CN100535005C

CN100535005C - 长链人胰岛素样生长因子(lr3igf-1)及其制备和应用方法

Info

Publication number: CN100535005C
Application number: CNB2007100034188A
Authority: CN
Inventors: 朱成钢
Original assignee: Individual
Current assignee: Sure Biotech (hangzhou) Ltd
Priority date: 2007-02-06
Filing date: 2007-02-06
Publication date: 2009-09-02
Anticipated expiration: 2027-02-06
Also published as: CN101007848A

Abstract

本发明涉及一种新的长链人胰岛素样生长因子，其具有促进细胞和/或组织生长、增殖和/或再生的功能。另外，本发明还涉及制备该长链人胰岛素样生长因子的方法，以及该生长因子在药品、食品、保健品和化妆品等方面的应用。

Description

长链人胰岛素样生长因子(LR3IGF-1)及其制备和应用方法

技术领域

本发明属于生物重组技术领域。更具体地来说，本发明涉及一种新的长链人胰岛素样生长因子(Long R³ Insulin-like growth factor-1，本文中简称为LR³IGF-1)。另外，本发明还涉及制备该长链人胰岛素样生长因子的方法，以及该生长因子在药品、食品、保健品和化妆品等方面的应用。

背景技术

人胰岛素样生长因子是调节正常人体细胞生长的因子，具有诱导或提高组织生长、增殖和/或再生的作用。人胰岛素样生长因子通过介导生长激素而促进人体的生长，因此像细胞复制、骨骼生长和另外一些与生长相关的过程均受人胰岛素样生长因子水平的影响(参见J.Clin.Endocrinol.Metab，192(75)：183-188)。人胰岛素样生长因子可以促进哺乳动物细胞在无血清培养基中的生长，例如，它能够刺激甲状腺细胞的增殖(J.Biol.Chem.，264：18485-18488)，还可以与其他一些生长因子协同作用，如促进软组织和间叶组织损伤的修复(Endocrinology，131：2399-2403)。

因此，目前胰岛素样生长因子已经广泛应用于制备促进细胞生长的药品、食品、保健品和化妆品等方面。中国专利申请CN1251531A公开了可以利用胰岛素样生长因子诱导或提高组织生长、增殖或再生的方法，尤其是利用胰岛素样生长因子促进内耳组织的生长；中国专利申请CN1204263A披露了可以利用胰岛素样生长因子治疗脑或脊髓神经的退行性疾病，如阿尔兹海默症(Alzheimer’s Disease)、帕金森氏症(Parkinson’s Disease)等。在治疗糖尿病方面，也有大量文献披露了利用胰岛素样生长因子治疗I型、II型和胰岛素耐药性糖尿病等方面的实践(参见中国专利申请CN1387440A、CN1384201A等)。人胰岛素样生长因子的可以从细胞中提取，也可以通过基因工程来制备，目前已经有商品化的人胰岛素样生长因子，Cephalon公司的基因工程重组人胰岛素样生长因子。

此外，人们也在积极开发人胰岛素样生长因子的衍生物和类似物。Gropep公司的美国专利US5679771A公开了一系列特定的长链胰岛素样生长因子，其中长链人胰岛素样生长因子(LR³IGF-1)是由83个氨基酸残基组成的人胰岛素样生长因子衍生物，分子量约为9000Da。该LR³IGF-1是由人胰岛素样生长因子序列上将一个氨基酸残基Glu取代为Arg并在IGF-1的N末端添加了13个氨基酸而形成的多肽。如Gropep公司的专利所述，这种LR³IGF-1能够保持人胰岛素样生长因子的生物学活性，促进细胞、组织生长、增殖或再生，从而能替代人胰岛素样生长因子而在药品、食品、保健品和化妆品等方面进行应用。本发明人经过长期艰苦的研究，获得了一种新的长链人胰岛素样生长因子。尽管本发明的LR³IGF-1也由83个氨基酸残基组成，但是其序列结构无法从公开文献中推导出，与Gropep公司的LR³IGF-1相比仅仅具有73％的同一性，具有完整的自主知识产权；而且更出人意料的是，其还具有比Gropep公司的LR³IGF-1更高的生物学活性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的长链人胰岛素样生长因子，其能够促进细胞、组织生长、增殖或再生，而且较之现有技术中的长链人胰岛素样生长因子甚至具有更高的生物学活性。本发明的目的还在于提供编码所述长链人胰岛素样生长因子的核酸分子及其载体、宿主细胞和利用基因工程技术制备所述长链人胰岛素样生长因子的方法。另外，本发明的目的还在于提供该长链人胰岛素样生长因子的药物组合物及其在制备用于促进细胞增殖的药物、保健食品和/或化妆品中的应用。

