CN110964122B - T细胞受体融合蛋白及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种重组的T细胞受体(TCR)融合蛋白，包括(a)与表面抗原结合的抗原结合区；(b)TCRγ链的恒定区；和(c)TCRδ链的恒定区；本发明还涉及包含上述TCR融合蛋白的蛋白质复合物、包含上述TCR融合蛋白的编码序列的核酸、包含所述核酸的载体、细胞和药物组合物及其在治疗疾病中的用途。

Description

T细胞受体融合蛋白及其用途

技术领域

本发明涉及T细胞受体(T Cell Receptor,TRC)融合蛋白、其编码核酸分子以及它们的用途。

背景技术

近年来，嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)-T细胞疗法技术在肿瘤免疫治疗领域的发展和成果有目共睹。但是，CAR-T细胞在临床应用中也一直存在很多问题，尤其是CAR-T治疗造成的细胞因子释放综合征(Cytokine Release Syndrome，CRS)和神经毒性。CRS是由CAR-T脱靶或脱瘤引起的T细胞攻击正常组织或T细胞短期大量杀伤肿瘤引起。由于CAR-T细胞对抗原具有强亲和力和信号传导功能，当其结合相关抗原后，会释放大量细胞因子，引起炎症反应，从而造成CRS。CRS的主要表现包括高热、低血压、休克等。目前，CAR-T细胞引起神经毒性的机制尚不清楚，但已经观察到CAR-T细胞导致的脑水肿、颅内压升高、癫痫、意识状态改变等症状，并且据报道已经有患者因为这种神经毒性去世。

除了CAR-T细胞疗法之外，TCR-T细胞疗法也正在被大力研发和推动，并且在临床试验中获得不错的疗效。TCR是所有T细胞表面的特征性标志，包括两种类型：由α和β两条链组成的αβ型，由γ和δ两条链组成的γδ型。每一个T细胞只表达其中一种类型的TCR，从而产生2种T细胞群：αβT细胞和γδT细胞。在人类中，大部分成熟的T细胞是αβT细胞，仅有1％-5％是γδT细胞。在T细胞中，当αβ链或γδ链的细胞外结构域识别抗原后，TCR会与CD3复合物非共价结合形成TCR-CD3复合物，然后进行信号的传导和T细胞的活化。其中，γδT细胞是调节并启动抗感染免疫应答的亚群。例如，外周血中有一类γδT细胞，其表达的Vγ9Vδ2TCR分子(即，由γ链V基因中的第9号片段和δ链V基因中第2号片段构成的TCR)能够直接识别磷酸抗原，然后通过TCR/CD3传递活化信号，行使杀伤功能。同时这类细胞还分泌细胞因子TNF-α和TNF-γ，并参与激活辅助性T细胞Th1。

目前，TCR-T细胞疗法一般涉及对TCR的α链和β链进行基因改造，然后将改造后的TCR引入T细胞，产生肿瘤抗原特异性T细胞，增强TCR对肿瘤相关抗原(Tumor AssociatedAntigen,TAA)的亲和力，从而加强T细胞对肿瘤细胞的识别，并最终杀死肿瘤细胞。但是，这种TCR识别特异性抗原的能力会受到主要组织相容性复合物(Major HistocompatibilityComplex,MHC)限制性的影响，并且引入的经改造的αβ链与内源性TCR中的αβ链之间可能会形成错配，从而诱导自体抗原的有害识别，导致移植物抗宿主病。

本发明提供了一种新的T细胞受体融合蛋白，其包含TCRγ链和δ链的恒定区以及与其连接的特异性结合细胞表面抗原的抗原结合区。这种新的融合蛋白能够在保持与传统CAR相当的杀伤力的情况下，释放比CAR少得多的促炎性细胞因子，而这些细胞因子的释放水平与CRS以及过继性CAR-T疗法的剂量限制性毒性相关。

发明概述

本发明的第一个主题是重组的T细胞受体(TCR)融合蛋白，其包括与表面抗原结合的抗原结合区、TCRγ链的恒定区和TCRδ链的恒定区。

在一个实施方案中，抗原结合区直接与TCRγ链的恒定区和/或TCRδ链的恒定区连接。在另一个实施方案中，抗原结合区通过连接肽与TCRγ链的恒定区和/或TCRδ链的恒定区连接。在该实施方案中，连接肽选自(G4S)n、CD8和IgG4，其中n为1-4的整数。

在一个实施方案中，本发明的TCR融合蛋白不包括TCRγ链的可变区和/或TCRδ链的可变区。在另一个实施方案中，本发明的TCR融合蛋白包括TCRγ链的可变区和/或TCRδ链的可变区，优选同时包括TCRγ链的可变区和TCRδ链的可变区。在一个具体的实施方案中，所述TCRγ链的恒定区选自SEQ ID NO：14、32，或与其具有至少85％序列同一性的功能性变体；其中所述TCRδ链的恒定区选自SEQ ID NO：16、34，或与其具有至少85％序列同一性的功能性变体。当本发明的TCR融合蛋白还包含TCRγ链的可变区和TCRδ链的可变区(即，TCR融合蛋白包含完整的TCRγ链和δ链时，所述TCRγ链选自SEQ ID NO：18，或与其具有至少85％序列同一性的功能性变体；所述TCRδ链选自SEQ ID NO：20，或与其具有至少85％序列同一性的功能性变体。

在一个实施方案中，本发明的TCR融合蛋白包含一个或两个抗原结合区，所述抗原结合区结合相同或不同的抗原。具体地，抗原结合区选自scFv、VH结构域、VL结构域、单结构域抗体、纳米抗体、抗原结合配体(例如PD1、PDL1、PDL2、TGFβ、APRIL和NKG2D)、重组纤连蛋白结构域、anticalin和DARPIN。

在一个实施方案中，本发明的TCR融合蛋白包含的抗原结合区与选自以下的抗原结合：TSHR、CD19、CD123、CD22、BAFF-R、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、GPRC5D、Tn Ag、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-l lRa、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、Folate受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、Claudin18.2、Prostase、PAP、ELF2M、Ephrin B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gplOO、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、Fucosyl GMl、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、Folate受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD 179a、ALK、多聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-A1、豆荚蛋白、HPV E6、E7、MAGE Al、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺特异性蛋白、存活蛋白和端粒酶、PCTA-l/Galectin 8、MelanA/MARTl、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、Cyclin Bl、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B 1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES 1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠道羧酸酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1和它们的任意组合。优选地，所述表面抗原选自：CD19、CD20、CD22、BAFF-R、CD33、EGFRvIII、BCMA、GPRC5D、PSMA、ROR1、FAP、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、CAIX、WT1、NY-ESO-1、CD79a、CD79b、GPC3、Claudin18.2。

在一个实施方案中，所述抗原结合区是单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、鼠源抗体、嵌合抗体及其功能片段。在一个具体的实施方案中，所述抗原结合区选自抗CD19scFv、抗CD19抗体的重链可变区或轻链可变区，优选地，所述抗原结合区选自SEQ ID NO：4、6、8、10、12或与其具有至少95％序列同一性的保留与表面抗原结合活性的功能性变体。

在一个实施方案中，本发明的TCR融合蛋白还包括跨膜结构域。具体地，所述跨膜结构域选自以下蛋白质的跨膜结构域：TCRγ链、TCRδ链、CD3ζ亚基、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154及其功能性片段。优选地，所述跨膜结构域选自以下蛋白质的跨膜结构域：TCRγ链、TCRδ链、CD3ζ亚基、CD3ε亚基、CD3γ亚基、CD3δ亚基及其功能性片段。

