰岛素相对于野生型人胰岛素而言已经减弱的二聚化结构域缀合的6个20kDa PEG部分。而且，PEG_20kDa-B28_(92.4％)/A_1(7.6％)-赖脯胰岛素和赖脯胰岛素的70/30混合物也表现形成六聚体复合物的能力，所述能力支持制备基础胰岛素和速效胰岛素的现场配制和/或稳定的预混合制剂。

表I

实施例8：分析与Zn、酚和/或钙配制的PEG_20kDa-B28_(92.4％)/A1_(7.6％)-赖脯胰岛素的六聚体状态

胰岛素和一些胰岛素类似物的化学货架期和使用中稳定性得益于在溶液中形成分立的六聚体复合物的能力。在二价金属离子(Zn⁺²或Co⁺²)和酚类保存剂(酚或间甲酚)存在下胰岛素或赖脯胰岛素六聚化的能力减慢了AsnA21的脱酰胺作用并随后使高分子量粒子(HMWP)的形成最小化。

为评估PEG_20kDa-LysB28-赖脯胰岛素形成六聚体的能力，在水中在pH6.7透析基于A_276nm起始蛋白质浓度＝8.6mg赖脯胰岛素/mL或38.2mg聚乙二醇化的赖脯胰岛素缀合物/mL的PEG_20kDa-B28_(92.4％)/A1_(7.6％)-赖脯胰岛素。经透析的蛋白质随后用水稀释以调节蛋白质浓度至4.6mg/mL或20.6mg的聚乙二醇化的蛋白质缀合物/mL。在pH 7.0制备具有40mM磷酸盐缓冲剂终浓度和12.8mg/mL间甲酚终浓度的4倍缓冲液母液。通过溶解氧化锌于0.5mL的1N HCl中，随后用水稀释至0.097M锌终浓度，制备氧化锌母液。通过混合蛋白质浓度4.6mg/mL的450μLPEG_20kDa-B28_(92.4％)/A1_(7.6％)-胰岛素与等分试样的锌母液(添加的锌母液的最大总体积＝2.5μL或等价于每个PEG_20kDa-B28_(92.4％)/A1_(7.6％)-胰岛素六聚体4个锌离子)和150μL的4倍磷酸盐缓冲剂母液制备具有不同锌浓度(0至400μM)的用于近UV圆二色谱法(CD)分析的溶液样品。终末pH根据需要调节至pH约7.0。使用0.2cm小室，在近UV圆二色谱法中在250nm(一个对二硫化物变化灵敏的区域)监测PEG_20kDa-B28_(96％)/A1_(4％)-赖脯胰岛素或赖脯胰岛素的六聚体缔合。将平均残余椭圆度对锌摩尔数/六聚体摩尔数之比作图。

表II中所示的结果进一步显示，PEG_20kDa-B28_(92.4％)/A1_(7.6％)-赖脯胰岛素可以在二价金属离子和酚类保存剂存在下在与

的那些配制条件类似的配制条件中令人吃惊且出人意料地缔合为六聚体复合物，尽管存在靠近赖脯胰岛素相对于野生型人胰岛素而言已经减弱的二聚化结构域缀合的6个20kDa PEG部分。

还用CD热去饱和实验研究了六聚化和配体结合作用对PEG_20kDa-B28_(92.4％)/A1_(7.6％)-胰岛素在促进六聚体的试验制剂中的热稳定性的影响。用于热去饱和研究的波长是240nm，因为发现总体信号变化在240nm处大于在Zn²⁺结合研究中所用的250nm，然而溶液总吸光度相对于待获得的高品质CD数据是足够低的。以扫描率和数据设定1℃/分钟，带宽1.5nm和响应时间8秒，从5℃至大约95℃(终末温度对每个样品略微变动)收集在240nm处1mm比色杯中的热扫描数据。热去饱和数据可以作为原始信号(在240nm的mdeg)和由F_unf(T)＝[Y_obs(T)-Y_nat(T)]/[Y_unf(T)-Y_nat(T)]给出的表观解折叠分数(F_unf)进行作图，

其中Y_obs(T)是观察到作为温度函数的信号并且Y_nat(T)和Y_unf(T)分别是天然基线和解折叠基线的线性外推结果。解折叠启动温度定义为F_unf开始从天然基线(F_unf＝0)增加的温度，并且中点温度是F_unf＝0.5的温度。

