CN114805611A - 靶向末端甘露糖的嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供靶向末端甘露糖的嵌合抗原受体及其应用。具体涉及一种嵌合抗原受体，包含甘露糖结合分子、铰链区、跨膜区、胞内共刺激区和任选的信号传导区，任选还包含信号肽序列。表达所述嵌合抗原的免疫细胞，可以有效抑制肿瘤生长和复发。

Description

靶向末端甘露糖的嵌合抗原受体及其应用

技术领域

本发明涉及细胞治疗领域，具体涉及靶向甘露糖的嵌合抗原受体及其应用。

背景技术

随着生物技术的发展，癌症疾病迎来了细胞免疫治疗新手段。目前上市或在研的细胞治疗产品主要集中于血液肿瘤领域，然而受实体瘤折磨的癌症患者数量明显高于血液恶性肿瘤患者数量。尽管目前也有一些针对实体瘤领域的细胞免疫疗法处于临床前/临床阶段，然而靶点特异性不足、各器官间靶点差异性大、新靶点开发难度受限、恶性肿瘤治疗效果欠佳、治疗过程容易引发严重的毒副作用等使得实体肿瘤领域的研发进程受阻，至今仍无针对实体瘤的细胞治疗产品获批。

发明内容

本发明提供的靶向末端甘露糖的嵌合抗原受体特异性识别肿瘤细胞或者病变位点处抗原/配体上含末端甘露糖的N-糖结构。

本文一方面提供一种嵌合抗原受体，包含甘露糖结合分子、铰链区、跨膜区和胞内区，任选还包含信号肽序列。

在一个或多个实施方案中，所述甘露糖结合分子包含选自以下的一种或多种：甘露糖结合蛋白或其甘露糖结合结构域、特异性结合甘露糖的抗体或其抗原结合片段、特异性结合甘露糖的核酸适配体或其衍生物。

在一个或多个实施方案中，甘露糖结合蛋白是甘露糖凝集素。

在一个或多个实施方案中，甘露糖结合蛋白具有：

（1）SEQ ID NO:2所示的序列，或

（2）与SEQ ID NO:2具有至少60%（例如至少70%、至少80%、至少90%、至少95%，至少98%，至少99%）序列相同性并保留其甘露糖结合活性的序列。

在一个或多个实施方案中，项目（2）所述序列具有甘露糖结合基序WGG、RL₂Q、EGP中的一个或二个或全部，其中L₂为1~3个任意氨基酸。L₂优选为2个任意氨基酸。

在一个或多个实施方案中，项目（2）所述序列具有1-5个甘露糖结合基序WGGL₁RL₂QL₃EGP，其中，L₁为12~18个任意氨基酸，L₂为1~3个任意氨基酸，L₃为20~25个任意氨基酸。

在一个或多个实施方案中，项目（2）所述序列具有1-2个所述甘露糖结合基序。

在一个或多个实施方案中，L₁为15个任意氨基酸，L₂为2个任意氨基酸，L₃为24个任意氨基酸。

在一个或多个实施方案中，（2）是与SEQ ID NO:2具有至少60%（例如至少70%、至少80%、至少90%、至少95%，至少98%，至少99%）序列相同性并在其对应于SEQ ID NO:2的选自以下的至少12个或至少13个或至少16个或全部位点具有与SEQ ID NO:2相同的氨基酸的序列：第10、11、12、28、31、56、57、58、77、78、79、95、98、123、124、125位。

在一个或多个实施方案中，（2）具有SEQ ID NO:17-27中任一所述的序列。

在一个或多个实施方案中，甘露糖结合蛋白的甘露糖结合结构域包含甘露糖结合基序WGG、RL₂Q、EGP中的一个或二个或全部，其中L₂为1~3个任意氨基酸。L₂优选为2个任意氨基酸。

在一个或多个实施方案中，甘露糖结合蛋白的甘露糖结合结构域包含甘露糖结合基序WGGL₁RL₂QL₃EGP，其中，L₁为12~18个任意氨基酸，L₂为1~3个任意氨基酸，L₃为20~25个任意氨基酸。优选地，L₁为15个任意氨基酸，L₂为2个任意氨基酸，L₃为24个任意氨基酸。

在一个或多个实施方案中，甘露糖结合蛋白的甘露糖结合结构域是SEQ ID NO:2的包含选自以下的至少12个或至少13个或至少16个或全部位点的片段：第10、11、12、28、31、56、57、58、77、78、79、95、98、123、124、125位。

在一个或多个实施方案中，从N端到C端，该嵌合抗原受体依次含有甘露糖结合分子、铰链区、跨膜区和胞内区。

在一个或多个实施方案中，所述铰链区包括选自CTLA4、CD28、CD7、IgA1、IgA2、IgG1、IgG4、IgD、CD8α、PD-1的铰链区或胞外区衍变序列。所述铰链区优选为CD8α铰链区。

在一个或多个实施方案中，所述铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

在一个或多个实施方案中，所述跨膜区包括选自TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD4、CD8α，CD28、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD45、CD5、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154的跨膜结构域。所述跨膜区优选为CD28跨膜域。

在一个或多个实施方案中，所述跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。

在一个或多个实施方案中，胞内区包括胞内共刺激区和/或信号传导区。

在一个或多个实施方案中，胞内共刺激区包括选自以下蛋白的共刺激区：MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、激活NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a和与CD83特异性结合的配体。所述胞内共刺激区优选为CD28共刺激结构域。

在一个或多个实施方案中，所述胞内共刺激区的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

在一个或多个实施方案中，信号传导区包含选自BCR、FcεRI、FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA、CD3ζ的信号传导结构域。所述信号传导区优选为CD3ζ信号传导结构域。

在一个或多个实施方案中，所述信号传导区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。

本发明还提供核酸分子，包含选自以下的序列：

（1）本文任一实施方案所述嵌合抗原受体的编码序列；

（2）（1）的互补序列；

（3）（1）或（2）中任一序列的5-50bp的片段。

在一个或多个实施方案中，所述片段是引物。

在一个或多个实施方案中，所述编码序列是DNA或RNA。

本发明还提供核酸构建物，其包含本发明任一实施方案所述的核酸分子。

在一个或多个实施方案中，核酸构建物是载体，例如克隆载体、表达载体或整合载体。

本发明另一方面提供一种宿主细胞，所述宿主细胞：

（1）包含和/或表达本文任一实施方案中所述的嵌合抗原受体，和/或

（2）包含本文所述的核酸分子和/或核酸构建物。

在一个或多个实施方案中，所述细胞是免疫细胞。

本发明另一方面提供一种药物组合物，含有药学上可接受的辅料和：

（1）本文任一实施方案所述的嵌合抗原受体和/或其编码序列，或

（2）本文任一实施方案所述的核酸分子、核酸构建物或细胞。

在一个或多个实施方案中，所述药物组合物用于治疗肿瘤。

在一个或多个实施方案中，所述肿瘤选自以下的一种或多种：胃癌、甲状腺肿瘤、胆囊癌、胆管癌、肺癌、黑色素瘤、头颈癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、肝癌、结直肠癌、脑胶质瘤、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、肾癌、骨肉瘤。

本发明另一方面提供试剂在制备活化的免疫细胞中的应用，所述试剂含有：

（1）本文任一实施方案所述的嵌合抗原受体和/或其编码序列，或

（2）本文任一实施方案所述的核酸分子、核酸构建物或细胞，

本发明另一方面提供试剂在制备治疗肿瘤的药物中的应用，所述试剂含有：（1）本文任一实施方案所述的嵌合抗原受体和/或其编码序列，或（2）本文任一实施方案所述的核酸分子、核酸构建物或细胞。

本发明还提供一种治疗或预防肿瘤的方法，所述方法包括给予需要的患者治疗有效量的本发明任一实施方案所述的细胞或药物组合物。

在一个或多个实施方案中，细胞或药物组合物通过静脉注射给予。

本发明优点：与其他嵌合抗原受体相关产品不同的是，本发明中嵌合抗原受体胞外抗原/配体结合结构域识别的抗原或配体并非某一种蛋白，而是含有末端甘露糖的一类N-糖结构，这种特殊的结合靶点识别强度高、可变性较低，受基因突变等因素产生靶点干扰的程度远低于传统的某种蛋白类靶点。

附图说明

图1，CEGA23-CAR的质粒结构示意图和蛋白结构示意图。A，pSLenti-CEGA23-CAR-P2A-EGFP重组质粒结构示意图。B，质粒在细胞内表达的CEGA23-CAR蛋白结构示意图。

图2，慢病毒感染HEK293T细胞的荧光显微图。

图3，CD8 T淋巴细胞阳性信号。

图4，CAR-T细胞的EGFP阳性信号。

图5，CAR-T细胞对HCG-27靶细胞的杀伤效果。

图6，CAR-T细胞对AGS靶细胞的杀伤效果。

图7，CAR-T细胞对PC-9靶细胞的杀伤效果。

图8，CAR-T细胞对A549靶细胞的杀伤效果。

图9，CAR-T细胞对RKO靶细胞的杀伤效果。

图10，CAR-T细胞对SW948靶细胞的杀伤效果。

图11，CAR-T细胞对HOS靶细胞的杀伤效果。

图12，CAR-T细胞对U-2OS靶细胞的杀伤效果。

图13，CAR-T细胞与肿瘤靶细胞孵育后IL-2分泌水平。

图14，CAR-T细胞与肿瘤靶细胞孵育后IFN-gamma分泌水平。

图15，CAR-T细胞与肿瘤靶细胞孵育后TNF-alpha分泌水平。

图16，CAR-T细胞的体内杀伤HCG-27检测。

图17，CAR-T细胞的体内杀伤A549检测。

图18，CAR-T细胞的体内杀伤SW948检测。

图19，CEGA23与其他天然序列的比对，显示保守的甘露糖结合基序。

图20，含末端甘露糖的N糖结构示例。

具体实施方式

发明人发现，将甘露糖结合分子作为嵌合抗原受体(CAR)的胞外配体结合结构域，制备表达所述CAR的免疫细胞，可以有效抑制肿瘤生长和复发。因此，本文提供靶向甘露糖的嵌合抗原受体（CAR）。该CAR含有任选的信号肽序列、抗原识别区即本文所述的甘露糖结合分子、任选的接头、铰链区、跨膜区和胞内区。其中胞内区包含一个或多个胞内共刺激域和/或一个或多个胞内信号转导结构域。本文中的“铰链区”、“跨膜区”和“胞内区”均可选自已知的CAR-T技术中的铰链区、跨膜区和胞内区的序列。