在一个实施方案中，本发明的TCR融合蛋白还包括共刺激结构域。具体地，所述共刺激结构域是从以下蛋白质获得的功能性信号传导结构域：TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG3)、CD270(HVEM)、CD273(PD-L2)、CD274(PD-L1)、CD278(ICOS)、DAP10、LAT、NKD2C SLP76、TRIM和ZAP70。

在一个实施方案中，本发明的TCR融合蛋白还包含信号肽和/或2A肽。

在一个实施方案中，本发明还提供一种蛋白质复合物，其包含本发明的融合蛋白和至少一种内源性CD3亚基或内源性CD3复合物。优选地，所述内源性CD3亚基选自CD3ζ亚基、CD3ε亚基、CD3γ亚基和CD3δ亚基；所述内源性CD3复合物是由CD3ζ亚基、CD3ε亚基、CD3γ亚基和CD3δ亚基形成的复合物。

本发明的第二个主题是包含编码本发明的TCR融合蛋白的序列的核酸、包含所述核酸的载体、本发明的系统、包含所述核酸或载体或系统的细胞以及包含所述TCR融合蛋白、所述核酸、所述载体、所述系统或所述细胞的药物组合物。

在一个实施方案中，本发明提供一种核酸，其包含编码本发明的TCR融合蛋白的序列。优选地，所述核酸是DNA或RNA，更优选mRNA。

在一个实施方案中，本发明提供包含上述核酸的载体。具体地，所述载体选自线性核酸分子、质粒、逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、牛痘病毒、劳氏肉瘤病毒(RSV)、多瘤病毒和腺相关病毒(AAV)、噬菌体、噬菌粒、粘粒或人工染色体。在一些实施方案中，该载体还包含在宿主细胞中自主复制的起、选择标记、限制酶切割位点、启动子、多聚腺苷酸尾(polyA)、3’UTR、5’UTR、增强子、终止子、绝缘子、操纵子、选择标记、报告基因、靶向序列和/或蛋白质纯化标签等元件。在一个具体的实施方案中，所述载体是体外转录的载体。

在一个实施方案中，本发明还提供包含上述核酸或载体或系统的细胞。优选地，所述细胞是免疫细胞，例如T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、NK细胞或NKT细胞，更优选T细胞或自然杀伤细胞，甚至更优选CD4+/CD8+双阳性T细胞、CD4+辅助T细胞、CD8+T细胞、肿瘤浸润细胞、记忆T细胞、幼稚T细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T(NKT)细胞、γδ-T细胞、αβ-T细胞。在一个具体的实施方案中，所述细胞包含一种或多种本发明的TCR融合蛋白或蛋白质复合物。在另一个具体的实施方案中，所述细胞缺失TCRα链和/或TCRβ链。

在一个实施方案中，本发明还提供一种载体系统，其包括：(a)编码TCRγ链的恒定区的第一核酸序列；(b)编码TCRδ链的恒定区的第二核酸序列；其中所述第一核酸序列和/或第二核酸序列与编码抗原结合区的第三核酸序列可操作地连接，所述第一核酸序列和第二核酸序列位于同一载体或不同载体。载体的含义如上所定义。

在一个实施方案中，本发明还提供一种药物组合物，其包含本发明所述的TCR融合蛋白、核酸、载体、系统、细胞或细胞群和药学上可接受的赋型剂。在一个具体的实施方案中，所述药学上可接受的赋型剂选自以下的一种或多种：填充剂、粘合剂、崩解剂、包衣剂、吸附剂、抗粘附剂、助流剂、抗氧化剂、调味剂、着色剂、甜味剂、溶剂、共溶剂、缓冲剂、螯合剂、表面活性剂、稀释剂、润湿剂、防腐剂、乳化剂、包覆剂、等渗剂、吸收延迟剂、稳定剂和张力调节剂。在一个具体的实施方案中，所述药物组合物通过局部、动脉内、肌内、皮下、髓内、鞘内、心室内、静脉内、腹膜内、子宫内、阴道内、舌下或鼻内途径施用。在一个具体的实施方案中，所述药物组合物是软膏剂、乳膏剂、透皮贴剂、凝胶剂、粉剂、片剂、溶液剂、气雾剂、颗粒剂、丸剂、混悬剂、乳剂、胶囊剂、糖浆剂、液体剂、酏剂、浸膏剂、酊剂或流浸膏提取物的形式。

本发明的第三个主题涉及制备改造的免疫细胞的方法，包括将本发明的TCR融合蛋白、蛋白质复合物、核酸或载体引入所述免疫细胞，优选T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、NK细胞或NKT细胞，更优选T细胞、NK细胞或NKT细胞。

本发明的第四个主题涉及一种治疗患有与表面抗原表达有关的疾病的受试者的方法。

在一个实施方案中，上述方法包括向该哺乳动物施用有效量的本发明的TCR融合蛋白、蛋白质复合物、核酸、载体、细胞或药物组合物。在另一个实施方案中，上述方法包括以下步骤：(a)提供受试者的样品，所述样品包含免疫细胞；(b)在体外将本发明的TCR融合蛋白、蛋白质复合物、核酸、载体、细胞和/或药物组合物引入所述免疫细胞，获得经修饰的免疫细胞，(c)向所述受试者施用所述经修饰的免疫细胞。优选地，所免疫细胞是自体或同种异体的细胞，优选T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、NK细胞或NKT细胞，更优选T细胞、NK细胞或NKT细胞。

在一个实施方案中，所述受试者是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛。

在一个实施方案中，所述与表面抗原表达有关的疾病选自：胚细胞瘤、肉瘤、白血病、基底细胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脑和CNS癌症、乳腺癌、腹膜癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠和直肠癌、结缔组织癌症、消化系统的癌症、子宫内膜癌、食管癌、眼癌、头颈癌、胃癌(包括胃肠癌)、胶质母细胞瘤(GBM)、肝癌、肝细胞瘤、上皮内肿瘤、肾癌、喉癌、白血病、肝肿瘤、肺癌(例如小细胞肺癌、非小细胞肺癌、腺状肺癌和鳞状肺癌)、淋巴瘤(包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤)、黑色素瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、口腔癌(例如唇、舌、口和咽)、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、直肠癌、呼吸系统的癌症、唾液腺癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫或子宫内膜癌、泌尿系统的恶性肿瘤、外阴癌以及其它癌和肉瘤、以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞性(SL)NHL、中间级/滤泡性NHL、中间级扩散性NHL、高级成免疫细胞性NHL、高级成淋巴细胞性NHL、高级小型非裂化细胞性NHL、大肿块病NHL)、套细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤、以及Waldenstrom巨球蛋白血症、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)、B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤、伯基特氏淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、慢性骨髓性白血病(CML)、恶性淋巴组织增生疾病、MALT淋巴瘤、毛细胞白血病、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓发育不良、浆母细胞性淋巴瘤、白血病前期、浆细胞样树突状细胞瘤、以及移植后淋巴细胞增生性紊乱(PTLD)。

发明详述

除非另有说明，否则本文中所使用的所有科学技术术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解的相同。

