CN114699506A

CN114699506A - 重组钙网蛋白在生发、育发、保护毛发或防脱发中的用途和相关产品

Info

Publication number: CN114699506A
Application number: CN202111668170.3A
Authority: CN
Inventors: 孙成龙; 魏东东; 喻倩; 王毅; 贺改英; 崔俊生; 李翛然
Original assignee: Beijing Biohelix Biotech Co ltd
Current assignee: Beijing Biohelix Biotech Co ltd
Priority date: 2021-12-30
Filing date: 2021-12-30
Publication date: 2022-07-05
Also published as: EP4458368A4; US20250000944A1; EP4458368A1; CN116440250A; WO2023125600A1

Abstract

本发明公开了重组钙网蛋白(Calreticulin，CRT)在生发、育发、保护毛发或防脱发中的用途和相关产品。该重组蛋白来源于钙网蛋白全长或其片段，通过注射或涂抹外用具有治疗脱发、改善毛发的功能。因此，钙网蛋白有望被开发为治疗脱发、改善毛发的有效方法和手段。

Description

重组钙网蛋白在生发、育发、保护毛发或防脱发中的用途和相关产品

技术领域

本发明属于蛋白质药物领域，属于医药生物技术领域，具体涉及重组钙网蛋白在生发、育发、保护毛发或防脱发中的用途和相关产品。

背景技术

脱发是临床上常见疾病，而脱发的病因尚未完全明晰，可能与免疫情况、遗传原因、激素水平、局部炎症反应、神经和环境因素相关。常见的脱发类型包括：雄性激素脱发(Androgenetic alopecia,AGA)、斑秃、休止期脱发、老年性脱发等，其中AGA是发病率最高的脱发类型。文献报道，30岁男性中 AGA的发病率为30％，50岁男性中AGA患病率高达50％，70岁以上男性和女性中AGA患病率分别为80％和53％。文献报道，中国AGA的发病率男性为21.3％，女性6.0％。已被美国FDA批准用于治疗脱发药物仅有非那雄胺和米诺地尔。然而，这两种药物的临床疗效不尽如人意，并且有一定的副作用。因此迫切需要安全高效的新药和治疗方法。

钙网蛋白(Calreticulin，CRT)最早被发现于细胞内质网(ER)内，进化过程中高度保守。CRT属于热休克蛋白家族，主要存在于内质网，具有多种生物学功能。CRT是一个Ca²⁺结合蛋白，人源CRT分子量约为46kDa，分为N、 P、C三个结构域。N区和P区连接部位为该蛋白发挥分子伴侣功能的重要区域；P区，对钙离子有高亲和力，但结合的量比较少；C区则相反，对钙离子亲和力低，但容量很大，被认为是细胞内的“钙库”。近年来的研究表明，CRT 还存在于内质网以外并发挥着重要的生物学功能，诸如参与适应性免疫的抗原加工和递呈、抗肿瘤免疫应答、介导凋亡细胞的吞噬、细胞的粘附和迁移以及免疫细胞的增殖和活化等。后来研究发现CRT还存在于细胞基质以及几乎所有的免疫细胞膜上，包括单核/巨噬细胞，中性粒细胞，T细胞以及DC细胞表面，在细胞活化和清除凋亡细胞以及肿瘤细胞中发挥重要的作用。钙离子是细胞内重要的第二信使，胞内钙离子浓度的变化对细胞的许多功能都产生重要的影响，包括各类细胞活性物质的分泌、肌肉的收缩舒张、蛋白的修饰以及基因表达等。内质网是大部分蛋白折叠、修饰、和装配的重要场所。在蛋白的合成过程中，不可避免的会有错误折叠的情况发生。此时，钙网蛋白可作为分子伴侣在各种酶的作用下完成蛋白修复。CRT还能和钙联蛋白结合，共同对未正常合成的糖蛋白就行修复。

目前，尚未有任何文献及相关报道揭示CRT在生发、改善毛发方面的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供涉及的钙网蛋白，编码该蛋白的DNA序列，含有该DNA序列的载体或质粒、宿主细胞，用基因工程制备该蛋白的方法，以及该蛋白在生发、育发、防脱发、促进或保护毛发生长等方面中的应用。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开了钙网蛋白(Calreticulin，CRT)在生发、育发、保护毛发或防脱发中的用途。

优选地，所述钙网蛋白CRT是重组表达的CRT全长蛋白(1-400aa)，为rh- CRT-1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，或者，与如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相似度至少为85％的蛋白。

优选地，所述钙网蛋白CRT是包含重组表达的CRT片段的蛋白(片段1- 349aa)，为rh-CRT-2，其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，或者，与如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列相似度至少为85％的蛋白。

优选地，所述钙网蛋白CRT是包含重组表达的CRT片段的蛋白(片段1- 291aa)，为rh-CRT-3，其氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，或者，与如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列相似度至少为85％的蛋白。

本发明公开的一种与生发、育发、保护毛发或防脱发相关的重组蛋白，所述重组蛋白为rh-CRT-1、rh-CRT-2或rh-CRT-3，rh-CRT-1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，rh-CRT-2的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，rh-CRT-3的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。

进一步地，编码上述的与生发、育发、保护毛发及防脱发相关的重组蛋白的基因，其特征在于，编码rh-CRT-1的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，编码 rh-CRT-2的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，编码rh-CRT-3的核苷酸序列如 SEQ ID NO:11所示。