本文中，甘露糖主要是指糖链的末端甘露糖，特别是N糖结构中的末端甘露糖。含末端甘露糖的N糖结构包括但不限于：线性甘露糖、分枝三低聚甘露糖、分枝四低聚甘露糖、分枝五低聚甘露糖、分枝六低聚甘露糖、分枝七烷甘露糖、高甘露糖、高甘露糖（-Asn）、单触复合糖、双触复合糖、三触复合糖、四触复合糖、多触复合糖、四触杂合糖、多触杂合糖。图20示出含末端甘露糖的N糖结构的示例。

本发明的嵌合抗原受体（CAR）含有甘露糖结合分子、铰链区、跨膜区、胞内共刺激区。

本文中，甘露糖的“结合分子”是特异性结合甘露糖的蛋白质或核酸，包括但不仅限于，甘露糖结合蛋白、抗体、抗体的抗原结合片段、重链抗体、纳米抗体、微型抗体、亲和体、受体的靶结合区、配体、细胞因子、和趋化因子。本文中，术语“抗体”包括单克隆抗体（包括全长抗体，其具有免疫球蛋白Fc 区），具有多表位特异性的抗体组合物，多特异性抗体（例如，双特异性抗体），双抗体和单链分子，以及抗体片段，尤其是抗原结合片段，例如，Fab，F(ab’)2和Fv）。

可作为甘露糖结合分子的分子包括但不限于i）天然或经人工改造的甘露糖结合蛋白（甘露糖凝集素），ii）天然或经人工改造的甘露糖结合蛋白（甘露糖凝集素）的甘露糖结合结构域，iii）特异性结合甘露糖的抗体或抗体片段，iv）特异性结合甘露糖的核酸适配体或适配体衍生物。

任何能识别图19所示糖链的末端甘露糖的甘露糖结合分子均可用作本文的甘露糖结合分子。

在一些实施方案中，甘露糖结合分子可以是甘露糖结合蛋白或其甘露糖结合结构域。在一些实施方案中，甘露糖结合分子是SEQ ID NO:2所示CEGA23，或者是与CEGA23具有相似甘露糖结合结构域的其他天然序列。

发明人研究发现，CEGA23的甘露糖结合结构域包含甘露糖结合基序WGG、RL₂Q和EGP，其中L₂为1~3个任意氨基酸。进一步地，CEGA23的甘露糖结合结构域包含保守的甘露糖结合基序WGGL₁RL₂QL₃EGP。该基序中的WGG、RL₂Q、EGP这3个位点在蛋白质中形成特定空间构象，共同组成活性结合位点。本发明的实施方案中，甘露糖结合分子可以具有一个或多个（例如1、2、3、4、5、6个）所述甘露糖结合基序，其中，L₁各自独立为为12~18个任意氨基酸，L₂各自独立为为1~3个任意氨基酸，L₃各自独立为为20~25个任意氨基酸。优选地，L₁为15个任意氨基酸，L₂为2个任意氨基酸，L₃为24个任意氨基酸。图19显示SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:17的比对，方框标出基序氨基酸。

在进一步的实施方案中，CEGA23的甘露糖结合结构域是包含SEQ ID NO:2的选自以下的至少12个或至少13个或至少16个或全部位点的片段：第10、11、12、28、31、56、57、58、77、78、79、95、98、123、124、125位；优选包含SEQ ID NO:2的第10、11、12、28、31、56、57、58、77、78、79、95、98、123、124和125位氨基酸，或第10、11、12、28、31、77、78、79、95、98、123、124和125位氨基酸，或第56、57、58、77、78、79、95、98、123、124和125位氨基酸。示例性的其他天然序列包括：

SEQ ID NO:17所示的Lectin OAA源自Pseudomonas sp.（BG5），具有SEQ ID NO:2的第10、11、12、28、31、56、57、58、77、78、79、95、98、123、124、125位的氨基酸；

SEQ ID NO:18所示的Lectin ESA-2源自Nostocales cyanobacterium（HT-58-2），具有SEQ ID NO:2的第10、11、12、28、31、56、57、58、77、78、79、95、98、123、124、125位的氨基酸；

SEQ ID NO:19所示的Lectin ESA-2源自Aquimarina sp. （TRL1），具有SEQ IDNO:2的第10、11、12、28、31、56、57、58、77、78、79、95、98、123、124、125位的氨基酸；

SEQ ID NO:20所示的蛋白源自Herpetosiphon aurantiacus（ATCC 23779 /DSM785/114-95），具有SEQ ID NO:2的第10、11、12、28、31、56、57、58、77、78、79、95、98、123、124、125位的氨基酸；

SEQ ID NO:21所示的Lectin OAA源自: Chloroflexia bacterium （SDU3-3），具有SEQ ID NO:2的第10、11、12、28、31、56、57、58、77、78、79、95、98、123、124、125位的氨基酸；

SEQ ID NO:22所示的粘液血凝素（Myxo hemagglutinin）源自: Nostoc sp. （PCC7107），具有SEQ ID NO:2的第10、11、12、28、31、56、57、58、77、78、79、95、98、123、124、125位的氨基酸；

SEQ ID NO:23所示的Lectin SfL-2源自Solieria filiformis (Red alga)(Euhymenia filiformis)，具有SEQ ID NO:2的第10、11、12、28、31、56、57、58、77、78、79、95、98、123、124、125位的氨基酸；

SEQ ID NO:24所示的蛋白源自Lyngbya sp. (strain PCC 8106)，具有SEQ IDNO:2的第10、11、12、28、31、56、57、58、77、78、79、95、98、123、124、125位的氨基酸；

SEQ ID NO:25所示的粘细菌血凝素（Myxobacterial hemagglutinin）源自Stigmatella aurantiaca (strain DW4/3-1)，具有SEQ ID NO:2的第10、11、12、28、31、77、78、79、95、98、123、124、125位的氨基酸；

SEQ ID NO:26所示的蓖麻毒素B型凝集素结构域蛋白（Ricin B-type lectindomain-containing protein）源自Hyalangium minutum，具有SEQ ID NO:2的第56、57、58、77、78、79、95、98、123、124、125位的氨基酸；

SEQ ID NO:27所示的Lectin ESA-2源自Janthinobacterium agaricidamnosum（NBRC 102515 = DSM 9628），具有SEQ ID NO:2的第10、11、12、28、31、77、78、79、95、98、123、124、125位的氨基酸。

在不实质性影响甘露糖结合分子活性（例如甘露糖结合活性）的前提下，本领域技术人员可以对本发明的甘露糖结合分子改变一个或更多个（例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个）氨基酸，以获得所述甘露糖结合分子的变体。这些变体包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行保守性取代时，通常不会改变蛋白质的功能。可进行保守性取代的氨基酸残基为本领域所周知。这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。它们都被视为包括在本发明保护的范围内。

本文所述甘露糖结合分子包括与SEQ ID NO:2所示的CEGA23具有至少60%（例如至少70%、至少80%、至少90%、至少95%，至少98%，至少99%）序列相同性并保留其甘露糖结合活性的CEGA23变体。这样的变体通常包含CEGA23变体的甘露糖结合结构域或甘露糖结合基序。根据发明人的发现，该甘露糖结合基序包含你WGGL₁RL₂QL₃EGP，其中，L₁为12~18个任意氨基酸，L₂为1~3个任意氨基酸，L₃为20~25个任意氨基酸。CEGA23变体可以具有1-5个（例如1-2个）所述甘露糖结合基序。

具体地，这样的CEGA23变体与SEQ ID NO:2具有至少60%（例如至少70%、至少80%、至少90%、至少95%，至少98%，至少99%）序列相同性并在其对应于SEQ ID NO:2的选自以下的至少12个或至少13个或至少16个或全部位点具有与SEQ ID NO:2相同的氨基酸的序列：第10、11、12、28、31、56、57、58、77、78、79、95、98、123、124、125位。优选地，所述位点是对应于SEQ ID NO:2的第10、11、12、28、31、56、57、58、77、78、79、95、98、123、124和125位的位点，或第10、11、12、28、31、77、78、79、95、98、123、124和125位的位点，或第56、57、58、77、78、79、95、98、123、124和125位的位点。

CAR上任选的信号肽可以根据需要选择。一般而言，信号肽是使多肽靶向细胞中的所需部位的肽序列。信号肽使多肽靶向细胞的分泌通路，并且将允许多肽整合和锚定至脂双层；信号肽还可以是膜定位信号肽。示例性的信号肽例如CD8信号肽、CD28信号肽、CD4信号肽或轻链信号肽，其序列在本领域技术人员的知识范围内。适用于本发明的CD28信号肽可以是本领域常用于CAR的各种CD28信号肽序列。在某些实施方案中，所述CD28信号肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO:1所示序列。

