CN114057890A - 新型共刺激结构域及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种嵌合抗原受体，其包含配体结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号传导结构域，其中所述共刺激结构域包含CD94和/或LTβ的胞内区。本发明还涉及包含此类嵌合抗原受体的工程化免疫细胞及其在治疗疾病，例如癌症、自身免疫性疾病、感染中的用途。

Description

新型共刺激结构域及其用途

技术领域

本发明属于免疫治疗领域。更具体地，本发明涉及包含新型共刺激结构域的嵌合抗原受体，以及包含此类嵌合抗原受体的工程化免疫细胞及其用途。

背景技术

近几年，癌症免疫治疗技术发展迅速，尤其是嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）相关的免疫疗法在血液瘤的治疗上获得了优异的临床效果。CAR-T细胞免疫疗法是将T细胞在体外进行基因改造，使其能够识别肿瘤抗原，在扩增到一定数量后回输至病人体内，进行癌细胞杀伤，从而达到治疗肿瘤的目的。

目前，随着技术的发展，已经出现了四代不同的CAR结构。第一代CAR的胞内信号传导结构域仅包含初级信号传导结构域，例如CD3ζ，因此携带CAR的细胞（例如CAR-T细胞）活性差，体内存活时间短。第二代CAR引入了共刺激结构域，例如CD28或4-1BB，使得细胞能够持续增殖，增强抗肿瘤活性。第三代CAR则包含两个共刺激结构域（例如CD28+4-1BB），第四代CAR则加入了细胞因子或共刺激配体以进一步增强T细胞应答，或加入自杀基因以在需要时使CAR-T细胞自我毁灭。现在临床研究中大多使用的仍然是第二代CAR结构。

然而，CAR-T细胞疗法在临床应用中仍然存在一些问题，例如在血液瘤治疗中存在大量肿瘤复发现象，在实体瘤治疗中应答率不高等等，这些可能是由复杂的肿瘤微环境、CAR-T细胞耗竭等因素造成。

因此，仍然需要对现有的CART细胞疗法进行改进，以促进CAR-T细胞在体内的增殖，抵抗肿瘤微环境的免疫抑制作用，进而提高CAR-T细胞疗法对肿瘤的整体治疗效果。

发明简述

因此，在第一个方面，本发明提供一种嵌合抗原受体，其包含配体结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号传导结构域，其中所述共刺激结构域包含CD94胞内区和/或LTβ胞内区。

在一个实施方案中，所述CD94胞内区与SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列具有至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，LTβ胞内区与SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列具有至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。

在一个实施方案中，所述共刺激结构域进一步包含选自以下蛋白的信号传导结构域：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD2、CD7、CD8、CD18（LFA-1）、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD270（HVEM）、CD272（BTLA）、CD276（B7-H3）、CD278(ICOS)、CD357（GITR）、DAP10、DAP12、LAT、NKG2C、SLP76、PD-1、LIGHT、TRIM、ZAP70以及它们的组合。优选地，所述共刺激结构域进一步包含CD27、CD28、CD134、CD137或CD278的信号传导结构域或它们的组合，更优选进一步包含CD28和/或CD137的信号传导结构域。

在一个实施方案中，所述配体结合结构域是抗体或其抗原结合部分。

在一个实施方案中，所述配体结合结构域选自完整抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、scFv抗体片段、线性抗体、sdAb或纳米抗体。

在一个实施方案中，所述配体结合结构域与选自以下的靶标结合：TSHR、CD19、CD123、CD22、BAFF-R、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII 、GD2、GD3、BCMA、GPRC5D、TnAg、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-l lRa、PSCA、PRSS21、 VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、AFP、Folate 受体α、ERBB2 (Her2/neu)、MUC1、EGFR、CS1、CD138、NCAM、Claudin18.2、Prostase、PAP、ELF2M、Ephrin B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gploo、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、Fucosyl GMl、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、Folate受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、多聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-A1、豆荚蛋白、HPV E6、E7、MAGE Al、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺特异性蛋白、存活蛋白和端粒酶、PCTA-l/Galectin 8、MelanA/MARTl、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG (TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、Cyclin Bl、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B 1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES 1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠道羧酸酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、PD1、PDL1、PDL2、TGFβ、APRIL、NKG2D和它们的任意组合。优选地，所述配体结合结构域与选自以下的靶标结合：所述靶标选自CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD123、CD138、CD171、MUC1、AFP、Folate 受体α、CEA、PSCA、PSMA、Her2、EGFR、IL13Ra2、GD2、NKG2D、EGFRvIII、CS1、BCMA、间皮素和它们的任意组合。

在一个实施方案中，所述跨膜结构域选自以下蛋白质的跨膜结构域：TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3ζ亚基、CD3ε亚基、CD3γ亚基、CD3δ亚基、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。

在一个实施方案中，所述胞内信号传导结构域选自以下蛋白的信号传导结构域：FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d，优选CD3ζ信号传导结构域。

在第二个方面，本发明还提供包含编码本发明的嵌合抗原受体的序列的核酸、包含所述核酸的载体、以及包含所述核酸或载体的免疫细胞。

在一个实施方案中，本发明提供一种核酸，其包含编码本发明的嵌合抗原受体的序列。优选地，所述核酸是DNA或RNA，更优选DNA。

在一个实施方案中，本发明提供包含上述核酸的载体。具体地，所述载体选自线性核酸分子、质粒、逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、牛痘病毒、劳氏肉瘤病毒(RSV)、多瘤病毒和腺相关病毒(AAV)、噬菌体、噬菌粒、粘粒或人工染色体。在一些实施方案中，该载体还包含在免疫细胞中自主复制的起点、选择标记、限制酶切割位点、启动子、多聚腺苷酸尾（polyA）、3’UTR、5’UTR、增强子、终止子 、绝缘子、操纵子、选择标记、报告基因、靶向序列和/或蛋白质纯化标签等元件。在一个具体的实施方案中，所述载体是体外转录的载体。

在一个实施方案中，本发明提供包含本发明的核酸或载体的免疫细胞，其能够表达本发明的嵌合抗原受体。在一个具体的实施方案中，所述免疫细胞选自T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、NK细胞或NKT细胞。优选地，所述T细胞是CD4+/CD8+双阳性T细胞、CD4+辅助T细胞、CD8+T细胞、肿瘤浸润细胞、记忆T细胞、幼稚T细胞、γδ-T细胞或αβ-T细胞。在一个实施方案中，所述免疫细胞衍生自干细胞，例如成体干细胞、胚胎干细胞、脐带血干细胞、祖细胞、骨髓干细胞、诱导多能干细胞、全能干细胞或造血干细胞。

在第三个方面，本发明提供一种药物组合物，包含如上定义的本发明的嵌合抗原受体或其编码核酸、载体或包含它们的免疫细胞，和一种或多种药学上可接受的赋型剂。

在第四个方面，本发明提供一种治疗癌症、感染或自身免疫疾病的方法，包括向所述受试者施用治疗有销量的本发明的嵌合抗原受体、工程化免疫细胞或药物组合物。

本发明还提供如上定义的嵌合抗原受体、核酸、载体、工程化免疫细胞或药物组合物在制备治疗癌症、感染或自身免疫疾病的药物中的用途。

在一个实施方案中，所述癌症选自：脑神经胶质瘤、胚细胞瘤、肉瘤、基底细胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脑和CNS癌症、乳腺癌、腹膜癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠和直肠癌、结缔组织癌症、消化系统的癌症、子宫内膜癌、食管癌、眼癌、头颈癌、胃癌(包括胃肠癌)、胶质母细胞瘤(GBM)、肝癌、肝细胞瘤、上皮内肿瘤、肾癌、喉癌、肝肿瘤、肺癌(例如小细胞肺癌、非小细胞肺癌、腺状肺癌和鳞状肺癌)、黑色素瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、口腔癌(例如唇、舌、口和咽)、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、间皮瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、直肠癌、呼吸系统的癌症、唾液腺癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫或子宫内膜癌、泌尿系统的恶性肿瘤、外阴癌、Waldenstrom巨球蛋白血症、淋巴瘤(包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，例如B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞性(SL)NHL、中间级/滤泡性NHL、中间级扩散性NHL、高级成免疫细胞性NHL、高级成淋巴细胞性NHL、高级小型非裂化细胞性NHL、大肿块病NHL)、套细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、MALT淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞瘤等)、白血病（包括急性白血病，例如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性非淋巴细胞白血病诸如急性粒细胞白血病（包括未分化型和部分分化型）、急性早幼粒细胞白血病、急性粒-单核细胞白血病、急性单核细胞白血病、红白血病、急性巨核细胞白血病；慢性白血病，例如慢性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性单核细胞白血病；和其他特殊类型的白血病例如毛细胞白血病、幼淋巴细胞白血病、浆细胞白血病、成人T细胞白血病、嗜酸性粒细胞白血病、嗜碱性粒细胞白血病等）、母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤、恶性淋巴组织增生疾病、骨髓发育不良、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常、以及移植后淋巴细胞增生性紊乱(PTLD)。

在一个实施方案中，所述感染包括但不限于由病毒、细菌、真菌和寄生虫引起的感染。

在一个实施方案中，所述自身免疫性疾病包括但不限于I型糖尿病、腹腔疾病、格雷夫斯病、炎症性肠病、多发性硬化症、银屑病、类风湿性关节炎、艾迪生病、干燥综合征、桥本甲状腺炎、重症肌无力、血管炎、恶性贫血与系统性红斑狼疮等。

本发明的优势之处在于，来自CD94和/或LTβ的信号传导结构域作为新的共刺激结构域可以提供更好的共刺激能力，增强CAR修饰的工程化免疫细胞的存活和持续性，进而增强CAR细胞对肿瘤的抑制效果。