本发明还公开了一种质粒，含有上述的与生发、育发、保护毛发或防脱发相关的重组蛋白的基因。

本发明还公开了一种载体，以上述的与生发、育发、保护毛发或防脱发相关的重组蛋白的基因作为活性成分。

本发明公开了上述的重组蛋白、质粒或载体在制备生发、育发、保护毛发或防脱发的药物或医疗器械中的应用。

优选地，所述的药物为改善毛干、毛小皮状态的药物。

优选地，所述的药物为增加皮肤毛囊数量的药物。

优选地，所述的药物为通过降低雄性激素含量促进毛发生长的药物。

进一步优选地，所述雄性激素为双氢睾酮。

本发明还公开了一种具有生发、育发、保护毛发或防脱发功能的产品，其活性成分为上述的重组蛋白、基因、质粒或载体；

所述产品的用途至少包括下述用途中的一种：

a)改善毛发顺滑程度；

b)增多毛发量；

c)促进毛发生长；

所述产品为药物、添加剂或活性成分剂。

本发明还公开了一种具有生发、育发、保护毛发或防脱发功能的药物，由权上述的重组蛋白、基因、质粒或载体和药学上可添加的辅料组成。

优选地，所述的辅料包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体和润滑剂中的一种或多种。

优选地，所述药物能够通过注射、喷射、渗透、吸收，以及物理或化学介导的方法导入机体组织中；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。

优选地，所述药物为外用制剂。

本发明还公开了钙网蛋白CRT在制备治疗痤疮或青春痘或斑秃的药物或器械中的应用。

优选地，所述钙网蛋白CRT是重组表达的CRT全长蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示，或者，与如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相似度至少为85％的蛋白。

优选地，所述钙网蛋白CRT是包含重组表达的CRT片段的蛋白，其氨基酸序列如SEQID NO:9所示，或者，与如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列相似度至少为85％的蛋白。

优选地，所述钙网蛋白CRT是包含重组表达的CRT片段的蛋白，其氨基酸序列如SEQID NO:12所示，或者，与如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列相似度至少为85％的蛋白。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明首次公开了钙网蛋白(Calreticulin，CRT)在生发、育发、保护毛发或防脱发方面的用途，进一步本发明首次公开了具有上述生发、育发、保护毛发或防脱发功能的重组蛋白，并明确了该重组蛋白的制备方法及应用，该蛋白来源于钙网蛋白或其片段，与上述重组蛋白序列相似度达到95％、90％或85％的蛋白，均具备生发、育发、保护毛发或防脱发的功能。本发明通过充分的实验验证，本发明公开的重组蛋白通过注射或涂抹外用具有治疗脱发、改善毛发的功能。因此，CRT蛋白有望被开发为治疗脱发、改善毛发的有效方法和手段。

附图说明

图1为pPICZ_αA-rh-CRT-1质粒图谱；

图2为pPICZ_αA-rh-CRT-1质粒酶切(Xho I/Not I)电泳结果；分子量标准单位：bp；

图3为蛋白rh-CRT-1SDS-PAGE电泳图；

图4为pET42a-rhCRT-2质粒图谱；

图5为pET42a-rhCRT-2质粒酶切(Nde I/Xho I)电泳结果；分子量标准单位： bp；

图6为蛋白rh-CRT-2SDS-PAGE电泳图；

图7为pET42a-rhCRT-3质粒图谱；

图8为pET42a-rhCRT-3质粒酶切(Nde I/Xho I)电泳结果；分子量标准单位： bp；

图9为蛋白rh-CRT-3SDS-PAGE电泳图；

图10为正常对照组(皮肤镜观察)；

图11为模型组(皮肤镜观察)；

图12为实验A组(皮肤镜观察)；

图13为实验B组(皮肤镜观察)；

图14为阳性对眼组——米诺地尔(皮肤镜观察)；

图15为阳性对照组——非那雄胺(皮肤镜观察)；

图16为正常对照组(扫描镜观察)；

图17为模型组(扫描镜观察)；

图18为实验A组(扫描镜观察)；

图19为实验B组(扫描镜观察)；

图20为阳性对照组——米诺地尔(扫描镜观察)；

图21为阳性对照组——非那雄胺(扫描镜观察)；

图22为小鼠各组毛发生长情况

图23为皮肤镜观察小鼠各组情况；

图24为小鼠各组颜色观察仪检测结果；

图25为实验各组扫描电镜照片；

图26为实验各组对雄激素脱发小鼠毛囊数量的影响；其中，(a)实验C组与D组对雄激素脱发小鼠毛囊的病理切片图；(b)实验C组与D组对雄激素脱发小鼠毛囊数量的影响；

图27为实验C组与D组对雄激素脱发小鼠血清和皮肤组织激素的影响。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

下面结合附图对本发明做进一步详细描述：

1.重组人钙网蛋白(Calreticulin，rh-CRT)的表达与纯化

人钙网蛋白基因(CRT，GenBank:M84739.1)1958bp，编码417个氨基酸，其中，1-17位氨基酸为信号肽，成熟多肽(18-417位氨基酸)的序列如SEQ ID NO:1所示；成熟多肽的基因序列如SEQ ID NO:2所示。

1.1 rh-CRT-1克隆与表达

以全基因合成的SEQ ID NO:2基因为模版，以pFcrt-1/pRcrt-1为上下游引物，PCR扩增基因，上游引入XhoI酶切位点，下游引入his-tag(his-his-his-his- his-his)序列及NotI酶切位点。

pFcrt-1引物：

5’-CTCTCTCGAGAAAAGAGAGCCTGCCGTCTACTTCAAG-3’(SEQ ID NO:3)

pRcrt-1引物5’- GTAAGCGGCCGCCTAATGATGATGATGATGATGCAGCTCGTCCTTGGCCTG -3’(SEQ ID NO:4)

