CN118440210A

CN118440210A - 表达her2嵌合抗原受体的巨噬细胞及其应用

Info

Publication number: CN118440210A
Application number: CN202310044300.9A
Authority: CN
Inventors: 尹秀山; 于琳; 高赟; 刘军花; 房晓彬; 鞠悦; 刘玉
Original assignee: Suzhou Kunshi No1 Biotechnology Co ltd
Current assignee: Suzhou Kunshi No1 Biotechnology Co ltd
Priority date: 2023-01-30
Filing date: 2023-01-30
Publication date: 2024-08-06

Description

表达HER2嵌合抗原受体的巨噬细胞及其应用

技术领域

本发明涉及免疫细胞治疗和生物技术领域，涉及用于表达嵌合抗原受体的巨噬细胞及其制备方法，以及所述巨噬细胞在制备用于治疗肿瘤的制剂中的用途。

背景技术

在全球范围内，卵巢癌是女性第七大最常见的癌症，也是第八大最常见癌症死亡原因，5年生存率低于45%，是预后最差的妇科恶性肿瘤之一。 2020年，大约有21750例卵巢癌新病例，占所有癌症病例的1.2%，与此相关的死亡人数估计为13940人。大约15.7%的卵巢癌病例在局部期被诊断，约58%在转移期被诊断，在早期局部扩散期被发现的患者，5年生存率约为30.2%。卵巢癌是女性病死率最高的恶性肿瘤，而我国卵巢癌发病率居全球第1位。90%的卵巢癌是上皮性的，其中浆液型最常见。详细的妇科评估以及经阴道超声和实验室标记物如癌症抗原-125 (CA-125)检测，是早期检测的关键策略，但对这种癌症的发病率或死亡率没有显著的益处。现有筛查试验的预测价值很低。由于缺乏临床症状，大多数卵巢癌一旦发现就是晚期，发生了广泛转移，手术治疗异常困难，亟需新的有效治疗方案。约75％的卵巢癌患者发生腹膜转移，手术难以完全清除肿瘤病灶，治疗效果差，易复发。晚期卵巢癌腹膜转移患者常伴有不同程度的癌性腹腔积液，临床上多以控制局部发展为主要治疗目标，因此，肿瘤细胞减灭术，以及腹腔注射化疗药物成为此类患者的主要治疗方式。

多形性胶质母细胞瘤（Glioblastoma multiforme，GBM）又叫胶质母细胞瘤，是成人常见的中枢神经系统恶性神经上皮性肿瘤，在神经上皮性肿瘤中占22.3%，有报道占颅内肿瘤的10.2%。GBM是由星形细胞瘤恶变而来，是星形细胞瘤中恶性程度最高的类型。GBM一般被认为是星形细胞瘤、混合性星形少突细胞瘤、少突胶质细胞瘤进行性间变的表现，为分化Ⅳ级的星形细胞瘤。这一变化时间长短不一，但可能相当短。伴有分化好的胶质瘤成分被称为继发性胶质母细胞瘤，不伴有分化好胶质瘤成分的被称为原发性胶质母细胞瘤。原发性GBM可来源于生长过于迅速的分化好的胶质瘤，也可来源于伴有星形及少突胶质细胞分化倾向的Denovo原始肿瘤。少见的变异型GBM可分为巨细胞性胶质母细胞瘤、富脂质上皮样胶质母细胞瘤及胶质肉瘤三型。GBM是目前已发现的最普遍、最具侵袭性的原发性脑肿瘤。其发病率占具了颅内肿瘤的12％-15％和星型细胞肿瘤的50％-60％。罹患该肿瘤的患者中位数生存期约为15个月，5年生存率不到10％。因此，该肿瘤对人类生命健康构成了极大的威胁。虽然目前针对GBM的治疗方法有外科手术、放疗和化疗等手段，但由于该肿瘤向脑叶深部浸润生长，并具备生长迅速、易复发等特点，因此收效甚微，且容易对患者大脑造成难以恢复的二次伤害。

免疫治疗（immunotherapy）是指针对机体低下或亢进的免疫状态，人为地增强或抑制机体的免疫功能以达到治疗疾病目的的治疗方法。免疫治疗的方法有很多，适用于多种疾病的治疗。肿瘤的免疫治疗旨在激活人体免疫系统，依靠自身免疫机能杀灭癌细胞和肿瘤组织。肿瘤免疫治疗不会产生类似放化疗后的耐药性，而且疗效持久甚至有免疫记忆功能，还可以根据肿瘤患者特定的自身条件设计特异性的靶向治疗，契合精准治疗的理念。肿瘤免疫治疗主要包括单克隆抗体治疗、T细胞疗法、肿瘤疫苗疗法、细胞因子疗法等，其中单克隆抗体和T细胞疗法在肿瘤治疗中表现出的优越性使其越来越受到重视，有成为肿瘤一线治疗的潜力。

嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法是目前肿瘤免疫治疗研究的热门。CAR主要由2部分偶联形成，一段是能特异性结合肿瘤相关抗原的单链抗体(scFv)，以及一个能激活 T细胞发挥免疫效应功能的激活性受体。针对B细胞表面CD19抗原的CAR-T疗法在临床上治疗B细胞源性的血液肿瘤已经取得了巨大成功，但在治疗实体瘤的研究中却陷入挣扎，其中最主要的原因之一就是实体瘤具有高度异质性，缺乏一个稳定表达的肿瘤特异性抗原。尽管目前利用CAR-T疗法在针对GBM在内的诸多实体瘤的治疗中做了大量探索，但其效果并不理想。其中的主要原因在于：1.过继移植的CAR-T细胞在治疗中可能发生的脱靶效应；2.T细胞对实体肿瘤浸润性较差；3.T细胞难以穿透血脑屏障；4.实体肿瘤高度复杂性和厌氧的微环境等因素导致细胞毒性T细胞出现的难以恢复的耗竭。因此急需找到新的免疫细胞治疗替代方案。