基本上如上文所述进行的CD热去饱和实验显示，PEG_20kDa-B28_(92.4％)/A1_(7.6％)-胰岛素六聚体的热稳定性与赖脯胰岛素六聚体比较大幅度降低，此时两者相似地配制于16mM TRIS，pH 7.2，3.1mg/ml间甲酚和锌中。而且，CD热去饱和研究检测到PEG_20kDa-B28_(92.4％)/A1_(7.6％)-赖脯胰岛素解链温度的明显钙和氯化物离子浓度依赖性升高(数据未显示)。更具体地，观察到解折叠的启动温度在16mM TRIS，pH 7.2，3.1mg/ml间甲酚和锌中是约30℃，但是在具有75mM氯化钙的相同制剂中大幅度升高至约50℃。对NaCl(25mM至150mM NaCl)而非氯化钙添加至该制剂观察到相似的影响。因而，钙和/或氯化物可能是包含PEG_20kDa-B28-赖脯胰岛素化合物的药物组合物中旨在提高该药物组合物贮存时化学和/或物理稳定性的很有用的促六聚体赋形剂。

表II作为Zn/六聚体比的函数的平均残余椭圆度(MRE)变化

实施例9：PEG_20kDa-B28_(约95％)/A1_(约5％)-赖脯胰岛素的产生

含有150mM磷酸氢二钠和50mM EDTA的缓冲溶液与150mM磷酸三钠混合产生pH在10.85和11.10之间温度在约4和6℃之间的缓冲液。在约4和6℃之间的温度上，将赖脯胰岛素晶体(30-60mg/mL)缓慢地添加至该缓冲液，伴以温和搅拌以避免晶体溶解期间聚集物的形成。

通过所需量的冰冷的水置于容器中、搅拌产生涡旋并将mPEG-NPC粉末缓慢地倾入该涡旋的中心以确保充分和快速分散而将具有重均分子量约20kDa±约2kDa的PEG的单甲氧基聚(乙二醇)对硝基苯基碳酸酯(mPEG-NPC)以60-120mg/mL的浓度溶解于冰冷的水(4-6℃)中。mPEG-NPC粉末是细粉并且当分散时大量的气泡被释放入该容器中。使容器中的mPEG-NPC溶液脱气30至60分钟，这取决于体积。

将上文制备的赖脯胰岛素溶液转移至机械搅拌的加套容器。此容器配有用于测量温度和pH的仪器。搅拌由湍流状态下在雷诺数上运行的标准叶轮提供。mPEG-NPC(PEG)溶液以产生3至5小时之间PEG总添加时间的速率计量入该容器中。套层的温度维持在4℃和6℃之间并且继续混合。反应的pH通过添加所需量的150mM磷酸三钠缓冲液维持在10.85至11.10之间。添加PEG直至最终PEG：赖脯胰岛素摩尔比在2.5至4.5之间的范围内。

在PEG添加结束时，套层温度在60分钟内升高至25℃和30℃之间并且反应混合物在该温度孵育约3小时至约6小时，同时维持pH在约10.7至约11.0之间。在孵育期结束时，反应混合物通过添加2x缓冲液(100mM酸性酸/乙酸钠，pH 4.0)猝灭并用相同的2x缓冲液稀释以调节其电导率(2.5mS/cm)和浓度(3-5mg/mL)。

使用以适宜树脂(例如，Fast Flow SP Sepharose树脂)装填的阳离子交换层析(CEX)柱纯化反应混合物。该柱用树脂装填至约15至约30cm之间的床高度，用100mM乙酸钠(缓冲液A)平衡并在低pH(约2.5至约4.0)以约50至约90cm/小时之间的适宜流速加载稀释的反应混合物(5-8gm产物/L树脂)。单聚乙二醇化的产物和未反应的蛋白质偏好地结合到该树脂上，而多聚乙二醇化的副产物和过量的试剂大多穿过该柱。具有稀盐浓度(20-30mM)的缓冲液A用来洗除微弱吸附的任何多聚乙二醇化的副产物，随后使用具有增加的盐浓度(50-70mM)的缓冲液(8-12CV)梯度洗脱以偏好地从该树脂移下聚乙二醇化的产物，同时保持未反应的任何蛋白质在该柱上。收集该产物(3-5CV)并用具有高盐浓度(100mM)的缓冲液A洗涤该柱以除去未反应的蛋白质。