使用Thermo Scientific公司的高保真DNA聚合酶Phusion，按98℃10秒，55℃30秒，72℃60秒，30个循环；72℃保持10分钟进行聚合酶链式反应(PCR)。将所得的PCR产物(约1250bp)纯化后用XhoI/NotI双酶切后插入质粒 pPICZ_αA(Invitrogen公司产品)中，转化感受态大肠杆菌TOP10，在含抗生素 Zeocin(Invitrogen公司产品)的LB培养基上挑选阳性克隆。提取质粒，测序验证正确，将该质粒命名为pPICZ_αA-rh-CRT-1，质粒图谱如图1所示、酶切结果如图2所示。pPICZ_αA-rh-CRT-1经SacI酶切线性化后，通过电击转化毕赤酵母GS115菌，在含抗生素Zeocin(100μg/ml)的YPD平板上挑选阳性克隆。挑选20个阳性克隆，分别接种含50ml BMGY培养基的小三角瓶中，30℃200RPM 培养至OD₆₀₀＝1.5左右，培养液离心收集菌体，菌体用100ml的BMMY液体重悬后转移到500ml的大三角瓶中，30℃200RPM继续培养，使用终浓度为0.5％的甲醇诱导表达，在0h,24h,48h,72h,96h分别取培养液1.0ml，离心后取上清用SDS-PAGE检测目标蛋白表达量。选取表达量高的克隆，用5L发酵罐发酵72h, 离心收取上清液。

其中培养基配方如下：

LB液体培养基配方：蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，氯化钠5.0g，加纯化水至1.0L，调pH值为7.2，分装到三角瓶中，121℃高压灭菌20分钟。

LB固体体培养基配方：蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，氯化钠5.0g，琼脂粉 15.0g，加纯化水至1.0L，调pH值为7.2，分装到三角瓶中，121℃高压灭菌20 分钟。

YPD培养基配方：蛋白胨20.0g，酵母粉10.0g，葡萄糖20.0g，琼脂粉15.0g，加纯化水至1.0L，分装到三角瓶中，115℃高压灭菌20分钟。

BMGY培养基配方：蛋白胨20.0g，酵母粉10.0g，磷酸二氢钾11.8g，三水合磷酸氢二钾3.0g，甘油10.0mL,加纯化水900mL，115℃高压灭菌20分钟。冷却后加入除菌过滤的100mL浓度为13.4％的YNB溶液和除菌过滤的2.0mL 浓度为0.02％的生物素溶液。

BMMY培养基配方：蛋白胨20.0g，酵母粉10.0g，磷酸二氢钾11.8g，三水合磷酸氢二钾3.0g，加纯化水800mL，115℃高压灭菌20分钟。冷却后加入除菌过滤的100mL浓度为13.4％的YNB溶液和除菌过滤的2.0mL浓度为 0.02％的生物素溶液以及100mL浓度为5.0％甲醇溶液5.0ml。

1.2 rh-CRT-1蛋白的纯化

取上步中表达上清1.0L，用1.5L的20mM pH7.5的Tris-HCl缓冲液稀释后，用AKTApurifier 100系统上样，层析柱选用GE公司的XK16/20型号层析柱，填料选用GE公司的Nisepharose 6FF 20ml,用含100mM咪唑20mM pH7.5 的Tris-HCl缓冲液冲洗，用25mM EDTA溶液洗脱，收集蛋白峰。蛋白峰用截留分子量为5kDa的超滤离心管浓缩，用AKTA purifier100系统上样，层析柱选用GE公司和XK16/100，填料选用GE公司的Sephactyl S-200,层析柱装填95cm高度，用含0.5％NaCl的10mM pH7.2的PB缓冲液洗脱，收集蛋白峰。蛋白溶液即为rh-CRT-1，SDS-PAGE电泳如图3所示。

1.3 rh-CRT-2克隆与表达

为了在原核系统中进行蛋白质表达，对SEQ ID NO:2的基因序列进行密码子优化，基因序列如SEQ ID NO:5所示，通过全基因合成亚克隆(BamH I/Xho I 之间)到pET28a质粒(Novagen公司产品)中，质粒命名为pET28a-MCRT。

以pET28a-MCRT为模版，以pFcrt-2/pRcrt-2为上下游引物，PCR扩增基因，上游引入NdeI酶切位点，下游引入XhoI酶切位点。

pFcrt-2引物5’-GTTCATATGGAACCGGCAGTGTATTTTAAG-3’(SEQ ID NO:6)

pRcrt-2)引物5’-GTGCTCGAGACGCTGTTCTTCATCCTGTTTATC-3’ (SEQ ID NO:7)

rh-CRT-2对应CRT基因序列如SEQ ID NO:8所示，蛋白序列如SEQ ID NO:9所示。

使用Thermo Scientific的高保真DNA聚合酶Phusion按98℃10秒，55℃ 30秒，72℃60秒，30个循环；72℃保持10分钟进行PCR。将所得的PCR 产物(约1060bp)纯化后用NdeI/XhoI双酶切后插入质粒pET42a(Novagen公司产品)中，转化感受态大肠杆菌TOP10，在含卡那霉素的LB培养上挑选阳性克隆。测序正确后提取质粒，质粒命名为pET42a-rh-CRT-2，质粒图谱如图4 所示，质粒酶切图如图5所示。pET42a-rh-CRT-2转化感受态BL21(DE3)(Thermo Scientific公司产品)。在含硫酸卡那霉素(50μg/ml)的LB平板上挑选阳性克隆。取pET42a-rh-CRT-2转化获得的BL21(DE3)阳性克隆，接种6.0ml含50μg/ml 硫酸卡那霉素的LB液体培养基，37℃220RPM震荡培养约3小时；取2.0ml菌液接种于1.0L的三角瓶中，其中含终浓度50μg/ml硫酸卡那霉素的200ml LB 无菌培养基。继续37℃220RPM震荡培养3h，直到OD₆₀₀约为1.0左右，再按1.0％接种量接种到6个5L灭菌三角瓶中，其中每个三角瓶中含1.0L的LB培养基，30℃220RPM继续震荡培养，当OD₆₀₀＝0.8左右时，加入1.0M的IPTG(AMRESCO公司产品)使其终浓度为0.5mM，温度调整为28℃，继续培养6 小时，然后离心收集菌体。