HER2是表皮生长因子受体（ERBB）家族的一种膜结合酪氨酸激酶，它缺乏内源性的配体。HER2通过与ERBB家族其他成员的异源二聚作用，激活PI3K、MAPK、JAK/STAT等信号转导通路，促进细胞增殖和存活。HER2突变被认为是肿瘤发生的潜在驱动因素。它参与了多种肿瘤的发生和发展，如乳腺癌、卵巢癌、胃癌、骨肉瘤和成神经管细胞瘤。HER2作为GBM有效的免疫治疗靶点，在近80%的GBM患者中具有高表达，这提示着 HER2 可以作为胶质瘤主动靶向的作用靶点。

因此，挖掘肿瘤特异性抗原以探索新型有效的治疗靶点，是目前所有实体瘤包括乳腺癌、卵巢癌、GBM免疫治疗研究的难点与关键。巨噬细胞，这一类同样具有肿瘤细胞杀伤能力的非特异性免疫细胞，由于在过继性免疫系统和先天性免疫系统的相互作用中起着核心作用，且备较强的可塑性，易于突破血脑屏障，以及更有效的向肿瘤组织部位浸润并长时间驻存的特性，正在成为免疫细胞工程化改造的新选择。作为一种新的细胞免疫疗法，CAR-M具有其独特的优势，如促进抗原提呈能力、增强T细胞杀伤作用、吞噬肿瘤细胞作用，与CAR-T疗法相比，CAR-M疗法优势在于非肿瘤靶向毒性小、循环时间有限。CAR-M疗法在实体瘤治疗方面展现出应用前景，但受技术、研究水平限制，CAR-M疗法商业化水平低，行业发展面临着诸多技术挑战，如巨噬细胞扩增能力有限、巨噬细胞过度激活带来的毒副作用等。构建HER2的CAR-M针对实体瘤的治疗会更具有治疗前景，本领域需要开发新的针对实体瘤的治疗方法。

发明内容

鉴于现有技术存在的问题，在本发明中提供了一种新型的巨噬细胞治疗肿瘤策略，本发明设计的嵌合抗原受体由CD8跨膜区、抗人HER2单克隆抗体 (hHER2scFv)、CD32a-TM-ITAM胞内区结构串联构成。该嵌合抗原受体用于修饰单核/巨噬细胞，修饰后的单核/巨噬细胞(CAR-M)能用于HER2阳性的肿瘤的治疗。利用病毒系统将肿瘤相关嵌合抗原受体(anti-HER2scfv)融合，转导巨噬细胞/单核细胞，构建CAR-M。用特异性CARs修饰人巨噬细胞，以提高巨噬细胞对肿瘤的吞噬活性和抗原呈递能力。巨噬细胞属于单核-巨噬细胞系统，其可吞噬或降解胞内细菌、肿瘤细胞、死亡细胞等，在机体的免疫防御、免疫自稳、免疫监视中发挥着重要作用。CAR-M疗法是最具潜力的抗肿瘤前沿技术之一，其出现克服了CAR-T治疗的局限性，为治疗实体瘤开辟了新的可能性。通过其肿瘤相关嵌合抗原受体与乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、脑胶质瘤细胞等结合活化巨噬细胞，同时递呈肿瘤抗原，刺激T细胞活化，从而起到抗肿瘤的效果。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。

一种靶向HER2嵌合抗原受体(CAR)，所述CAR包含HER2抗原结合结构域scFv，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。

进一步地，所述的靶向HER2嵌合抗原受体还包括铰链区、跨膜区、胞内区，所述胞内区包括信号传导结构域和/或共刺激信号传导区，

和/或，所述的跨膜结构域为CD8跨膜结构域，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；

和/或，所述的胞内区为CD32a-TM-ITAM信号传导结构域，其氨基酸序列其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；

和/或，所述的共刺激信号传导区为CD28、CD137/4-1BB、CD27、CD134/OX40、ICOS信号传导结构域中的任意一种或至少两种的组合。

所述的靶向HER2嵌合抗原受体由CD8跨膜区、抗人HER2单克隆抗体、CD32a-TM-ITAM胞内区结构串联构成依次串联而成。

所述靶向HER2嵌合抗原受体具有SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO.8所示的氨基酸序列有85％以上的同源性的氨基酸序列，所述的氨基酸序列包含未突变或点突变的氨基酸序列。

一种由所述的靶向HER2嵌合抗原受体修饰的免疫细胞。

进一步地，所述的靶向HER2嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，其特征在于，所述的免疫细胞为T细胞、NK细胞、NKT细胞、B细胞、粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞或CIK细胞；

进一步地，所述的靶向HER2嵌合抗原受体修饰的免疫细胞由含有所述的靶向HER2嵌合抗原受体的核苷酸序列的病毒载体转染免疫细胞得到。

进一步地，所述病毒载体为逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体中的一种或几种。

一种核酸分子，所述核酸分子包括所述的嵌合抗原受体的编码基因。

一种表达载体，所述表达载体包括所述的核酸分子。

进一步地，所述表达载体为含有所述的核酸分子的慢病毒载体或腺病毒载体。

一种重组慢病毒或腺病毒，所述重组慢病毒或腺病毒由转染有所述的表达载体和辅助质粒的哺乳动物细胞制备得到。

一种由所述的靶向HER2嵌合抗原受体修饰的免疫细胞。

进一步地，所述的免疫细胞为T细胞、NK细胞、NKT细胞、B细胞、粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞或CIK细胞。

进一步地，所述的靶向HER2嵌合抗原受体修饰的免疫细胞由所述的靶向HER2嵌合抗原受体的核苷酸序列的病毒载体转染免疫细胞得到。

所述的靶向HER2嵌合抗原受体其基因组中整合有所述的核酸分子。

所述的靶向HER2嵌合抗原受体包括所述的表达载体和/或所述的重组慢病毒和/或腺病毒。

所述的靶向HER2嵌合抗原受体的制备方法，包括将所述的表达载体和/或所述的重组慢病毒和/或腺病毒导入免疫效应细胞的步骤。

所述的靶向HER2嵌合抗原受体修饰的免疫细胞的制备方法，具体包括如下步骤。

（1）合成跨膜表达蛋白或多肽大分子各个结构域的核酸序列。

（2）将目的片段与慢病毒或腺病毒过表达载体连接，获得重组质粒载体。

（3）重组质粒载体及辅助质粒载体的提取与制备。

（4）病毒包装。

（5）功能性细胞系的构建。

所述的靶向HER2嵌合抗原受体、所述的核酸分子、所述的表达载体、所述的重组慢病毒和/或腺病毒、所述的靶向HER2嵌合抗原受体修饰的免疫细胞、或所述方法制备的靶向HER2嵌合抗原受体修饰的免疫细胞在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