发明详述

除非另有说明，否则本文中所使用的所有科学技术术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解的相同。

嵌合抗原受体

如本文所用，术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指人工构建的杂合多肽，该杂合多肽一般包括配体结合结构域（例如抗体或其抗原结合部分）、跨膜结构域、共刺激结构域和细胞内信号传导结构域，各个结构域之间通过接头连接。CAR能够利用抗体的抗原结合特性以非MHC限制性的方式将T细胞和其它免疫细胞的特异性和反应性重定向至所选择的靶标。非MHC限制性的抗原识别给予表达CAR的免疫细胞与抗原处理无关的识别抗原的能力，因此绕过了肿瘤逃逸的主要机制。

在第一个方面，本发明提供一种嵌合抗原受体，其包含配体结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号传导结构域，其中所述共刺激结构域包含CD94胞内区和/或LTβ胞内区。

共刺激结构域是来自共刺激分子的细胞内功能性信号传导结构域，其包含所述共刺激分子的整个细胞内部分，或其功能性片段。“共刺激分子”是指在T细胞上与共刺激配体特异性结合，由此介导T细胞的共刺激反应（例如增殖）的同源结合配偶体。传统的嵌合抗原受体使用CD28或4-1BB作为共刺激结构域。本发明的嵌合抗原受体包含新型共刺激结构域，即，来自CD94或LTβ的胞内区。本发明发现， CD94胞内区和/或LTβ胞内区作为新型共刺激结构域的加入能够显著增加CAR细胞的扩增水平，进而提高对肿瘤的抑制效果。

CD94是II型跨膜蛋白，属于C型凝集素家族成员。CD94由180个氨基酸组成，其中胞外区包含两个N连接的糖基化位点。CD94的胞外区包含四个链间二硫键，其中Cys61-Cys72、Cys89-Cys174和Cys152-Cys156是C型凝集素受体特征性的二硫键，而Cys59-Cys70之间的二硫键则是CD94特有的结构。CD94分子中唯一未形成二硫键的Cys58则与NKG2家族分子中相应的半胱氨酸残基形成链间二硫键，从而形成CD94/NKG2异源二聚体。NKG2家族包括NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2D、NKG2E、NKG2F等成员，其中NKG2A、NKG2B、NKG2C和NKG2E能够与CD94结合。CD94/NKG2A（或NKG2B，作为NKG2A是选择性剪切形式）是抑制性受体，能够识别非经典MHC-I类分子HLA-E及其呈递的抗原肽，并通过NKG2A胞内区包含的2个免疫受体酪氨酸抑制基序（ITIM），向NK细胞传递抑制性信号。CD94/NKG2C和CD94/NKG2E是活化性受体，能够通过跨膜区的赖氨酸残基与衔接分子DAP12结合，进而使后者的胞内区包含的免疫受体酪氨酸活化基序（ITAM）中的酪氨酸残基发生磷酸化，募集ZAP-70和Syk，导致NK细胞激活。

一般认为，CD94的胞内区非常短，并不具有信号传递功能。但发明人出乎意料地发现，当用于嵌合抗原受体时，CD94胞内区能够作为共刺激结构域传递信号。因此，在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体包含CD94胞内区作为共刺激结构域，其与SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或其编码序列与SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。

LTβ也称为LTB、淋巴毒素β或p33，在T细胞、NK细胞、CD4+ CTL细胞、B细胞、淋巴因子激活杀伤(LAK)细胞以及多种肿瘤细胞系，例如各种T淋巴瘤细胞、慢性淋巴细胞白血病中的B细胞等的表面广泛表达。LTβ与另一个亚基LTα结合形成异源三聚体复合物LTα1β2或LTα2β1，并通过LTβ包含的疏水氨基酸将整个复合物锚定在细胞膜上。在缺少LTβ的情况下，LTα将被释放到细胞外。研究表明，LTβ单独无法正确聚合，只有与LTα共同组装成异源三聚体复合物才能发挥相应的生物功能。LTβ通过与其特异性受体LTβR的结合发挥其生物功能，例如细胞毒性作用、诱导细胞凋亡、促进细胞增殖、调节免疫系统发育等。

发明人首次发现，LTβ胞内区可以作为共刺激结构域提供刺激信号。因此，在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体包含LTβ胞内区作为共刺激结构域，其与SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或其编码序列与SEQ ID NO:28所示的核苷酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。

除了本发明提供的新型CD94和LTβ共刺激结构域外，本发明的嵌合抗原受体还可以包含一个或多个额外的共刺激结构域，其选自以下蛋白质的共刺激信号传导结构域：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD2、CD7、CD8、CD18（LFA-1）、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD270（HVEM）、CD272（BTLA）、CD276（B7-H3）、CD278(ICOS)、CD357（GITR）、DAP10、DAP12、LAT、NKG2C、SLP76、PD-1、LIGHT、TRIM或ZAP70，优选选自4-1BB、CD28、CD27、OX40或其组合，更优选选自4-1BB、CD28。

在一个实施方案中，本发明的CAR包含CD94胞内区作为共刺激结构域。在一个实施方案中，本发明的CAR包含LTβ胞内区作为共刺激结构域。在一个实施方案中，本发明的CAR包含CD94和4-1BB共刺激结构域。在一个实施方案中，本发明的CAR包含LTβ和4-1BB共刺激结构域。在一个实施方案中，本发明的CAR包含CD94和CD28共刺激结构域。在一个实施方案中，本发明的CAR包含LTβ和CD28共刺激结构域。

4-1BB和CD28共刺激结构域是本领域技术人员已知的。例如，4-1BB共刺激结构域与SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或其编码序列与SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。CD28共刺激结构域与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或其编码序列与SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。

如本文所用，“配体结合结构域”是指可以与配体（例如抗原）结合的任何结构或其功能性变体。配体结合结构域可以是抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、鼠源抗体、嵌合抗体及其抗原结合片段。例如，配体结合结构域包括但不限于完整抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、scFv抗体片段、线性抗体、sdAb(VH或VL)、纳米抗体（Nanobody，Nb）、重组纤连蛋白结构域、anticalin和DARPIN等，优选选自Fab、scFv、sdAb和纳米抗体。在本发明中，配体结合结构域可以是单价或二价，且可以是单特异性、双特异性或多特异性的抗体。

“Fab”是指免疫球蛋白分子被木瓜蛋白酶裂解后产生的两个相同片段中的任一个，由通过二硫键连接的完整轻链和重链N端部分组成，其中重链N端部分包括重链可变区和CH1。与完整的IgG相比，Fab没有Fc片段，流动性和组织穿透能力较高，并且无需介导抗体效应即可单价结合抗原。

“单链抗体”或“scFv”是由抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）通过接头连接而成的抗体。可以选择接头的最佳长度和/或氨基酸组成。接头的长度会明显影响scFv的可变区折叠和相互作用情况。事实上，如果使用较短的接头(例如在5-10个氨基酸之间)，则可以防止链内折叠。关于接头的大小和组成的选择，参见例如，Hollinger等人,1993ProcNatl Acad .Sci .U .S .A .90:6444-6448；美国专利申请公布号2005/0100543、2005/0175606、2007/0014794；以及PCT公布号WO2006/020258和WO2007/024715，其全文通过引用并入本文。scFv可以包含以任何顺序连接的VH和VL，例如VH-接头-VL或VL-接头-VH。

“单结构域抗体”或“sdAb”是指一种天然缺失轻链的抗体，该抗体只包含一个重链可变区（VHH）和两个常规的CH2与CH3区，也称为“重链抗体”。

“纳米抗体”或“Nb”是指单独克隆并表达出来的VHH结构，其具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性，是目前已知的可结合目标抗原的最小单位。

术语“功能性变体”或“功能性片段”是指基本上包含亲本的氨基酸序列但与该亲本氨基酸序列相比含有至少一个氨基酸修饰(即取代、缺失或插入)的变体，条件是所述变体保留亲本氨基酸序列的生物活性。例如，对于抗体，其功能性片段是其抗原结合部分。在一个实施方案中，所述氨基酸修饰优选是保守型修饰。

如本文所用，术语“保守性修饰”是指不会明显影响或改变含有该氨基酸序列的抗体或抗体片段的结合特征的氨基酸修饰。这些保守修饰包括氨基酸取代、添加及缺失。修饰可以通过本领域中已知的标准技术，如定点诱变和PCR介导的诱变而引入本发明的嵌合抗原受体中。保守氨基酸取代是氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基置换的取代。具有类似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中有定义，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)及芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。保守性修饰可以例如基于极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或所涉及残基的两亲性质的相似性来进行选择。

因此，“功能性变体”或“功能性片段”与亲本氨基酸序列具有至少75%，优选至少76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且保留亲本氨基酸的生物活性，例如结合活性。

如本文所用，术语“序列同一性”表示两个(核苷酸或氨基酸)序列在比对中在相同位置处具有相同残基的程度，并且通常表示为百分数。优选地，同一性在被比较的序列的整体长度上确定。因此，具有完全相同序列的两个拷贝具有100％同一性。本领域技术人员将认识到，一些算法可以用于使用标准参数来确定序列同一性，例如Blast (Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402)、Blast2(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410)、Smith-Waterman(Smith等(1981)J.Mol.Biol .147：195-197)和ClustalW。