TCR融合蛋白

本发明的第一个主题是重组的T细胞受体(TCR)融合蛋白，其包括与表面抗原结合的抗原结合区、TCRγ链的恒定区和TCRδ链的恒定区。

如本文所用，术语“TCR融合蛋白”是指包含抗原结合区和TCRγ链和δ链或其恒定区部分的分离的重组蛋白。一般而言，当正确表达时，本发明的TCR融合蛋白能够结合靶细胞上的表面抗原，并且与靶细胞中的内源性CD3组分相互作用，形成TCR融合蛋白-CD3复合物。

“T细胞受体”或“TCR”在本文中可互换使用，是指T细胞表面的特异性受体，主要功能是识别抗原并激活T细胞。TCR是固定在细胞膜上的异源二聚体，由通过二硫键连接的两个不同的亚基所构成。根据组成亚基的不同，TCR分为两类：αβ型和γδ型。其中，约95％的TCR由α亚基和β亚基构成，另外约5％的TCR由γ亚基和δ亚基构成。TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ亚基分别由TCRA、TCRB、TCRG和TCRD基因座编码。

TCR会与CD3分子(包括CD3δ/ε二聚体、CD3γ/ε二聚体以及CD3δ/δ)一起构成TCR-CD3复合体(参见图2)。因此，如本文所用，术语“CD3亚基”是指CD3δ、CD3ε、CD3γ和CD3δ亚基，这些亚基共同组成了CD3复合物。CD3的胞内区域有许多免疫受体酪氨酸激活基序(Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motifs,ITAM)。当TCR与抗原结合而被激活后，这些ITAM序列中的酪氨酸被磷酸化，从而实现了信号的跨膜传递，最终激活T细胞。

TCR的每一个亚基都含有两个细胞外的结构域：可变区(V区)与恒定区(C区)。TCR的可变区负责识别抗原，恒定区负责将链锚定在质膜中的跨膜区。TCR的可变区包括框架区和三个互补决定区(Complementary Determining Regions,CDR)：CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR3是抗原识别和特异性的主要决定簇。因此，本发明的TCR的可变区包括完整的TCR可变区、其功能性片段例如CDR1、CDR2和CDR3中的一个或多个，或其功能性变体。TCRγ链和δ链的恒定区/可变区可以来自人或其他物种，例如小鼠。例如，可以将人TCRγ链或δ链的恒定区/可变区用鼠源恒定区/可变区代替，从而形成“嵌合恒定区/可变区”，或者完全用鼠源恒定区/可变区代替人TCRγ链和δ链的恒定区/可变区。在一个实施方案中，TCRγ链的恒定区选自SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：32及其功能性变体；TCRδ链的恒定区选自SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：34及其功能性变体。

在一个实施方案中，本发明的TCR融合蛋白不包括TCRγ链的可变区和/或TCRδ链的可变区。在另一个实施方案中，本发明的TCR融合蛋白包括TCRγ链的可变区和/或TCRδ链的可变区，优选同时包括TCRγ链的可变区和TCRδ链的可变区。在另一个实施方案中，当包含可变区时，完整的TCRγ链选自SEQ ID NO：18及其功能性变体；完整的TCRδ链选自SEQ IDNO：20及其功能性变体。

在一个实施方案中，抗原结合区直接与TCRγ链的恒定区和/或TCRδ链的恒定区连接。在另一个实施方案中，抗原结合区通过连接肽与TCRγ链的恒定区和/或TCRδ链的恒定区连接。

如本文所用，术语“连接肽”是指由氨基酸组成的连接抗原结合区和TCR恒定区的肽接头，其长度一般为10-120个氨基酸，优选10-100、10-80、10-60，更优选10-50个氨基酸。可以用于本发明的连接肽是本领域技术人员熟知的。

在一个实施方案中，连接肽是(G4S)n，其中n为1-4的整数。在另一些实施方案中，连接肽是CD8或IgG连接肽，优选CD8α、IgG1或IgG4连接肽。

在一个实施方案中，本发明的TCR融合蛋白还包括信号肽。

如本文所用，术语“信号肽”是指引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短肽链(长度5-30个氨基酸)。信号肽一般位于肽链的N末端，能够指导蛋白质的跨膜转移(定位)，并且负责把蛋白质引导到细胞的亚细胞器内。本发明可以使用本领域技术人员熟知的信号肽，例如膜蛋白信号肽，如CD8α信号肽、CD33信号肽，CD4信号肽；和细胞分泌因子信号肽，如IL-2信号肽、CCL19信号肽。

在一个实施方案中，本发明的TCR融合蛋白还包括2A肽。

如本文所用，术语“2A序列”、“2A肽”或“2A病毒肽”可互换使用，其属于cis-水解酶作用元件(CHYSEls)，最初在口蹄疫病毒(FMDV)中发现。2A肽的平均长度为18～22氨基酸。在蛋白翻译时，2A肽可以通过核糖体跳跃从自身最后2个氨基酸C末端断裂。具体地，甘氨酸和脯氨酸之间的肽链结合群在2A位点是受损的，能引发核糖体跳跃而从第2个密码子开始翻译，从而使1个转录单元里的2个蛋白独立表达。这种2A肽介导的剪切广泛存在于真核动物细胞中。利用2A肽较高的剪切效率及促使上下游基因平衡表达的能力，可以改进异源多聚蛋白(如细胞表面受体、细胞因子、免疫球蛋白等)的表达效率。常规2A肽包含：P2A、T2A、E2A、F2A等。例如，在本发明中，当TCRγ链和δ链的恒定区位于同一表达载体上时，2A肽可以位于包含TCRγ链恒定区的转录单元和包含TCRδ链恒定区的转录单元之间，使得这两个转录单元可以独立表达而互不影响。

在一个实施方案中，本发明的TCR融合蛋白包含一个或两个抗原结合区，所述抗原结合区结合相同或不同的抗原。

在一个实施方案中，本发明的TCR融合蛋白包含的抗原结合区与选自以下的一个或多个表面抗原结合：TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、Tn Ag、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-l lRa、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、Folate受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、Prostase、PAP、ELF2M、Ephrin B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gplOO、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、Fucosyl GMl、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、Folate受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD 179a、ALK、多聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-A1、豆荚蛋白、HPV E6、E7、MAGE Al、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺特异性蛋白、存活蛋白和端粒酶、PCTA-l/Galectin 8、MelanA/MARTl、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、Cyclin Bl、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B 1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES 1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠道羧酸酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1和它们的任意组合。在一个优选的实施方案中，表面抗原选自：CD19、CD20、CD22、BAFF-R、CD33、EGFRvIII、BCMA、GPRC5D、PSMA、ROR1、FAP、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、CAIX、WT1、NY-ESO-1、CD79a、CD79b、GPC3、Claudin18.2。

如本文所用，“抗原结合区”是指可以与抗原结合的任何结构或其功能性变体，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体及其功能片段。例如，抗原结合区包括但不限于单链抗体(Single Chain Antibody Fragment,scFv)及其片段(例如，重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL))、单结构域抗体、纳米抗体、抗原结合配体、以及本领域中已知可用作抗原结合区的替代性支架，如重组纤连蛋白结构域、anticalin、DARPIN等。在本发明中，抗原结合区可以是单价或二价。