具体而言，在第一个方面，本发明提供了一种长链人胰岛素样生长因子，其氨基酸序列

a)如序列表中的序列1所示；或

b)是对序列表中的序列1所示的序列添加、缺失和/或取代一个或几个氨基酸残基而得的氨基酸序列，并且所述长链人胰岛素样生长因子能够促进细胞增殖。

优选本发明第一个方面的长链人胰岛素样生长因子的氨基酸序列如序列表中的序列1所示。本发明人经过艰苦的研究，发现了本发明的第一个方面的长链人胰岛素样生长因子，令人意外的是，本发明优选的长链人胰岛素样生长因子比现有技术公开的LR³IGF-1具有更高的生物学活性。

本发明的第一个方面的长链人胰岛素样生长因子也可以是氨基酸序列如序列表中的序列1所示的长链人胰岛素样生长因子的变异体，所述变异体的氨基酸序列是在序列表中的序列1所示的序列的基础上添加、缺失和/或取代一个或几个氨基酸残基而得的氨基酸序列，优选是添加、缺失和/或取代一个至五个而得的，更优选是添加、缺失和/或取代一个至三个而得的，并且所述长链人胰岛素样生长因子仍旧能够促进细胞增殖。本领域技术人员知晓，通过改变已知多肽的编码基因序列并将其导入表达载体，可以制备出取代、添加或缺失了氨基酸残基的多肽，这些方法广泛记载于《分子克隆实验指南》(北京：科学出版社，2002年)等本领域公知的文献中。在取代的氨基酸残基中，优选取代为与原氨基酸残基侧链性质相似的其他氨基酸，从而更容易得以保持原有功能活性。侧链性质相似的氨基酸分别有疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、亲水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、脂肪族侧链的氨基酸(G、A、V、L、I、P)、含羟基侧链的氨基酸(S、T、Y)、含硫原子侧链的氨基酸(C、M)、含羧酸和酰胺侧链的氨基酸(D、N、E、Q)、含碱性基团侧链的氨基酸(R、K、H)、含芳香族侧链的氨基酸(H、F、Y、W)。目前已经存在大量公知的检验促进细胞增殖能力的实验方法，本领域技术人员可根据这些方法确定取代、添加或缺失而得的氨基酸序列的生物功能和/或活性，优选通过本发明实施例所述的具体实验方法从经添加、缺失或取代的氨基酸序列中选出具有上述功能的长链人胰岛素样生长因子。本发明优选的变异体的生物学活性不低于氨基酸序列如序列表中的序列1所示的长链人胰岛素样生长因子生物学活性的50％，更优选不低于80％，更优选不低于90％，最优选是相同的。

在第二个方面，本发明提供了一种核酸分子，其编码本发明第一个方面所述的长链人胰岛素样生长因子。本发明的核酸分子，可以是DNA形式，也可以是RNA形式，优选是DNA形式。DNA形式包括天然cDNA和人工合成的cDNA，DNA可以是编码链或模板链。通过常规技术，如PCR方法、重组法或人工合成的方法，本领域技术人员可以很容易获得本发明的长链人胰岛素样生长因子的核酸分子或其片段。这些序列一旦获得，就可以将其克隆入载体，再转化或转染入相应的细胞，然后通过常规的宿主细胞进行增殖，从中分离得到大量的核酸分子。优选本发明的核酸分子的核苷酸序列如序列表中的序列2所示。该优选序列可以在酵母中表达。