配体结合结构域的选择取决于待识别的与具体疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标记，例如肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原。因此，在一个实施方案中，本发明的配体结合结构域与选自以下的一个或多个靶标结合：TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、Tn Ag、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-l lRa、PSCA、PRSS21、 VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、Folate 受体α、ERBB2 (Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、Prostase、PAP、ELF2M、Ephrin B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gplOO、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、Fucosyl GMl、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、Folate受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD 179a、ALK、多聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-A1、豆荚蛋白、HPV E6、E7、MAGE Al、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺特异性蛋白、存活蛋白和端粒酶、PCTA-l/Galectin8、MelanA/MARTl、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG (TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、Cyclin Bl、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B 1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES 1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠道羧酸酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、PD1、PDL1、PDL2、TGFβ、APRIL、Claudin18.2、NKG2D和它们的任意组合。优选地，所述靶标选自：CD19、CD20、CD22、BAFF-R、CD33、EGFRvIII、BCMA、GPRC5D、PSMA、ROR1、FAP、ERBB2 (Her2/neu)、MUC1、EGFR、CAIX、WT1、NY-ESO-1、CD79a、CD79b、GPC3、Claudin18.2、NKG2D和它们的任意组合。根据待靶向的抗原，本发明的CAR可以被设计为包括对该抗原具有特异性的配体结合结构域。例如，如果CD19是待靶向的抗原，则CD19抗体可用作本发明的配体结合结构域。

在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体靶向CD19、CD22或其组合。在一个优选的实施方案中，本发明的嵌合抗原受体包含抗CD19抗体，其包含与SEQ ID NO：1第1-107位或SEQ ID NO：29第1-107位所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％、99％或100％序列同一性的轻链可变区序列和与SEQ ID NO：1第123-242位或SEQ ID NO：29第123-238位所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％、99％或100％序列同一性的重链可变区序列。在一个优选的实施方案中，本发明的嵌合抗原受体包含抗CD22抗体，其包含与SEQ ID NO：31第1-124位所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％、99％或100％序列同一性的重链可变区序列和与SEQ ID NO：31第143-249位所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％、99％或100％序列同一性的轻链可变区序列。

如本文所用，术语“跨膜结构域”是指能够使嵌合抗原受体在免疫细胞（例如淋巴细胞、NK细胞或NKT细胞）表面上表达，并且引导免疫细胞针对靶细胞的细胞应答的多肽结构。跨膜结构域可以是天然或合成的，也可以源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。当嵌合抗原受体与靶抗原结合时，跨膜结构域能够进行信号传导。特别适用于本发明中的跨膜结构域可以源自例如TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3ζ亚基、CD3ε亚基、CD3γ亚基、CD3δ亚基、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154及其功能性片段。或者，跨膜结构域可以是合成的并且可以主要地包含疏水性残基如亮氨酸和缬氨酸。优选地，所述跨膜结构域源自CD8α链或CD28，其与SEQ ID NO:3或5所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或其编码序列与SEQ ID NO:4或6所示的核苷酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。

在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体还可以包含位于配体结合结构域和跨膜结构域之间的铰链区。如本文所用，术语“铰链区”一般是指作用为连接跨膜结构域至配体结合结构域的任何寡肽或多肽。具体地，铰链区用来为配体结合结构域提供更大的灵活性和可及性。铰链区可以包含最多达300个氨基酸，优选10至100个氨基酸并且最优选25至50个氨基酸。铰链区可以全部或部分源自天然分子，如全部或部分源自CD8、CD4或CD28的胞外区，或全部或部分源自抗体恒定区。或者，铰链区可以是对应于天然存在的铰链序列的合成序列，或可以是完全合成的铰链序列。在优选的实施方式中，所述铰链区包含CD8α链、FcγRIIIα受体、CD28、IgG4或IgG1的铰链区部分，更优选来自CD8α、CD28或IgG4的铰链，其与SEQ ID NO:19、21或23所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或者其编码序列与SEQ ID NO:20、22或24所示的核苷酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。

如本文所用，术语“胞内信号传导结构域”是指转导效应子功能信号并指导细胞进行指定功能的蛋白质部分。胞内信号传导结构域负责在配体结合结构域结合抗原以后的细胞内信号传递，从而导致免疫细胞和免疫反应的活化。换言之，胞内信号传导结构域负责活化其中表达CAR的免疫细胞的正常的效应子功能的至少一种。例如，T细胞的效应子功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。

在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体包含的胞内信号传导结构域可以是T细胞受体和共受体的细胞质序列，其在抗原受体结合以后一同起作用以引发信号传导，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同或相似功能的任何合成序列。胞内信号传导结构域可以包含许多免疫受体酪氨酸激活基序（Immunoreceptor Tyrosine-basedActivation Motifs, ITAM）。本发明的胞内信号传导结构域的非限制性施例包括但不限于源自FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。在优选的实施方式中，本发明CAR的信号传导结构域可以包含CD3ζ信号传导结构域，该信号传导结构域与SEQ ID NO:11或13所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或其编码序列与SEQ ID NO:12或14所示的核苷酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。

在一个实施方案中，共刺激结构域和胞内信号传递结构域可以任何顺序可操作连接。例如，共刺激结构域可以位于近膜端，而胞内信号传导结构域位于远膜端，或者刺激结构域位于远膜端，而胞内信号传导结构域位于近膜端。当含有两个或更多个共刺激结构域时，共刺激结构域可以位于胞内信号传递结构域的一侧或两侧。

在一个实施方案中，本发明的CAR还可以包含信号肽，使得当其在细胞例如T细胞中表达时，新生蛋白质被引导至内质网并随后引导至细胞表面。信号肽的核心可以含有长的疏水性氨基酸区段，其具有形成单个α-螺旋的倾向。在信号肽的末端，通常有被信号肽酶识别和切割的氨基酸区段。信号肽酶可以在移位期间或完成后切割，以产生游离信号肽和成熟蛋白。然后，游离信号肽被特定蛋白酶消化。可用于本发明的信号肽是本领域技术人员熟知的，例如衍生自CD8α、IgG1、GM-CSFRα、B2M等的信号肽。在一个实施方案中，可用于本发明的信号肽与SEQ ID NO:15或17所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或该信号肽的编码序列与SEQ ID NO:16或18所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。

在一个实施方案中，本发明的CAR还可以包含开关结构，以调控CAR的表达时间。例如，开关结构可以是二聚化结构域的形式，通过与其相应配体的结合引起构象变化，暴露胞外结合结构域，使其与被靶向抗原结合，从而激活信号传导通路。或者，也可以使用开关结构域分别连接结合结构域和信号传导结构域，仅当开关结构域互相结合（例如在诱导化合物的存在下）时，结合结构域和信号传导结构域才能通过二聚体连接在一起，从而激活信号通路。开关结构还可以是掩蔽肽的形式。掩蔽肽可以遮蔽胞外结合结构域，阻止其与被靶向抗原的结合，当通过例如蛋白酶切割掩蔽肽后，就可以暴露胞外结合结构域，使其成为一个“普通”的CAR结构。本领域技术人员知晓的各种开关结构均可用于本发明。

在一个实施方案中，本发明的CAR还可以包含自杀基因，即，使其表达一个可通过外源物质诱导的细胞死亡信号，以在需要时（例如产生严重的毒副作用时）清除CAR细胞。例如，自杀基因可以是插入的表位的形式，例如CD20表位、RQR8等，当需要时，可以通过加入靶向这些表位的抗体或试剂来消除CAR细胞。自杀基因也可以是单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK），该基因可使细胞在接受更昔洛韦治疗诱导下死亡。自杀基因还可以是iCaspase-9，可以通过化学诱导药物如AP1903、AP20187等诱导iCaspase-9发生二聚化，从而激活下游的Caspase3分子，导致细胞凋亡。本领域技术人员知晓的各种自杀基因均可用于本发明。

核酸

本发明还提供一种核酸分子，其包含编码本发明的嵌合抗原受体的核酸序列。

如本文所用，术语“核酸分子”包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的序列，如经修饰的或未经修饰的RNA或DNA，各自为单链和/或双链形式的线性或环状，或它们的混合物(包括杂合分子)。因此，根据本发明的核酸包括DNA (比如dsDNA、ssDNA、cDNA)、RNA(比如dsRNA、ssRNA、mRNA、ivtRNA)，它们的组合或衍生物(比如PNA)。优选地，所述核酸是DNA或RNA，更优选mRNA。

核酸可以包含常规的磷酸二酯键或非常规的键(如酰胺键，比如在肽核酸(PNA)中发现的)。本发明的核酸还可含有一种或多种经修饰的碱基，比如，例如三苯甲基化的碱基和不常见的碱基(比如肌苷)。也可以想到其它修饰，包括化学、酶促或代谢修饰，只要本发明的多链CAR可以从多核苷酸表达即可。核酸可以以分离的形式提供。在一个实施方案中，核酸也可以包括调节序列，比如转录控制元件(包括启动子、增强子、操纵子、抑制子和转录终止信号)、核糖体结合位点、内含子等。

可以对本发明的核酸序列进行密码子优化以在所需的宿主细胞(如，免疫细胞)中进行最佳表达；或者用于在细菌、酵母菌或昆虫细胞中表达。密码子优化是指将目标序列中存在的在给定物种的高度表达的基因中一般罕见的密码子替换为在这类物种的高度表达的基因中一般常见的密码子，而替换前后的密码子编码相同的氨基酸。因此，最佳密码子的选择取决于宿主基因组的密码子使用偏好。