“单链抗体”或“scFv”是由抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过接头连接而成的抗体。可以选择接头的最佳长度和/或氨基酸组成。接头的长度会明显影响scFv的可变区折叠和相互作用情况。事实上，如果使用较短的接头(例如在5-10个氨基酸之间)，则可以防止链内折叠。关于接头的大小和组成的选择，参见例如，Hollinger等人,1993ProcNatl Acad.Sci.U.S.A.90:6444-6448；美国专利申请公布号2005/0100543、2005/0175606、2007/0014794；以及PCT公布号WO2006/020258和WO2007/024715，其全文通过引用并入本文。

“单结构域抗体”是指一种天然缺失轻链的抗体，该抗体只包含一个重链可变区(VHH)和两个常规的CH2与CH3区，也称为“重链抗体”。而单独克隆并表达出来的VHH结构具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性，是目前已知的可结合目标抗原的最小单位，也称为纳米抗体(Nanobody，Nb)。

本发明的TCR融合蛋白的抗原结合区还可以包含特异性识别并结合靶抗原的天然或合成的配体。例如，可用于本发明的配体包括但不限于PD1、PDL1、PDL2、TGFβ、APRIL、NKG2D等。

术语“功能性变体”或“功能性片段”是指基本上包含亲本的氨基酸序列但与该亲本氨基酸序列相比含有至少一个氨基酸修饰(即取代、缺失或插入)的变体，条件是所述变体保留亲本氨基酸序列的生物活性。例如，上述氨基酸修饰可以引入或存在于TCR融合蛋白的可变区和/或恒定区和/或抗原结合区，并且可以用于调节诸如结合强度和特异性、翻译后加工(例如糖基化)、热力学稳定性、溶解度，表面表达或TCR组装的性质。在一个实施方案中，所述氨基酸修饰优选是保守型修饰。

如本文所用，术语“保守性修饰”是指不会明显影响或改变含有该氨基酸序列的抗体或抗体片段的结合特征的氨基酸修饰。这些保守修饰包括氨基酸取代、添加及缺失。修饰可以通过本领域中已知的标准技术，如定点诱变和PCR介导的诱变而引入本发明的TCR融合蛋白中。保守氨基酸取代是氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基置换的取代。具有类似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中有定义，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)及芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。保守性修饰可以例如基于极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或所涉及残基的两亲性质的相似性来进行选择。

因此，“功能性变体”或“功能性片段”与亲本氨基酸序列具有至少75％，优选至少76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且保留亲本氨基酸的生物活性，例如结合活性。

如本文所用，术语“序列同一性”表示两个(核苷酸或氨基酸)序列在比对中在相同位置处具有相同残基的程度，并且通常表示为百分数。优选地，同一性在被比较的序列的整体长度上确定。因此，具有完全相同序列的两个拷贝具有100％同一性。本领域技术人员将认识到，一些算法可以用于使用标准参数来确定序列同一性，例如Blast(Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402)、Blast2(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410)、Smith-Waterman(Smith等(1981)J.Mol.Biol.147：195-197)和ClustalW。

在一个实施方案中，本发明涵盖起始抗体或片段(例如scFv)氨基酸序列的修饰，这些修饰产生功能等效的分子。例如，TCR融合蛋白中包含的抗原结合区(例如scFv)的VH或VL可以经过修饰以与亲本VH或VL框架保持至少约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性。为了产生功能等效的分子，本发明涵盖完整TCR融合蛋白的修饰，例如在TCR融合蛋白各种结构域的一个或多个氨基酸序列中的修饰。TCR融合蛋白可以经过修饰以与亲本TCR融合蛋白保持至少约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。

因此，在一个实施方案中，本发明的TCR融合蛋白包含抗CD19scFv、抗CD19抗体的重链可变区或轻链可变区。优选地，本发明的TCR融合蛋白包含的抗原结合区选自SEQ IDNO：4、6、8、10、12及其功能性片段，其中所述功能性片段是与SEQ ID NO：4、6、8、10、12具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的抗CD19scFv或抗CD19抗体的重链可变区或轻链可变区的氨基酸序列。

在一个实施方案中，本发明的TCRγ链的恒定区选自SEQ ID NO：14、32，或与其具有至少85％序列同一性的功能性变体；其中所述TCRδ链的恒定区选自SEQ ID NO：16、34，或与其具有至少85％序列同一性的功能性变体。在一个实施方案中，当包含TCRγ链和δ链的可变区时，本发明的TCRγ链选自SEQ ID NO：18，或与其具有至少85％序列同一性的功能性变体；其中所述TCRδ链选自SEQ ID NO：20，或与其具有至少85％序列同一性的功能性变体。

在一个实施方案中，本发明的TCR融合蛋白还包括跨膜结构域。在该实施方案中，一般而言，TCR融合蛋白包含的跨膜结构域与恒定区来自同一基因组序列，即，TCRγ链或δ链的跨膜结构域。然而，TCR融合蛋白也可以被设计成包含与恒定区异源的跨膜结构域。跨膜结构域可以包括与跨膜区邻近的一个或多个额外氨基酸，例如与作为跨膜蛋白来源的蛋白质的细胞外区域缔合的一个或多个氨基酸(例如细胞外区域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或超过15个氨基酸)和/或与作为跨膜蛋白来源的蛋白质的细胞内区域缔合的一个或多个额外氨基酸(例如细胞内区域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或超过15个氨基酸)。在一个实施方案中，跨膜结构域可以经过选择或通过氨基酸取代进行修饰以避免此类结构域结合至相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域，例如以使与受体复合物的其它成员的相互作用减到最少。在一个实施方案中，跨膜结构域能够与表达TCR融合蛋白的T细胞表面上的另一TCR融合蛋白发生同二聚化。在另一个实施方案中，跨膜结构域的氨基酸序列可以经过修饰以使与同一TCR融合蛋白中存在的天然结合配偶体的结合结构域的相互作用减到最小。

跨膜结构域可以来源于天然来源或重组来源。在该来源是天然来源的情况下，该结构域可以来源于任何膜结合或跨膜蛋白。在一个实施方案中，当TCR融合蛋白与靶抗原结合时，跨膜结构域能够进行信号传导。特别适用于本发明中的跨膜结构域可以至少包括例如TCRγ链、TCRδ链、CD3ζ亚基、CD3ε亚基、CD3γ亚基、CD3δ亚基、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154及其功能性片段。

在一些情形中，跨膜结构域可以通过铰链，例如来自人蛋白质的铰链连接至TCR融合蛋白的恒定区。例如，在一个实施方案中，铰链可以是人免疫球蛋白(Ig)铰链，例如IgG4铰链，或CD8a铰链。

在一个实施方案中，本发明的TCR融合蛋白还可以包括共刺激结构域。

术语“共刺激结构域”是指在T细胞上与共刺激配体特异性结合，由此介导T细胞的共刺激反应的同源结合配偶体。共刺激结构域可以是来自共刺激分子的细胞内功能性信号传导结构域，其可以包含作为该结构域的来源的分子的整个细胞内部分，或整个天然细胞内信号传导结构域，或其功能片段。共刺激分子是高效免疫反应所需的除抗原受体或其配体外的细胞表面分子。淋巴细胞的增殖不仅需要抗原的结合，还需要接受共刺激分子的信号。共刺激分子包括但不限于，1类MHC分子、BTLA和Toll配体受体，以及OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)及4-1BB(CD137)。共刺激分子可以通过以下蛋白质家族表示：TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整合素、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)及活化NK细胞受体。这些分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3，以及与CD83特异性结合的配体等。因此，在一个实施方案中，存在于本发明的TCR融合蛋白中的共刺激结构域是来自选自以下蛋白质的信号转导结构域：TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG3)、CD270(HVEM)、CD273(PD-L2)、CD274(PD-L1)、CD278(ICOS)、DAP10、LAT、NKD2C SLP76、TRIM和ZAP70。术语“4-1BB”是指具有如GenBank登录号AAA62478.2所提供的氨基酸序列或来自非人物种，例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等的等效残基的TNFR超家族的成员；并且“4-1BB共刺激性结构域”定义为GenBank登录号AAA62478.2的氨基酸残基214-255，或来自非人物种，例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等的等效残基。