1.4 rh-CRT-2蛋白纯化

取1.3中收集的菌体10g，按1:20(g/g)加入20mM pH＝7.5的Tris-HCl缓冲液，冰水浴中进行超声波破菌，离心收集上清。上清用AKTA purifier 100系统上样，层析柱选用GE公司的XK16/20型号层析柱，填料选用GE公司的Ni sepharose 6FF 10ml,用含100mM咪唑20mM pH7.5的Tris-HCl缓冲液冲洗，用 25mM EDTA溶液洗脱，收集蛋白峰。蛋白峰用截留分子量为5kDa的超滤离心管浓缩，用AKTA purifier 100系统上样，层析柱选用GE公司和XK16/100，填料选用GE公司的Sephactyl S-200,层析柱装填95cm高度，用含0.5％NaCl 的10mM pH7.2的PB缓冲液洗脱，收集蛋白峰。蛋白溶液即为rh-CRT-2，SDS- PAGE电泳如图6所示。

1.5 rh-CRT-3克隆与表达

以pET28a-MCRT为模版，以pFcrt-2/pRcrt-3为上下游引物，PCR扩增基因，上游引入NdeI酶切位点，下游引入XhoI酶切位点。

pFcrt-2引物5’-GTTCATATGGAACCGGCAGTGTATTTTAAG-3’(SEQ ID NO:6)

pRcrt-3)引物5’-GTGCTCGAGGTATGCGTAAATAGACGGGTC-3’(SEQ ID NO:10)

rh-CRT-3对应CRT基因序列如SEQ ID NO:11所示，蛋白序列如SEQ ID NO:12所示。

使用Thermo Scientific的高保真DNA聚合酶Phusion按98℃10秒，55℃ 30秒，72℃60秒，30个循环；72℃保持10分钟进行PCR。将所得的PCR 产物(约890bp)纯化后用NdeI/XhoI双酶切后插入质粒pET42a中，转化感受态大肠杆菌TOP10，在含卡那霉素的LB培养上挑选阳性克隆。测序正确后提取质粒，质粒命名为pET42a-rh-CRT-3，质粒图谱图谱如图7所示，质粒酶切图如图8所示。pET42a-rh-CRT-3转化感受态BL21(DE3)。在含卡那霉素 (50μg/ml)的LB平板上挑选阳性克隆。取pET42a-rh-CRT-3转化获得的 BL21(DE3)阳性克隆，接种6.0ml含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB液体培养基， 37℃220RPM震荡培养约3h；取2.0ml菌液接种于1.0L的三角瓶中，其中含终浓度50μg/ml硫酸卡那霉素的200ml LB无菌培养基。继续37℃220RPM震荡培养3小时，直到OD₆₀₀约为1.0左右，再按1.0％接种量接种到6个5L灭菌三角瓶中，其中每个三角瓶中含1.0L的LB培养基，30℃220RPM继续震荡培养，当OD₆₀₀＝0.8左右时，加入1.0M的IPTG使其终浓度为0.5mM,温度调整为 28℃，继续培养6小时，然后离心收集菌体。

1.6 rh-CRT-3蛋白纯化

取1.5中收集的菌体10g，按1:20(g/g)加入20mM pH＝7.5的Tris-HCl缓冲液，冰水浴中进行超声波破菌，离心收集上清。上清用AKTA purifier 100系统上样，层析柱选用GE公司的XK16/20型号层析柱，填料选用GE公司的Ni sepharose 6FF 10ml,用含100mM咪唑20mM pH7.5的Tris-HCl缓冲液冲洗，用 25mM EDTA溶液洗脱，收集蛋白峰。蛋白峰用截留分子量为5kDa的超滤离心管浓缩，用AKTA purifier 100系统上样，层析柱选用GE公司和XK16/100，填料选用GE公司的Sephactyl S-200,层析柱装填95cm高度，用含0.5％NaCl 的10mM pH7.2的PB缓冲液洗脱，收集蛋白峰。蛋白溶液即为rh-CRT-3，SDS- PAGE电泳如图9所示。

2、小鼠生发实验研究

2.1第一次实验

实验动物：C57BL/6雄性小鼠，6～7周龄，体重(20±2)g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号为SCXK(京)2021-0006。将其饲养于12h光照/12h黑暗的环境中，自由摄食和饮水。小鼠分为正常对照组(normal NC group,NC)，模型组(Model)，阳性对照——米诺地尔组(Minoxidil)，阳性对照——非那雄胺组(Finasteride)，实验A组和实验B组蛋白保存于-70℃冰箱中，使用时用生理盐水稀释，实验A组(rh-CRT-1，蛋白使用时浓度为0.21mg/ml)，实验B组(rh-CRT-2,蛋白使用时浓度为0.21mg/ml)，每组小鼠6只。

主要试剂如下：4％多聚甲醛(中国，北京索莱宝科技有限公司)；异氟烷 (中国，瑞沃德公司)；睾酮(中国，上海诗丹德生物技术公司)；石蜡切片机 (美国，Thermo公司)；小动物麻醉机(中国，瑞沃德公司)；倒置显微镜(日本，Olympus公司)。