进一步地，所述的肿瘤为HER2阳性表达的肿瘤。

进一步地，所述的肿瘤为乳腺癌、卵巢癌、脑癌、头颈癌、黑色素瘤、间皮瘤中的一种或多种。

更优选地，所述脑癌选自脑胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、脑膜瘤、少突神经胶质瘤、神经胶质瘤中的一种或多种；所述乳腺癌为三阴乳腺癌，所述头颈癌为头颈鳞状细胞癌。

一种治疗肿瘤的药物，所述的药物包括所述的靶向HER2嵌合抗原受体、所述的核酸分子、所述的表达载体、所述的重组慢病毒和/或腺病毒、所述的靶向HER2嵌合抗原受体修饰的免疫细胞、或所述方法制备的靶向HER2嵌合抗原受体修饰的免疫细胞。

进一步地，所述的肿瘤为所述的肿瘤为HER2阳性表达。

进一步地，所述的药物采用静脉注射或者腹腔注射方式给药。

进一步地，所述的药物的给药对象为哺乳动物。

与现有技术比，本发明的有益效果如下。

本发明利用嵌合抗原受体修饰巨噬细胞技术来制备特异性靶向HER2的嵌合抗原受体修饰的工程免疫细胞，该制备方法步骤简单，获得的新型工程免疫细胞能特异识别衰老细胞，能更有效地靶向攻击细胞，并且可以用于制备抗肿瘤的产品，尤其是用于制备治疗HER2阳性肿瘤的药物。本发明有望用于制备抗肿瘤的产品，尤其是用于制备治疗抗胶质母细胞瘤的免疫细胞治疗药物，具有良好的产业应用前景。

附图说明

图1是构建的目的质粒结构示意图。

图2是巨噬细胞转导CAR后的效率评估结果，其中（A）荧光显微镜成像，（B）流式分析。其中（A）RNA-Seq聚类分析，（B）差异基因表达热图，发现CAR-M中高表达M1表型经典标记物、抗原递呈相关的MHCI/II基因和干扰素相关基因等。（C）qPCR验证M1表型的表面标记物高表达。备注：Macrophage -Ad5f35 （Ad）；Macrophage-Ad5f35-HER2（AdH）；Macrophage-Ad5f35-culture（AdC）；Macrophage（NC）。

图3是CAR-M 转录水平和极化表型验证结果。

图4是CAR-mBMDM对 4T1-HER2体外吞噬能力实验结果。

图5是CAR-hMDM vs SK-BR-3（HER2+）体外吞噬能力实验结果。

图6是RAW264.7-CAR-HER2 vs LN229的体外吞噬能力实验结果。

图7是对CAR-M浸润实体瘤能力的评估结果。

图8是对CAR-M杀伤实体瘤细胞能力的评估结果。

具体实施方式

为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。

本发明的一个方面提供靶向HER2的嵌合抗原受体(CAR)。嵌合抗原受体一般由胞外区、跨膜区和胞内区构成。胞外区包含抗原结合区，和任选的铰链区。胞内区包含一个或多个信号传导区，包括共刺激信号传导区。在细胞中表达时，嵌合抗原受体的多肽还可以包含信号肽，特别是膜定位信号肽。

在细胞中表达时，本发明的嵌合抗原受体的多肽可以包含多肽的N端处的信号肽（也称为信号序列）。一般而言，信号肽是使多肽靶向细胞中的所需部位的肽序列。在一些实施方案中，信号肽使多肽靶向细胞的分泌通路，并且将允许多肽整合和锚定至脂双层。

本发明的嵌合抗原受体包含靶向HER2的抗原结合区。抗原结合区可以是单价的或多价的（例如二价的）。抗原结合区还可以是单特异性的或多特异性的（例如双特异性的）。双特异性可以是针对HER2和另一种抗原，也可以是针对HER2的两种不同表位。

在一些实施方案中，本发明中使用的抗原结合区是上文描述的抗HER2抗体或抗原结合片段，特别是scFv形式的。

任选地，本发明的嵌合抗原受体包含位于胞外抗原结合区和跨膜区之间的铰链区。铰链区是通常在蛋白质的两个域之间存在的氨基酸区段，并且可以允许蛋白质的柔性和两个域的彼此相对运动。

铰链区可以是天然存在的蛋白质的铰链区或其部分。抗体（诸如IgG、IgA、IgM、IgE或IgD抗体）的铰链区也可用于本文所述的嵌合抗原受体。非天然存在的肽也可用作本文所述的嵌合抗原受体的铰链区。在一些实施方案中，铰链区是肽接头。在一些实施方案中，使用的铰链区来源于CD8α。在

本发明的嵌合抗体受体包含跨膜区。跨膜区可以形成α螺旋、多于一个α螺旋的复合物、β桶或能够跨域细胞磷脂双层的任何其它稳定结构。跨膜区可以是天然或合成来源的。跨膜区可源自CD3ε、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、细胞受体的α、β或ζ链。

在一些实施方案中，本发明中使用的跨膜区来源于CD8α。在一些实施方案中，CD8α跨膜区包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。

本发明的嵌合抗原受体包含胞内区。胞内区包含一个或多个信号传导区，包括共刺激信号传导区。

胞内信号传导区负责表达嵌合抗原受体的免疫效应细胞的至少一种正常效应子功能的活化。例如，细胞的效应子功能可以是细胞裂解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。虽然通常可以利用整个胞内信号传导区，但是在很多情况下，使用整个链是不必要的。就使用胞内信号传导区的截短部分而言，只要其转导效应子功能信号，就可以使用这种截短部分代替完整链。因此，胞内信号传导区包括足以转导效应子功能信号的胞内信号传导区的任何截短形式。在一些实施方案中，信号传导区来源于CD3ζ、FcRγ (FCER1G)、FcRβ(Fcε Rib)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。