使用标准平板膜(3-5kDa分子量截止值)，CEX柱主流(3-5CV)以3-5mg/mL进行切向流过滤以增加其浓度至40-80mg/mL。该过程通过初步浓缩，随后缓冲液交换并最终浓缩至所需的浓度而实施。贯穿该过程的运行流量维持在每平方米滤器面积每小时(LMH)10升之间并且跨膜压力(TMP)维持在约15psi至约35psi之间。

最终浓缩的大体积有效药物成分溶液在适宜的温度(-20℃至-70℃)冷冻并在适宜的温度(-20℃至-70℃)贮存。

实施例10：聚乙二醇化的赖脯胰岛素在犬中的药物代谢动力学曲线

体重7-10kg的2-4岁雌性比格(Beagle)犬用18.9nmol/kg的示例性试验化合物皮下给药。定期地，从头静脉和隐静脉抽取血样并收集至含有EDTA钠的管。从静脉血采样收集血浆，并且市售的胰岛素放射免疫测定法用来测定血浆中所施用药物的水平。对基本上如实施例2中所述制备的每种以下示例性化合物确定药物代谢动力学曲线和参数：使用具有约40kDa、约30kDa和约20kDa平均分子量的线性mPEG-NPC制备的化合物11。

使用不依赖模型的方法(WinNonlin Pro)计算药物代谢动力学参数。使用具有约20kDa平均分子量的线性mPEG-NPC所制备的化合物11显示大约12小时的时间对最大浓度(T_max)、大约0.046L/h/kg的表观清除率(CL/F)、大约14nM最大浓度(C_max)和大约14小时的消除半寿期(t_1/2)。

使用具有约30kDa平均分子量的线性mPEG-NPC所制备的化合物11显示大约24小时的T_max、大约0.027L/h/kg的CL/F、大约18nM的C_max和大约23小时的t_1/2。

使用具有约40kDa平均分子量的线性mPEG-NPC所制备的化合物11显示大约24小时的T_max、大约0.026L/h/kg的CL/F、大约15nM的C_max和大约20小时的t_1/2。

地特胰岛素类似地以18.9nmol/kg的剂量施用至雌性比格犬，并显示大约1.3小时的T_max、大约0.12L/h/kg的CL/F、大约23nM的C_max和大约3.5小时的t_1/2。

表III列出了犬中的可比较参数。用于这些研究的胰岛素特异性RIA检测了聚乙二醇化的赖脯胰岛素和内源胰岛素。

表III.犬中聚乙二醇化的赖脯胰岛素的PK参数

18.9nmol/kg皮下给药；n＝3个/组

实施例11：估计在人中的平均‘平缓度(flatness)’和剂量

改善的基础胰岛素疗法的一项重要标准是实现真实平缓曲线的能力，该能力对于患者每日给药一次是可顺从的。足够的平缓度定义为小于2的峰谷比(PT)。对于比较目的，从公开的PK曲线计算的PT比对于地特胰岛素是约4-9并且对于甘精胰岛素是约1.2-2.6。将18.9nmol/kg剂量的示例性化合物和地特胰岛素的大鼠和犬PK数据(分别见实施例5和10)拟合至就ka、CL/F和V/F而言参数化的1-CMT PK模型。每个PK参数(P)随后拟合至下式的差律成长方程式(allometric equation)：P＝aBW^b，其中b针对ka、CL/F和V/F分别固定在-0.25、0.75和1并且a是拟合参数。对每种PK参数获得平均的人估计值，并且每日在人中给药后，模拟过程产生平均曲线。因为30kDa和40kDa聚乙二醇化的赖脯胰岛素缀合物之间的相似性，仅对20kDa聚乙二醇化的赖脯胰岛素、40kDa聚乙二醇化的赖脯胰岛素和地特胰岛素显示了该模拟。产生的模拟过程显示，20kDa和40kDa聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物的峰谷比(PT)明显地比地特胰岛素更平缓。模拟结果显示于图1中。

用于估计效力所要求的聚乙二醇化的赖脯胰岛素人用剂量的策略是使用已知临床比较物(地特胰岛素)作为大鼠效力模型中的内对照，同时假定大鼠模型中聚乙二醇化的赖脯胰岛素和地特胰岛素之间的相对效力与临床中的相对效力相似。临床中所需的聚乙二醇化的赖脯胰岛素每日剂量可以使用以下方程获得：