造模和用药：先做雄性激素脱发模型，造模开始前一天，用备皮刀将实验动物背部中央的部分毛发剔除，使用脱毛膏对备皮区域进行脱毛。脱毛处理24h 后，除NC组外，其它组使用造模剂(睾酮，5.0mg/mL)在小鼠颈部进行皮下注射，总剂量为0.2mL/只，NC组小鼠注射等量的生理盐水。造模后，开始给药，NC组每天一次，每次注射生理盐水0.15mL/只；实验A组、实验B组及阳性对照组每天均注射造模剂(睾酮)2h后再给药，造模剂剂量为0.2mL/只；实验A组和实验B组分别在背部注射，每天一次，每次0.15mL/只；阳性对照米诺地尔组用5％米诺地尔外用0.01mL/只，每天一次；阳性对照非那雄胺组，非那雄胺使用浓度13μg/mL，每只注射0.2mL，每天一次。

结果：

实验进行21天，通过皮肤镜观察各组毛发的变化。结果如图10至图15所示：正常对照组毛发顺滑；模型组毛发毛躁；与模型组比较，实验A组、实验 B组毛发较顺滑，阳性对照——米诺地尔组与非那雄胺组毛发顺滑。

通过扫描电镜观察毛干和毛小皮的变化，结果如图16至图21所示：正常对照组毛干有层层叠加排列的鳞片状毛小皮覆盖，Model组部分毛干出现中空状态，实验A组和实验B组毛小皮排列较整齐，阳性对照组——米诺地尔组毛小皮呈鳞片状排列较整齐，阳性对照组——非那雄胺组毛小皮排列较整齐。

2.2第二次实验

实验动物：C57BL/6雄性小鼠，6～7周龄，体重(20±2)g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号为SCXK(京)2021-0006。将其饲养于12h光照/12h黑暗的环境中，自由摄食和饮水。小鼠分为正常对照组(normal group,NC)；模型组(Model)；实验C组(rh-CRT-2,蛋白使用时浓度0.35mg/ml)，设注射组和外用涂抹组；实验D组(rh-CRT-3,蛋白使用时 0.21mg/ml)，设注射组和涂抹组，实验组蛋白保存于-70℃冰箱中，使用时用生理盐水稀释；阳性药对照——米诺地尔组(Minoxidil)。每组6只小鼠。

造模和用药：先做脱发模型。造模开始前一天，用备皮刀将实验动物背部中央的部分毛发剔除，使用脱毛膏对备皮区域进行脱毛。脱毛处理24h后，除正常对照组给予75％乙醇外，其它组均注射用75％乙醇配制的睾酮溶液 (5mg/mL)，每只0.01mL。2小时后，实验C组注射组和实验D组注射组分别在背部注射，0.15mL/只，每天一次，连续17天；实验C组外用组和实验D 组外用组分别在背部涂抹，剂量为0.15mL/只，每天一次，连续17天。正常对照组和模型组外用生理盐水，每天一次，每次0.15mL/只，连续17天。实验给药过程中，除正常对照组外其它各组每天均注射造模剂(睾酮)2h后再给药。用皮肤镜、颜色测试仪、扫描电镜观察毛发情况。并对实验结束后小鼠皮肤进行病理切片。病理切片的操作：取皮肤病理组织，置于4％多聚甲醛固定，经过修剪、脱水和透明后，包埋组织。采用石蜡切片机切厚度为6μm的切片，进一步脱蜡、染色、脱水、透明和封片，在光学显微镜下观察不同区域的毛囊，并对毛囊数量进行统计分析。

扫描电镜观察：实验结束时，在每组小鼠背部新生毛发区随机拔取毛干，每组选取3只小鼠，对拔取的毛干进行固定，通过扫描电镜观察毛干和毛小皮的变化。

血清与皮肤组织中激素含量：实验结束时，小鼠进行眼眶采血，常温静置 30min，5000r/min离心10min，移出血清；实验结束时取皮肤组织，于-80℃冰箱保存。进行实验时对皮肤组织进行匀浆，通过酶联免疫吸附(Enzyme-Linked Immunosorbent Assays,ELISA)试验检测各组血清和皮肤组织睾酮、双氢睾酮和雌二醇的变化。

统计分析：所有数据均采用SPSS17.0软件进行统计处理，多组间比较均采用one-way ANOVA分析，数据采用均数±标准差以(

)表示，P<0.05为有统计差异，P>0.05尚不能认为有差异。

结果：

通过皮肤镜观察，分别在用药第3天、7天、10天、14天和17天对小鼠整个背部皮肤进行拍照，结果如图22所示。实验17天时，正常对照组背部皮肤长出毛发，模型组仅小部分皮肤长出毛发，实验C组和实验D组均可以促进小鼠背部毛发生长，其中实验C组外用组促毛发生长最显著，其次是实验D组注射组、实验D组外用组和实验C组注射组。

实验结束时，各组背部皮肤剃毛和脱毛后，通过皮肤镜观察背部毛发生长阶段和数量的变化。发现正常对照组毛发数量多、粗大，模型组毛发稀疏、细小，呈微型化。与模型组比较，实验C组外用组毛发数量增多、增粗，其次是实验D组注射组和外用组，实验C组注射组毛发数量较少且细小。如图23所示。

用颜色测试仪观察分别在7天，10天，14天，17天观察各组背部皮肤黑色程度的变化，结果参见图24：

7天：各组背部皮肤黑色程度没有明显变化(P＞0.05)。

10天：与正常对照组背部皮肤黑色程度比较，模型组背部黑色显著降低(P ＜0.01。与模型组背部皮肤黑色程度比较，药物组没有明显变化(P＞0.05)，米诺地尔组显著升高(P＜0.01)。