在第三个方面，本发明提供了一种载体，其含有本发明第二个方面所述的核酸分子。本文中的术语“表达载体”、“载体”，在此可以交互替换使用，是指本领域中常用的细菌质粒、粘粒、噬菌粒、酵母质粒、植物细胞病毒、动物病毒及其它各种病毒载体。本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达用的载体(原核表达载体)、在酵母中表达用的载体(如毕赤酵母载体、汉逊酵母载体等)、在昆虫细胞中表达的杆状病毒载体、在哺乳动物细胞中表达用的载体(痘苗病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴病毒载体等)、在植物中表达用的植物病毒载体以及在哺乳动物乳腺中表达用的各种载体。总之，只要能使本发明第二个方面所述的核酸分子在宿主细胞中稳定复制，任何质粒和载体都可使用。优选表达载体包含选择标记基因，如细菌的氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因、卡那霉素抗性基因、链霉素抗性基因、氯霉素抗性基因；酵母菌的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因，酵母菌的缺陷选择标志，如His，Leu，Trp等营养缺陷型；真核细胞的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因、二氢叶酸还原酶基因及荧光蛋白标记基因等。本发明的载体优选为真核载体，在本发明的具体实施方式中，其为pPICZ-LR³IGF-1，即在pPICZαA质粒上克隆有序列表中的序列2所示核苷酸序列的表达质粒。本领域技术人员可利用DNA重组技术等一系列技术，构建含本发明所述编码蛋白的DNA序列、合适的转录和翻译调控序列、启动子及选择性标记基因等特定元件的表达载体。上述载体可用来转化、转染合适的宿主细胞，以便获得所需要的长链人胰岛素样生长因子。

在第四个方面，本发明提供了一种宿主细胞，其特征在于，所述细胞含有本发明第三个方面所述的载体，或者所述细胞用本发明第二个方面所述的核酸分子转化或转染而得。宿主细胞可以是原核细胞，也可以是真核细胞，如，细菌细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。宿主细胞在转化或转染含本发明所述编码蛋白的基因序列后，即构成工程化细胞或细胞株，可用于生产所需蛋白。本领域技术人员能够恰当地选择适当的载体、宿主细胞，并熟知如何将载体高效地转化或转染入宿主细胞中，所用方法包括但不限于：氯化钙法、电穿孔法用于细菌细胞，电穿孔法和原生质体融合法用于酵母细胞，脂质体包裹、磷酸钙共沉淀、电融合法以及显微注射法用于哺乳动物细胞等真核细胞。优选本发明的宿主细胞是Pichia pastoris酵母表达菌株GS115。该优选宿主细胞能高效分泌表达长链人胰岛素样生长因子，从而大大简化了下游分离纯化工作。

在第五个方面，本发明提供了用于促进细胞增殖的组合物，其包含本发明第一个方面所述的长链人胰岛素样生长因子以及药学上可接受的载体。所述药物组合物能促进细胞增殖。对于本领域普通技术人员来说，已经有很多公知的方法能将蛋白质或多肽活性成分与药学上可接受的载体制备成药物组合物和化妆品。本文中使用的药学上可接受的载体指无毒的填充剂、赋形剂、稀释剂或其他制剂辅料，它们与活性成分相容。运用药学上可接受的载体制备药物组合物和化妆品对本领域普通技术人员来说是公知的。本发明的组合物包含本发明第一个方面所述的长链人胰岛素样生长因子作为活性成分，将该长链人胰岛素样生长因子和药学上可接受的载体(如本领域普通技术人员所熟知的赋形剂、稀释剂等)组合在一起，配制成各种制剂，优选为固体制剂和液体制剂。优选本发明的制剂为单位剂量形式，如片剂、软膏、丸剂、胶囊(包括持续释放或延迟释放形式)、粉剂、混悬剂、颗粒剂、酊剂、糖浆剂、乳液剂、悬浮液、针剂等剂型，从而适合各种给药形式，例如口服、透皮、非肠道注射、粘膜、肌肉、静脉内、皮下、眼内、皮内等的给药形式。本发明的组合物特别优选制成喷剂、软膏或注射剂。优选本发明的组合物包含缓冲液(如磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液)或生理盐水。例如，对于大鼠损伤的表皮，含本发明长链人胰岛素样生长因子的生理盐水能够促进伤口愈合。