$\frac{{\mathrm{Dose}}_{\det }}{{\mathrm{Dose}}_{\mathrm{PEG}}}=\frac{{\mathrm{EC}}_{50,\det }}{{\mathrm{EC}}_{50.\mathrm{PEG}}}\×\frac{\mathrm{CL}/F_{\det }}{\mathrm{CL}/F_{\mathrm{PEG}}}$

可以在表IV中获得每种聚乙二醇化的赖脯胰岛素缀合物的相对效力比。在表V中汇编了大鼠、犬和(估计的)人中示例性聚乙二醇化的赖脯胰岛素/地特胰岛素的相对表观清除率比。

表IV.聚乙二醇化的赖脯胰岛素缀合物和地特胰岛素在大鼠中基于浓度的相对效力

表V.地特胰岛素/聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物的相对CL/F比

使用来自表IV的相对效力估计值和来自表V的相对CL/F估计值，聚乙二醇化的赖脯胰岛素缀合物在人中的平均剂量估计值对于20kDa聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物和40kDa聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物分别是4.2和6.9nmol/kg。这些估计值基于如对地特胰岛素标签的2型糖尿病患者所报道的地特胰岛素平均每日临床剂量18.5nmol/kg。当考虑时间作用和效力时，最大平均临床剂量预测值比地特胰岛素低约3倍。在最好的情况下，20kDa、30kDa和40kDa聚乙二醇化的赖脯胰岛素缀合物的平均临床剂量估计值比地特胰岛素低约20倍和约45倍。

实施例12：健康志愿者中单次施用后的葡萄糖输注率：PEG_20kDa-B28_{(≥ 约95％)}/A1_(≤约5％)-赖脯胰岛素和甘精胰岛素施用

使用单个剂量的基本上如实施例9中所述制备的PEG_20kDa-B28_{(≥约 95％)}/A1_(≤约5％)-赖脯胰岛素(LY)进行一项3方的人剂量首次研究。A方包括3个研究期，其中受试者在第1期接受皮下(SC)注射LY剂量，随后在第2期注射甘精胰岛素剂量(0.5U/kg)并且然后在第3期注射另一个LY剂量。B方是一个开放标记、单剂量、双重复期研究，其中受试者在利用24-和36-小时葡萄糖钳夹术的两个时期接受单个剂量的LY。C方是一个开放标记、双期、单剂量、固定顺序、比较物控制的研究，其中受试者在一个时期接受单个0.5mg/kg皮下剂量的LY并在另一个时期接受单个0.8U/kg皮下剂量的甘精胰岛素。受试者在A方和C方的每个时期中接受24小时葡萄糖钳夹术并且在B方的每个时期中接受较长持续期(达36小时)的葡萄糖钳夹术。LY作为A方、B方和C方中的单次剂量皮下地施用如下：

A方剂量：0.0025、0.0125、0.075、0.325mg/kg体重

B方剂量：0.15、0.225mg/kg

C方剂量：0.5mg/kg

受试者被施用单剂量的聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物或作为比较物的甘精胰岛素单剂量(0.5U/kg)并在第3期被施用另一个单剂量的LY。在全部治疗时期中，受试者在每次胰岛素化合物注射后进行血糖正常钳夹术持续多到24/36小时。调节萄糖输注率(GIR)以维持血糖正常，记录的GIR随时间提供了胰岛素作用的GD量度。血糖正常葡萄糖钳夹的目的是在施用一个剂量的胰岛素化合物后整个的葡萄糖输注期间维持血糖正常。假定内源胰岛素分泌和肝脏葡萄糖输出最小并且从葡萄糖空间转运出的任何葡萄糖(即，代谢的葡萄糖)是所施用外源胰岛素的直接结果。在这种情况下，GIR将是胰岛素作用随时间的葡萄糖代谢动力学(GD)量度。全部葡萄糖钳夹研究在过夜禁食大约8小时后进行。在该研究的早晨，将小导管置入一只胳膊的、理想地在前臂肘窝中的静脉中，以在容积泵控制下施用20％右旋糖溶液(缓冲至近中性pH)。另一根导管理想地安置于腰部或手用于静脉葡萄糖采样。该区域用加温装置加热至大约55-60℃以对动脉化的静脉血采样。床边获得血样以使用自动化葡萄糖氧化酶技术立即测定全血葡萄糖浓度。在基础血样采集和大约30分钟的稳定期后，每位受试者接受一个剂量皮下施用的胰岛素化合物。皮下注射胰岛素化合物的开始定义为零时间。给药结束后，频繁采集血样以测量血糖，以可变速率静脉内输注葡萄糖，旨在胰岛素施用后维持血糖正常多达24或36小时。