载体

本发明还提供一种载体，包含如本发明所述的核酸分子。

如本文所用，术语“载体”是用作将(外源)遗传材料转移到宿主细胞中的媒介核酸分子，在该宿主细胞中所述核酸分子可以例如复制和/或表达。

载体一般包括靶向载体和表达载体。“靶向载体”是通过例如同源重组或使用特异性靶向位点处序列的杂合重组酶将分离的核酸递送至细胞内部的介质。“表达载体”是用于异源核酸序列(例如编码本发明的嵌合抗原受体多肽的那些序列)在合适的宿主细胞中的转录以及它们的mRNA的翻译的载体。可用于本发明的合适载体是本领域已知的，并且许多可商购获得。在一个实施方案中，本发明的载体包括但不限于质粒、病毒例如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、牛痘病毒、劳氏肉瘤病毒(RSV)、多瘤病毒和腺相关病毒(AAV)等、噬菌体、噬菌粒、粘粒和人工染色体(包括BAC和YAC)。载体本身通常是核苷酸序列，通常是包含插入物(转基因)的DNA序列和作为载体“骨架”的较大序列。工程化载体通常还包含在宿主细胞中自主复制的起点(如果需要多核苷酸的稳定表达)、选择标记和限制酶切割位点(如多克隆位点，MCS)。载体可另外包含启动子、多聚腺苷酸尾（polyA）、3’ UTR、增强子、终止子、绝缘子、操纵子、选择标记、报告基因、靶向序列和/或蛋白质纯化标签等元件。在一个具体的实施方案中，所述载体是体外转录的载体。

工程化免疫细胞

本发明提供工程化免疫细胞，其包含嵌合抗原受体或其编码核酸。

如本文所用，术语“免疫细胞”是指免疫系统的具有一种或多种效应子功能(例如，细胞毒性细胞杀伤活性、分泌细胞因子、诱导ADCC和/或CDC)的任何细胞。免疫细胞可以从多种来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸膜积液、脾组织及肿瘤。免疫细胞还可以衍生自成体干细胞、胚胎干细胞、脐带血干细胞、祖细胞、骨髓干细胞、诱导多能干细胞、全能干细胞或造血干细胞等干细胞。例如，免疫细胞可以是T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、NK细胞和/或NKT细胞。优选地，免疫细胞是T细胞。T细胞可以是任何T细胞，如体外培养的T细胞，例如原代T细胞，或者来自体外培养的T细胞系例如Jurkat、SupT1等的T细胞，或获得自受试者的T细胞。受试者的实例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。 T细胞也可以被浓缩或纯化。T细胞可以是任何类型的T细胞并且可以处于任何发育阶段，包括但不限于，CD4+/CD8+双阳性T细胞、CD4+辅助T细胞（例如Th1和Th2细胞）、CD8+T细胞(例如，细胞毒性T细胞)、肿瘤浸润细胞、记忆T细胞、幼稚T细胞、γδ-T细胞、αβ-T细胞等。在一个优选的实施方案中，免疫细胞是人T细胞、NK细胞或NKT细胞。可以使用本领域技术人员已知的多种技术，如Ficoll分离从受试者的血液获得T细胞。在本发明中，免疫细胞被工程化以表达嵌合抗原受体多肽。

采用本领域已知的常规方法(如通过转导、转染、转化等)可以将编码嵌合抗原受体多肽的核酸序列引入免疫细胞，使其表达本发明的嵌合抗原受体多肽。“转染”是将核酸分子或多核苷酸(包括载体)引入靶细胞的过程。一个例子是RNA转染，即将RNA(比如体外转录的RNA，ivtRNA)引入宿主细胞的过程。该术语主要用于真核细胞中的非病毒方法。术语“转导”通常用于描述病毒介导的核酸分子或多核苷酸的转移。动物细胞的转染通常涉及在细胞膜中打开瞬时的孔或“洞”，以允许摄取材料。可以使用磷酸钙、通过电穿孔、通过细胞挤压或通过将阳离子脂质与材料混合以产生与细胞膜融合并将它们的运载物沉积入内部的脂质体，进行转染。用于转染真核宿主细胞的示例性技术包括脂质囊泡介导的摄取、热休克介导的摄取、磷酸钙介导的转染(磷酸钙/DNA共沉淀)、显微注射和电穿孔。术语“转化”用于描述核酸分子或多核苷酸(包括载体)向细菌中、也向非动物真核细胞(包括植物细胞)中的非病毒转移。因此，转化是细菌或非动物真核细胞的基因改变，其通过细胞膜从其周围直接摄取并随后并入外源遗传材料(核酸分子)而产生。转化可以通过人工手段实现。为了发生转化，细胞或细菌必须处于感受态的状态。对于原核转化，技术可包括热休克介导的摄取、与完整细胞的细菌原生质体融合、显微注射和电穿孔。

还在一个实施方案中，本发明的免疫细胞还包含一种选自以下的基因的表达被抑制或沉默：CD52、GR、TCRα、TCRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD247ζ、HLA-I、HLA-II基因、免疫检查点基因如PD1、LAG3、TIM3、CTLA4、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、HAVCR2、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、TGFBRII、TGFRBRI、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2和GUCY1B3。更特别地，免疫细胞中的至少TCRα或TCRβ基因，和/或HLA-I或HLA-II被失活。这种策略对于避免或降低免疫排斥风险特别有用。使基因表达被抑制或沉默的方法是本领域已知的，例如可以使用反义RNA、RNA诱饵、RNA适体、siRNA、shRNA/miRNA、反式显性阴性蛋白(TNP)、嵌合/融合蛋白、趋化因子配体、抗感染性细胞蛋白、细胞内抗体(sFvs)、核苷类似物(NRTI)、非核苷类似物(NNRTI)、整合酶抑制剂(寡核苷酸、二核苷酸和化学剂)和蛋白酶抑制剂来抑制基因的表达。或者，也可以通过例如大范围核酸酶、锌指核酸酶、TALE核酸酶或CRISPR系统中的Cas酶介导DNA断裂，从而使基因沉默。

药物组合物

本发明还提供一种药物组合物，其包含本发明所述的嵌合抗原受体、核酸、载体或工程化免疫细胞作为活性剂，和一种或多种药学上可接受的赋型剂。因此，本发明还涵盖所述嵌合抗原受体、核酸、载体或工程化免疫细胞在制备药物组合物或药物中的用途。

如本文所用，术语“药学上可接受的赋型剂” 是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容（即，能够引发所需的治疗效果而不会引起任何不希望的局部或全身作用）的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's PharmaceuticalSciences.Edited by Gennaro AR,19th ed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)。药学上可接受的赋型剂的实例包括但不限于填充剂、粘合剂、崩解剂、包衣剂、吸附剂、抗粘附剂、助流剂、抗氧化剂、调味剂、着色剂、甜味剂、溶剂、共溶剂、缓冲剂、螯合剂、表面活性剂、稀释剂、润湿剂、防腐剂、乳化剂、包覆剂、等渗剂、吸收延迟剂、稳定剂和张力调节剂。本领域技术人员已知选择合适的赋型剂以制备本发明期望的药物组合物。用于本发明的药物组合物中的示例性赋型剂包括盐水、缓冲盐水、葡萄糖和水。通常，合适的赋形剂的选择尤其取决于所使用的活性剂、待治疗的疾病和药物组合物的期望剂型。

根据本发明的药物组合物可适用于多种途径施用。通常，通过胃肠外完成施用。胃肠外递送方法包括局部、动脉内、肌内、皮下、髓内、鞘内、心室内、静脉内、腹膜内、子宫内、阴道内、舌下或鼻内施用。

根据本发明的药物组合物也可以制备成各种形式，如固态、液态、气态或冻干形式，特别可以是软膏、乳膏、透皮贴剂、凝胶、粉末、片剂、溶液、气雾剂、颗粒、丸剂、混悬剂、乳剂、胶囊、糖浆、酏剂、浸膏剂、酊剂或流浸膏提取物的形式，或者是特别适用于所需施用方法的形式。本发明已知的用于生产药物的过程可包括例如常规混合、溶解、制粒、制糖衣、研磨、乳化、包封、包埋或冻干过程。包含例如本文所述的免疫细胞的药物组合物通常以溶液形式提供，并且优选包含药学上可接受的缓冲剂。

根据本发明的药物组合物还可以与一种或多种适用于治疗和/或预防待治疗疾病的其它药剂组合施用。适用于组合的药剂的优选实例包括已知的抗癌药物，比如顺铂、美登素衍生物、雷查霉素(rachelmycin)、卡里奇霉素(calicheamicin)、多西紫杉醇、依托泊苷、吉西他滨、异环磷酰胺、伊立替康、美法仑、米托蒽醌、sorfimer卟啉钠II(sorfimersodiumphotofrin II)、替莫唑胺、拓扑替康、葡萄糖醛酸曲美沙特(trimetreateglucuronate) 、奥利斯他汀E(auristatin E)、长春新碱和阿霉素；肽细胞毒素，比如蓖麻毒素、白喉毒素、假单胞菌细菌外毒素A、DNA酶和RNA酶；放射性核素，比如碘131、铼186、铟111、铱90、铋210和213、锕225和砹213；前药，比如抗体定向的酶前药；免疫刺激剂，比如IL-2，趋化因子比如IL-8、血小板因子4、黑色素瘤生长刺激蛋白等；抗体或其片段，比如抗CD3抗体或其片段，补体活化剂，异种蛋白结构域，同种蛋白结构域，病毒/细菌蛋白结构域和病毒/细菌肽。此外，本发明的药物组合物页可以与其他一种或多种治疗方法，例如化疗、放疗组合使用。

制备工程化免疫细胞的方法

本发明还提供一种制备工程化免疫细胞的方法，包括将本发明的嵌合抗原受体或其编码核酸序列引入免疫细胞，以使所述免疫细胞表达本发明的嵌合抗原受体。

在一个实施方案中，所述免疫细胞是人免疫细胞，更优选人T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、NK细胞和/或NKT细胞。