嵌合抗原受体的铰链区位于胞外抗原结合区和跨膜区之间，铰链区是通常在蛋白质的两个域之间存在的氨基酸区段，并且可以允许蛋白质的柔性和两个域的彼此相对运动。铰链区可以是天然存在的蛋白质的铰链区或其部分。抗体（诸如IgG、IgA、IgM、IgE 或IgD抗体）的铰链区也可用于本文所述的嵌合抗原受体。非天然存在的肽也可用作本文所述的嵌合抗原受体的铰链区。示例性地，CAR的铰链区选自CD8α铰链区、IgD铰链区、IgG1 FcCH2CH3铰链区或IgG4 Fc CH2CH3铰链区，其序列在本领域技术人员的知识范围内。适用于本发明的CD8α铰链区可以是本领域常用于CAR的各种CD8α铰链区序列。在某些实施方案中，所述CD8α铰链区包含SEQ ID NO:4所示序列。

嵌合抗体受体的跨膜区可以形成α螺旋、多于一个α螺旋的复合物、β桶或能够跨域细胞磷脂双层的任何其它稳定结构。跨膜区可以是天然或合成来源的。跨膜区可选自以下蛋白的跨膜区：CD3ε、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、T细胞受体的α、β或ζ链。适用于本发明的人CD28跨膜区可以是本领域常用于CAR的各种CD28跨膜区序列。在某些实施方案中，所述CD28跨膜区的氨基酸序列包含SEQ ID NO:5所示序列。

胞内信号转导结构域负责表达嵌合抗原受体的免疫效应细胞的至少一种正常效应子功能的活化。例如，T细胞的效应子功能可以是细胞裂解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。虽然通常可以利用整个胞内信号转导结构域，但是在很多情况下，使用整个链是不必要的。就使用胞内信号转导结构域的截短部分而言，只要其转导效应子功能信号，就可以使用这种截短部分代替完整链。因此，胞内信号转导区包括足以转导效应子功能信号的胞内信号转导结构域的任何截短形式。CAR的胞内信号域可以根据需要选择，包括但不限于来源于CD3ζ、FcRγ (FCER1G)、FcRβ(FcεRib)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d中的至少一种的胞内信号域。优选地，所述胞内信号区来源于CD3ζ胞内信号区。进一步地，所述CD3ζ胞内信号区具有SEQ ID NO:7所示氨基酸序列。

在抗原特异性信号的刺激以外，很多免疫效应细胞还需要共刺激来促进细胞增殖、分化和存活，以及活化细胞的效应子功能。“共刺激域”可以是共刺激分子的胞质部分。术语“共刺激分子”是指免疫细胞（诸如T细胞）上的关联结合伴侣，该关联结合伴侣与共刺激配体特异性结合，从而由免疫细胞介导共刺激响应，诸如但不限于增殖和存活。可以根据需要选择适合的胞内共刺激域，包括具有共刺激信号分子的胞内结构域，例如源自4-1BB，CARD11，CD2，CD7，CD27，CD28，CD30，CD40，CD54，CD83，OX40，CD137，CD134，CD150，CD152，CD223，CD270，PD-L2，PD-L1，CD278，DAP10，LAT，NKD2C，SLP76，TRIM，FcεRIγ，MyD88，和41BBL的胞内结构域的至少一种。在某些实施方案中，CD28共刺激域的氨基酸序列包含SEQID NO:6所示序列。

形成本发明的嵌合抗原受体的上述各部分，如CD8信号肽、抗MSLN纳米抗体、CD8铰链区、CD28跨膜区、CD28共刺激域、CD3ζ胞内信号域等，相互之间可直接连接，或者可通过接头序列连接。接头序列可以是本领域周知的适用于抗体的接头序列，例如含G和S的接头序列。通常，接头含有一个或多个前后重复的基序。例如，该基序可以是GGGS、GGGGS、SSSSG、GSGSA和GGSGG。优选地，该基序在接头序列中是相邻的，在重复之间没有插入氨基酸残基。接头序列可以包含1、2、3、4或5个重复基序组成。接头的长度可以是3～25个氨基酸残基，例如3～15、5～15、10～20个氨基酸残基。在某些实施方案中，接头序列是多甘氨酸接头序列。接头序列中甘氨酸的数量无特别限制，通常为2～20个，例如2～15、2～10、2～8个。除甘氨酸和丝氨酸来，接头中还可含有其它已知的氨基酸残基，例如丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)等。在某些实施方案中，接头序列为(GGGGS)n连接，其中n为1～5的整数。在某些实施方案中，接头包含SEQ ID NO:3所示序列。

本发明也包括任一实施方案所述的CAR的突变体。这些突变体包括：与该CAR具有至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少97％的序列相同性并保留该CAR的生物学活性(如识别末端甘露糖并活化细胞)的氨基酸序列。可采用例如NCBI的BLASTp计算两条比对的序列之间的序列相同性。

在示例性实施方案中，CAR从N端到C端依次含有CD28信号肽、CEGA23蛋白、CD8α铰链区、CD28跨膜域、CD28共刺激结构域和CD3ζ信号转导结构域。在具体实施例中，具有上述结构的示例性CAR如SEQ ID NO:15所示。

应理解，在基因克隆操作中，常常需要设计合适的酶切位点，这势必在所表达的氨基酸序列末端引入了一个或多个不相干的残基，而这并不影响目的序列的活性。为了构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化，常常需要将一些氨基酸添加至重组蛋白的N-末端、C-末端或该蛋白内的其它合适区域内，例如，包括但不限于，适合的接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸等。因此，本发明的CAR的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本文。例如，所述的标签可以是FLAG，HA，HA1，c-Myc，Poly-His，Poly-Arg，Strep-TagII，AU1，EE，T7，4A6，ε，B，gE以及Ty1。这些标签可用于对蛋白进行纯化。

本发明的CAR中的抗原识别区还可以是前述的甘露糖结合分子的变体。此外，CAR的的其他部分也可以发生序列变化，得到的突变体与该CAR具有至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少97％的序列相同性并保留该CAR的生物学活性(如活化T细胞)。可采用例如NCBI的BLASTp计算两条比对的序列之间的序列相同性。

突变体还包括：在任一实施方案所述的CAR的氨基酸序列中具有一个或数个突变(插入、缺失或取代)、同时仍保留该CAR的生物学活性的氨基酸序列。所述数个突变通常指1－10个以内，例如1－8个、1－5个或1－3个。取代优选是保守性取代。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行保守性取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。“性能相近或相似的氨基酸”包括例如，具有相似侧链的氨基酸残基的家族，这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，在本发明多肽中用来自同一侧链类的另一氨基酸残基替换一个或几个位点，将不会在实质上影响其活性。

本发明包括编码本发明融合蛋白的多核苷酸。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。本发明也包括编码融合蛋白的多核苷酸序列的简并变异体，即编码相同的氨基酸序列但核苷酸序列有所不同的核苷酸序列。

所以，本发明还涉及与上述多核苷酸序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严谨条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严谨条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明的结合分子的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。CAR的序列也可以如上获得。或者，可以如上得到CAR的各部分（信号肽、抗原识别区、铰链区、跨膜区或胞内区）的序列后再连接得到CAR的全长。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。CAR各部分可以顺序克隆到载体中或者可以整合为全长CAR后再克隆。

本发明也涉及核酸构建物，该核酸构建物含有本文所述的多核苷酸序列，以及与这些序列操作性连接的一个或多个调控序列。本发明所述的多核苷酸序列可以多种方式被操作以保证所述抗体或CAR的表达。在将核酸构建物插入载体之前可根据表达载体的不同或要求而对核酸构建物进行操作。利用重组DNA方法来改变多核苷酸序列的技术是本领域已知的。

在某些实施方案中，所述核酸构建物是载体，例如克隆载体、表达载体和整合载体。通常通过可操作地连接本发明的多核苷酸序列至表达载体，实现本发明多核苷酸序列的表达。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。整合载体含有将靶序列整合到细胞基因组上的组件。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。载体通常含有用于质粒维系和用于克隆与表达外源性核苷酸序列的序列。所述序列（在某些实施方案中总称为“侧翼序列”）通常包括一个或多个以下核苷酸序列：启动子、一个或多个增强子序列、复制起点、转录终止序列、含有供体和受体剪接位点的完全内含子序列、编码用于多肽分泌的前导序列的序列、核糖体结合位点、聚腺苷酸化序列、用于插入编码将要表达的抗体的核酸的多连接子区和可选标记元件。

载体的类型不受限制，例如，质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒，可根据待导入的宿主细胞而改变。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，NewYork)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。

为了评估CAR多肽或其部分的表达，被引入细胞的载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。

适用于导入本文所述核酸构建物的宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞，特别是免疫细胞，优选免疫效应细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。

“免疫效应细胞”是可执行免疫效应功能的免疫细胞。在一些实施方案中，免疫效应细胞执行ADCC效应子功能。介导ADCC的免疫效应细胞的实例包括外周血单个核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。优选地，免疫效应细胞选自：由多能干细胞或胚胎干细胞培养分化的免疫细胞、T淋巴细胞、NK细胞、外周血单个核细胞（PBMC）和造血干细胞中的至少一种。更优选地，所述免疫效应细胞为T淋巴细胞（同T细胞）。适用于本发明的T细胞可以是各种来源的各种类型的T细胞。在一些实施方案中，T细胞可以为CD8+ T细胞。在一些实施方案中，T细胞在表达嵌合抗原受体并结合至靶细胞时产生IL-2、IFN和/或TNF。在一些实施方案中，CD8+ T细胞在表达嵌合抗原受体并结合至靶细胞时裂解靶细胞。

T细胞可来源于B细胞恶性肿瘤患者的PBMC。在某些实施方案中，获得T细胞后，可先用适量的(例如30～800ng/ml)的CD3和CD28抗体刺激活化，然后在含有适量的(例如30～800IU/ml)的IL2培养基进行培养备用。