在一些实施方案中，本发明中使用的信号传导区来源于CD32a-TM-ITM。在一些实施方案中，CD32a-TM-ITM信号传导区包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明的嵌合抗原受体的胞内区还包含一个或多个共刺激信号传导区。在抗原特异性信号的刺激以外，很多免疫效应细胞还需要共刺激来促进细胞增殖、分化和存活，以及活化细胞的效应子功能。“共刺激信号传导区”可以是共刺激分子的胞质部分。术语“共刺激分子”是指免疫细胞上的关联结合伴侣，该关联结合伴侣与共刺激配体特异性结合，从而由免疫细胞介导共刺激响应，诸如但不限于增殖和存活。共刺激信号传导区可源自CARD11，CD2，CD7，CD27，CD28，CD30，CD40， CD54，CD83，OX40，CD137，CD134，CD150，CD152，CD223，CD270，PD-L2， PD-L1，CD278，DAP10，LAT，NKD2C，SLP76，TRIM，FcεRIγ，MyD88，和41BBL的胞内信号区；和/或。

在一些实施方案中，本发明中使用的共刺激信号传导区来源于CD28和/或4-1BB。在一些实施方案中，本发明的嵌合抗原受体的胞内区包含以N端至C端方向连接的上文所述CD28共刺激信号传导区和/或4-1BB共刺激信号传导区和上文所述CD3ζ信号传导区。

本发明的一个方面提供至少一种多核苷酸，其特征在于编码依照本发明的嵌合抗原受体或多肽。本发明的一个方面提供一种载体，其特征在于包含依照本发明的多核苷酸。在一个实施方案中，所述载体为克隆载体或表达载体。在一个实施方案中，所述载体为病毒载体。

本发明的一个方面提供用于克隆和表达本发明的靶向HER2的嵌合抗原受体的载体。在一些实施方案中，载体适于在真核细胞（诸如哺乳动物细胞）中复制和整合。在一些实施方案中，载体是病毒载体。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、牛痘载体、单纯疱疹病毒载体及其衍生物。

已经开发了许多基于病毒的系统用于向哺乳动物细胞进行基因转移。在一些实施方案中，使用慢病毒载体。在一些实施方案中，使用自失活慢病毒载体。例如，携带嵌合抗原受体编码序列的自失活慢病毒载体可以使用本领域已知的方案包装。所得的慢病毒载体可用于使用本领域已知的方法转导哺乳动物细胞。来源于慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期、稳定整合以及它们在子代细胞中的繁殖。慢病毒载体也具有低免疫原性，并且可以转导非增殖性细胞。

本发明的一个方面提供经基因修饰改造，包含或表达本发明的靶向HER2的嵌合抗原受体的细胞，诸如免疫效应细胞。在一些实施方案中，所述免疫效应细胞是T细胞、NK细胞、外周血单个核细胞(PBMC)、巨噬细胞造血干细胞、多能干细胞或胚胎干细胞培养分化的细胞（例如免疫细胞）。在一些实施方案中，所述免疫效应细胞是自体的。在一些实施方案中，所述免疫效应细胞是同种异体的。

“免疫效应细胞”是可执行免疫效应功能的免疫细胞。在一些实施方案中，免疫效应细胞表达至少FcγRIII并执行ADCC效应子功能。介导ADCC的免疫效应细胞的实例包括外周血单个核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、巨噬细胞、细胞毒性T细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。

通过将嵌合抗原受体引入免疫效应细胞来制备经基因改造的免疫效应细胞。在一些实施方案中，通过转染包含编码嵌合抗原受体的序列的核酸或载体来将嵌合抗原受体引入免疫效应细胞。在一些实施方案中，通过将蛋白质插入细胞膜，同时使细胞通过微流控系统来将嵌合抗原受体引入免疫效应细胞。

将核酸或载体引入哺乳动物细胞的方法是本领域已知的。所述载体可以通过物理、化学或生物方法转入免疫效应细胞。用于将载体引入免疫效应细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质体转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等等。用于将核酸或载体引入免疫效应细胞的化学手段包括胶体分散体系，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球体、珠粒和基于脂质的体系（包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体）。用作体外递送媒介物的示例性胶体体系是脂质体（例如人工膜囊泡）。用于将核酸或载体引入免疫效应细胞的生物方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体已成为将基因插入哺乳动物，例如人细胞的最广泛使用的方法。

在一些实施方案中，转导的或转染的免疫效应细胞在引入核酸或载体之后离体繁殖。在一些实施方案中，进一步评估或筛选转导的或转染的免疫效应细胞以选择经改造的免疫效应细胞。

本发明的一个方面提供药物组合物，其包含本发明的一种或多种抗体或抗原结合片段、嵌合抗原受体或改造的免疫效应细胞，以及一种或多种药学上可接受的载剂。

药物组合物可以通过使具有所需纯度的活性药剂与任选的药学上可接受的载剂混合以冻干制剂或水溶液的形式制备。药学上可接受的载剂在所用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，并且包括缓冲剂、抗氧化剂、防腐剂、等渗剂、稳定剂、表面活性剂等。

为了使药物组合物可用于体内施用，它们必须是无菌的。可以通过无菌过滤膜过滤使药物组合物无菌。

药物组合物可以含有待治疗的具体适应症所需的多于一种活性药剂，优选地具有不会不利地互相影响的互补活性的那些。或者或此外，药物组合物还可包含细胞毒性剂、化学治疗剂、细胞因子、免疫抑制剂或生长抑制剂。此类分子以对于预期目的有效的量适当地联合存在。