在一个实施方案中，本发明还提供一种蛋白质复合物，其包含本发明的TCR融合蛋白和至少一种内源性CD3亚基或内源性CD3复合物。优选地，所述内源性CD3亚基选自CD3ζ亚基、CD3ε亚基、CD3γ亚基和CD3δ亚基；所述内源性CD3复合物是由CD3ζ亚基、CD3ε亚基、CD3γ亚基和CD3δ亚基形成的复合物。

核酸

本发明还提供一种核酸，其包含编码本发明的TCR融合蛋白的序列。

如本文所用，术语“核酸”包括多核糖核苷酸和多脱氧核糖核苷酸的序列，如经修饰的或未经修饰的RNA或DNA，各自为单链和/或双链形式的线性或环状，或它们的混合物(包括杂合分子)。因此，根据本发明的核酸包括DNA(比如dsDNA、ssDNA、cDNA)、RNA(比如dsRNA、ssRNA、mRNA、ivtRNA)，它们的组合或衍生物(比如PNA)。优选地，所述核酸是DNA或RNA，更优选mRNA。

核酸可以包含常规的磷酸二酯键或非常规的键(如酰胺键，比如在肽核酸(PNA)中发现的)。本发明的核酸还可含有一种或多种经修饰的碱基，比如，例如三苯甲基化的碱基和不常见的碱基(比如肌苷)。也可以想到其它修饰，包括化学、酶促或代谢修饰，只要本发明的结合分子可以从多核苷酸表达即可。核酸可以以分离的形式提供。在一个实施方案中，核酸也可以包括调节序列，比如转录控制元件(包括启动子、增强子、操纵子、抑制子和转录终止信号)、核糖体结合位点、内含子等。

可以对本发明的核酸序列进行密码子优化以在所需的宿主细胞(如，人淋巴细胞)中进行最佳表达；或者用于在细菌、酵母菌或昆虫细胞中表达。密码子优化是指将目标序列中存在的在给定物种的高度表达的基因中一般罕见的密码子替换为在这类物种的高度表达的基因中一般常见的密码子，而替换前后的密码子编码相同的氨基酸。因此，最佳密码子的选择取决于宿主基因组的密码子使用偏好。

载体或载体系统

本发明还提供一种载体，包含如本发明所述的一种或多种核酸。

本发明还提供一种载体系统，其包含(a)编码TCRγ链的恒定区的第一核酸序列；(b)编码TCRδ链的恒定区的第二核酸序列；其中所述第一核酸序列和/或第二核酸序列与编码抗原结合区的第三核酸序列可操作地连接，所述第一核酸序列和第二核酸序列位于同一载体或不同载体。

如本文所用，术语“可操作地连接”是指两个核酸序列之间的功能性连接关系，特别是在相同的多核苷酸分子上。例如，当第一核酸序列与第二核酸序列呈功能关系时，该第一核酸序列与该第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则该启动子可操作地连接至编码序列。可操作地连接的DNA序列可以彼此相邻，并且例如在需要接合两个蛋白质编码区时是处于同一阅读框中。

如本文所用，术语“载体”是用作将(外源)遗传材料转移到宿主细胞中的媒介核酸分子，在该宿主细胞中所述核酸分子可以例如复制和/或表达。

载体一般包括靶向载体和表达载体。“靶向载体”是通过例如同源重组或使用特异性靶向位点处的序列的杂合重组酶将分离的核酸递送至细胞内部的介质。“表达载体”是用于异源核酸序列(例如编码本发明的TCR融合蛋白的那些序列)在合适的宿主细胞中的转录以及它们的mRNA的翻译的载体。可用于本发明的合适载体是本领域已知的，并且许多可商购获得。在一个实施方案中，本发明的载体包括但不限于线性核酸分子(例如DNA或RNA)、质粒、病毒(例如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、牛痘病毒、劳氏肉瘤病毒(RSV、多瘤病毒和腺相关病毒(AAV)等)、噬菌体、噬菌粒、粘粒和人工染色体(包括BAC和YAC)。载体本身通常是核苷酸序列，通常是包含插入物(转基因)的DNA序列和作为载体“骨架”的较大序列。工程化载体通常还包含在宿主细胞中自主复制的起点(如果需要多核苷酸的稳定表达)、选择标记和限制酶切割位点(如多克隆位点，MCS)。载体可另外包含启动子、多聚腺苷酸尾(polyA)、3’UTR、增强子、终止子、绝缘子、操纵子、选择标记、报告基因、靶向序列和/或蛋白质纯化标签等元件。在一个具体的实施方案中，所述载体是体外转录的载体。

宿主细胞

本发明还提供一种宿主细胞，其包含本发明所述的TCR融合蛋白、核酸或载体。

如本文所用，术语“宿主细胞”是指可以是或已经是本文所述的核酸或载体的接受体和/或表达(和任选地分泌)本发明的TCR融合蛋白的细胞。一般而言，宿主细胞包括原核或真核细胞，并且还包括但不限于细菌、酵母细胞、真菌细胞、植物细胞和动物细胞，所述动物细胞比如昆虫细胞和哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞比如鼠、大鼠、猕猴或人细胞。

在一个实施方案中，宿主细胞是免疫细胞，例如T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、NK细胞和/或NKT细胞。优选地，宿主细胞是T细胞。在本发明中，能够表达本发明的TCR融合蛋白的T细胞也称为TRUE-T(T cell receptor fusion engager-T)细胞。T细胞可以是任何T细胞，如体外培养的T细胞，例如原代T细胞，或者来自体外培养的T细胞系例如Jurkat、SupT1等的T细胞，或获得自受试者的T细胞。受试者的实例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。T细胞可以从多种来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸膜积液、脾组织及肿瘤。T细胞也可以被浓缩或纯化。T细胞可以是任何类型的T细胞并且可以处于任何发育阶段，包括但不限于，CD4+/CD8+双阳性T细胞、CD4+辅助T细胞(例如Th1和Th2细胞)、CD8+T细胞(例如，细胞毒性T细胞)、肿瘤浸润细胞、记忆T细胞、幼稚T细胞、γδ-T细胞、αβ-T细胞等。在一个优选的实施方案中，宿主细胞是人T细胞。可以使用本领域技术人员已知的多种技术，如Ficoll分离从受试者的血液获得T细胞。