将核酸或载体引入哺乳动物细胞的方法是本领域已知的，所述载体可以通过物理、化学或生物方法转入细胞。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔，脂质体包装等。在一些实施方案中，转导的或转染的免疫效应细胞在引入核酸或载体之后离体繁殖。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的抗体或CAR。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。在使用诱导型启动子表达CAR的实施方案中，当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本文所述的CAR、编码序列、核酸构建物、和细胞的所有方面都可用于制备用以预防或治疗本文所述各种病况和疾病的药物，所述病况和疾病是与细胞表面的末端甘露糖相关的疾病或病况，指由细胞表面的末端甘露糖表达异常所直接或间接导致的疾病，例如肿瘤。

本发明还包括一类细胞疗法，包括使免疫细胞被基因修饰以表达本文所述的CAR，和将细胞注入需要其的接受者中。注入的细胞能够杀死接受者的肿瘤细胞。

本发明的CAR-修饰的细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如相关的细胞因子或细胞群结合施用。因此，本发明还提供包含本文所述方法制得的CAR-修饰的细胞和药学上可接受辅料的药物组合物。

本发明中，“药学上可接受的辅料”是用于将本发明的CAR-修饰的免疫细胞传送给动物或人的药学上或食品上可接受的载体、溶剂、悬浮剂或赋形剂。本文中，药学上可接受的辅料在所采用的剂量和浓度对所述组合物的接受者是无毒的。可包括本领域周知的治疗中常用于递送免疫细胞的各种类型的载体或赋形剂。示例性的辅料可以是液体或固体，包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，碳水化合物，佐剂，抗氧化剂，螯合剂，离子强度增强剂、防腐剂、载剂、助流剂、甜味剂、染料/着色剂、增味剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等渗剂、溶剂或乳化剂。在一些实施方案中，药学上可接受的辅料可以包括一种或多种非活性成分，包括但不限于：稳定剂、防腐剂、添加剂、佐剂、喷雾剂、压缩空气或其它适宜的气体，或其它适宜的与药效化合物合用的非活性成分。参见例如REMINGTON'SPHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版，A. R. Genrmo编，1990，Mack Publishing Company。可视预期的施用途径、递送方式和所需的剂量来确定最佳的药物组合物。

可选择本发明的药物组合物用于肠胃外递送、用于吸入或通过消化道(诸如经口)递送，例如用于静脉输注递送。所述组合物的制备在本领域的技术内。其它药物组合物将为本领域技术人员显而易见，包括在持续或控制释放递送配制物中包含免疫细胞特别是免疫细胞（例如T细胞）的配制物。本发明的药物组合物还可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。

用于体内施用的药物组合物通常以无菌制剂的形式提供。通过经无菌过滤膜过滤来实现灭菌。用于肠胃外施用的组合物可以冻干形式或在溶液中（例如冻存制剂）储存。肠胃外组合物通常放在具有无菌进入孔的容器中，例如具有皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液带或小瓶。

药物组合物一经配制，就以溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体、晶体、冻存物或以脱水或冻干粉末的形式储存在无菌小瓶中。所述药物配制物（例如，冻存制剂）可储存成即用形式或在施用前进一步配制的形式。例如，适合递送本文所述药物组合物可以是冻存制剂，这样可以耐受远距离运输而不损伤细胞。除了细胞本身外，冻存制剂通常还包括细胞冻存液、人血清白蛋白（HSA）等组分。在施用前（例如静脉输注），冻存的药物组合物需低温保存（例如置于液氮中）。冻存制剂解冻后可直接或者配制为输注组合物向患者输注。本领域技术人员知晓常规冻存液的组分和浓度。例如，冻存液或输注组合物还可包含二甲亚砜、氯化钠、葡萄糖、醋酸钠、氯化钾或氯化镁等，其浓度可由本领域技术人员（例如有经验的医师）根据细胞、疾病、患者等状况确定。

在本发明的一些实施方案中，本发明的含CAR细胞或其组合物可与本领域已知的其它疗法结合。

“患者”、“对象”、“个体”等等在本文中可交换使用，指可引起免疫应答的活有机体，如哺乳动物。例子包括但不限于人、狗、猫、小鼠、大鼠和其转基因物种。

在具体实施方案中，本发明通过PCR或同源重组将胞外抗原/配体结合结构域（例如CEGA23）的核苷酸序列与其他序列连接，最终形成编码CAR的基因分子，将编码CAR的基因分子插入逆转录病毒载体，完成CAR分子制备。使用逆转录病毒系统将CAR转导至CD3和CD28抗体活化的T细胞中，制备CAR-T细胞。通过FACS验证CAR-T细胞中CAR的表达和细胞增殖能力。并验证了CAR-T细胞对表达含末端甘露糖的N-糖靶点的靶细胞的体外杀伤效率和在含末端甘露糖的N-糖靶点的靶细胞刺激下的细胞因子表达。证明了CAR-T细胞在荷瘤小鼠中的抗瘤能力、抑制肿瘤复发能力检测。

本发明通过参考以下实验实施例进一步详细地进行描述。这些实施例仅出于说明性的目的提供，并不意欲为限制性的，除非另有规定。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为包括由于本文提供的教导变得显而易见的任何和全部的变化。实施例中所用的方法和试剂，除非另有说明，否则为本领域常规的方法和试剂。

实施例

实验设备和试剂

BD 流式细胞仪 Aria III；Cytiva 表面等离子共振理化分析仪 Biacore 4000；ThermoFisher 电穿孔仪 Neon；Sartorius 生物反应器 Biostat B；Leica 荧光显示器DMi8；Cytiva 高内涵分析仪 IN Cell Analyzer 2500 HS；ThermoFisher 自动荧光细胞计数仪 Countess Ⅱ FL；ThermoFisher 动态内毒素检测仪 Multiskan ET；ThermoFisher多功能酶标仪 Varioskan LUX；ThermoFisher 二氧化碳培养箱 thermo 1501；Gibco 大体积分选磁力架 CTS™ DynaMag™ Magnet；Beckman Coulter 落地离心机 Avanti j-e；ThermoFisher 台式冷冻离心机 FRESCO17；Eppendorf 冷冻离心机 5415D；Agilent 毛细血管电泳仪 ZAG M5320AA；Genscript 快速转湿仪 eBlot 1.Ounit；Bruker 多模式小动物活体成像仪 In-Vivo Xtreme；Biozone 小型SPF实验动物IVC系统 samrt rack；ZHEJIANGFUXIA 二级生物安全柜 BSC-1000ⅡA2。

Gibco Dynabeads™ Mouse T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion andActivation；Gibco Dynabeads™ Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansionand Activation；Invitrogen Dynabeads™ FlowComp™ 人 CD4 试剂盒；InvitrogenDynabeads™ FlowComp™ 人 CD8 试剂盒；Invitrogen Dynabeads™ FlowComp™ 小鼠CD4 试剂盒；Invitrogen Dynabeads™ FlowComp™ 小鼠 CD8 试剂盒；ThermoFisherMagniSort™人NK细胞富集试剂盒；Invitrogen Neon™ 转染系统 100 μL 试剂盒；Invitrogen Lipofectamine™ 2000/3000 Transfection Reagent；Procell 特技胎牛血清；Procell RPMI-1640/ RPMI-1640无酚红；Procell DPBS；Procell L-谷氨酰胺溶液；Stemcell mTeSR Plus；Promega Killing assay试剂盒；Preprotech 重组人白介素2；Biolegend CD19/CD45/CD3/CD4/CD8/CD69抗体；BD Matrixgel/ Matrixgel高浓度；四正柏人单个核细胞分离液；NEST 细胞培养工厂；BD EDTA抗凝管；ThermoFisher SpinnerDouble Side Arm Flasks；Nunc 多孔细胞培养板；Greiner U型底96孔板。

实施例1，制备靶向末端甘露糖的嵌合抗原受体CEGA23-CAR的基因序列

分别制备CD28信号肽、靶向末端甘露糖的CEGA23蛋白、linker序列、CD8α铰链区、CD28跨膜域、CD28共刺激结构域和CD3ζ信号转导结构域的编码基因。上述序列的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1-7所示；编码基因序列分别如SEQ ID NO:8-14所示。

通过PCR的方法将上述信号肽、靶向末端甘露糖的CEGA23蛋白、linker序列、CD8α铰链区、CD28跨膜域、CD28共刺激结构域和CD3ζ信号转导结构域的编码基因依次从5’端到3’端连接到一起，得到靶向末端甘露糖的嵌合抗原受体CEGA23-CAR的编码基因。所述CEGA23-CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，编码序列如SEQ ID NO:16所示。

实施例2，构建pSLenti-CEGA23-CAR-P2A-EGFP重组质粒

使用T4连接酶将CEGA23-CAR的编码基因插入到pSLenti-P2A-EGFP载体的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点之间，并在pSLenti-P2A-EGFP载体EF1α之后，以EF1α为启动子。所述CEGA23-CAR的编码基因插入到pSLenti-P2A-EGFP载体时，所述CEGA23-CAR编码基因的5’端加入了起始密码子ATG，与pSLenti-P2A-EGFP载体中BamHⅠ酶切位点相连，3’端与pSLenti-P2A-EGFP载体中EcoRⅠ酶切位点相连。将连接产物转入大肠杆菌感受态细胞DH5α中，转化菌液涂布于含有氨苄抗生素的LB固体平半中进行37℃过夜培养，次日对平板中的单克隆菌落进行阳性克隆PCR筛选、质粒抽提和质粒测序鉴定。PCR产物凝胶电泳检测、质粒测序鉴定均符合目的片段大小和基因序列，最终获得正确的pSLenti-CEGA23-CAR-P2A-EGFP重组质粒。图1，A显示pSLenti-CEGA23-CAR-P2A-EGFP重组质粒结构示意图。图1，B显示质粒在细胞内表达的CEGA23-CAR蛋白结构示意图。