本发明中所用的细胞系包括293FT细胞，其培养在含有10％FBS，1％glutamax,1％双抗的IMDM培养基里。WM-266-4,LN-229,U87-MG和MDA-MB-231细胞培养基为10％FBS的RPMI640或者DMEM中。GFP阳性的细胞由编码GFP的逆转录病毒转染制备，小鼠用的肿瘤细胞系由编码luciferase或者GFP-firefly luciferase(GFP-FFLuc)的慢病毒或逆转录病毒转染而成。

实施例1 HER2在肿瘤细胞系中的表达检测。

为了确定HER2抗原在肿瘤中的表达情况，首先选择了黑色素瘤(WM-266-4细胞系)、胶质瘤(LN229、GL261、U251、U87MG、细胞系)和乳腺癌(MDA-MB-231细胞系)的肿瘤细胞系来检测。同时，为了进一步验证HER2在原代脑胶质瘤中的表达，利用免疫组化的方法用HER2的抗体检测了包含多个病人脑胶质瘤组织以及正常组织的切片。

方法：收集肿瘤细胞后利用1×PBS洗三次，然后用HER2抗体在冰上染色30分钟，1×PBS洗后加入APC偶联的二抗，室温孵育20分钟，1×PBS洗后用流式细胞术检测HER2在肿瘤细胞上的表达。

免疫组化染色：石蜡切片经二甲苯脱蜡与酒精复水后，利用柠檬酸钠进行抗原修复。之后在血清中封闭1小时。HER2抗体染色在4℃过夜，然后由辣根过氧化酶偶联的二抗孵育30分钟。洗涤后用DAB显色，然后用苏木精染色。染色完成后在显微镜下观察拍照。

在检测的肿瘤细胞表明均有HER2的高表达。在所有的病人的脑胶质瘤样本中均检测到了不同程度的HER2的表达，而在正常脑组织中未见HER2的表达。这表明HER2是针对脑胶质瘤疗法的较好的靶点。

实施例2 靶向HER2嵌合抗原受体的构建。

本发明的靶向HER2嵌合抗原受体由单链抗体区、CD8α跨膜区和CD32a-TM-ITM胞内区组成。依次连接跨膜区SP(hCD8)、抗HER2 scFv、CD32a-TM-ITM胞内区的基因片段，所有序列都是人源化。结构示意图如图1所示。

HER2 scFv的序列如SEQ ID NO.1所示：GACATCCAGATGACCCAGTCTCCGTCTTCTCTGTCTGCTTCTGTTGGTGACCGTGTTACCATCACCTGCCGTGCTTCTCAGGACGTTAACACCGCTGTTGCTTGGTACCAGCAGAAACCGGGTAAAGCTCCGAAACTGCTGATCTACTCTGCTTCTTTCCTGTACTCTGGTGTTCCGTCTCGTTTCTCTGGTTCTCGTTCTGGTACCGACTTCACCCTGACCATCTCTTCTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCTACCTACTACTGCCAGCAGCACTACACCACCCCGCCGACCTTCGGTCAGGGTACCAAAGTTGAAATCAAAGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGAAGTTCAGCTGGTTGAATCTGGTGGTGGTCTGGTTCAGCCGGGTGGTTCTCTGCGTCTGTCTTGCGCTGCTTCTGGTTTCAACATCAAAGACACCTACATCCACTGGGTTCGTCAGGCTCCGGGTAAAGGTCTGGAATGGGTTGCTCGTATCTACCCGACCAACGGTTACACCCGTTACGCTGACTCTGTTAAAGGTCGTTTCACCATCTCTGCTGACACCTCTAAAAACACCGCTTACCTGCAGATGAACTCTCTGCGTGCTGAAGACACCGCTGTTTACTACTGCTCTCGTTGGGGTGGTGACGGTTTCTACGCTATGGACTACTGGGGTCAGGGTACCCTGGTTACCGTTTCTTCT。

SP(hCD8)的序列如SEQ ID NO.2所示：ATGGCCCTGCCTGTTACCGCCCTGTTGCTCCCTCTTGCCCTGCTGCTTCACGCCGCTCGCCCT。

CD32a-TM-ITM的序列如SEQ ID NO.3所示：GTGCCCAGCATGGGCAGCTCTTCACCAATGGGGATCATTGTGGCTGTGGTCATTGCGACTGCTGTAGCAGCCATTGTTGCTGCTGTAGTGGCCTTGATCTACTGCAGGAAAAAGCGGATTTCAGCCAATTCCACTGATCCTGTGAAGGCTGCCCAATTTGAGCCACCTGGACGTCAAATGATTGCCATCAGAAAGAGACAACTTGAAGAAACCAACAATGACTATGAAACAGCTGACGGCGGCTACATGACTCTGAACCCCAGGGCACCTACTGACGATGATAAAAACATCTACCTGACTCTTCCTCCCAACGACCATGTCAACAGTAATAACTAA。