血样采集在给药前大约每隔10分钟进行大约30分钟并且在给药后头2个小时每隔5-10分钟继续进行(备选项是以每隔2.5分钟的频繁采样)，并且随后减少至10-30分钟间隔进行直至钳夹术结束。

在葡萄糖钳夹术期间，调节葡萄糖输注率以维持针对个体受试者的预定目标血糖浓度。优选地，该目标浓度接近于空腹血糖浓度。葡萄糖钳夹术的目的是维持血糖浓度于给药前目标值的+5％范围内，所述的给药前目标值定义为平均空腹血糖浓度以下5mg/dL。因而，血糖浓度保持恒定而GIR变动。因此，变动的葡萄糖输注率反应试验胰岛素化合物的活性。记录整个钳夹术期间来自采样和输注率变化的血糖水平。

基本上如实施例12中所述进行的研究表明，在人中，LY具有理想的“基础”胰岛素的特征：长作用持续期、范围从24-44小时的表观半寿期和基础特征，即小于2的峰谷比(图2)。另外，LY的作用持续期比甘精胰岛素的作用持续期长(图2)。葡萄糖代谢动力学中的受试者内变异性是小于30％(数据未显示)，其类似于或更优于甘精胰岛素。最后，来自该研究C方的葡萄糖代谢动力学数据(0.5mg/kg)产生LY的GIR曲线，其中所述的GIR曲线是“无峰的”，维持GD大于36小时并超过甘精胰岛素的峰值GIR响应(0.5U/kg；数据未显示)。

实施例13：PEG_20kDa-B28_(约95％)/A1_(约5％)-赖脯胰岛素药物组合物的化学和物理稳定性

如上文实施例7和8中所述，PEG_20kDa-B28_(约95％)/A1_(约5％)-赖脯胰岛素可以在二价金属离子和酚类保存剂存在下在与

的那些配制条件类似的配制条件中缔合为六聚体复合物。因此，对相似于赖脯胰岛素商业溶液制剂(即，溶液制剂)的PEG_20kDa-B28-赖脯胰岛素制剂进行化学和物理稳定性研究。如果从所示贮存时期的初始时间点起在不同温度没有检测到多种分析特性的明显改变，则认为测试药物制剂的化学稳定性是可接受的。如果眼观评估时没有观察到粒子并且通过Thioflavin T荧光显微镜评估时没有观察到纤丝或凝胶形成，则认为测试药物制剂的物理稳定性是可接受的。

制备在pH 7.0或pH 6.5分别以磷酸盐或柠檬酸盐缓冲的PEG_20kDa-B28-赖脯胰岛素制剂并测试其化学和物理稳定性，所述的PEG_20kDa-B28-赖脯胰岛素制剂含有0.5摩尔锌/1摩尔PEG_20kDa-B28-赖脯胰岛素、16mg/mL丙三醇、3.15mg/mL间甲酚。测试无锌的相似制剂以评价锌对稳定性的影响。样品在大约1个月贮存后在35℃形成凝胶粒子并且样品在大约2个月贮存后在25℃显示明显数目的粒子/气泡形成。柠檬酸盐和磷酸盐缓冲的制剂以及含锌/无锌的制剂均在促进的35℃条件显出相似的化学/物理稳定性，尽管眼观评估时柠檬酸盐缓冲的样品显然比磷酸盐缓冲的样品更差。赖脯胰岛素对照制剂保持清亮。柠檬酸盐和磷酸盐缓冲的制剂均在5℃显示可接受的化学稳定性持续至少13个月。

后续研究显示，酚类保存剂间甲酚与所包含的并暴露于高温(＞25℃)的PEG_20kDa-B28-赖脯胰岛素组合时促进凝胶化。有趣地，当间甲酚单独添加至(活化或未活化的)mPEG时，则凝胶粒子不在暴露于高温后产生。