将核酸或载体引入免疫细胞并进行表达的方法是本领域已知的。例如，可以通过物理方法，如括磷酸钙沉淀法、脂质转染法、粒子轰击法、显微注射法、电穿孔法等将核酸或载体导入免疫细胞。或者，也可以采用化学方法，如通过胶体分散系统，如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠粒以及基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束及脂质体引入核酸或载体。此外，还可以使用生物方法引入核酸或载体。例如，病毒载体，尤其是逆转录病毒载体等已经成为将基因插入哺乳动物，例如人细胞中的最常用方法。其它病毒载体可以来源于慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒及腺相关病毒等。

将核酸或载体引入免疫细胞后，本领域技术人员可以通过常规技术对所得免疫细胞进行扩增和活化。

治疗应用

本发明还提供一种治疗患有癌症、感染或自身免疫性疾病的受试者的方法，包括向所述受试者施用有效量的根据本发明所述的嵌合抗原受体、核酸分子、载体、工程化免疫细胞或药物组合物。因此，本发明还涵盖所述嵌合抗原受体、核酸分子、载体或工程化免疫细胞在制备治疗癌症、感染或自身免疫性疾病的药物中的用途。

在一个实施方案中，直接向受试者施用有效量的本发明的免疫细胞和/或药物组合物。

在另一个实施方案中，本发明的治疗方法是离体治疗。具体地，该方法包括以下步骤：（a）提供受试者的样品，所述样品包含免疫细胞；(b)在体外将本发明的嵌合抗原受体引入所述免疫细胞，获得经修饰的免疫细胞，(c)向有此需要的受试者施用所述经修饰的免疫细胞。优选地，步骤(a)中提供的免疫细胞选自T细胞、NK细胞和/或NKT细胞；并且所述免疫细胞可以通过本领域已知的常规方法从受试者的样品(特别是血液样品)中获得。然而，也可以使用能够表达本发明的嵌合抗原受体并发挥如本文所述的所需生物效应功能的其它免疫细胞。此外，通常选择的免疫细胞与受试者的免疫系统相容，即优选所述免疫细胞不引发免疫原性响应。例如，可以使用“通用接受体细胞”，即发挥所需生物效应功能的普遍相容的可在体外生长和扩增的淋巴细胞。使用此类细胞将不需要获得和/或提供受试者自身淋巴细胞。步骤(c)的离体引入可以通过经由电穿孔将本文所述的核酸或载体引入免疫细胞或通过用病毒载体感染免疫细胞来实施，所述病毒载体为如前所述的慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或逆转录病毒载体。其它可想到的方法包括使用转染试剂(比如脂质体)或瞬时RNA转染。

在一个实施方案中，所述免疫细胞是自体或同种异体的细胞，优选T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、NK细胞和/或NKT细胞，更优选T细胞、NK细胞或NKT细胞。

如本文所用，术语“自体”是指来源于个体的任何材料稍后将被再引入该相同个体中。

如本文所用，术语“同种异体”是指任何材料来源于与引入该材料的个体相同物种的不同动物或不同患者。当在一个或多个基因座处的基因不同时，认为两个或更多个体彼此为同种异体的。在一些情况下，来自同一物种的各个体的同种异体材料在基因上的不同可能足以发生抗原相互作用。

如本文所用，术语“受试者”是哺乳动物。哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些实例。除人以外的哺乳动物可以有利地用作代表癌症动物模型的受试者。优选地，所述受试者是人。

在一个实施方案中，所述癌症是与配体结合结构域结合的靶标表达有关的癌症。例如，所述癌症包括但不限于：脑神经胶质瘤、胚细胞瘤、肉瘤、基底细胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脑和CNS癌症、乳腺癌、腹膜癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠和直肠癌、结缔组织癌症、消化系统的癌症、子宫内膜癌、食管癌、眼癌、头颈癌、胃癌(包括胃肠癌)、胶质母细胞瘤(GBM)、肝癌、肝细胞瘤、上皮内肿瘤、肾癌、喉癌、肝肿瘤、肺癌(例如小细胞肺癌、非小细胞肺癌、腺状肺癌和鳞状肺癌)、黑色素瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、口腔癌(例如唇、舌、口和咽)、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、间皮瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、直肠癌、呼吸系统的癌症、唾液腺癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫或子宫内膜癌、泌尿系统的恶性肿瘤、外阴癌、Waldenstrom巨球蛋白血症、淋巴瘤(包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，例如B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞性(SL)NHL、中间级/滤泡性NHL、中间级扩散性NHL、高级成免疫细胞性NHL、高级成淋巴细胞性NHL、高级小型非裂化细胞性NHL、大肿块病NHL)、套细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、MALT淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞瘤等)、白血病（包括急性白血病，例如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性非淋巴细胞白血病诸如急性粒细胞白血病（包括未分化型和部分分化型）、急性早幼粒细胞白血病、急性粒-单核细胞白血病、急性单核细胞白血病、红白血病、急性巨核细胞白血病；慢性白血病，例如慢性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性单核细胞白血病；和其他特殊类型的白血病例如毛细胞白血病、幼淋巴细胞白血病、浆细胞白血病、成人T细胞白血病、嗜酸性粒细胞白血病、嗜碱性粒细胞白血病等）、母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤、恶性淋巴组织增生疾病、骨髓发育不良、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常、以及移植后淋巴细胞增生性紊乱(PTLD)；以及其他与靶标表达有关的疾病。优选地，可以用本发明的工程化免疫细胞或药物组合物治疗的疾病选自：白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、脑神经胶质瘤、胰腺癌、卵巢癌、间皮瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、黑色素瘤、骨髓瘤、肉瘤、胃癌等。

在一个实施方案中，所述感染包括但不限于由病毒、细菌、真菌和寄生虫引起的感染。

在一个实施方案中，所述自身免疫性疾病包括但不限于I型糖尿病、腹腔疾病、格雷夫斯病、炎症性肠病、多发性硬化症、银屑病、类风湿性关节炎、艾迪生病、干燥综合征、桥本甲状腺炎、重症肌无力、血管炎、恶性贫血与系统性红斑狼疮等。

在一个实施方案中，所述方法还进一步包括向所述受试者施用一种或多种额外的化疗剂、生物制剂、药物或治疗。在该实施方案 中，化疗剂、生物制剂、药物或治疗选自放射疗法、手术、抗体试剂和/或小分子和它们的任意组合。

下面将参考附图并结合实例来详细说明本发明。需要说明的是，本领域的技术人员应该理解本发明的附图及其实施例仅仅是为了例举的目的，并不能对本发明构成任何限制。在不矛盾的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

附图说明

图1示出了本发明中嵌合抗原受体的结构示意图。

图2示出了z-CAR、94z-CAR和LTBz-CAR T细胞中的scFv表达水平。

图3示出了表达z-CAR、94z-CAR和LTBz-CAR的CAR-T细胞的扩增水平。

图4示出了表达bbz-CAR、bbz94-CAR和bbzLTB-CAR的CAR-T细胞中的scFv表达水平。

图5示出了表达bbz-CAR、bbz94-CAR和bbzLTB-CAR的CAR-T细胞在各种效靶比浓度下对靶细胞的杀伤效果。

图6示出了表达bbz-CAR、bbz94-CAR和bbzLTB-CAR的CAR-T细胞的细胞因子释放水平。

图7示出了表达bbz-CAR、bbz94-CAR和bbzLTB-CAR的CAR-T细胞在体内的扩增水平。

图8示出了接受CAR-T细胞处理的各组带瘤小鼠的存活率。

具体实施方式

本发明所有实施例中使用的T细胞是通过Ficoll-PaqueTM PREMIUM(GEHealthcare，货号17-5442-02)采用白细胞分离术从健康供体分离的原代人CD4+CD8+T细胞。

实施例1. 制备CAR T细胞

合成以下编码序列，并将其克隆至pGEM-T Easy载体（Promega，货号A1360），制备CAR构建体：CD8α信号肽（SEQ ID NO：18）、抗CD19 scFv（SEQ ID NO：2）、CD8α铰链区（SEQ ID NO：20）、CD8α跨膜区（SEQ ID NO：4）、共刺激结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域（SEQ ID NO：12），其中共刺激结构域是无（z-CAR）、CD94胞内区（SEQ ID NO：26，94z-CAR）或LTβ胞内区（SEQ ID NO：28，LTBz-CAR），并通过测序确认目标序列的正确插入。CAR的结构如图1所示。

在无菌管中加入3ml Opti-MEM（Gibco，货号31985-070）稀释上述质粒后，再根据质粒: 病毒包装载体：病毒包膜载体=4:2:1的比例加入包装载体psPAX2（Addgene，货号12260）和包膜载体pMD2.G（Addgene，货号12259）。然后，加入120ul X-treme GENE HP DNA转染试剂（Roche，货号06366236001），立即混匀，于室温下孵育15min，然后将质粒/载体/转染试剂混合物逐滴加入到293T细胞的培养瓶中。在24小时和48小时收集病毒，将其合并后，超速离心（25000g，4℃，2.5小时）获得浓缩的慢病毒。

用DynaBeads CD3/CD28 CTSTM（Gibco,货号40203D）激活T细胞，并在37℃和5％CO2下培养1天。然后，加入浓缩的慢病毒，持续培养3天后，获得靶向CD19的传统z-CAR T细胞以及本发明的94z-CAR T和LTBz-CAR T细胞。未经修饰的野生型T细胞用作阴性对照（NT）。

在37℃和5％CO2下培养11天之后，使用Biotin-SP (long spacer) AffiniPureGoat Anti-Mouse IgG, F(ab')₂ Fragment Specific(min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot)（jackson immunoresearch，货号115-065-072）作为一抗，APC Streptavidin（BDPharmingen，货号554067）或PE Streptavidin（BD Pharmingen，货号554061）作为二抗，通过流式细胞仪检测CAR-T细胞上的scFv的表达水平，结果如图2所示。