采用本领域已知的常规方法(如通过转导、转染、转化等)可以将本发明的多核苷酸和/或载体引入宿主细胞。“转染”是将核酸分子或多核苷酸(包括载体)引入靶细胞的过程。一个例子是RNA转染，即将RNA(比如体外转录的RNA，ivtRNA)引入宿主细胞的过程。该术语主要用于真核细胞中的非病毒方法。术语“转导”通常用于描述病毒介导的核酸分子或多核苷酸的转移。动物细胞的转染通常涉及在细胞膜中打开瞬时的孔或“洞”，以允许摄取材料。可以使用磷酸钙、通过电穿孔、通过细胞挤压或通过将阳离子脂质与材料混合以产生与细胞膜融合并将它们的运载物沉积入内部的脂质体，进行转染。用于转染真核宿主细胞的示例性技术包括脂质囊泡介导的摄取、热休克介导的摄取、磷酸钙介导的转染(磷酸钙/DNA共沉淀)、显微注射和电穿孔。术语“转化”用于描述核酸分子或多核苷酸(包括载体)向细菌中、也向非动物真核细胞(包括植物细胞)中的非病毒转移。因此，转化是细菌或非动物真核细胞的基因改变，其通过细胞膜从其周围直接摄取并随后并入外源遗传材料(核酸分子)而产生。转化可以通过人工手段实现。为了发生转化，细胞或细菌必须处于感受态的状态。对于原核转化，技术可包括热休克介导的摄取、与完整细胞的细菌原生质体融合、显微注射和电穿孔。对于植物转化的技术包括土壤杆菌(Agrobacterium)介导的转移(诸如通过根瘤土壤杆菌(A.tumefaciens))、被快速推进的钨或金微弹、电穿孔、显微注射和聚乙二醇介导的摄取。

在一个优选的实施方案中，所述宿主细胞缺失TCRα链和/或TCRβ链。发明人出乎意料地发现，相对于野生型T细胞，本发明的TRUE-T细胞在缺失TCRα链和/或β链的T细胞中能够更加高效地表达TCR融合蛋白，实现与传统CAR-T细胞相当的肿瘤杀伤效果，同时显著降低细胞因子的释放，从而降低发展CRS的风险。另外，由于本发明的TRUE-T细胞表达的是γδ型TCR，还能够避免与内源性TCRα链和/或TCRβ链的错配，从而减少移植物抗宿主病的发生。

在细胞中敲除TCRα链和/或TCRβ链的技术是本领域技术人源熟知的，例如可以通过CRISPR系统、TALEN系统、锌指核酸酶系统、碱基编辑器、RNAi技术、反义吗啉环寡核苷酸(Morpholino)等技术来敲除T细胞中的TCRα链和/或TCRβ链。

药物组合物

在一个实施方案中，本发明还提供一种药物组合物，其包含本发明所述的TCR融合蛋白、核酸、载体、系统或宿主细胞作为活性剂，和一种或多种药学上可接受的赋型剂。因此，本发明还涵盖所述TCR融合蛋白、核酸、载体、系统或宿主细胞在制备药物组合物或药物中的用途。

如本文所用，术语“药学上可接受的赋型剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容(即，能够引发所需的治疗效果而不会引起任何不希望的局部或全身作用)的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's PharmaceuticalSciences.Edited by Gennaro AR,19th ed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)。药学上可接受的赋型剂的实例包括但不限于填充剂、粘合剂、崩解剂、包衣剂、吸附剂、抗粘附剂、助流剂、抗氧化剂、调味剂、着色剂、甜味剂、溶剂、共溶剂、缓冲剂、螯合剂、表面活性剂、稀释剂、润湿剂、防腐剂、乳化剂、包覆剂、等渗剂、吸收延迟剂、稳定剂和张力调节剂。本领域技术人员已知选择合适的赋型剂以制备本发明期望的药物组合物。用于本发明的药物组合物中的示例性赋型剂包括盐水、缓冲盐水、葡萄糖和水。通常，合适的赋形剂的选择尤其取决于所使用的活性剂、待治疗的疾病和药物组合物的期望剂型。

根据本发明的药物组合物可适用于多种途径施用。通常，通过胃肠外完成施用。胃肠外递送方法包括局部、动脉内、肌内、皮下、髓内、鞘内、心室内、静脉内、腹膜内、子宫内、阴道内、舌下或鼻内施用。

根据本发明的药物组合物也可以制备成各种形式，如固态、液态、气态或冻干形式，特别可以是软膏剂、乳膏剂、透皮贴剂、凝胶剂、粉剂、片剂、溶液剂、气雾剂、颗粒剂、丸剂、混悬剂、乳剂、胶囊剂、糖浆剂、液体剂、酏剂、浸膏剂、酊剂或流浸膏提取物的形式，或者是特别适用于所需施用方法的形式。本发明已知的用于生产药物的过程可包括例如常规混合、溶解、制粒、制糖衣、研磨、乳化、包封、包埋或冻干过程。包含例如本文所述的宿主细胞或TCR融合蛋白、核酸或载体的药物组合物通常以液体形式提供，并且优选包含药学上可接受的缓冲剂。

根据本发明的药物组合物还可以与一种或多种适用于治疗和/或预防待治疗疾病的其它药剂组合施用。适用于组合的药剂的优选实例包括已知的抗癌药物，比如顺铂、美登素衍生物、雷查霉素(rachelmycin)、卡里奇霉素(calicheamicin)、多西紫杉醇、依托泊苷、吉西他滨、异环磷酰胺、伊立替康、美法仑、米托蒽醌、sorfimer卟啉钠II(sorfimersodiumphotofrin II)、替莫唑胺、拓扑替康、葡萄糖醛酸曲美沙特(trimetreateglucuronate)、奥利斯他汀E(auristatin E)、长春新碱和阿霉素；肽细胞毒素，比如蓖麻毒素、白喉毒素、假单胞菌细菌外毒素A、DNA酶和RNA酶；放射性核素，比如碘131、铼186、铟111、铱90、铋210和213、锕225和砹213；前药，比如抗体定向的酶前药；免疫刺激剂，比如IL-2，趋化因子比如IL-8、血小板因子4、黑色素瘤生长刺激蛋白等；抗体或其片段，比如抗CD3抗体或其片段，补体活化剂，异种蛋白结构域，同种蛋白结构域，病毒/细菌蛋白结构域和病毒/细菌肽。

制备改造的免疫细胞的方法

本发明还提供一种制备改造的免疫细胞的方法，包括将本发明的核酸或载体引入免疫细胞，以使所述免疫细胞表达本发明的TCR融合蛋白或蛋白质复合物。

在一个实施方案中，所述免疫细胞是人免疫细胞，更优选人T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、NK细胞和/或NKT细胞。

将核酸或载体引入免疫细胞并进行表达的方法是本领域已知的。例如，可以通过物理方法，如括磷酸钙沉淀法、脂质转染法、粒子轰击法、显微注射法、电穿孔法等将核酸或载体导入T细胞。或者，也可以采用化学方法，如通过胶体分散系统，如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠粒以及基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束及脂质体引入核酸或载体。此外，还可以使用生物方法引入核酸或载体。例如，病毒载体，尤其是逆转录病毒载体，已经成为将基因插入哺乳动物，例如人细胞中的最常用方法。其它病毒载体可以来源于慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒及腺相关病毒等。