得到的基因序列片段连接至通用腺病毒表达载体，得到能同时表达靶向HER2靶点CAR的质粒anti-CAR-HER2，然后克隆到腺病毒载体中。嵌合抗原受体由基因合成的方法产生，用EF1a启动子启动CAR序列的表达；CAR序列为依次连接SP(hCD8)、抗HER2 scFv、CD32a-TM-ITM序列片段所得。克隆完成后通过测序确认其序列的正确性。anti-HER2 CAR，核酸序列如SEQ ID NO.4所示: TCTAGAATGGCCCTGCCTGTTACCGCCCTGTTGCTCCCTCTTGCCCTGCTGCTTCACGCCGCTCGCCCTGAGCAGAAACTTATATCAGAGGAAGATCTGGAATTCGACATCCAGATGACCCAGTCTCCGTCTTCTCTGTCTGCTTCTGTTGGTGACCGTGTTACCATCACCTGCCGTGCTTCTCAGGACGTTAACACCGCTGTTGCTTGGTACCAGCAGAAACCGGGTAAAGCTCCGAAACTGCTGATCTACTCTGCTTCTTTCCTGTACTCTGGTGTTCCGTCTCGTTTCTCTGGTTCTCGTTCTGGTACCGACTTCACCCTGACCATCTCTTCTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCTACCTACTACTGCCAGCAGCACTACACCACCCCGCCGACCTTCGGTCAGGGTACCAAAGTTGAAATCAAAGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGAAGTTCAGCTGGTTGAATCTGGTGGTGGTCTGGTTCAGCCGGGTGGTTCTCTGCGTCTGTCTTGCGCTGCTTCTGGTTTCAACATCAAAGACACCTACATCCACTGGGTTCGTCAGGCTCCGGGTAAAGGTCTGGAATGGGTTGCTCGTATCTACCCGACCAACGGTTACACCCGTTACGCTGACTCTGTTAAAGGTCGTTTCACCATCTCTGCTGACACCTCTAAAAACACCGCTTACCTGCAGATGAACTCTCTGCGTGCTGAAGACACCGCTGTTTACTACTGCTCTCGTTGGGGTGGTGACGGTTTCTACGCTATGGACTACTGGGGTCAGGGTACCCTGGTTACCGTTTCTTCTCCTGCAGGAGTGCCCAGCATGGGCAGCTCTTCACCAATGGGGATCATTGTGGCTGTGGTCATTGCGACTGCTGTAGCAGCCATTGTTGCTGCTGTAGTGGCCTTGATCTACTGCAGGAAAAAGCGGATTTCAGCCAATTCCACTGATCCTGTGAAGGCTGCCCAATTTGAGCCACCTGGACGTCAAATGATTGCCATCAGAAAGAGACAACTTGAAGAAACCAACAATGACTATGAAACAGCTGACGGCGGCTACATGACTCTGAACCCCAGGGCACCTACTGACGATGATAAAAACATCTACCTGACTCTTCCTCCCAACGACCATGTCAACAGTAATAACTAAGCGGCCGC。

实施例3 表达靶向HER2的嵌合抗原受体巨噬细胞的制备。

1、利用实施例2的构建方法构建能靶向HER2的CAR质粒。

2、腺病毒制备。

将质粒Ad5F35-CAR-HER2酶切线性化（PacI），用琼脂糖凝胶电泳验证是否酶切成功；将酶切得到的质粒进行乙醇沉淀回收；转染前24h将293A细胞铺至六孔板中，转染时融合度70-80%，状态良好；用jetPRIME对293A细胞进行转染，4h后换液；观察细胞，当出现CPE效应收集细胞和上清，离心；细胞沉淀加适量培养基溶解，液氮/37℃水浴反复冻融3次，离心取上清，用0.45μm滤器过滤，-80℃保存；扩增腺病毒：用上述粗病毒感染新的293A细胞，收获粗病毒；腺病毒纯化：粗病毒经Capto core700和Capto Q ImpRes两步层析纯化；纯化腺病毒浓缩：用AKTAflux6切向流浓缩腺病毒，0.22μm滤器过滤除菌；检测腺病毒滴度，标记并存于-80℃。在制备得到病毒浓缩液后，对病毒滴度进行测定，具体如下：1)取生长状态良好的293T细胞，加入1ml胰酶消化细胞，直至细胞刚有脱落，消化后计数，按5×10⁵细胞/孔将细胞均匀铺至24孔细胞培养板，37℃含5％CO₂培养箱培养6～10h至细胞贴壁。2)向24孔板中细胞培养上清中分别加入0.1μL、0.5μL、1μL浓度的病毒浓缩液，并设置1个阴性对照，轻轻拍打24孔板边缘，使病毒液与培养液混合均匀，于培养箱中37℃含5％CO₂培养箱感染48h。3)感染48h后，加入1ml胰酶消化细胞消化，直至细胞刚有脱落，收集细胞，标准流式细胞术检测阳性细胞百分比，并根据以下公式计算病毒滴度，单位为TM/mL：T＝(铺板时细胞数×阳性细胞百分比×1000)/加入的病毒液体积(μL)。

3、腺病毒感染巨噬细胞。

PBMC细胞制备：（1）以采血量为120mL为例，准备10个高效离心管，分别加入13.5mL淋巴细胞分离液，以200g、1min离心，离心后吸出多余试剂。（2）采血袋经碘伏消毒后将外周血转移至50mL离心管中，外周血进行稀释(外周血:0.9%氯化钠注射液=1:1)，取稀释后的外周血加入准备好的高效离心管中，每管25mL，以600g、20min、20℃(升降速调至最低）离心。取白膜层至50mL离心管中(建议将高效离心管隔板上层所有液体吸出) ，以600g、5min离心；离心后的细胞沉淀加45mL 0.9%氯化钠注射液重悬，以600g、5min离心。两次清洗离心得到PBMC，并留样进行计数。

PBMC磁珠分选：（1）分选Buffer配制：准备PBS（pH 7.2），0.5% BSA和2mM EDTA；4℃保存。（2）PBMC用10mL PBS重悬，用巴氏细胞反复吹打，过40μm细胞筛网，去除大细胞团，转移到至15mL离心管，300g离心10min，弃上清。（3）得到的细胞沉淀用分选Buffer重悬（Buffer所用体积为10⁷个细胞/80μL），再加入MicroBeads（MicroBeads所用体积为107个细胞/20μL），吹打混匀，4℃、避光孵育15min。（4）孵育结束，向离心管中加入分选Buffer（Buffer所用体积为10⁷个细胞/1-2mL），吹打洗涤细胞，300g离心10min，弃上清。（5）加入500 μL Buffer重悬。（6）分选柱分选：将分选柱安装在分选器上，先加入500μL 分选Buffer润洗分选柱，注意不要造成肉眼可见的气泡，以免堵塞柱子；流空后，悬空加入样本，此时被磁珠标记的阳性细胞会滞留在柱子上；流完后，加入500μL Buffer清洗分选柱，重复3次，注意前一次液体快流空时再进行下一次清洗，尽量不要挂壁。（7）洗脱目的细胞：待最后一次清洗Buffer流空后，将分选柱放在一个新的阳性收集管（15ml离心管）上，加入1mL Buffer到分选柱中，用活塞快速推下去，此时阳性管中即为目的细胞。（8）分选之后的细胞，用血细胞分析仪计数，计算分选得率。（9）300g离心10min，弃上清，加入含有细胞因子的RPMI-1640完全培养基重悬细胞沉淀，接种至培养皿中。分选得到的细胞，用血细胞计数仪计数，计算分选得率，将细胞接种至培养板/皿，（RPMI-1640+10%FBS+1%P/S+100 ng/ml M-CSF）。进行磁珠分选后的单核细胞CD14阳性细胞率为97.84%。