实施例3，重组慢病毒构建

将pSLenti-CEGA23-CAR-P2A-EGFP重组质粒、包装质粒psPAX2、包膜质粒pMD2G三者共转染入培养好的HEK293T细胞，第72h收获含病毒的上清，上清经0.45μm滤膜过滤，过滤后的病毒上清中加入1/10体积的Takara 慢病毒浓缩液Lenti-X Concentrator，随后将混合液置于冰上孵育12-24h，孵育结束后使用ThermoFisher 台式离心机进行离心，离心参数为1500g、45min、4℃。离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入1/10体积的病毒保存液，轻轻吹打以重悬沉淀；随后取部分病毒进行梯度稀释、感染HEK293T细胞，通过FACS荧光检测确定病毒滴度为6.15x10⁸ TU/mL（FACS中使用的仪器为BD Aria III，具体操作方法请参考仪器使用说明书），慢病毒感染HEK293T细胞的荧光显微图如图2所示。得到的重组慢病毒按照100μL/支进行分装并保存于-80℃超低温冰箱。

实施例4，靶向末端甘露糖的嵌合抗原受体（CEGA23-CAR）T细胞制备

外周血单个核细胞（PBMC）分离：使用STEMCELL Technologies品牌的EasySep™Direct Human PBMC Isolation Kit得到外周血单个核细胞。具体操作方法请参考试剂盒说明书。

免疫磁珠法分离抗原特异性T淋巴细胞：使用STEMCELL Technologies品牌的EasySep™ Human Naïve CD8+ T Cell Isolation Kit II得到CD8阳性T淋巴细胞。具体操作方法请参考试剂盒说明书。取部分细胞进行FACS检测CD8阳性信号，如图3所示，CD8阳性率大于95%。

CD8阳性T淋巴细胞的活化和增殖：使用PBS将CD3和CD28抗体稀释成1μg/mL和2μg/mL，然后加入六孔板中进行孔板包被，每孔加入1mL稀释液，将六孔板至于4℃冰箱包被过夜；次日，将分离得到的CD8阳性T细胞用含10％FBS和1％双抗的RPMI-1640培养基稀释至2x10⁶个/mL，去掉六孔板中的包被液，每孔加入2mL稀释后T细胞，将T细胞放在37℃，5％CO2培养箱中培养48h。

慢病毒转染法制备靶向末端甘露糖的T淋巴细胞：将成功活化增殖的T细胞收集起来进行离心，离心参数设定为300g、5min、RT；离心后去除上清，使用新鲜的含8μg/mLPolybrene的RPMI-1640培养基进行重悬，重悬液重新加入六孔板的每孔中；在六孔板的每孔中加入表达CEGA23-CAR的慢病毒（根据慢病毒滴度，MOI值设定为20）； 将感染病毒的T细胞放在37℃，5％CO2培养箱中培养8-12h，随后将培养基更换为新鲜的含300IU/mL IL-2的RPMI-1640培养基，继续放在37℃，5％CO2培养箱中培养；培养2天后取部分细胞进行FACS检测EGFP阳性信号，结果如图4所示，细胞阳性率在90%以上。剩余细胞继续进行扩增培养，从而得到足够的表达CEGA23-CAR的T细胞用于后续效果验证实验。

实施例5，靶向末端甘露糖的嵌合抗原受体T细胞的体外肿瘤细胞杀伤实验

对制备的靶向末端甘露糖的嵌合抗原受体T细胞（CEGA23-CAR T）、未经慢病毒转导的T细胞（CTL T）的体外肿瘤杀伤效果进行比较：将T细胞和肿瘤靶细胞按照Effector：Target cell不同比例（Effector：Target cell数量比为1:1、1:2、1:5和1:10）在96孔板中进行体外共培养，每孔加入150μL培养基，培养基中含7x10⁴个靶细胞（HCG-27、AGS、PC-9、A549、RKO、SW948、HOS、U-2OS）；将96孔板放在37℃，5％CO2培养箱中培养，4~8h后，使用Promega品牌的CytoTox 96® Non-Radioactive Cytotoxicity Assay试剂盒，通过测定培养基上清中LDH的含量，计算细胞毒性百分比（tumor lysis %= LDH实验性释放量/LDH最大释放量x100%，Cytotoxicity Assay具体操作方法请参考试剂盒说明书）；结果如图5-12所示，表明靶向末端甘露糖的嵌合抗原受体T细胞肿瘤杀伤效果明显高于阴性对照组。

将肿瘤细胞预先进行糖苷内切酶H（Endoglycosidase H，Endo H，特异性切割高甘露糖结构）处理，再与不同的T淋巴细胞进行共培养检测T细胞的体外肿瘤杀伤效果：将肿瘤细胞在六孔板中进行培养，培养基中加入Roche品牌的糖苷内切酶H，糖苷内切酶H的终浓度为3000mU/mL，六孔板放在37℃，5％CO2培养箱中培养，24h后按照上述提及的方法进行T淋巴细胞的体外肿瘤杀伤实验；结果如图5-12所示，表明靶向末端甘露糖的嵌合抗原受体T细胞对经Endo H处理的肿瘤细胞失去杀伤效果。

实施例6，靶向末端甘露糖的嵌合抗原受体T细胞细胞因子分泌水平检测

将制备的靶向末端甘露糖的嵌合抗原受体T细胞（CEGA23-CAR T）、未经慢病毒转导的T细胞（CTL T）分别与肿瘤细胞HCG-27、AGS、PC-9、A549、RKO、SW948、HOS、U-2OS按照Effector：Target cell比为2:1的条件在37℃，5％CO2培养箱中共培养24h，随后使用Invitrogen品牌的人源IL-2、IFN-γ、TNF-α ELISA检测试剂盒检测细胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α的分泌效应。ELISA的具体操作方法请参考试剂盒说明书。结果如图13-15所示，表明靶向末端甘露糖的嵌合抗原受体T细胞与肿瘤靶细胞孵育后细胞因子分泌水平明显高于阴性对照组。

将肿瘤细胞预先进行糖苷内切酶H（Endoglycosidase H，Endo H，特异性切割高甘露糖结构）处理，再与不同的T淋巴细胞进行共培养检测细胞因子的IL-2、IFN-γ、TNF-α分泌效应，结果如图13-15所示，表明靶向末端甘露糖的嵌合抗原受体T细胞与经Endo H处理的肿瘤靶细胞孵育后细胞因子分泌水平和阴性对照组无明显差异。

实施例7，靶向末端甘露糖的嵌合抗原受体T细胞在荷瘤小鼠中的抗瘤能力检测

将肿瘤靶细胞HCG-27（5x10⁶）、A549（1x10⁷）、SW948（5x10⁶）在免疫缺陷NSG鼠（NOD-SCID IL2rg-/-）皮下进行接种，每周测定小鼠皮下肿瘤体积，第16天时在小鼠尾静脉注射1×10⁶个未经慢病毒转导的T细胞（Non-transduced T）或1×10⁶个靶向末端甘露糖的嵌合抗原受体T细胞（CEGA23-CAR T），空白对照组注射PBS（MOCK），随后继续每周测定小鼠皮下肿瘤体积，确定靶向末端甘露糖的嵌合抗原受体T细胞对肿瘤生长的抑制效果；结果如图16-18所示，表明制备的靶向末端甘露糖的嵌合抗原受体T细胞对肿瘤细胞的生长抑制效果明显优于阴性对照组。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海荧辉医疗器械有限公司