在第六个方面，本发明提供了本发明第一个方面所述的长链人胰岛素样生长因子在制备用于促进细胞和/或组织生长、增殖和/或再生的药物、保健食品和/或化妆品中的应用。本发明的长链人胰岛素样生长因子具有促进细胞分裂、增殖的作用，可用于诱导或提高患者的组织生长、增殖或再生的水平，治疗相应疾病，例如脑或脊髓神经的退行性疾病，如阿尔兹海默症、帕金森氏症等，能够用于治疗和/或预防碳水化合物等能源代谢调节紊乱等方面的疾病，如治疗和预防糖代谢或脂肪代谢等方面的疾病，特别是糖尿病，包括I型、II型和胰岛素耐药性糖尿病等。另外，健康人服用一定量的本发明的长链人胰岛素样生长因子也有助于维持其正常的细胞分裂、增殖作用，有助于改善亚健康状态，保持其充沛的活力。健康人外用一定量的本发明的长链人胰岛素样生长因子有助于维持其皮肤细胞的分裂、增殖，改善外部形象，具有美容的作用。

对于药物来说，给药的剂量和形式一般由医师根据患者的具体情况(如年龄、体重、性别、病情、患病时间、身体状况等)确定。一般而言，给药的剂量为0.001～100mg/kg患者体重，优选为0.01～10mg/kg，更优选为0.1～1mg/kg。给药形式可以根据各种药物制剂的剂型来确定，适合的给药形式有口服、透皮、非肠道注射、粘膜、肌肉、静脉内、皮下、眼内、皮内等给药形式，优选使用喷剂或软膏。本发明的第一个方面所述的长链人胰岛素样生长因子可以单独作为药品、保健食品和/或化妆品使用，也可以添加到其他药品、保健食品和/或化妆品中使用。例如，本发明的纳米化制品可以添加到常规的饮料、食品或化妆品中配合应用。

在第七个方面，本发明提供了制备本发明第一个方面所述长链人胰岛素样生长因子的方法，其包括，用本发明第四个方面所述的宿主细胞表达本发明第一个方面所述的长链人胰岛素样生长因子，然后分离纯化所述长链人胰岛素样生长因子。获得的工程细胞可以通过常规方法培养、诱导来表达所需要的蛋白，包括发酵过程和纯化工艺。上述表达的蛋白可在细胞内、细胞膜上或分泌到细胞周质、细胞外。根据需要，可利用融合蛋白的物理的、化学的以及其它生物学特性，进行分离纯化。方法包括但不限于：裂菌(超声波裂菌、渗透压裂菌)，离心，盐析，分子筛色谱，离子交换色谱，吸附色谱(亲和层析、金属鏊合层析)，反向色谱，高效液相色谱，毛细管电泳，制备性等电聚焦以及常规的变性、复性处理等，这些方法均是本领域技术人员所熟知的。为了能够高效地获得长链人胰岛素样生长因子，尤其是为方便下游分离纯化操作，优选在本发明第七个方面的方法中，用载体pPICZ-LR³IGF-1转染Pichia pastoris酵母表达菌株GS115，其中载体pPICZ-LR³IGF-1含有本发明第二个方面所述的核酸分子。另外，由于本发明的长链人胰岛素样生长因子能够分泌到发酵酵母细胞的培养基中，优选在本发明第七个方面的方法中，分离纯化所述长链人胰岛素样生长因子的步骤包括超滤。其中，本领域技术人员能够选用合适的超滤膜来滤过和/或截留相应分子量的长链人胰岛素样生长因子。

本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。

为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见了。

具体实施方式

以下所述实验方法，没有具体说明的，均按照《分子克隆实验指南》，第三版，2002年，科学出版社(北京))所述方法进行。

实施例1

本发明LR³IGF-1基因的克隆

通过商业途径委托上海泽衡生物技术有限公司合成本发明LR³IGF-1基因并构建成表达质粒载体。克隆过程参照《分子克隆实验指南》以及所用的TaKaRa公司(日本)的T4多核苷酸激酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶所附的操作指南进行，简要过程如下：