可以看出，本发明制备的CAR T细胞中的scFv均可以有效表达。

实施例2：CAR-T细胞的体外扩增水平

为了检测CAR-T细胞体外扩增的能力，首先以1x10⁶/孔将携带绿色荧光蛋白基因的Nalm6靶细胞铺入24孔板中，然后分别以1：1的效靶比（即效应T细胞与靶细胞之比）将表达94z-CAR、LTBz-CAR或z-CAR的CAR-T细胞铺入24孔板进行共培养（D0），并分别在D4、D8、D12、D16、D20按照1：1的效靶比持续加入靶细胞，定期统计CAR T细胞的扩增数量，结果如图3所示。

可以看出，不含共刺激结构域的z-CAR T细胞在D12之后的扩增水平逐渐下降，而94z-CAR和LTBz-CAR T细胞能够持续进行扩增，并且在D12后的体外扩增水平显著高于z-CAR T组。这表明，CD94胞内区和LTβ胞内区可以作为共刺激结构域高效地向T细胞提供刺激信号，从而提高CAR-T细胞的扩增水平。

实施例3：CAR T细胞对靶细胞的杀伤效果和细胞因子释放

3.1 制备CAR-T细胞

合成以下编码序列，并将其克隆至pGEM-T Easy载体（Promega，货号A1360），制备CAR构建体：CD8α信号肽（SEQ ID NO：18）、抗CD19 scFv（SEQ ID NO：30）、CD8α铰链区（SEQ ID NO：20）、CD8α跨膜区（SEQ ID NO：4）、4-1BB共刺激结构域（SEQ ID NO：10）、CD3ζ胞内信号传导结构域（SEQ ID NO：12），并通过测序确认目标序列的正确插入，获得bbz-CAR。

在bbz-CAR中分别进一步包含额外的共刺激结构域CD94胞内区（SEQ ID NO：26）或LTβ胞内区（SEQ ID NO：28），获得bbz94-CAR和bbzLTB-CAR。CAR的结构如图1所示。

根据实施例1所述的方法，用流式细胞术检测上述CAR-T细胞中的scFv表达水平，结果如图4所示。

可以看出，本发明制备的bbz-CAR、bbz94-CAR和bbzLTB-CAR T细胞中的scFv均可以有效表达。

3.2 CAR-T细胞对靶细胞的杀伤效果

当T细胞对靶细胞有杀伤时，靶细胞的数量就会减少。将T细胞和带有可表达荧光素酶的靶细胞共培养后，靶细胞数量减少的同时，分泌的荧光素酶也会随之减少。荧光素酶可以催化荧光素转化为氧化性荧光素，而在此氧化过程中，会产生生物发光，并且这种发光的强度将取决于靶细胞表达的荧光素酶的水平。因此，检测的荧光强度能够反应T细胞对靶细胞的杀伤能力。

为了检测CAR-T细胞对靶细胞的杀伤能力，首先以1x10⁴/孔将携带荧光素基因的Nalm6靶细胞铺入96孔板中，然后分别以10:1、5：1或2.5：1的效靶比（即效应T细胞与靶细胞之比）将表达bbz94-CAR、bbzLTB-CAR或bbz-CAR的细胞和NT细胞铺入到96孔板进行共培养，16-18小时后利用酶标仪测定荧光值。根据计算公式：（靶细胞荧光均值-样品荧光均值）/靶细胞荧光均值×100%，计算得到杀伤效率，结果如图5所示。

可以看出，与NT相比，在各种效靶比浓度下，本发明的CAR T细胞对靶细胞的特异性杀伤效果与传统的bbz-CAR T细胞相当。

3.3 CAR-T细胞的细胞因子释放

T细胞杀伤靶细胞时，靶细胞数量减少的同时也会释放细胞因子IL-2和IFN-γ等。根据以下步骤，使用酶联免疫吸附法（ELISA）来测定CAR T细胞杀伤靶细胞时细胞因子IL-2和IFN-γ的释放水平。

（1）收集细胞共培养上清液

以1x10⁵/孔的浓度将靶细胞Nalm6铺于96孔板中，然后以1:1的比例将bbz94-CAR、bbzLTB-CAR、bbz-CAR T细胞和NT细胞分别与靶细胞共培养，18-24小时后收集细胞共培养上清液。

（2）ELISA检测上清中IL-2和IFN-γ的分泌量

使用捕获抗体 Purified anti-human IL2 Antibody（Biolegend，货号500302）或Purified anti-human IFN-γ Antibody（Biolegend，货号506502）包被96孔板4℃孵育过夜，然后移除抗体溶液，加入250μL含有2% BSA（sigma，货号V900933-1kg）的PBST（含0.1%吐温的1XPBS）溶液，37℃孵育2小时。然后用250μL PBST（含0.1%吐温的1XPBS）清洗板3次。每孔加入50μL细胞共培养上清液或标准品，并在37℃孵育1小时，然后用250μL PBST（含0.1%吐温的1XPBS）清洗板3次。然后向各孔分别加入50μL检测抗体 Anti-Interferon gamma抗体[MD-1] (Biotin) (abcam，货号ab25017) ，在37℃孵育1小时后，用250μL PBST（含0.1%吐温的1XPBS）清洗板3次。再加入HRP Streptavidin（Biolegend，货号405210），在37℃孵育30分钟后，弃上清液，加入250μL PBST（含0.1%吐温的1XPBS），清洗5次。向各孔加入50μLTMB底物溶液。使反应在室温下于暗处发生30分钟，之后向各孔中加入50μL 1mol/L H₂SO₄以停止反应。在停止反应的30分钟内，使用酶标仪检测450nm处吸光度，并根据标准曲线（根据标准品的读值和浓度绘制）计算细胞因子的含量，结果如图6所示。

可以看出，NT组中均没有检测到IL-2和IFN-γ的释放，表明bbz-CAR T细胞和本发明CAR T细胞对靶细胞的杀伤是特异性的。此外，与传统的bbz-CAR T细胞相比，bbz94-CART细胞的IL-2释放水平没有显著变化，但IFN-γ的释放水平明显较高；而bbzLTB-CAR T细胞的IL-2和IFN-γ的释放水平均优于bbz-CAR T组。因此，总体上，本发明的bbz94-CAR T细胞和bbzLTB-CAR T细胞的细胞因子释放水平均优于传统的bbz-CAR T细胞。

实施例3 CAR-T 细胞的肿瘤抑制效果验证

在小鼠模型体内验证CAR-T细胞对肿瘤的抑制效果。

将20只8周龄的健康雌性NCG小鼠分成四组： NT组（阴性对照）、bbz-CAR T组、bbz94-CAR T组和bbzLTB-CAR T组。在第0天（D0），向每只小鼠尾静脉注射1x10⁶个Nalm6细胞。7天后（D7），根据分组情况向每只小鼠尾静脉注射PBS溶液或者2x10⁶个NT细胞、bbz-CART细胞、bbz94-CAR T细胞或bbzLTB-CAR T细胞。

在D21，对bbz-CAR T、bbz94-CAR T和bbzLTB-CAR T组的小鼠进行颌下静脉取血，并通过Trucount FACS分析hCD8和hCD4的表达水平，从而检测CAR T细胞在小鼠体内的扩增情况，结果如图7所示。

可以看出，在检测的所有CAR T组小鼠体内均检测到T细胞扩增，并且bbz94-CAR T组和bbzLTB-CAR T组中CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的扩增显著高于bbzCAR T组。

此外，发明人还统计了截至本实验结束（即，接种肿瘤细胞Nalm6后第53天），各组小鼠的存活百分比（图8）。其中， NT组小鼠在第21天全部死亡，用bbz-CAR T细胞处理的小鼠仅存活一只（占20%），而用bbz94-CAR T细胞处理的小鼠仍有3只存活（占60%），bbzLTB-CAR T组则有4只小鼠存活，存活率高达80%。这表明，CD94和LTβ共刺激结构域的加入能够显著提高CAR-T细胞对肿瘤的抑制效果，提高带瘤小鼠的存活率。

综上，与传统的CAR T细胞相比，本发明中包含CD94胞内区和LTβ胞内区的CAR-T细胞由于引入了新的共刺激域结构，使得可以极大促进T细胞的扩增，从而提高对肿瘤细胞持续的杀伤效果，改善肿瘤抑制效果。

序列表

<110> 南京北恒生物科技有限公司

<120> 新型共刺激结构域及其用途

<160> 32

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 242

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ala Ile Gly Met Thr Gly Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Ala Ala Val Thr Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ala Ile Ser Leu Thr

20 25 30

Leu Ala Thr Thr Gly Gly Leu Pro Ala Gly Thr Val Leu Leu Leu Ile

35 40 45

Thr His Thr Ser Ala Leu His Ser Gly Val Pro Ser Ala Pro Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Ala Thr Ser Leu Thr Ile Ser Ala Leu Gly Gly

65 70 75 80

Gly Ala Ile Ala Thr Thr Pro Cys Gly Gly Gly Ala Thr Leu Pro Thr

85 90 95

Thr Pro Gly Gly Gly Thr Leu Leu Gly Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Val Leu Leu Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gly Ser Leu Ser Val Thr Cys

130 135 140

Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Ala Thr Gly Val Ser Thr Ile Ala