将核酸或载体引入免疫细胞后，本领域技术人员可以通过常规技术对所得免疫细胞进行扩增和活化。

治疗

本发明还提供一种向受试者提供抗肿瘤免疫性的方法或一种预防或治疗受试者中的疾病的方法，包括向该受试者施用有效量的表达本发明的TCR融合蛋白的细胞。

在一个实施方案中，直接向受试者施用有效量的本发明的TCR融合蛋白、核酸、载体、载体系统、宿主细胞和/或药物组合物。

在另一个实施方案中，本发明的治疗方法是离体治疗。具体地，该方法包括以下步骤：(a)提供受试者的样品，所述样品包含免疫细胞；(b)在体外将本发明的TCR融合蛋白、蛋白质复合物、核酸、载体、载体系统、细胞和/或药物组合物引入所述免疫细胞，获得经修饰的免疫细胞，(c)向有此需要的受试者施用所述经修饰的免疫细胞。优选地，步骤(a)中提供的免疫细胞为“效应细胞”，并且有利地选自T细胞、NK细胞和/或NKT细胞；并且所述免疫细胞可以通过本领域已知的常规方法在步骤(a’)中从受试者的样品(特别是血液样品)中获得。然而，也可以使用能够表达本发明的TCR融合蛋白并发挥如本文所述的所需生物效应功能的其它免疫细胞。此外，通常选择的免疫细胞与受试者的免疫系统相容，即优选所述免疫细胞不引发免疫原性响应。例如，可以使用“通用接受体细胞”，即发挥所需生物效应功能的普遍相容的可在体外生长和扩增的淋巴细胞。使用此类细胞将不需要获得和/或提供受试者自身淋巴细胞。步骤(c)的离体引入可以通过经由电穿孔将本文所述的核酸或载体引入免疫细胞或通过用病毒载体感染免疫细胞来实施，所述病毒载体为如前所述的慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或逆转录病毒载体。其它可想到的方法包括使用转染试剂(比如脂质体)或瞬时RNA转染。经由如(逆转录)病毒载体或瞬时RNA转染使抗原特异性TCR基因向(初级)T细胞中的转移是用于产生肿瘤相关抗原特异性T细胞的有前途的工具，随后可以将所述T细胞重新引入供体，在供体中这些T细胞特异性地靶向并破坏表达所述抗原的肿瘤细胞。

在一个实施方案中，所述宿主细胞或免疫细胞是自体或同种异体的细胞，优选T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、NK细胞和/或NKT细胞，更优选T细胞，最优选人T细胞。

如本文所用，术语“自体”是指来源于个体的任何材料稍后将被再引入该相同个体中。

如本文所用，术语“同种异体”是指任何材料来源于与引入该材料的个体相同物种的不同动物或不同患者。当在一个或多个基因座处的基因不同时，认为两个或更多个体彼此为同种异体的。在一些情况下，来自同一物种的各个体的同种异体材料在基因上的不同可能足以发生抗原相互作用。

如本文所用，术语“受试者”是哺乳动物。哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些实例。除人以外的哺乳动物可以有利地用作代表癌症动物模型的受试者。优选地，所述受试者是人。

在一个实施方案中，所述疾病是与抗原结合区结合的表面抗原表达有关的疾病。例如，所述疾病包括但不限于：胚细胞瘤、肉瘤、白血病、基底细胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脑和CNS癌症、乳腺癌、腹膜癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠和直肠癌、结缔组织癌症、消化系统的癌症、子宫内膜癌、食管癌、眼癌、头颈癌、胃癌(包括胃肠癌)、胶质母细胞瘤(GBM)、肝癌、肝细胞瘤、上皮内肿瘤、肾癌、喉癌、白血病、肝肿瘤、肺癌(例如小细胞肺癌、非小细胞肺癌、腺状肺癌和鳞状肺癌)、淋巴瘤(包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤)、黑色素瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、口腔癌(例如唇、舌、口和咽)、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、直肠癌、呼吸系统的癌症、唾液腺癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫或子宫内膜癌、泌尿系统的恶性肿瘤、外阴癌以及其它癌和肉瘤、以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞性(SL)NHL、中间级/滤泡性NHL、中间级扩散性NHL、高级成免疫细胞性NHL、高级成淋巴细胞性NHL、高级小型非裂化细胞性NHL、大肿块病NHL)、套细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤、以及Waldenstrom巨球蛋白血症、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)、B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤、伯基特氏淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、慢性骨髓性白血病(CML)、恶性淋巴组织增生疾病、MALT淋巴瘤、毛细胞白血病、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓发育不良、浆母细胞性淋巴瘤、白血病前期、浆细胞样树突状细胞瘤、以及移植后淋巴细胞增生性紊乱(PTLD)；以及其他与表面抗原表达有关的疾病。优选地，可以用本发明的TCR融合蛋白、核酸、载体、宿主细胞或药物组合物治疗的疾病选自：白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、脑神经胶质瘤、胰腺癌、胃癌等。

在一个实施方案中，所述方法还进一步包括向所述受试者施用一种或多种额外的化疗剂、生物制剂、药物或治疗。在该实施方案中，化疗剂、生物制剂、药物或治疗选自放射疗法、手术、抗体试剂和/或小分子和它们的任意组合。

下面将参考附图并结合实例来详细说明本发明。需要说明的是，本领域的技术人员应该理解本发明的附图及其实施例仅仅是为了例举的目的，并不能对本发明构成任何限制。在不矛盾的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

附图说明

图1示出了天然的γδ型TCR结构和本发明的TCR融合蛋白的各种示例性实施方案。A.天然的γδ型TCR结构，包括γ链和δ链，每条链各自包含一个可变区(V区)和一个恒定区(C区)；B.两个抗原结合区scFv通过连接肽分别与γ链和δ链连接；C.两个抗原结合区scFv通过连接肽分别与γ链和δ链的恒定区连接(即，γ链和δ链的可变区被敲除)；D.一个抗原结合区scFv通过连接肽与γ链的恒定区连接；E.一个抗原结合区scFv通过连接肽与δ链的恒定区连接；F.两个抗原结合区scFv直接分别与γ链和δ链的恒定区连接；G和H.抗体的重链可变区和轻链可变区通过连接肽分别与γ链和δ链的恒定区连接；I.抗体的重链可变区和轻链可变区直接与γ链和δ链的恒定区连接；J.两个不同的抗原结合区scFv通过连接肽分别与γ链和δ链的恒定区连接。

图2示出了天然的γδTCR-CD3复合物和本发明的TCR融合蛋白-CD3复合物的结构。天然的γδTCR-CD3复合物包括两个CD3ε多肽、一个CD3γ多肽、一个CD3δ多肽、两个CD3δ多肽、一个TCRγ亚基和一个TCRδ亚基，其中水平的灰色条段表示细胞膜。当将本发明的TCR融合蛋白引入T细胞后，其与天然的TCR竞争结合CD3，形成改造的TCR融合蛋白-CD3复合物。

图3示出了制备TCRα/TCRβ双敲除T细胞的效率。A.电转染Cas9蛋白和两种sgRNA(TRAC sgRNA和TRBC sgRNA)的T细胞(即，TCRα/TCRβ双敲除T细胞)；B.未转染Cas9蛋白和sgRNA的T细胞。

图4示出了用本发明的TCR融合蛋白转导TCRα/TCRβ双敲除T细胞和野生型T细胞后的平均荧光强度MFI。Mock：空白电转染的T细胞。

图5示出了单独用scFv-TRG或scFv-TRD转导野生型T细胞后的scFv表达量。NT：未经转导的野生型T细胞。

图6示出了包含不同连接肽或不含连接肽的TCR融合蛋白转导TCRα/TCRβ双敲除T细胞后的scFv表达量。NT：未转导TCR融合蛋白的TCRα/TCRβ双敲除T细胞。用Two-way ANOVA分析，并用T test进行统计学分析。*表示P值小于0.05，**表示P值小于0.01，均达到显著水平。ns表示没有显著差异。