通过DNA自动合成仪，合成IGF-1基因的5个核酸片段(序列分别如序列表的序列3、4、5、6、7所示)，用T4多核苷酸激酶(购自TaKaRa公司)将这5个核酸片段的5’端进行磷酸化，然后等摩尔比混合这5个核酸片段后于65℃变性5分钟，退火降温至16℃，加入T4 DNA连接酶(购自TaKaRa公司)连接12小时。然后，取1μL上述连接产物在50μL反应体积中进行PCR，其中正向引物如序列表的序列8所示(引入了EcoR I内切酶位点)、反向引物如序列表的序列9所示(引入了Xba I内切酶位点)，反应条件为：以94℃变性4分钟，然后以94℃变性30秒、63℃退火30秒并72℃延伸30秒进行35个循环，最后以72℃延伸4分钟并降温至4℃。

琼脂糖凝胶电泳上述PCR产物，回收约260bp大小的片段，用EcoR I和Xba I双酶切该片段，并与经这两个内切酶酶切的pPICZαA质粒(购自Invitrogen公司)用T4DNA连接酶进行连接，转化入大肠杆菌Top10F’中。挑出阳性克隆，抽提出其中的质粒，经测序验证无误后由上海泽衡生物技术有限公司将构建好的质粒(命名为pPICZ-LR³IGF-1)寄回。

实施例2

LR³IGF-1酵母分泌表达菌株的构建

按照《分子克隆实验指南》和Invitrogen公司的酵母转化操作指南，将pPICZ-LR³IGF-1导入Pichia pastoris酵母表达菌株GS115(购自Invitrogen公司)。过程如下：

(1)线性化pPICZ-LR³IGF-1质粒DNA：在100μl反应体系中，加入20μgpPICZ-LR³IGF-1质粒DNA和20单位Pme I酶(购自New England Biolabs)，于37℃酶切3小时，加入2μl 200mM EDTA，终止反应。然后，加入100μl去离子水，加入等体积酚/氯仿，剧烈振荡混匀，13000rpm高速离心10分钟，将上清液转入新管，加入1/10体积3M醋酸钠，再加入2.5倍体积无水乙醇，混匀后于-70℃放置1小时，再在4℃以13000rpm离心15分钟，弃去液体，以80％乙醇洗涤一次，空气中晾干，将沉淀重新溶解在10μl去离子水中，置于0℃，待用。

(2)制备酵母菌感受态细胞：在5ml YPD培养基(YPD培养基的配制：900ml水中溶解10g酵母抽提物和20g蛋白胨，高压灭菌后，待冷却至55～60℃时，加入100ml 20％葡萄糖溶液)中接种Pichia pastoris酵母表达菌株GS115，30℃振荡培养过夜，次日转接入500ml新的YPD培养基中，30℃继续培养，直至OD₆₀₀达到1.3～1.5为止。在4℃以1500rpm离心8分钟，弃去上清液，收集沉淀的菌体，加入预冷的500ml无菌去离子水重新悬浮菌体。然后，再次离心，在4℃以1500rpm离心8分钟，弃去上清液，收集沉淀的菌体，以250ml预冷的无菌去离子水重新悬浮菌体。然后，在4℃以1500rpm离心8分钟收集沉淀的菌体，再以20ml预冷的无菌去离子水重新悬浮菌体。最后，在4℃以1500rpm离心8分钟收集沉淀的菌体，再用1ml预冷的1M山梨醇悬浮菌体。将该制备好的感受态细胞置于0℃，待用。

(3)酵母菌的电融合：取80μl上述感受态细胞与5μl上述线性化的pPICZ-LR³IGF-1质粒DNA混合均匀，转入0℃预冷的0.2cm电融合杯中，于0℃放置5分钟。然后进行电击，其中电击的条件如下：1500V，25μF，20Ω。然后立即加入1ml预冷的1M山梨醇，混合均匀后转入一个15ml试管中，于30℃孵育2小时。取200μl分别铺于含不同浓度Zeocin的YPDS平板(YPDS平板的配制：900ml水中溶解10g酵母抽提物、20g蛋白、182.2g山梨醇和20g琼脂，高压灭菌后，待冷却至55～60℃时，加入100ml 20％葡萄糖溶液和1ml 250mg/ml的Zeocin，铺平板)上，倒置，30℃培养2天，挑取阳性克隆，经发酵和SDS-PAGE电泳验证(过程基本同实施例3)无误后，该克隆即为表达本发明LR³IGF-1的重组分泌表达菌株。