14天：与正常对照组背部皮肤黑色程度比较，模型组背部黑色显著降低(P ＜0.01)，与模型组比较，实验C组外用组黑色明显升高(P＜0.05)。

17天：模型组背部黑色程度与正常对照组显著降低(P＜0.01)，与模型组比较，实验C组外用组和实验D组注射组显著升高(P＜0.01)，实验C组注射组和实验D组外用组显著升高(P＜0.01)。:

通过扫描电镜观察各组毛发的变化，结果如图25所示，正常对照组毛干粗大，毛干表面由层层叠加排列的、密集的鳞片状毛小皮覆盖。模型组组毛干细小，毛小皮稀疏且表面有褶皱。与模型组比较，实验C组外用组毛干明显变粗，毛干光滑，叠加排列的鳞片状毛小皮密集，实验D组外用组毛干变粗，毛小皮密集，实验C组注射组和实验D组注射组虽然毛干细小，但毛小皮较密集。以上结果可知，实验C组外用组的毛发不管是毛干直径还是毛小皮状态，都明显好于模型组，趋于健康状态。

病理切片结果如图26所示，与正常对照组比较，模型组毛囊数量显著减少，具有统计学意义(P＜0.01)。与模型组比较，实验C组和实验D组不论是外用组还是注射组均显著促进雄激素脱发小鼠毛囊数量的表达，均具有统计学意义(P＜0.01)，其中实验C组外用组毛囊数量增加作用最显著。这些结果表明实验C组和实验D组均可以增加由于睾酮引起的毛囊萎缩和数量的减少，促进毛发生长。

为观察实验组对睾酮、双氢睾酮和雌二醇不同激素的影响，在实验结束时取血和皮肤组织观察血清和皮肤组织激素的变化，结果如27所示，结果显示：

与正常对照组睾酮比较，模型组血清和皮肤组织睾酮明显升高，具有统计学意义(P＜0.05)。与模型组比较，实验C组注射组血清和皮肤组织睾酮明显降低(P＜0.05)，其它组血清和皮肤组织没有统计学意义(P＞0.05)。

与正常对照组双氢睾酮比较，模型组血清和皮肤组织双氢睾酮明显升高，具有统计学意义(P＜0.01)。与模型组比较，实验C组注射组血清和皮肤组织双氢睾酮明显降低(P＜0.01)，实验C组外用组血清双氢睾酮明显降低(P＜ 0.05)，其它组血清和皮肤组织没有统计学意义(P＞0.05)。

与正常对照组雌二醇比较，模型组血清和皮肤组织雌二醇没有变化(P＜ 0.01)。与模型组比较，其它组血清和皮肤组织雌二醇没有统计学意义(P＞0.05)，即各组之间雌二醇没有明显变化。

以上结果可知，实验C组外用组可以降低血清双氢睾酮的含量，其促毛发生长的作用可能与降低双氢睾酮含量有关。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

序列表

<110> 北京百华百汇生物科技有限公司

<120> 重组钙网蛋白在生发、育发、保护毛发或防脱发中的用途和相关产品

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 400

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Glu Pro Ala Val Tyr Phe Lys Glu Gln Phe Leu Asp Gly Asp Gly Trp

1 5 10 15

Thr Ser Arg Trp Ile Glu Ser Lys His Lys Ser Asp Phe Gly Lys Phe

20 25 30

Val Leu Ser Ser Gly Lys Phe Tyr Gly Asp Glu Glu Lys Asp Lys Gly

35 40 45

Leu Gln Thr Ser Gln Asp Ala Arg Phe Tyr Ala Leu Ser Ala Ser Phe

50 55 60

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65 70 75 80

Lys His Glu Gln Asn Ile Asp Cys Gly Gly Gly Tyr Val Lys Leu Phe

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100 105 110

Ile Met Phe Gly Pro Asp Ile Cys Gly Pro Gly Thr Lys Lys Val His

115 120 125

Val Ile Phe Asn Tyr Lys Gly Lys Asn Val Leu Ile Asn Lys Asp Ile

130 135 140

Arg Cys Lys Asp Asp Glu Phe Thr His Leu Tyr Thr Leu Ile Val Arg

145 150 155 160

Pro Asp Asn Thr Tyr Glu Val Lys Ile Asp Asn Ser Gln Val Glu Ser

165 170 175

Gly Ser Leu Glu Asp Asp Trp Asp Phe Leu Pro Pro Lys Lys Ile Lys

180 185 190

Asp Pro Asp Ala Ser Lys Pro Glu Asp Trp Asp Glu Arg Ala Lys Ile

195 200 205

Asp Asp Pro Thr Asp Ser Lys Pro Glu Asp Trp Asp Lys Pro Glu His

210 215 220

Ile Pro Asp Pro Asp Ala Lys Lys Pro Glu Asp Trp Asp Glu Glu Met

225 230 235 240

Asp Gly Glu Trp Glu Pro Pro Val Ile Gln Asn Pro Glu Tyr Lys Gly

245 250 255

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Ile His Pro Glu Ile Asp Asn Pro Glu Tyr Ser Pro Asp Pro Ser Ile

275 280 285

Tyr Ala Tyr Asp Asn Phe Gly Val Leu Gly Leu Asp Leu Trp Gln Val

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Lys Ser Gly Thr Ile Phe Asp Asn Phe Leu Ile Thr Asn Asp Glu Ala