<120> 靶向末端甘露糖的嵌合抗原受体及其应用

<130> 218756 1CNCN

<160> 27

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CD28信号肽

<400> 1

Met Leu Arg Leu Leu Leu Ala Leu Asn Leu Phe Pro Ser Ile Gln Val

1 5 10 15

Thr Gly Gly Ser Ser

20

<210> 2

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CEGA23

<400> 2

Met Ser Lys Tyr Ala Val Ala Asn Gln Trp Gly Gly Ser Ser Ala Pro

1 5 10 15

Trp His Pro Gly Gly Thr Trp Val Leu Gly Ala Arg Asp Asn Gln Asn

20 25 30

Val Val Ala Ile Glu Ile Lys Ser Gly Asp Gly Gly Lys Ser Phe Thr

35 40 45

Gly Thr Met Thr Tyr Ala Gly Glu Gly Pro Ile Gly Phe Lys Ala Gln

50 55 60

Arg Thr Gly Gln Asn Gln Tyr Asn Val Glu Asn Gln Trp Gly Gly Asn

65 70 75 80

Asp Ala Pro Trp His Pro Gly Gly Lys Trp Val Ile Gly Gly Arg Asp

85 90 95

Asn Gln Asn Val Ile Ala Leu Ser Val Thr Ser Ser Asp Gly Gly Lys

100 105 110

Asn Leu Ser Gly Thr Asn Thr Tyr Ala Asn Glu Gly Pro Ile Gly Phe

115 120 125

Arg Gly Gln Ile Glu

130

<210> 3

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> linker

<400> 3

Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr

1 5 10 15

Lys Gly

<210> 4

<211> 24

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CD8α铰链区

<400> 4

Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr

1 5 10 15

Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

20

<210> 5

<211> 31

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CD28跨膜域

<400> 5

Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys

1 5 10 15

Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg

20 25 30

<210> 6

<211> 40

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CD28共刺激结构域

<400> 6

Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro

1 5 10 15

Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro

20 25 30

Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 7

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 信号转导结构域

<400> 7

Ala Ser Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr

1 5 10 15

Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg

20 25 30

Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met

35 40 45

Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn

50 55 60

Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met

65 70 75 80

Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly

85 90 95

Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala

100 105 110

Leu Pro Pro Arg Ala Ser

115

<210> 8

<211> 63

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CD28信号肽

<400> 8

atgctcaggc tgctcttggc tctcaactta ttcccttcaa ttcaagtaac aggagggtct 60

tcg 63

<210> 9

<211> 399

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CEGA23

<400> 9

atgtcaaaat atgcagtagc taatcaatgg ggcggcagca gcgcaccgtg gcacccgggt 60

ggcacttggg tgctgggtgc gcgtgacaat cagaacgttg ttgcgattga gatcaaatcc 120

ggtgatggtg gcaagtcgtt caccggtacg atgacctacg cgggtgaggg tccgattggc 180

ttcaaagcgc agcgtaccgg tcaaaaccag tataacgtgg aaaatcaatg gggtggaaac 240

gacgctccgt ggcatccagg tggcaagtgg gtcatcggcg gtcgcgacaa ccaaaacgtg 300

atcgccctga gcgttaccag ctctgatggc ggcaagaact tgtccggcac caatacgtac 360

gctaatgaag gtccgatcgg ctttcgtggt cagattgag 399

<210> 10

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> linker

<400> 10

ggctccacct ctggatccgg caagcccgga tctggcgagg gatccaccaa gggc 54

<210> 11

<211> 72

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 铰链区

<400> 11

ctgcgacctg aggcttgtcg accagcagcc ggaggcgcag tgcacacgag ggggctggac 60

ttcgcctgtg at 72

<210> 12

<211> 93

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CD28跨膜域

<400> 12

tctaagccct tttgggtgct ggtggtggtt ggtggagtcc tggcttgcta tagcttgcta 60

gtaacagtgg cctttattat tttctgggtg agg 93

<210> 13

<211> 120

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CD28共刺激结构域

<400> 13

agtaagagga gcaggctcct gcacagtgac tacatgaaca tgactcccag gcggcccgga 60

cccacccgca agcattacca gccctatgcc ccaccacgcg acttcgcagc ctatcgctcc 120

<210> 14

<211> 354

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 信号转导结构域

<400> 14

gctagcctga gagtgaagtt cagcaggagc gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag 60

aaccagctct ataacgagct caatctagga cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag 120

agacgtggcc gggaccctga gatgggggga aagccgcaga gaaggaagaa ccctcaggaa 180

ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag atggcggagg cctacagtga gattgggatg 240

aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac gatggccttt accagggtct cagtacagcc 300

accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg caggccctgc cccctcgcgc tagc 354

<210> 15

<211> 389

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CAR

<400> 15

Met Leu Arg Leu Leu Leu Ala Leu Asn Leu Phe Pro Ser Ile Gln Val

1 5 10 15

Thr Gly Gly Ser Ser Met Ser Lys Tyr Ala Val Ala Asn Gln Trp Gly

20 25 30

Gly Ser Ser Ala Pro Trp His Pro Gly Gly Thr Trp Val Leu Gly Ala

35 40 45

Arg Asp Asn Gln Asn Val Val Ala Ile Glu Ile Lys Ser Gly Asp Gly

50 55 60

Gly Lys Ser Phe Thr Gly Thr Met Thr Tyr Ala Gly Glu Gly Pro Ile

65 70 75 80

Gly Phe Lys Ala Gln Arg Thr Gly Gln Asn Gln Tyr Asn Val Glu Asn

85 90 95

Gln Trp Gly Gly Asn Asp Ala Pro Trp His Pro Gly Gly Lys Trp Val

100 105 110

Ile Gly Gly Arg Asp Asn Gln Asn Val Ile Ala Leu Ser Val Thr Ser

115 120 125

Ser Asp Gly Gly Lys Asn Leu Ser Gly Thr Asn Thr Tyr Ala Asn Glu

130 135 140

Gly Pro Ile Gly Phe Arg Gly Gln Ile Glu Gly Ser Thr Ser Gly Ser

145 150 155 160

Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Leu Arg Pro Glu

165 170 175

Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp

180 185 190

Phe Ala Cys Asp Arg Arg Pro Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val

195 200 205

Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala

210 215 220

Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser

225 230 235 240

Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His

245 250 255

Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Ala

260 265 270

Ser Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln

275 280 285

Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu

290 295 300

Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly

305 310 315 320

Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu

325 330 335

Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys

340 345 350

Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu

355 360 365

Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu

370 375 380

Pro Pro Arg Ala Ser

385

<210> 16

<211> 1167

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CAR

<400> 16

atgctcaggc tgctcttggc tctcaactta ttcccttcaa ttcaagtaac aggagggtct 60

tcgatgtcaa aatatgcagt agctaatcaa tggggcggca gcagcgcacc gtggcacccg 120

ggtggcactt gggtgctggg tgcgcgtgac aatcagaacg ttgttgcgat tgagatcaaa 180

tccggtgatg gtggcaagtc gttcaccggt acgatgacct acgcgggtga gggtccgatt 240

ggcttcaaag cgcagcgtac cggtcaaaac cagtataacg tggaaaatca atggggtgga 300

aacgacgctc cgtggcatcc aggtggcaag tgggtcatcg gcggtcgcga caaccaaaac 360

gtgatcgccc tgagcgttac cagctctgat ggcggcaaga acttgtccgg caccaatacg 420

tacgctaatg aaggtccgat cggctttcgt ggtcagattg agggctccac ctctggatcc 480

ggcaagcccg gatctggcga gggatccacc aagggcctgc gacctgaggc ttgtcgacca 540

gcagccggag gcgcagtgca cacgaggggg ctggacttcg cctgtgatag aagacctcct 600

tctaagccct tttgggtgct ggtggtggtt ggtggagtcc tggcttgcta tagcttgcta 660

gtaacagtgg cctttattat tttctgggtg aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt 720

gactacatga acatgactcc caggcggccc ggacccaccc gcaagcatta ccagccctat 780

gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc tccgctagcc tgagagtgaa gttcagcagg 840

agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 900

ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 960

ggaaagccgc agagaaggaa gaaccctcag gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat 1020

aagatggcgg aggcctacag tgagattggg atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg 1080

cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca gccaccaagg acacctacga cgcccttcac 1140

atgcaggccc tgccccctcg cgctagc 1167

<210> 17

<211> 133

<212> PRT

<213> Pseudomonas sp. 6G5

<400> 17

Met Ser Lys Tyr Ala Val Ala Asn Gln Trp Gly Gly Ser Ser Ala Pro

1 5 10 15

Trp His Pro Gly Gly Thr Trp Val Leu Gly Ala Arg Asp Asn Gln Asn

20 25 30

Val Val Ala Ile Asp Ile Lys Ser Gly Asp Gly Gly Lys Thr Phe Thr

35 40 45

Gly Thr Met Thr Tyr Ala Gly Glu Gly Pro Ile Gly Phe Lys Ala Gln

50 55 60

Arg Thr Gly Gln Asn Gln Tyr Asn Val Glu Asn Gln Trp Gly Gly Asn

65 70 75 80

Asp Ala Pro Trp His Pro Gly Gly Lys Trp Val Ile Gly Gly Arg Asp

85 90 95

Asn Gln Asn Val Ile Ala Leu Ser Val Thr Ser Asn Asp Gly Gly Lys

100 105 110

Asn Leu Ser Gly Thr Asn Thr Tyr Ala Asn Glu Gly Pro Ile Gly Phe

115 120 125

Arg Gly Gln Ile Glu

130

<210> 18

<211> 275

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> Nostocales cyanobacterium

<400> 18

Met Thr Thr Thr Lys Thr Ala Asn Asn Leu Tyr Asn Val Glu Asn Gln

1 5 10 15

Trp Gly Gly Thr Ser Ala Pro Trp Asn Pro Gly Gly Ala Trp Val Ile

20 25 30

Gly Ala Arg Ala Asn Gln Arg Val Val Ala Leu Lys Val Thr Ser Ser

35 40 45

Asp Asn Gly Lys Thr Leu Thr Gly Thr Thr Thr Tyr Ala Gly Glu Gly

50 55 60

Pro Ile Gly Phe Arg Ala Thr Leu Thr Asp Ser Ser Asp Thr Tyr Thr

65 70 75 80

Val Glu Asn Gln Trp Gly Gly Ser Ser Ala Pro Trp Asn Pro Gly Gly

85 90 95

Thr Trp Val Leu Gly Ser Arg Gly Asn Gln Asn Val Val Ala Ile Asp

100 105 110

Ile Thr Ser Ser Asp Asp Gly Asn Thr Leu Thr Gly Thr Ile Thr Tyr

115 120 125

Ala Gly Glu Gly Pro Ile Gly Phe Lys Ser Ala Val Val Asp Gly Gly

130 135 140

Val Tyr Thr Val Glu Asn Gln Trp Gly Gly Ser Ser Ala Pro Trp Asn

145 150 155 160

Pro Gly Gly Ile Trp Val Leu Gly Ser Arg Gly Asn Gln Asn Val Val

165 170 175

Ala Ile Asp Ile Thr Ser Ser Asp Asp Gly Asn Thr Leu Thr Gly Thr

180 185 190

Ile Thr Tyr Ala Gly Glu Gly Pro Ile Gly Phe Lys Gly Lys Ile Phe

195 200 205

Gly Ser Asn Asn Tyr Thr Val Asp Asn Gln Trp Gly Gly Asn Thr Ala

210 215 220

Pro Trp Asn Pro Gly Gly Ile Trp Leu Ile Gly Gly Arg Val Gly Gln

225 230 235 240

Asn Val Val Ala Leu Asn Val Thr Ser Ser Asp Gly Gly Lys Thr Leu

245 250 255

Thr Gly Thr Thr Thr Tyr Lys Gly Glu Gly Pro Ile Gly Phe Arg Ala

260 265 270

Thr Gln Ile

275

<210> 19

<211> 276

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> Aquimarina sp.