实施例3

LR³IGF-1的发酵和纯化

将实施例2中得到的LR³IGF-1的重组分泌表达菌株接种于100ml BMGY培养基中，30℃振荡培养16～18小时，当OD₆₀₀达到2～6之间时，以3000g离心8分钟，弃上清，用20ml BMGY培养基重新悬浮沉淀的菌体并加入100％甲醇0.1ml至终浓度0.5％，于30℃继续振荡培养72小时，期间每隔24小时补加100％甲醇0.1ml。

然后，以3000g离心8分钟，保留发酵上清液，弃去沉淀。向上述发酵上清液中缓慢加入硫酸铵粉末，使硫酸铵饱和度达到80％，由此盐析沉淀出其中的多肽和蛋白质。然后，以7000g离心盐析液15分钟，弃上清，沉淀用10mL 20mM pH8.0的Tris-HCl溶解。接着进行2次超滤：首次超滤用截留分子量为100000Da的超滤膜(购自Millopore，Ultrapore)，保留滤出液；然后将滤出液用截留分子量为1000Da(购自Millopore，Ultrapore)的超滤膜进行超滤，弃去滤出液，用10mL 20mM pH8.0的Tris-HCl洗涤该超滤膜，从而溶出超滤膜截留的多肽。对溶出液进行SDS-PAGE电泳并测定280nm处的吸光度。结果显示，相比用pPICZαA转染后获得的空白菌株发酵后的纯化液，本发明hIGF-1的溶出液在电泳图上的9kDa左右的位置上有明显的条带，其量占蛋白质总量的95％以上，即纯化获得的本发明LR³IGF-1的纯度大于95％，通过OD₂₈₀值得到本发明LR³IGF-1的终产率为0.2～0.3克/升发酵液。

实施例4

本发明LR³IGF-1促细胞增殖活性的测定

采用常规的MTT法测定本发明的LR³IGF-1、Gropep公司的LR³IGF-1和空白对照对细胞的促增殖作用。具体过程如下：用含10％胎牛血清的DMEM培养液将Balb-3T3细胞(可购自美国ATCC，编号为ATCC20864)稀释成1.5*10⁴个细胞/mL。在96孔培养板上每孔分别接种200μL上述细胞液，于37℃、5％CO₂培养24小时。然后，吸去每孔中的培养液，分别加入200μL用含0.4％胎牛血清的DMEM培养液稀释成不同浓度的本发明的LR³IGF-1、Gropep公司的LR³hIGF-1(购自Gropep公司)和空白对照(空白对照为含0.4％胎牛血清的DMEM培养液)液，于37℃、5％CO₂培养24小时。接着向每孔加入20μL 5mg/mL的MTT液，于37℃、5％CO₂继续培养4小时。然后吸去每孔中的培养液，加入150μL DMSO(购自Sigma公司)，37℃放置1小时。由于活细胞可将四唑盐转化成可被DMSO溶解的有色产物，其产量与活细胞数量成正比，因此用酶联免疫检测仪检测490nm处的吸光度，即可估算活细胞数。结果如表1所示，相对于空白对照，本发明的LR³IGF-1和Gropep公司的LR³IGF-1都能显著促进细胞增殖，而且本发明的LR³IGF-1的活性更优于Gropep公司的LR³IGF-1。

表1本发明的LR³IGF-1和Gropep公司的LR³IGF-1对细胞的促增殖作用

实施例5

本发明LR³IGF-1促皮肤创伤愈合作用的测定

按照常规方法制备大鼠烫伤模型，测定本发明LR³IGF-1对大鼠皮肤创伤的促进愈合作用。使Wistar大鼠(购自上海第二军医大学动物中心)吸入乙醚麻醉，剃净大鼠背部，并用脱毛膏脱去毛发。24小时后(即在第1天)，用直径为5mm的皮肤活检用环锯在每只大鼠的背部皮肤上制作全厚度(即表皮加真皮厚度)伤口，并测定伤口面积。固定大鼠，分别将含有1μg/mL本发明的LR³IGF-1、Gropep公司的LR³IGF-1或空白对照(空白对照为生理盐水)的生理盐水50μL滴到大鼠伤口上，待自然干燥后松开大鼠，一天如此进行两次并测定伤口面积。结果如表2所示，相对于空白对照，本发明的LR³IGF-1和Gropep公司的LR³IGF-1都能促进皮肤创伤愈合，减小伤口面积，而且本发明的LR³IGF-1的活性更优于Gropep公司的LR³IGF-1。