145 150 155 160

Gly Pro Pro Ala Leu Gly Leu Gly Thr Leu Gly Val Ile Thr Gly Ser

165 170 175

Gly Thr Thr Thr Thr Ala Ser Ala Leu Leu Ser Ala Leu Thr Ile Ile

180 185 190

Leu Ala Ala Ser Leu Ser Gly Val Pro Leu Leu Met Ala Ser Leu Gly

195 200 205

Thr Ala Ala Thr Ala Ile Thr Thr Cys Ala Leu His Thr Thr Thr Gly

210 215 220

Gly Ser Thr Ala Met Ala Thr Thr Gly Gly Gly Thr Ser Val Thr Val

225 230 235 240

Ser Ser

<210> 2

<211> 726

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gacatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60

atcagttgca gggcaagtca ggacattagt aaatatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gatggaactg ttaaactcct gatctaccat acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180

aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240

gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg 300

gggaccaagc tggagatcac aggtggcggt ggctcgggcg gtggtgggtc gggtggcggc 360

ggatctgagg tgaaactgca ggagtcagga cctggcctgg tggcgccctc acagagcctg 420

tccgtcacat gcactgtctc aggggtctca ttacccgact atggtgtaag ctggattcgc 480

cagcctccac gaaagggtct ggagtggctg ggagtaatat ggggtagtga aaccacatac 540

tataattcag ctctcaaatc cagactgacc atcatcaagg acaactccaa gagccaagtt 600

ttcttaaaaa tgaacagtct gcaaactgat gacacagcca tttactactg tgccaaacat 660

tattactacg gtggtagcta tgctatggac tactggggcc aaggaacctc agtcaccgtc 720

tcctca 726

<210> 3

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ile Thr Ile Thr Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr Leu Thr Cys Leu

20 25

<210> 4

<211> 75

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Ala Thr Cys Thr Ala Cys Ala Thr Cys Thr Gly Gly Gly Cys Gly Cys

1 5 10 15

Cys Cys Thr Thr Gly Gly Cys Cys Gly Gly Gly Ala Cys Thr Thr Gly

20 25 30

Thr Gly Gly Gly Gly Thr Cys Cys Thr Thr Cys Thr Cys Cys Thr Gly

35 40 45

Thr Cys Ala Cys Thr Gly Gly Thr Thr Ala Thr Cys Ala Cys Cys Cys

50 55 60

Thr Thr Thr Ala Cys Thr Gly Cys Ala Ala Ala

65 70 75

<210> 5

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Pro Thr Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Thr Ser Leu

1 5 10 15

Leu Val Thr Val Ala Pro Ile Ile Pro Thr Val

20 25

<210> 6

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttttgggtcc tcgtcgtagt tggaggggta cttgcctgtt atagcctcct ggttaccgta 60

gcatttatta tattctgggt g 81

<210> 7

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Ala Ser Leu Ala Ser Ala Leu Leu His Ser Ala Thr Met Ala Met Thr

1 5 10 15

Pro Ala Ala Pro Gly Pro Thr Ala Leu His Thr Gly Pro Thr Ala Pro

20 25 30

Pro Ala Ala Pro Ala Ala Thr Ala Ser

35 40

<210> 8

<211> 123

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60

gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120

tcc 123

<210> 9

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Ala Gly Ala Leu Leu Leu Leu Thr Ile Pro Leu Gly Pro Pro Met Ala

1 5 10 15

Pro Val Gly Thr Thr Gly Gly Gly Ala Gly Cys Ser Cys Ala Pro Pro

20 25 30

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Cys Gly

35 40

<210> 10

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cggggcagaa agaaactcct gtatatattc aaacaaccat ttatgagacc agtacaaact 60

actcaagagg aagatggctg tagctgccga tttccagaag aagaagaagg aggatgtgaa 120

<210> 11

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Leu Ala Val Leu Pro Ser Ala Ser Ala Ala Ala Pro Ala Thr Gly Gly

1 5 10 15

Gly Gly Ala Gly Leu Thr Ala Gly Leu Ala Leu Gly Ala Ala Gly Gly

20 25 30

Thr Ala Val Leu Ala Leu Ala Ala Gly Ala Ala Pro Gly Met Gly Gly

35 40 45

Leu Pro Ala Ala Leu Ala Pro Gly Gly Gly Leu Thr Ala Gly Leu Gly

50 55 60

Leu Ala Leu Met Ala Gly Ala Thr Ser Gly Ile Gly Met Leu Gly Gly

65 70 75 80

Ala Ala Ala Gly Leu Gly His Ala Gly Leu Thr Gly Gly Leu Ser Thr

85 90 95

Ala Thr Leu Ala Thr Thr Ala Ala Leu His Met Gly Ala Leu Pro Pro

100 105 110

Ala

<210> 12

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 60

ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 120

ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 180

aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 240

cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 300

acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 339

<210> 13

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Leu Ala Val Leu Pro Ser Ala Ser Ala Ala Ala Pro Ala Thr Gly Gly

1 5 10 15

Gly Gly Ala Gly Leu Pro Ala Gly Leu Ala Leu Gly Ala Ala Gly Gly

20 25 30

Pro Ala Val Leu Ala Leu Ala Ala Gly Ala Ala Pro Gly Met Gly Gly

35 40 45

Leu Pro Gly Ala Ala Leu Ala Pro Gly Gly Gly Leu Thr Ala Gly Leu

50 55 60

Gly Leu Ala Leu Met Ala Gly Ala Thr Ser Gly Ile Gly Met Leu Gly

65 70 75 80

Gly Ala Ala Ala Gly Leu Gly His Ala Gly Leu Pro Gly Gly Leu Ser

85 90 95

Thr Ala Thr Leu Ala Thr Pro Ala Ala Leu His Met Gly Ala Leu Pro

100 105 110

Pro Ala

<210> 14

<211> 342

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 60

ctctttaacg agctcaatct aggacgaaga gaggagttcg atgttttgga caagagacgt 120

ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg cagagaagga agaaccctca ggaaggcctg 180

tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc 240

gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc cttttccagg gtctcagtac agccaccaag 300

gacacctttg acgcccttca catgcaggcc ctgccccctc gc 342

<210> 15

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Met Ser Ala Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser

1 5 10 15

Gly Leu Gly Ala

20

<210> 16

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

atgtcccgct ctgttgcttt ggctgtgctg gcccttttgt cccttagcgg actggaggcc 60

<210> 17

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Ala Pro

20

<210> 18

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccg 63

<210> 19

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Ala Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gly Pro Leu Ser Leu Ala Pro Gly Ala Cys Ala Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Ala Gly Leu Ala Pro Ala Cys Ala

35 40 45

<210> 20

<211> 135

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120

gacttcgcct gtgat 135

<210> 21

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

Ile Gly Val Met Thr Pro Pro Pro Thr Leu Ala Ala Gly Leu Ser Ala

1 5 10 15

Gly Thr Ile Ile His Val Leu Gly Leu His Leu Cys Pro Ser Pro Leu

20 25 30

Pro Pro Gly Pro Ser Leu Pro

35

<210> 22

<211> 117

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc 60

catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttc taagccc 117

<210> 23

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

Gly Ser Leu Thr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10

<210> 24

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gaaagcaaat acgggccgcc gtgtccaccc tgtccg 36

<210> 25

<211> 148

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

Leu Ala Ser Pro Thr Leu Leu Ser Ile Gly Pro Ala Pro Thr Pro Gly

1 5 10 15

Pro Ala Ile Gly Leu Gly Leu Ala Ser Ala Cys Cys Ser Cys Gly Gly

20 25 30

Leu Thr Val Gly Thr Ala Cys Ala Cys Thr Pro Ile Ser Ser Gly Gly

35 40 45

Leu Thr Thr Ala Gly Ser Ala His Leu Cys Ala Ser Gly Leu Ser Ser

50 55 60

Leu Leu Gly Leu Gly Ala Thr Ala Gly Leu Ala Pro Met Ser Ser Ser

65 70 75 80

Gly Gly Pro Thr Thr Ile Gly Leu Ser Thr Ser Gly Gly His Thr Ala

85 90 95

Thr Leu Thr Gly Ala Gly Ser Ala Leu Ser Gly Thr Leu Pro Pro Ser

100 105 110

Pro Gly Thr Pro Ala Thr Leu Ala Cys Ile Ala Thr Ala Pro Ala Gly

115 120 125

Ala Ala Leu Ala Gly Ser Cys Gly Ala Leu Ala Ala Thr Ile Cys Leu

130 135 140

Gly Gly Leu Ile

145

<210> 26

<211> 444

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

aaaaattctt ttactaaact gagtattgag ccagcattta ctccaggacc caacatagaa 60

ctccagaaag actctgactg ctgttcttgc caagaaaaat gggttgggta ccggtgcaac 120

tgttacttca tttccagtga acagaaaact tggaacgaaa gtcggcatct ctgtgcttct 180

cagaaatcca gcctgcttca gcttcaaaac acagatgaac tggattttat gagctccagt 240

caacaatttt actggattgg actctcttac agtgaggagc acaccgcctg gttgtgggag 300

aatggctctg cactctccca gtatctattt ccatcatttg aaacttttaa tacaaagaac 360

tgcatagcgt ataatccaaa tggaaatgct ttagatgaat cctgtgaaga taaaaatcgt 420

tatatctgta agcaacagct catt 444

<210> 27

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

Met Gly Ala Leu Gly Leu Gly Gly Ala Gly Gly Ala Leu Gly Gly Ala

1 5 10 15

Gly Ser

<210> 28

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

atgggggcac tggggctgga gggcaggggt gggaggctcc aggggagggg ttcc 54

<210> 29

<211> 238

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

Ala Ile Gly Met Thr Gly Ser Pro Ala Ser Leu Ser Thr Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gly Thr Val Thr Ile Gly Cys Gly Ala Ser Gly Ala Ile Thr Ser Gly