加入腺病毒感染前（细胞状态：瓶/皿/袋），弃细胞上清，用PBS洗一次，更换新鲜的含有M-CSF（100ng/ml）的RPMI-1640完全培养基；按照一定的MOI值（MOI=1000），向培养皿（规格）中加入一定量的病毒，“十字”摇晃混匀，置于二氧化碳培养箱（37℃）中培养；48h后，根据载体情况：有荧光，在荧光显微镜下观察荧光情况，荧光超过50%；无荧光有标签，WB评估；流式收集细胞，

利用流式细胞术对CAR的表达以及巨噬细胞细胞的病毒感染效率进行检测。CAR成功表达在巨噬细胞的细胞表面。镜下能观察到显著的红色荧光（mCherry）。当MOI=1000时，HER2-CAR感染人巨噬细胞的效率为37.42%~48.95%，并且随时间的延长感染效率增大。

腺病毒（CAR）转染293T和单核/巨噬细胞进行Western blot验证，均能检测到myc蛋白表达。

4、腺病毒转染RAW效率及WB检测。

RAW细胞感染表达有Ad5F35-mCherry、Ad5F35-CAR- HER2-mCherry病毒，感染后，观察荧光表达以及流式分析效率。当腺病毒感染两天后，出现荧光，Ad5f35+/-CAR转染RAW264.7细胞48h在镜下即可观察到明显的红色荧光。流式检测腺病毒转染效率。

5、CAR-M的极性表型验证实验。

验证巨噬细胞感染腺病毒Ad5F35HER2-CAR后对巨噬细胞极化表型的影响；实验中将转导有工程化的CAR的巨噬细胞，进行RNA-seq高通量测序和qPCR检测，验证M1和M2型转录组水平的变化，如图3所示，实验结果表明Ad5F35HER2-CAR可以将巨噬细胞重编程至M1状态。将成熟的巨噬细胞（1×10⁷个细胞）加入细胞培养皿中，分别加入Ad5F35-HER2 CAR腺病毒和对照病毒，转导48h后，采集各组细胞用于流式检测，进行转导效率的评估，RNA-seq和qPCR分析。巨噬细胞细胞转导CAR后的效率评估如图2所示，将携带有mcherry荧光标签的CAR转导至Macrophage细胞中48h，效率能达到80~90%，说明CAR-M转导成功。

实施例4 CAR-M对肿瘤的体外吞噬实验。

1、CAR-mBMDM vs 4T1-HER2体外吞噬。

样本：小鼠骨髓来源巨噬细胞。培养条件：DMEM (Corning)+10%FBS (ExCell)+1%P/S (TBD)+10ng/ml human M-CSF/mouse GM-CSF (PeproTech)，培养时间：7天。细胞处理：培养第5天，根据MOI=1000加入纯化的Ad5f35空载和HER2-CAR腺病毒感染；感染48h，进行体外吞噬。体外吞噬条件：mBMDM（红色-APC），4T1（绿色-FITC）；E:T=1:4；共培养时间3h。结果如图4所示，镜下可以观察到吞噬现象（黄色部分）。M-CSF诱导的BMDM经过HER2-CAR腺病毒感染后对4T1-HER2细胞的吞噬效果表现出CAR的靶向性（49.46%，25.45%）。

2、CAR-hMDM vs SK-BR-3（HER2+）体外吞噬。

样本：新鲜外周血分离的PBMC，经过CD14 Microbeads分选。培养条件：RPMI-1640(Corning)+10%FBS (ExCell)+1%P/S (TBD)+10ng/ml humanM-CSF (PeproTech)，培养时间：7天。细胞处理：培养第5天，根据MOI=1000加入纯化的Ad5f35空载和HER2-CAR腺病毒感染；感染48h，进行体外吞噬体外吞噬条件：人巨噬细胞（红色-APC），SK-BR-3（绿色-FITC）；E:T=1:4；共培养时间3h。结果如图5所示，镜下可以观察到吞噬现象（黄色部分）。M-CSF诱导的巨噬细胞经过HER2-CAR腺病毒感染后对SK-BR-3(HER2+)细胞的吞噬效果表现出CAR的靶向性（51.38%，36.41%）。

3、体外评估CAR-M杀伤GBM细胞系的能力。

将RAW和RAW-CAR- HER2，RAW-Ad5f35空载计数1×10⁵铺板并将RAW-CAR- HER2和RAW-空载组加入腺病毒(100μl)，可以多铺一个孔用做计数。腺病毒感染24小时之后将所有孔进行1:2传代(共48小时)，第二天进行实验。将六孔板中贴壁的 RAW进行计数后染色，RAW、RAW-CAR- HER2和RAW-空载直接用CelITracker DeepRed染色，工作液浓度为1.0 μlCellTracker DeepRed in 2ml 1640无血清培养基/孔(30min,37℃，避光孵育)，弃上清，用无血清1640洗涤一次。靶细胞LN229染色：将靶细胞用胰蛋白酶消化，完全培养基中和，离心得到细胞沉淀，用2mI PBS重悬，计数。取4倍于RAW的靶细胞LN229 (E:T=l:3) 至新15mL离心管中用PBS补齐至2mL，加入2L CellTracker Green (工作浓度 1.0μM，原液1mM，工作浓度0.5~1uM，10⁶细胞 1uL染色液)，37℃培养箱中，避光孵育 30 min 。染色孵育结束，4000rpm 离心 5min ，用PBS洗一次，弃上清，用无血清的1640重悬备用。取4倍的靶细胞 (E:T=1:4) 接种至吞噬细胞的六孔板中，37°C培养箱避光共培养3h。共培养结束，将用于拍照的六孔板细胞弃上清，用1%的多聚甲醛处理 (4%的多聚甲醛用PBS稀释后，取500μl稀释细胞，荧光显微镜下10X和20X拍照记录 (镜检)。共培养结束，将用于流式分析的六孔板弃上清，加入胰蛋白酶消化，完全培养基中和，离心收集细胞沉淀，用 PBS 洗一次9.500uLPBS(或者PBS加1%的多聚甲醛) 重悬上机，进行流式分析。结果如图6所示。