305 310 315 320

Tyr Ala Glu Glu Phe Gly Asn Glu Thr Trp Gly Val Thr Lys Ala Ala

325 330 335

Glu Lys Gln Met Lys Asp Lys Gln Asp Glu Glu Gln Arg Leu Lys Glu

340 345 350

Glu Glu Glu Asp Lys Lys Arg Lys Glu Glu Glu Glu Ala Glu Asp Lys

355 360 365

Glu Asp Asp Glu Asp Lys Asp Glu Asp Glu Glu Asp Glu Glu Asp Lys

370 375 380

Glu Glu Asp Glu Glu Glu Asp Val Pro Gly Gln Ala Lys Asp Glu Leu

385 390 395 400

<210> 2

<211> 1200

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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aaacatgagc agaacatcga ctgtgggggc ggctatgtga agctgtttcc taatagtttg 300

gaccagacag acatgcacgg agactcagaa tacaacatca tgtttggtcc cgacatctgt 360

ggccctggca ccaagaaggt tcatgtcatc ttcaactaca agggcaagaa cgtgctgatc 420

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ctctggcagg tcaagtctgg caccatcttt gacaacttcc tcatcaccaa cgatgaggca 960

tacgctgagg agtttggcaa cgagacgtgg ggcgtaacaa aggcagcaga gaaacaaatg 1020

aaggacaaac aggacgagga gcagaggctt aaggaggagg aagaagacaa gaaacgcaaa 1080

gaggaggagg aggcagagga caaggaggat gatgaggaca aagatgagga tgaggaggat 1140

gaggaggaca aggaggaaga tgaggaggaa gatgtccccg gccaggccaa ggacgagctg 1200

<210> 3

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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<211> 1200

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

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ggtccgggta cgaagaaagt tcatgtgatt tttaattaca agggcaaaaa cgttctgatt 420

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cctgataata cctatgaggt taaaattgac aacagtcagg ttgagagcgg ttctctggaa 540

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gaggaggaca aggaggaaga tgaggaggaa gatgtccccg gccaggccaa ggacgagctg 1200

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<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

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<210> 8

<211> 1047

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

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attgagagta agcataagag tgattttgga aaattcgttc tgagtagtgg gaaattttat 120

ggtgatgagg agaaggacaa gggactgcag acgagccagg atgcgcgctt ttatgcactg 180

agcgcatcat tcgaaccgtt tagcaataag ggtcagaccc tggtggtgca gtttacagtt 240

aaacatgagc agaatattga ctgtggtgga gggtatgtta agttatttcc gaatagctta 300

gaccagacgg atatgcatgg tgacagcgaa tacaacatca tgtttggacc cgatatttgt 360

ggtccgggta cgaagaaagt tcatgtgatt tttaattaca agggcaaaaa cgttctgatt 420

aacaaggata tacgttgtaa ggatgatgaa tttacccacc tgtataccct gattgtgcgt 480

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gacgattggg actttctgcc gccgaagaaa atcaaagatc cggacgcaag caaacctgaa 600

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aaaccggaac atatacctga cccggacgcc aaaaagccag aagattggga cgaagaaatg 720

gatggagaat gggaaccacc ggtgatacaa aatcctgaat acaaaggaga atggaaaccg 780

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<210> 9

<211> 349

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

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Thr Ser Arg Trp Ile Glu Ser Lys His Lys Ser Asp Phe Gly Lys Phe

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Val Leu Ser Ser Gly Lys Phe Tyr Gly Asp Glu Glu Lys Asp Lys Gly

35 40 45

Leu Gln Thr Ser Gln Asp Ala Arg Phe Tyr Ala Leu Ser Ala Ser Phe

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Glu Pro Phe Ser Asn Lys Gly Gln Thr Leu Val Val Gln Phe Thr Val

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Lys His Glu Gln Asn Ile Asp Cys Gly Gly Gly Tyr Val Lys Leu Phe

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Asp Gly Glu Trp Glu Pro Pro Val Ile Gln Asn Pro Glu Tyr Lys Gly

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Glu Trp Lys Pro Arg Gln Ile Asp Asn Pro Asp Tyr Lys Gly Thr Trp

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Ile His Pro Glu Ile Asp Asn Pro Glu Tyr Ser Pro Asp Pro Ser Ile

275 280 285

Tyr Ala Tyr Asp Asn Phe Gly Val Leu Gly Leu Asp Leu Trp Gln Val

290 295 300

Lys Ser Gly Thr Ile Phe Asp Asn Phe Leu Ile Thr Asn Asp Glu Ala

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Tyr Ala Glu Glu Phe Gly Asn Glu Thr Trp Gly Val Thr Lys Ala Ala

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Glu Lys Gln Met Lys Asp Lys Gln Asp Glu Glu Gln Arg

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<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtgctcgagg tatgcgtaaa tagacgggtc 30

<210> 11

<211> 873

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gaaccggcag tgtattttaa ggagcagttt ttagatggtg atggatggac cagtcggtgg 60

attgagagta agcataagag tgattttgga aaattcgttc tgagtagtgg gaaattttat 120

ggtgatgagg agaaggacaa gggactgcag acgagccagg atgcgcgctt ttatgcactg 180

agcgcatcat tcgaaccgtt tagcaataag ggtcagaccc tggtggtgca gtttacagtt 240

aaacatgagc agaatattga ctgtggtgga gggtatgtta agttatttcc gaatagctta 300

gaccagacgg atatgcatgg tgacagcgaa tacaacatca tgtttggacc cgatatttgt 360

ggtccgggta cgaagaaagt tcatgtgatt tttaattaca agggcaaaaa cgttctgatt 420

aacaaggata tacgttgtaa ggatgatgaa tttacccacc tgtataccct gattgtgcgt 480

cctgataata cctatgaggt taaaattgac aacagtcagg ttgagagcgg ttctctggaa 540

gacgattggg actttctgcc gccgaagaaa atcaaagatc cggacgcaag caaacctgaa 600

gactgggacg agagagcaaa aattgatgat ccgacagata gcaaaccgga agattgggat 660

aaaccggaac atatacctga cccggacgcc aaaaagccag aagattggga cgaagaaatg 720

gatggagaat gggaaccacc ggtgatacaa aatcctgaat acaaaggaga atggaaaccg 780

cgtcagattg acaatccgga ttataaaggc acatggatac atccggaaat agataatccg 840

gaatatagcc cggacccgtc tatttacgca tac 873

<210> 12

<211> 291

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Glu Pro Ala Val Tyr Phe Lys Glu Gln Phe Leu Asp Gly Asp Gly Trp