20 25 30

Leu Ala Thr Thr Gly Gly Leu Pro Gly Leu Ser Pro Gly Leu Leu Ile

35 40 45

Thr Gly Ala Ser Ala Leu Gly Ala Gly Val Pro Ser Ala Pro Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gly Thr Ser Leu Leu Ile Thr Ser Met Gly Thr

65 70 75 80

Gly Ala Gly Gly Val Thr Pro Cys Gly Gly Gly Leu Thr Thr Pro Ala

85 90 95

Thr Pro Gly Gly Gly Thr Leu Leu Gly Leu Leu Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Val Gly Leu Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Ala Gly Leu Val Ala Pro Gly Thr Ser Val Leu Leu Ser Cys

130 135 140

Leu Val Ser Gly Ala Thr Ile Thr Pro Thr Thr Met His Pro Val Leu

145 150 155 160

Gly Ala Pro Gly Gly Gly Leu Gly Thr Ile Gly Ala Ile Ala Pro Gly

165 170 175

Ala Gly Ser Thr Leu Thr Ser Gly Leu Pro Leu Ala Leu Ala Thr Leu

180 185 190

Thr Ala Ala Thr Ser Ser Ala Thr Ala Thr Leu Leu Leu Ser Ser Leu

195 200 205

Thr Ser Gly Ala Thr Ala Thr Thr Pro Cys Ile Thr Gly Gly Thr Thr

210 215 220

Pro Ala Thr Thr Gly Gly Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser

225 230 235

<210> 30

<211> 714

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

gacatccaga tgacccagag ccctgccagc ctgtctacca gcctgggcga gacagtgacc 60

atccagtgtc aggccagcga ggacatctac tctggcctgg cttggtatca gcagaagccc 120

ggcaagagcc ctcagctgct gatctacggc gccagcgacc tgcaggacgg cgtgcctagc 180

agattcagcg gcagcggctc cggaacccag tacagcctga agatcaccag catgcagacc 240

gaggacgagg gcgtgtactt ctgccagcaa ggcctgacct accctagaac cttcggagga 300

ggcaccaagc tggaactgaa gggcggaggc ggaagtggag gcggaggatc tggcggcgga 360

ggctctgaag tgcagctgca gcagtctggc gctgaactgg tccggcctgg cactagcgtg 420

aagctgtcct gcaaggtgtc cggcgacacc atcaccttct actacatgca cttcgtgaag 480

cagaggccag gacagggcct ggaatggatc ggcagaatcg accctgagga cgagagcacc 540

aagtacagcg agaagttcaa gaacaaggcc accctgaccg ccgacaccag cagcaacacc 600

gcctacctga agctgtctag cctgacctcc gaggacaccg ccacctactt ttgcatctac 660

ggcggctact acttcgacta ctggggccag ggcgtgatgg tcaccgtgtc cagc 714

<210> 31

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

Gly Val Gly Leu Gly Gly Ser Gly Pro Gly Leu Val Leu Pro Ser Gly

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Ala Ser Val Ser Ser Ala

20 25 30

Ser Ala Ala Thr Ala Thr Ile Ala Gly Ser Pro Ser Ala Gly Leu Gly

35 40 45

Thr Leu Gly Ala Thr Thr Thr Ala Ser Leu Thr Thr Ala Ala Thr Ala

50 55 60

Val Ser Val Leu Ser Ala Ile Thr Ile Ala Pro Ala Thr Ser Leu Ala

65 70 75 80

Gly Pro Ser Leu Gly Leu Ala Ser Val Thr Pro Gly Ala Thr Ala Val

85 90 95

Thr Thr Cys Ala Ala Gly Val Thr Gly Ala Leu Gly Ala Ala Pro Ala

100 105 110

Ile Thr Gly Gly Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Gly Leu

115 120 125

Gly Ser Thr Ser Pro Gly Ser Gly Gly Gly Ser Thr Leu Gly Ala Ile

130 135 140

Gly Met Thr Gly Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Ala Ala

145 150 155 160

Val Thr Ile Thr Cys Ala Ala Ser Gly Thr Ile Thr Ser Thr Leu Ala

165 170 175

Thr Thr Gly Gly Ala Pro Gly Leu Ala Pro Ala Leu Leu Ile Thr Ala

180 185 190

Ala Ser Ser Leu Gly Ser Gly Val Pro Ser Ala Pro Ser Gly Ala Gly

195 200 205

Ser Gly Thr Ala Pro Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gly Ala Gly Ala

210 215 220

Pro Ala Thr Thr Thr Cys Gly Gly Ser Thr Ser Ile Pro Gly Thr Pro

225 230 235 240

Gly Gly Gly Thr Leu Leu Gly Ile Leu

245

<210> 32

<211> 747

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

caggtgcagc tgcagcagtc tggacccggc ctcgtgaagc ctagccagac cctgtctctg 60

acctgcgcca tcagcggcga tagcgtgtcc agcaatagcg ccgcctggaa ctggatccgg 120

cagagccctt ctagaggcct ggaatggctg ggccggacct actaccggtc caagtggtac 180

aacgactacg ccgtgtccgt gaagtcccgg atcaccatca accccgacac cagcaagaac 240

cagttctccc tgcagctgaa cagcgtgacc cccgaggata ccgccgtgta ctactgcgcc 300

agagaagtga ccggcgacct ggaagatgcc ttcgacatct ggggccaggg cacaatggtc 360

accgtgtcta gcggcagtgg aaagggctca acgtcacccg gttccgggga ggggtcaact 420

aagggcgata ttcagatgac acagagcccc tccagcctgt ccgcctctgt gggagacaga 480

gtgacaatca cctgtcgggc ctcccagacc atctggtcct atctgaattg gtatcagcag 540

cggcctggca aggcccccaa cctgctgatc tatgccgcca gctctctgca gtccggcgtg 600

ccatctagat tcagcggcag aggcagcggc accgatttca ccctgacaat tagcagtctg 660

caggccgagg acttcgccac ctactattgc cagcagagct acagcatccc ccagaccttc 720

ggccagggaa caaaactgga aatcaaa 747

Claims (17)

1.一种嵌合抗原受体，其包含配体结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号传导结构域，其中所述共刺激结构域包含CD94胞内区和/或LTβ胞内区。

2.权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中所述CD94胞内区与SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列具有至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，LTβ胞内区与SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列具有至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。

3.权利要求1或2所述的嵌合抗原受体，其中所述共刺激结构域进一步包含选自以下蛋白的信号传导结构域：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD2、CD7、CD8、CD18（LFA-1）、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD270（HVEM）、CD272（BTLA）、CD276（B7-H3）、CD278(ICOS)、CD357（GITR）、DAP10、DAP12、LAT、NKG2C、SLP76、PD-1、LIGHT、TRIM、ZAP70以及它们的组合。

4.权利要求1或2所述的嵌合抗原受体，其中所述共刺激结构域进一步包含CD27、CD28、CD134、CD137或CD278的信号传导结构域或它们的组合。

5.权利要求1或2所述的嵌合抗原受体，其中所述配体结合结构域是抗体或其抗原结合部分。

6.权利要求5所述的嵌合抗原受体，其中所述抗原结合部分选自Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、scFv抗体片段、线性抗体、sdAb或纳米抗体。

7.权利要求1-6任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述配体结合结构域与选自以下的靶标结合：TSHR、CD19、CD123、CD22、BAFF-R、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII 、GD2、GD3、BCMA、GPRC5D、Tn Ag、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-l lRa、PSCA、PRSS21、 VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、AFP、Folate 受体α、ERBB2 (Her2/neu)、MUC1、EGFR、CS1、CD138、NCAM、Claudin18.2、Prostase、PAP、ELF2M、Ephrin B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gploo、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、Fucosyl GMl、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、Folate受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、多聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-A1、豆荚蛋白、HPV E6、E7、MAGE Al、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺特异性蛋白、存活蛋白和端粒酶、PCTA-l/Galectin 8、MelanA/MARTl、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG (TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、Cyclin Bl、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B 1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES 1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠道羧酸酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、PD1、PDL1、PDL2、TGFβ、APRIL、NKG2D和它们的任意组合。

8.权利要求1-7任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述跨膜结构域选自以下蛋白质的跨膜结构域：TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3ζ亚基、CD3ε亚基、CD3γ亚基、CD3δ亚基、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。

9.权利要求1-8任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述胞内信号传导结构域选自以下蛋白的信号传导结构域：FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。

10.一种核酸分子，其编码权利要求1-9任一项所述的嵌合抗原受体。

11.一种载体，其包含权利要求10所述的核酸分子。

12.一种工程化免疫细胞，其包含权利要求1-9任一项所述的嵌合抗原受体或权利要求10所述的核酸分子。

13.权利要求12所述的工程化免疫细胞，其中所述免疫细胞选自T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、NK细胞或NKT细胞。

14.权利要求13所述的工程化免疫细胞，其中所述T细胞是CD4+/CD8+双阳性T细胞、CD4+辅助T细胞、CD8+T细胞、肿瘤浸润细胞、记忆T细胞、幼稚T细胞、γδ-T细胞或αβ-T细胞。

15.权利要求12-14所述的工程化免疫细胞，其中所述免疫细胞衍生自成体干细胞、胚胎干细胞、脐带血干细胞、祖细胞、骨髓干细胞、诱导多能干细胞、全能干细胞或造血干细胞。

16.一种药物组合物，其包含权利要求1-15任一项所述的工程化免疫细胞，和一种或多种药学上可接受的赋型剂。

17.权利要求1-9任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求10所述的核酸分子、权利要求11所述的载体或权利要求12-16任一项所述的工程化免疫细胞在制备用于治疗癌症、感染或自身免疫性疾病的药物中的用途。

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