<400> 19

Met Ala Ile Tyr Gln Val Gln Asn Gln Trp Gly Gly Asn Ser Ala Pro

1 5 10 15

Trp His Ala Gly Gly Thr Trp Val Leu Gly Gly Arg Asp Asn Gln Asn

20 25 30

Val Val Ala Ile Asp Ile Lys Ser Gly Asp Gly Gly Arg Thr Phe Ser

35 40 45

Gly Thr Met Thr Tyr Glu Gly Glu Gly Pro Ile Gly Phe Lys Ala Ile

50 55 60

Gln Ile Ala Gly Asn Asn Tyr Ser Val Glu Asn Gln Trp Gly Gly Ala

65 70 75 80

Ser Ala Pro Trp His Pro Gly Gly Asn Trp Ile Ile Gly Gly Arg Asn

85 90 95

Gly Gln Asn Val Ile Glu Leu Asn Val Thr Ala Glu Ser Gly Ser Ala

100 105 110

Asn Leu Glu Gly Thr Met Lys Tyr Ala Gly Glu Gly Pro Ile Gly Phe

115 120 125

Lys Gly Gln Glu Thr Val Gly Ser Ser Tyr Ser Ile Glu Asn Gln Trp

130 135 140

Gly Gly Ala Ser Ala Pro Trp His Pro Gly Gly Thr Phe Val Leu Gly

145 150 155 160

Ala Arg Glu Asn Gln Asn Pro Val Ala Tyr Asp Ile Gln Ser Thr Asp

165 170 175

Gly Gly Lys Thr Phe Thr Gly Thr Met Thr Tyr Ala Gly Glu Gly Pro

180 185 190

Ile Gly Phe Arg Ala Ile Gln Thr Ala Gly Asn Asn Tyr Ala Ala Glu

195 200 205

Asn Gln Trp Gly Gly Ala Ser Ala Pro Trp His Pro Gly Gly Asn Leu

210 215 220

Val Ile Gly Ala Arg Val Asn Gln Asn Val Val Gln Leu Lys Ile Asn

225 230 235 240

Ser Asn Asp Asn Gly Glu Thr Phe Ser Gly Glu Met Thr Tyr Leu Gly

245 250 255

Glu Gly Pro Ile Gly Val Lys Ala Val Leu Ser Ser Arg Val Leu Ser

260 265 270

Gly Ala Thr Ser

275

<210> 20

<211> 133

<212> PRT

<213> Herpetosiphon aurantiacus

<400> 20

Met Ser Val Tyr Trp Val Glu Asn Gln Trp Gly Gly Asp Ser Ala Pro

1 5 10 15

Trp His Pro Gly Gly Thr Trp Val Leu Gly Ala Arg Asp Asn Gln Asn

20 25 30

Val Val Ala Ile Asn Ile Ser Ser Ala Asp Asn Gly Gln Thr Phe Thr

35 40 45

Gly Thr Met Thr Tyr Ile Asn Glu Gly Pro Ile Gly Phe Arg Ala Thr

50 55 60

Arg Thr Ser Ala Asn Asn Tyr Ala Val Glu Asn Gln Trp Gly Gly Asp

65 70 75 80

Ser Ala Pro Trp His Pro Gly Gly His Trp Ile Ile Gly Thr Arg Asp

85 90 95

Asn Gln Asn Pro Val Asn Leu Asp Val Asp Ser Arg Asp Gly Gly Gln

100 105 110

Thr Leu Asn Gly Thr Met Val Tyr Ala Gly Glu Gly Pro Ile Gly Phe

115 120 125

Arg Gly Lys Leu Gln

130

<210> 21

<211> 133

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> Chloroflexia bacterium

<400> 21

Met Ala Thr Tyr Ala Val Glu Asn Gln Trp Gly Gly Pro Asp Ala Pro

1 5 10 15

Trp His Ala Gly Gly Thr Trp Val Leu Gly Ala Arg Ser Glu Gln Ser

20 25 30

Val Val Ala Ile Asp Ile Ser Ser Ser Asp Gly Gly Asp Ser Phe Phe

35 40 45

Gly Thr Met Thr Tyr Ala Asn Glu Gly Pro Ile Gly Leu Arg Ala Thr

50 55 60

Leu Leu Asn Gly Asn Ser Tyr Asn Val Glu Asn Gln Trp Gly Gly Ser

65 70 75 80

Asn Ala Pro Trp His Pro Gly Gly Thr Trp Val Ile Gly Gly Arg Asp

85 90 95

Asn Gln His Val Ile Glu Leu His Val Ser Gly Asp Gly Asp Val Leu

100 105 110

Asp Gly Thr Asn Thr Tyr Val Gly Glu Gly Pro Ile Gly Phe His Gly

115 120 125

Val Leu Glu Ser Ala

130

<210> 22

<211> 274

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> Nostoc sp

<400> 22

Met Thr Ala Thr Ala Thr Ile Ser Asn Leu Tyr Ile Ala Gln Asn Gln

1 5 10 15

Trp Gly Gly Ser Ser Ala Pro Trp Asn Pro Gly Gly Ala Trp Val Ile

20 25 30

Gly Ala Arg Ser Asn Gln Arg Val Val Ala Leu Lys Val Thr Ser Ser

35 40 45

Asp Asn Gly Lys Thr Leu Asn Gly Thr Met Thr Tyr Ala Gly Glu Gly

50 55 60

Pro Ile Gly Phe Arg Gly Thr Leu Thr Thr Ser Asp Thr Tyr Lys Val

65 70 75 80

Glu Asn Gln Trp Gly Gly Ser Ser Ala Pro Trp Asn Pro Gly Gly Asn

85 90 95

Trp Ile Leu Gly Cys Arg Gly Asn Gln Asn Val Val Ala Ile Asp Ile

100 105 110

Thr Ser Asn Asp Gly Gly Asn Thr Leu Asn Gly Thr Ile Thr Tyr Ala

115 120 125

Gly Glu Gly Pro Ile Gly Phe Lys Ser Ala Ala Ala Asn Gly Ser Val

130 135 140

Tyr Thr Val Glu Asn Gln Trp Gly Gly Ala Ser Ala Pro Trp Asn Pro

145 150 155 160

Gly Gly Thr Trp Ala Leu Gly Cys Arg Asp Asn Gln Asn Val Val Ala

165 170 175

Ile Asn Val Thr Ser Asn Asp Gly Gly Lys Thr Leu Thr Gly Thr Asn

180 185 190

Thr Tyr Ala Gly Glu Gly Pro Ile Gly Phe Arg Gly Asn Leu Leu Gly

195 200 205

Ser Asn Asn Tyr Thr Val Glu Asn Gln Trp Gly Gly Ala Ser Ala Pro

210 215 220

Trp Asn Ala Gly Gly Thr Trp Val Ile Gly Cys Arg Ala Gly Gln Asn

225 230 235 240

Ala Val Ala Ile Asn Val Thr Ser Asn Asp Gly Gly Lys Thr Phe Thr

245 250 255

Gly Thr Met Thr Tyr Ala Gly Glu Gly Pro Ile Gly Phe Arg Ala Thr

260 265 270

Lys Ile

<210> 23

<211> 267

<212> PRT

<213> Solieria filliformis

<400> 23

Gly Arg Tyr Thr Val Gln Asn Gln Trp Gly Gly Ser Ser Ala Pro Trp

1 5 10 15

Asn Asp Ala Gly Val Phe Val Leu Gly Gly Arg Ala Asn Gln Asn Val

20 25 30

Met Ala Ile Asp Val Ser Ser Ser Asp Gly Gly Lys Thr Leu Thr Gly

35 40 45

Thr Met Thr Tyr Ser Gly Glu Gly Pro Ile Gly Phe Lys Gly Thr Arg

50 55 60

Arg Gly Glu Ser Asn Asn Tyr Glu Val Glu Asn Gln Trp Gly Gly Ser

65 70 75 80

Ser Ala Pro Trp His Pro Ala Gly Thr Phe Val Ile Gly Ser Arg Ser

85 90 95

Gly Gln Ala Val Val Ala Met Asn Val Thr Ser His Asp Gly Gly Lys

100 105 110

Thr Leu Ser Gly His Met Thr Tyr Glu Asn Glu Gly Pro Ile Gly Phe

115 120 125

Lys Gly Thr Gln Ala Glu Gly Asp Thr Tyr Asn Val Glu Asn Gln Trp

130 135 140

Gly Gly Ser Ser Ala Pro Trp Asn Lys Ala Gly Val Trp Ala Leu Gly

145 150 155 160

Ser Arg Ala Ser Gln Gly Val Val Lys Leu Asp Val Ser Ser Ser Asp

165 170 175

Gly Gly Lys Thr Leu Thr Gly Thr Met Gln Tyr Gln Asn Glu Gly Pro

180 185 190

Ile Gly Phe Arg Gly Thr Leu Thr Gly Ala Asn Asn Tyr Lys Ala Glu

195 200 205

Asn Gln Trp Gly Gly Ser Ser Gly Ala Trp Asn Pro Ala Gly Leu Trp

210 215 220

Leu Ile Gly Asp Arg His Asn Gln Asn Ile Ile Gly Val Lys Val Thr

225 230 235 240

Ser Asp Asp Asn Gly Lys Thr Leu Glu Gly Thr Cys Thr Tyr Tyr Arg

245 250 255

Glu Gly Pro Ile Gly Phe Lys Gly Val Ala Asn

260 265

<210> 24

<211> 256

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> Lyngbya sp.