1 5 10 15

Thr Ser Arg Trp Ile Glu Ser Lys His Lys Ser Asp Phe Gly Lys Phe

20 25 30

Val Leu Ser Ser Gly Lys Phe Tyr Gly Asp Glu Glu Lys Asp Lys Gly

35 40 45

Leu Gln Thr Ser Gln Asp Ala Arg Phe Tyr Ala Leu Ser Ala Ser Phe

50 55 60

Glu Pro Phe Ser Asn Lys Gly Gln Thr Leu Val Val Gln Phe Thr Val

65 70 75 80

Lys His Glu Gln Asn Ile Asp Cys Gly Gly Gly Tyr Val Lys Leu Phe

85 90 95

Pro Asn Ser Leu Asp Gln Thr Asp Met His Gly Asp Ser Glu Tyr Asn

100 105 110

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115 120 125

Val Ile Phe Asn Tyr Lys Gly Lys Asn Val Leu Ile Asn Lys Asp Ile

130 135 140

Arg Cys Lys Asp Asp Glu Phe Thr His Leu Tyr Thr Leu Ile Val Arg

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Pro Asp Asn Thr Tyr Glu Val Lys Ile Asp Asn Ser Gln Val Glu Ser

165 170 175

Gly Ser Leu Glu Asp Asp Trp Asp Phe Leu Pro Pro Lys Lys Ile Lys

180 185 190

Asp Pro Asp Ala Ser Lys Pro Glu Asp Trp Asp Glu Arg Ala Lys Ile

195 200 205

Asp Asp Pro Thr Asp Ser Lys Pro Glu Asp Trp Asp Lys Pro Glu His

210 215 220

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275 280 285

Tyr Ala Tyr

290

Claims

1.钙网蛋白在生发、育发、保护毛发或防脱发中的用途。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述钙网蛋白是重组表达的CRT全长蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，或者，与如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相似度至少为85％的蛋白。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述钙网蛋白是包含重组表达的CRT片段的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，或者，与如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列相似度至少为85％的蛋白。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述钙网蛋白是包含重组表达的CRT片段的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，或者，与如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列相似度至少为85％的蛋白。

5.一种与生发、育发、保护毛发或防脱发相关的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白为rh-CRT-1、rh-CRT-2或rh-CRT-3，rh-CRT-1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，rh-CRT-2的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，rh-CRT-3的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。

6.编码权利要求5所述的与生发、育发、保护毛发及防脱发相关的重组蛋白的基因，其特征在于，编码rh-CRT-1的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，编码rh-CRT-2的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，编码rh-CRT-3的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。

7.一种质粒，其特征在于，含有权利要求6所述的与生发、育发、保护毛发或防脱发相关的重组蛋白的基因。

8.一种载体，其特征在于，以权利要求6所述的与生发、育发、保护毛发或防脱发相关的重组蛋白的基因作为活性成分。

9.权利要求5所述的重组蛋白、权利要求7所述的质粒或权利要求8所述的载体在制备生发、育发、保护毛发或防脱发的药物或医疗器械中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的药物为改善毛干、毛小皮状态的药物。

11.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的药物为增加皮肤毛囊数量的药物。

12.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的药物为通过降低雄性激素含量促进毛发生长的药物。

13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述雄性激素为双氢睾酮。

14.一种具有生发、育发、保护毛发或防脱发功能的产品，其特征在于，其活性成分为权利要求5所述的重组蛋白、权利要求6所述的基因、权利要求7所述的质粒或权利要求8所述的载体；

所述产品的用途至少包括下述用途中的一种：

a)改善毛发顺滑程度；

b)增多毛发量；

c)促进毛发生长；

所述产品为药物、添加剂或活性成分剂。

15.一种具有生发、育发、保护毛发或防脱发功能的药物，其特征在于，由权利要求5所述的重组蛋白、权利要求6所述的基因、权利要求7所述的质粒或权利要求8所述的载体和药学上可添加的辅料组成。

16.根据权利要求15所述的具有生发、育发、保护毛发或防脱发功能的药物，其特征在于，所述的辅料包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体和润滑剂中的一种或多种。

17.根据权利要求15所述的具有生发、育发、保护毛发或防脱发功能的药物，其特征在于，所述药物能够通过注射、喷射、渗透、吸收，以及物理或化学介导的方法导入机体组织中；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。

18.根据权利要求15所述的具有生发、育发、保护毛发或防脱发功能的药物，其特征在于，所述药物为外用制剂。

19.钙网蛋白在制备治疗痤疮或青春痘或斑秃的药物中的应用。

20.如权利要求19所述的应用，其特征在于，所述钙网蛋白CRT是重组表达的CRT全长蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，或者，与如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相似度至少为85％的蛋白。

21.如权利要求19所述的应用，其特征在于，所述钙网蛋白CRT是包含重组表达的CRT片段的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，或者，与如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列相似度至少为85％的蛋白。

22.如权利要求19所述的应用，其特征在于，所述钙网蛋白CRT是包含重组表达的CRT片段的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，或者，与如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列相似度至少为85％的蛋白。