当赖脯胰岛素的原型制剂不赋予PEG_20kDa-B28-赖脯胰岛素化合物在升高温度上的可接受稳定性时，开发了包含展示出改善的化学和物理稳定性PEG_20kDa-B28_(约95％)/A1_(约5％)-赖脯胰岛素化合物的并适用于商业化为肠胃外施用药物制剂的药物组合物。

以下的PEG_20kDa-B28_(约95％)/A1_(约5％)-赖脯胰岛素(15mg/mL)制剂在40℃展示出可接受的化学和物理稳定性持续1周，在30℃持续1个月、在25℃持续3个月和在5℃持续超过8个月。

1)16mM TRIS缓冲液，pH 7.0-8.0，10mM氯化钙，20mg/mL糖(蔗糖或海藻糖)，3mg/mL(28mM)间甲酚，和0.5摩尔锌/1.0摩尔PEG_20kDa-B28_(约95％)/A1_(约5％)-赖脯胰岛素

2)16mM TRIS缓冲液，pH 7.0-8.0，10mM氯化钙，3mg/mL泊洛沙姆，3mg/mL(28mM)间甲酚，和0.5摩尔锌/1.0摩尔PEG_20kDa-B28_{(约 95％)}/A1_(约5％)-赖脯胰岛素

3)5mM磷酸盐缓冲液，pH 7.0，130mM丙三醇，3mg/mL(28mM)间甲酚、3mg/mL泊洛沙姆，0.3摩尔锌/1.0摩尔PEG_20kDa-B28_(约95％)/A1_{(约 5％)}-赖脯胰岛素

含有促六聚体赋形剂(例如锌、间甲酚和钙)的PEG_20kDa-B28_(约95％)/A1_{(约 5％)}-赖脯胰岛素制剂通常显示更大的物理的和化学稳定性，特别在升高的温度。添加钙、氯化物和/或NaCl至含有锌和间甲酚的PEG_20kDa-B28_{(约 95％)}/A1_(约5％)-赖脯胰岛素制剂进一步增强暴露于40℃或更高温度的制剂的物理稳定性。而且，磷酸盐和柠檬酸盐缓冲的制剂通常显示比TRIS缓冲的制剂更小的物理稳定性。

Claims (36)

1.式P-[(A)-(B)]的聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物或其可药用盐，其中

A是赖脯胰岛素的A链(SEQ ID NO：1)；

B是赖脯胰岛素的B链(SEQ ID NO：3)；且

P是具有范围从约20kDa至约40kDa的分子量的PEG，并且其中A和B适当地交联并且P通过氨基甲酸乙酯或硫醚共价键与A的第1位置处甘氨酸的α-氨基、B的第1位置处苯丙氨酸的α-氨基或B的第28位置处赖氨酸的ε-氨基连接。

2.权利要求1的化合物，其中PEG通过氨基甲酸乙酯或硫醚共价键与B的第28位置处赖氨酸的ε-氨基连接。

3.权利要求1或2的化合物，其特征进一步是具有约30nM或更小的人胰岛素受体Ki。

4.权利要求1或2的化合物，其特征进一步是具有约20nM或更小的人胰岛素受体Ki。

5.权利要求1或2的化合物，其特征进一步是具有约10nM或更小的人胰岛素受体Ki。

6.权利要求1至5任一项的化合物，其特征进一步是在STZ处理的大鼠中以约568nmol/kg施用具有大于约6小时的消除半寿期。

7.权利要求1至6任一项的化合物，其足以在STZ处理的大鼠中以剂量约568nmol/kg单次皮下注射该化合物后降低血糖至低于100mg/dL持续约4小时到至少约36小时范围的时间段。

8.权利要求1至7任一项的化合物，其足以在STZ处理的大鼠中以剂量约568nmol/kg单次皮下注射该化合物后降低血糖至低于100mg/dL持续约4小时到至少约48小时范围的时间段。