实施例5 CAR-M浸润实体瘤能力的评估。

将绿色荧光蛋白GFP标记的巨噬细胞或CAR-M细胞，添加到SKOV3人卵巢癌肿瘤细胞3D 肿瘤模型，共培养48h。结果如图7所示，95%的CAR-M细胞集中浸润到实体瘤模型中，而对照组的巨噬细胞则比较分散，表明CAR-M对于实体肿瘤有更强的靶向浸润能力。

实施例6 CAR-M杀伤实体瘤细胞能力的评估。

LDH (Lactate Dehydrogenase，乳酸脱氢酶），是稳定的胞内酶，存在所有的细胞中，当细胞膜受损时快速释放到细胞培养液中。若测得细胞培养液中的LDH浓度较高，则表明细胞损伤程度较重。在细胞接种后的第48h取细胞培养上清液进行LDH检测。结果如图8所示，相较于巨噬细胞，CAR-M对实体瘤细胞有更强的杀伤能力GBM模型体内CAR-M抗肿瘤能力。

ATP（Adenosine Triphosphate，三磷酸腺苷），是活细胞胞内最基本的能量来源，当细胞死亡时，ATP迅速水解，ATP浓度下降。因此，测定细胞内源性ATP的含量，可以反映细胞的活性和活细胞数量。若测得细胞内源性ATP浓度较低，则表明细胞死亡较多。在细胞接种后的第48h取细胞样本进行ATP检测。结果如图8所示，相较于巨噬细胞，CAR-M对实体瘤细胞有更强的杀伤能力。通过对细胞活力（ATP）和细胞损伤（LDH）的检测，相较于巨噬细胞，CAR-M对3D NAC-Organ有更强的杀伤能力。

Claims

1. 一种靶向HER2嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包含HER2抗原结合结构域scFv，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。

2.如权利要求1所述的靶向HER2嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体还包括铰链区、跨膜结构域、胞内结构域，所述胞内结构域包括信号传导结构域和/或共刺激信号传导区，

和/或，所述的跨膜结构域为CD8α跨膜结构域，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；

和/或，所述的信号传导结构域为CD32a-TM-ITAM信号传导结构域，其氨基酸序列如SEQID NO:7所示；

3.如权利要求1所述的靶向HER2嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体由HER2抗原结合结构域、CD8跨膜结构域、以及CD32a-TM-ITAM信号传导结构域依次串联而成。

4.如权利要求1所述的靶向HER2嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体具有SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列有85％以上的同源性的氨基酸序列，所述的氨基酸序列包含未突变或点突变的氨基酸序列。

5.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括权利要求1-4任一所述的嵌合抗原受体的编码基因。

6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括权利要求5所述的核酸分子。

7.如权利6所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为含有权利要求5所述的核酸分子的慢病毒载体或腺病毒载体。

8.一种重组慢病毒或腺病毒，其特征在于，所述重组慢病毒或腺病毒由转染有权利要求6或7所述的表达载体和辅助质粒的哺乳动物细胞制备得到。

9.一种由权利要求1-4任一所述的靶向HER2嵌合抗原受体修饰的免疫细胞。

10.如权利要求9所述的靶向HER2嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，其特征在于，所述的免疫细胞为T细胞、NK细胞、NKT细胞、B细胞、粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞或CIK细胞。

11.如权利要求9所述的靶向HER2嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，其特征在于，所述的靶向HER2嵌合抗原受体修饰的免疫细胞由含有权利要求1-4任一所述的靶向HER2嵌合抗原受体的核苷酸序列的病毒载体转染免疫细胞得到。

12.如权利要求9所述的靶向HER2嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，其特征在于，所述病毒载体为逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体中的一种或几种。

13.如权利9所述的靶向HER2嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，其特征在于，其基因组中整合有权利要求5所述的核酸分子。

14.如权利9所述的靶向HER2嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，其特征在于，包括权利要求6或7所述的表达载体和/或权利要求8所述的重组慢病毒和/或腺病毒。

15.如权利9所述的靶向HER2嵌合抗原受体修饰的免疫细胞的制备方法，其特征在于，包括将权利要求6或7所述的表达载体和/或权利要求8所述的重组慢病毒和/或腺病毒导入免疫效应细胞的步骤。

16.权利要求1-4任一所述的靶向HER2嵌合抗原受体、权利要求5所述的核酸分子、权利要求6或7所述的表达载体、权利要求8所述的重组慢病毒和/或腺病毒、权利要求9-14任一所述的靶向HER2嵌合抗原受体修饰的免疫细胞、或权利要求15的方法制备的靶向HER2嵌合抗原受体修饰的免疫细胞在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

17.如权利要求16所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤为HER2阳性表达的肿瘤。

18.如权利要求17所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤选自乳腺癌、卵巢癌、脑癌、头颈癌、黑色素瘤、间皮瘤中的一种或多种。

19.如权利要求18所述的应用，其特征在于，所述脑癌选自脑胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、脑膜瘤、少突神经胶质瘤、神经胶质瘤中的一种或多种；所述乳腺癌为三阴乳腺癌，所述头颈癌为头颈鳞状细胞癌。

20.一种治疗肿瘤的药物，其特征在于，所述药物包括权利要求1-4任一所述的靶向HER2嵌合抗原受体、权利要求5所述的核酸分子、权利要求6或7所述的表达载体、权利要求8所述的重组慢病毒和/或腺病毒、权利要求9-14任一所述的靶向HER2嵌合抗原受体修饰的免疫细胞、或权利要求15的方法制备的靶向HER2嵌合抗原受体修饰的免疫细胞。

21.如权利要求20所述的治疗肿瘤的药物，其特征在于，所述的肿瘤为HER2阳性表达。