<400> 24

Met Ser Thr Ala Pro Trp His Glu Gly Gly Lys Trp Val Ile Gly Gly

1 5 10 15

Arg Ser Asn Gln Asn Val Val Ala Ile Asn Val Lys Ser Gly Asp Asn

20 25 30

Gly Lys Thr Leu Asn Gly Thr Met Thr Tyr Ala Gly Glu Gly Pro Ile

35 40 45

Gly Phe Arg Ala Thr Leu Ser Gly Ser Asn Asn Tyr Met Val Glu Asn

50 55 60

Gln Trp Gly Gly Ser Ser Ala Pro Trp His Pro Gly Gly Gln Trp Val

65 70 75 80

Leu Gly Tyr Arg Thr Asp Gln Asn Val Val Glu Leu Asp Leu Lys Ser

85 90 95

Glu Asp Gly Gly Gln Thr Leu Asn Gly Thr Met Thr Tyr Gln Gly Glu

100 105 110

Gly Pro Ile Gly Phe Lys Ala Ala Met Ala Glu Gly Tyr Ala Tyr Thr

115 120 125

Val Glu Asn Gln Trp Gly Gly Ser Ser Ala Pro Trp Asn Glu Gly Gly

130 135 140

Thr Leu Val Leu Gly Ser Arg Asn Asn Gln Lys Val Val Ala Ile Asp

145 150 155 160

Ile Gln Ser Gly Asp Asn Gly Lys Thr Leu Asn Gly Thr Met Thr Tyr

165 170 175

His Gly Glu Gly Pro Ile Gly Phe Arg Ala Thr Leu Ser Gly Ser Asn

180 185 190

Asn Tyr Met Val Glu Asn Gln Trp Gly Gly Ser Ser Ala Pro Trp His

195 200 205

Pro Gly Gly Gln Trp Ile Ile Gly Tyr Arg Glu Asn Gln Asn Val Val

210 215 220

Ala Leu Asn Ile Asn Ser Asn Asp Glu Gly Thr Thr Leu Asn Gly Thr

225 230 235 240

Met Thr Tyr Gln Gly Glu Gly Pro Ile Gly Phe Lys Gly Ser Leu Met

245 250 255

<210> 25

<211> 267

<212> PRT

<213> Stigmatella aurantiaca

<400> 25

Met Ser Leu Tyr Gln Val Gln Asn Gln Trp Gly Gly Gln Ser Ala Ala

1 5 10 15

Trp Asn Pro Gly Gly Met Trp Ala Ile Gly Asn Arg Pro Asn Gln Asn

20 25 30

Val Ile Ala Leu Asn Leu Lys Ser Thr Asp Gly Gly Lys Thr Leu Thr

35 40 45

Gly Thr Met Thr Tyr Ala Gly Glu Gln Ala Ile Gly Val Gln Ala Ala

50 55 60

Gln Ala Gly Thr Asn Ser Tyr Thr Val Gln Asn Gln Trp Gly Gly Ser

65 70 75 80

Ser Ala Pro Trp Gln Pro Gly Gly Ser Trp Ile Leu Gly Asp Arg Pro

85 90 95

Asn Gln Ser Val Val Ala Ile Asp Ile Thr Ser Thr Asp Gly Gly Arg

100 105 110

Thr Leu Thr Gly Thr Ile Thr Tyr Ala Gly Glu Asn Pro Ile Gly Phe

115 120 125

Lys Ala Glu Gln Ser Ala Gly Gly Met Tyr Ser Val Gln Asn Gln Trp

130 135 140

Gly Gly Ser Ser Ala Ala Trp Gln Gln Gly Gly Ala Trp Val Val Gly

145 150 155 160

Ala Arg Gln Asn Gln Ser Val Val Ala Ile Lys Ala Thr Ser Thr Asp

165 170 175

Gly Gly Lys Thr Leu Thr Gly Thr Met Thr Tyr Ser Gly Glu Gly Ala

180 185 190

Ile Gly Phe Lys Ala Thr Leu Ser Gly Asp Asn Thr Tyr Thr Val Gln

195 200 205

Asn Gln Trp Gly Gly Ala Ser Ala Pro Trp Gln Pro Gly Gly Gln Trp

210 215 220

Ile Leu Gly Ala Arg Lys Gly Gln Gly Val Ile Ala Ile Asp Val Thr

225 230 235 240

Ser Asn Asp Gly Gly Lys Thr Leu Ala Gly Thr Met Thr Tyr Ala Gly

245 250 255

Glu Gly Pro Ile Gly Phe Arg Gly Thr Leu Asn

260 265

<210> 26

<211> 273

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> Hyalangium minutum

<400> 26

Met Leu Gly Gly Arg Pro Asn Gln Ser Val Val Ala Ile Gln Val Lys

1 5 10 15

Ser Gln Asp Asp Gly Gln Thr Leu Thr Gly Thr Met Thr Tyr Asn Gly

20 25 30

Glu Gly Pro Ile Gly Phe Arg Ala Lys Ala Thr Gly Asn Asn Gln Tyr

35 40 45

Ala Val Glu Asn Gln Trp Gly Gly Ala Ser Ala Pro Trp Gln Pro Gly

50 55 60

Gly Thr Trp Val Ile Gly Gly Arg Ser Gly Gln Ala Val Val Ala Leu

65 70 75 80

Asp Val Lys Ser Ala Asp Gln Gly Lys Ser Leu Ser Gly Thr Val Thr

85 90 95

Tyr Lys Gly Glu Gly Pro Ile Ser Phe Lys Gly Met Leu Gly Ser Gly

100 105 110

Ala Pro Ala Ser Ala Ser Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro

115 120 125

Ala Pro Ala Ser Tyr Val Val Leu Ile Ala Lys His Ser Gly Lys Val

130 135 140

Val Gly Val Ala Gly Gln Ser Lys Asp Asn Gly Ala Pro Val Ile Gln

145 150 155 160

Trp Ala Pro Ser Lys Thr Asp Asn Glu Lys Trp Ile Val Glu Pro Ala

165 170 175

Ala Asp Gly Tyr Val Ile Leu Lys Ala Met His Ser Gly Lys Val Leu

180 185 190

Asn Val Ser Gly Asn Ser Lys Thr Pro Gly Ala Lys Val Val Gln Trp

195 200 205

Pro Gln Ser Gly Thr Asp Asn Glu Lys Trp Lys Ile Asp Ser Thr Pro

210 215 220

Asp Gly Phe Val Thr Leu Thr Ala Lys His Ser Gly Gln Val Leu Asn

225 230 235 240

Val Ser Gly Asn Ser Lys Ala Asp Gly Gly Glu Leu Val Gln Trp Pro

245 250 255

Lys Ser Gly Thr Asp Asn Glu Lys Phe Lys Leu Val Lys Met Pro Leu

260 265 270

Asn

<210> 27

<211> 143

<212> PRT

<213> Janthinobacterium agaricidamnosum

<220>

<221> misc_feature

<222> (137)..(138)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<400> 27

Met Ser Lys Thr Ser Lys Ser Ala Asn Asn Leu His His Val Lys Asn

1 5 10 15

Gln Trp Gly Gly Pro Ser Ala Pro Trp Asn Glu Gly Gly Val Trp Val

20 25 30

Leu Gly Gly Arg Ser Gly Gln Asn Val Ala Ala Leu Asn Ile Asn Ser

35 40 45

Ala Asp Gly Gly Asn Thr Phe Thr Gly Ala Met Lys Tyr Val Gly Glu

50 55 60

Gly Gln Ile Gly Phe Arg Ala Thr Leu Thr Gln Ser Asn Thr Tyr Leu

65 70 75 80

Val Glu Asn Gln Trp Gly Gly Asp Ser Ala Pro Trp Asn Pro Gly Gly

85 90 95

Thr Trp Val Ile Gly Gly Arg Ser Asn Gln Asn Val Val Ala Leu Asn

100 105 110

Val Glu Ser Ser Asp Gly Gly Asn Thr Leu Ala Gly Ser Met Ser Tyr

115 120 125

Asn Gly Glu Gly Pro Ile Gly Phe Xaa Xaa Thr His Leu Ile Asn

130 135 140

Claims (13)

1.一种嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体依次含有甘露糖结合分子、铰链区、跨膜区和胞内区，其中胞内区包含胞内共刺激区和信号传导区，

所述甘露糖结合蛋白如SEQ ID NO:2所示，

所述铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，

所述跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，

所述胞内共刺激区的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，和

所述信号传导区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。

2.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体还含有位于N端的信号肽和位于甘露糖结合蛋白和铰链区之间的接头，所述信号肽如SEQ ID NO:1所示，所述接头如SEQ ID NO:3所示。

3.一种核酸分子，包含选自以下的序列：

（1）权利要求1或2所述的嵌合抗原受体的编码序列；

（2）（1）的互补序列。

4.一种核酸构建物，其包含权利要求3所述的核酸分子。

5.如权利要求4所述的核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物是载体。

6.一种宿主细胞，所述宿主细胞：

（1）表达权利要求1或2所述的嵌合抗原受体，和/或

（2）包含权利要求3所述的核酸分子和/或权利要求4或5所述的核酸构建物。

7.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是免疫细胞。

8.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为T细胞。

9.一种药物组合物，含有药学上可接受的辅料和：

（1）权利要求1或2所述的嵌合抗原受体，或

（2）权利要求3所述的核酸分子、权利要求4或5所述的核酸构建物或权利要求6或7或8所述的宿主细胞。

10.如权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物用于治疗肿瘤，所述肿瘤选自以下的一种或多种：胃癌、甲状腺肿瘤、胆囊癌、胆管癌、肺癌、黑色素瘤、头颈癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、肝癌、结直肠癌、脑胶质瘤、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、肾癌、骨肉瘤。

11.试剂在制备活化的免疫细胞中的应用，所述试剂含有：

（1）权利要求1或2所述的嵌合抗原受体，或

（2）权利要求3所述的核酸分子、权利要求4或5所述的核酸构建物或权利要求6或7或8所述的细胞。

12.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述免疫细胞是T细胞。

13.试剂在制备治疗肿瘤的药物中的应用，所述试剂含有：

（1）权利要求1或2所述的嵌合抗原受体，或

（2）权利要求3所述的核酸分子、权利要求4或5所述的核酸构建物或权利要求6或7或8所述的细胞。

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