9.权利要求1至8任一项的化合物，其特征进一步是以约0.225mg/kg单次皮下给药时在人中具有大于约30小时的消除半寿期。

10.权利要求1至9任一项的化合物，其特征进一步是以约0.225mg/kg单次皮下给药时在人中具有大于约36小时的消除半寿期。

11.权利要求1至10任一项的化合物，其中PEG具有范围从约17.5kDa至约25kDa的分子量。

12.权利要求1至11任一项的化合物，其中PEG具有范围从约20kDa至约25kDa的分子量。

13.权利要求1至12任一项的化合物，其中共价键是氨基甲酸乙酯键。

14.权利要求1至13任一项的化合物，其特征进一步是：肠胃外施用治疗有效量的该化合物至患者时，具有药物代谢动力学、药物动力学或活性峰谷比小于2。

15.权利要求1至14任一项的化合物在治疗中的用途。

16.权利要求1至14任一项的化合物的用途，用于制造治疗低血糖症或糖尿病的药物。

17.药物组合物，其包含权利要求1至14任一项的化合物和一种或多种可药用的赋形剂、稀释剂或载体。

18.权利要求17的药物组合物，其中大于约95％的聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物是单聚乙二醇化的。

19.权利要求17或18的药物组合物，其中大于约90％的聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物具有与B的第28位置处赖氨酸的ε-氨基共价连接的PEG。

20.权利要求17至19任一项的药物组合物，还包含浓度在范围从约10mM至约25mM TRIS的TRIS缓冲剂，其中所述药物组合物的pH是从约pH 7.0至约pH 8.0；和至少一种等渗剂，产生具有在约270mOsm和约330mOsm之间等渗性的溶液。

21.权利要求17至20任一项的药物组合物，还包含浓度在范围从约5mM至约10mM的磷酸盐缓冲剂，并且其中所述药物组合物的pH是从约pH 7.0至约pH 7.5；和至少一种等渗剂，产生具有在约270mOsm和约330mOsm之间等渗性的溶液。

22.权利要求17至21任一项的药物组合物，其中聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物的总浓度是从约15mg/mL至约40mg/mL。

23.权利要求17至22任一项的药物组合物，还包含治疗有效量的赖脯胰岛素。

24.权利要求17至23任一项的药物组合物，还包含约130mM间甲酚、每摩尔的胰岛素、胰岛素类似物和聚乙二醇化的赖脯胰岛素总计六聚体约2摩尔和约4摩尔之间的锌、在约2.5mM和约25mM之间的钙、和表面活性剂。

25.权利要求17至24任一项的药物组合物，还包含可药用的酚类保存剂和足以引起聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物六聚化的锌的量。

26.权利要求17至25任一项的药物组合物，还包含在约100mM至约150mM之间的NaCl、在约2.5mM至约25mM之间的钙和在约0.5mg/mL至约5mg/mL之间的泊洛沙姆188。

27.权利要求17至26任一项的药物组合物，包含在约1mg/mL至约5mg/mL之间的泊洛沙姆188。

28.权利要求17至27任一项的药物组合物，包含每摩尔聚乙二醇化的赖脯胰岛素约0.3摩尔至5摩尔之间的锌。

29.在需要治疗高血糖症或糖尿病的患者中治疗高血糖症或糖尿病的方法，所述的方法包括向患者施用治疗有效量的权利要求17至28任一项的药物组合物。

30.权利要求29的方法，其中治疗患者的糖尿病。

31.权利要求29的方法，其中治疗患者的妊娠糖尿病。

32.制备式P-[(A)-(B)]的聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物或其可药用盐的方法，其中

A是赖脯胰岛素的A链(SEQ ID NO：1)；

B是赖脯胰岛素的B链(SEQ ID NO：3)；并且

P是具有范围从约20kDa至约40kDa的分子量的PEG，并且其中A和B适当地交联且P通过氨基甲酸乙酯共价键与B的第28位置处赖氨酸的ε-氨基连接，所述方法包括使B的第28位置处赖氨酸的ε-氨基与具有约20kDa和约40kDa之间重均分子量的单甲氧基聚(乙二醇)对硝基苯基碳酸酯(mPEG-NPC)在含水溶剂中在约8.5和约11.5之间的pH以及在约25℃和约30℃之间反应约3小时和约6小时之间的时间段。

33.权利要求32的方法，其中PEG：赖脯胰岛素摩尔比在约2.5和约5.0之间范围内。

34.权利要求32或33的方法，其中mPEG-NPC的重均分子量是约20kDa。

35.权利要求32至34任一项的方法，其中反应的pH维持在约10.5和约11.5之间。

36.权利要求32至35任一项的方法，其中反应在约25℃和约30℃之间进行约3小时。

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