表2本发明的LR³IGF-1和Gropep公司的LR³IGF-1对皮肤创伤愈合的促进作用

序列表

<110>朱成钢

<120>长链人胰岛素样生长因子(LR³IGF-1)及其制备和应用方法

<160>9

<210>1

<211>83

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>1

Met Phe Pro Ala Met Pro Leu Ser Ser Leu Phe Val Asn Gly Pro Arg

1 5 10 15

Thr Leu Cys Ala Val Asp Leu Val Glu Ile Val Gln Phe Val Cys Gly

20 25 30

Asp Lys Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly Ser Ser Ser

35 40 45

Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Leu Ala Glu Asp Cys Cys Phe Lys Thr

50 55 60

Cys Asp Leu Lys Lys Ile Asp Met Tyr Cys Val Pro Leu Arg Pro Val

65 70 75 80

Arg Thr Ala

<210>2

<211>252

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>2

atgttccccg ccatgcccct gagcagcctg ttcgtgaacg gcccccgcac cctgtgcgcc 60

gtggacctgg tggagatcgt gcagttcgtg tgcggcgaca agggcttcta cttcaacaag 120

cccaccggct acggcagcag cagccgccgc gccccccaga ccggcctggc cgaggactgc 180

tgcttcaaga cctgcgacct gaagaagatc gacatgtact gcgtgcccct gcgccccgtg 240

cgcaccgcct ga 252

<210>3

<211>85

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工合成

<400>3

atgttccccg ccatgcccct gagcagcctg ttcgtgaacg gcccccgcac cctgtgcgcc 60

gtggacctgg tggagatcgt gcagt 85

<210>4

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工合成

<400>4

cacacgaact gcac 14

<210>5

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工合成

<400>5

tcgtgtgcgg cgacaagggc ttctacttca acaagcccac cggctacggc agcagcagcc 60

gccgcgcccc ccagaccgg 79

<210>6

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工合成

<400>6

ggccaggccg gtct 14

<210>7

<211>88

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工合成

<400>7

cctggccgag gactgctgct tcaagacctg cgacctgaag aagatcgaca tgtactgcgt 60

gcccctgcgc cccgtgcgca ccgcctga 88

<210>8

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工合成

<400>8

ggaattcatg ttccccgcca tgcccct 27

<210>9

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工合成

<400>9

ctctagatca ggcggtgcgc acggggc 27

Claims

1.一种长链人胰岛素样生长因子，其氨基酸序列如序列表中的序列1所示。

2.一种核酸分子，其编码权利要求1所述的长链人胰岛素样生长因子。

3.权利要求2所述的核酸分子，其核苷酸序列如序列表中的序列2所示。

4.一种载体，其含有权利要求2或3所述的核酸分子。

5.一种宿主细胞，其特征在于，所述细胞含有权利要求4所述的载体，或者所述细胞用权利要求2或3所述的核酸分子转化或转染而得。

6.权利要求5所述的宿主细胞，其是酵母。

7.一种用于促进细胞增殖的组合物，其包含权利要求1所述的长链人胰岛素样生长因子以及药学上可接受的载体。

8.权利要求1所述的长链人胰岛素样生长因子在制备用于促进细胞或组织生长、增殖或再生的药物、保健食品和/或化妆品中的应用。

9.权利要求8所述的应用，其应用为在制备用于促进细胞增殖的药物、保健食品或化妆品中的应用

10.权利要求9所述的应用，其应用为在制备用于促进细胞增殖的化妆品中的应用。

11.制备权利要求1所述的长链人胰岛素样生长因子的方法，其包括，用权利要求5或6所述的宿主细胞表达权利要求1所述的长链人胰岛素样生长因子，然后分离纯化所述长链人胰岛素样生长因子。

12.权利要求12所述的方法，其中分离纯化步骤包括超滤。