图7示出了TRUE-T细胞和传统CAR-T细胞对靶细胞的杀伤效果。NT：未转导TCR融合蛋白的T细胞。

图8示出了TRUE-T细胞和传统CAR-T细胞的IL2(A)和IFN-γ(B)释放水平。NT：未转导TCR融合蛋白的T细胞。用Two-way ANOVA分析，并用T test进行统计学分析。*表示P值小于0.05，**表示P值小于0.01，均达到显著水平。

图9示出了pLv-BHAm载体的结构。

图10示出了用鼠源TCR融合蛋白转导野生型T细胞(Mock)和TCRα/TCRβ双敲除T(dKO)后的scFv量。NT：未转导TCR融合蛋白的野生型T细胞。

具体实施方式

在以下实施例中所用的序列总结如下表1所示。

表1.本发明中所用的序列

实施例1.制备TCRα/TCRβ双敲除T细胞

本发明使用的Cas9蛋白(序列如SEQ ID NO：28所示)购买自Thermo(货号A36499)。

本发明所有实施例中使用的T细胞是通过Ficoll-PaqueTM PREMIUM(GEHealthcare，货号17-5442-02)采用白细胞分离术从健康供体分离原代人CD4+CD8+T细胞。

用DynaBeads CD3/CD28 CTSTM(Gibco,货号40203D)刺激该T细胞，并在37℃和5％CO2下培养3天。然后，使用BTX Agile Pulse Max电穿孔仪(Harvard Apparatus BTX)，以400V、0.7ms将10ug Cas9蛋白和10ug sgRNA(5ug TRAC sgRNA+5ug TRBC sgRNA)电转染进激活的T细胞内，获得TCRα/TCRβ双敲除T细胞。未转染Cas9蛋白和sgRNA的T细胞用作对照。电转染之后，立即将T细胞放入1ml预热的培养基中，并在IL-2(300IU/ml)存在下，在37℃和5％CO2下培养。11天之后，使用APC Mouse Anti-Human CD3(BD Pharmingen，货号555335)抗体，通过流式细胞仪检测TCR/CD3的表达，从而检测TCRα/TCRβ的敲除效率，结果如图3所示。

可以看出，与未转染的对照T细胞(图3B)相比，转染了Cas9蛋白和sgRNA的T细胞中TCR/CD3的表达大幅下降(图3A)，表明TCRα/TCRβ双敲除效率达到90％以上。

实施例2.制备抗CD19 scFv-CAR T细胞

合成编码CD8α信号肽(SEQ ID NO：37)的序列、编码抗CD19scFv-CAR(包含抗CD19scFv、CD8α铰链区、CD8α跨膜区、4-1BB胞内区、CD3ζ胞内区)的核酸序列(SEQ ID NO：29)，将其克隆至pGEM-T Easy载体(Promega，货号A1360)，并通过测序确认目标序列的正确插入。

然后，制备mRNA：用SpeI酶对以上制备的表达载体进行酶切，纯化回收后获得线性化载体。然后，根据制造商的建议，以线性化载体为模板，用mMESSAGE

T7Ultra Kit试剂盒(Invitrogen，货号AM1345)制备mRNA，并用Fastpure cell/Tissue totalRNA isolation kit试剂盒(Vazyme，货号RC101-01)进行纯化，获得纯化的mRNA。

最后，进行电转染：使用BTX Agile Pulse Max电穿孔仪(Harvard ApparatusBTX)，以400V、0.7ms将上述制备的10ug纯化mRNA电转染进激活的T细胞内，获得抗CD19scFv-CAR T细胞。

实施例3.制备TRUE-T细胞

(1)构建本发明的TCR融合蛋白表达载体

将合成的携带B2m信号肽(SEQ ID NO：35)或CD8α信号肽(SEQ ID NO：37)的抗CD19scFv的重链可变区(SEQ ID NO：3)、轻链可变区(SEQ ID NO：5)或完整scFv(SEQ ID NO：11)的编码序列；连接肽(CD8α、IgG4或(G4S)3)或重链/轻链恒定区(CL或CH1)的编码序列；TCRγ链的恒定区(SEQ ID NO：13)、TCRδ链的恒定区(SEQ ID NO：15)、完整的TCRγ链(SEQ IDNO：17)或完整的TCRδ链(SEQ ID NO：19)的编码序列依次克隆至pGEM-TEasy载体(Promega，货号A1360)，获得本发明的TCR融合蛋白表达载体，并通过测序确认目标序列的正确插入。所制备的表达载体如下表2所示。

表2.实施例3中所制备的表达载体

(2)制备mRNA

用SpeI酶对步骤1制备的表达载体进行酶切，纯化回收后获得线性化载体。然后，根据制造商的建议，以线性化载体为模板，用mMESSAGE

T7 Ultra Kit试剂盒(Invitrogen，货号AM1345)制备mRNA，并用Fastpure cell/Tissue total RNAisolation kit试剂盒(Vazyme，货号RC101-01)进行纯化，获得纯化的mRNA。

(3)制备TRUE-T细胞并检测scFv的表达

根据实施例2所述的电转染方法，将10ug从载体11和12获得的纯化的mRNA(scFv-hTRG+scFv-hTRD)同时通过电穿孔的方式转染进TCRα/TCRβ双敲除T细胞或野生型T细胞，获得TRUE-T细胞。同时，未经电穿孔转染的TCRα/TCRβ双敲除T细胞或野生型T细胞(Mock)用作阴性对照。

使用Biotin-SP(long spacer)AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG,F(ab')₂Fragment Specific(min X Hu,Bov,Hrs Sr Prot)(jackson immunoresearch，货号115-065-072)作为一抗，APC Streptavidin(BD Pharmingen，货号554067)或PE Streptavidin(BD Pharmingen，货号554061)作为二抗，通过流式细胞仪检测TRUE-T细胞中scFv的表达水平(只有当转染的TCR融合蛋白均正确表达时，才能够检测到完整scFv的表达)，并根据检测结果使用FlowJo软件计算出MFI值，结果如图4所示。

可以看出，转染了scFv-TRG+scFv TRD的TCRα/TCRβ双敲除T细胞中scFv的表达量远远高于野生型T细胞，表明内源性的TCRα和TCRβ亚基会与外源性的TCR融合蛋白中的TCRγ和TCRδ亚基竞争结合CD3组分，导致TCR融合蛋白的表达被抑制。

此外，为了验证单独的TRG或TRD亚基是否足以正确表达scFv，以同样的方式将单独的载体11或12(即，scFv-TRG或scFv-TRD)的纯化mRNA电转染进野生型T细胞，并使用Biotin-SP(long spacer)AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG,F(ab')₂Fragment Specific(min X Hu,Bov,Hrs Sr Prot)(jackson immunoresearch，货号115-065-072)作为一抗，APC Streptavidin(BD Pharmingen，货号554067)或PE Streptavidin(BD Pharmingen，货号554061)作为二抗，通过流式细胞仪检测scFv的表达水平，结果如图5所示。

可以看出，单独电转染scFv-TRG或scFv-TRD均不能有效表达scFv，表明TRUE-T的正确表达依赖于γ和δ亚基的同时表达，同时排除了scFv-TRG或scFv-TRD与TCRα或TCRβ亚基错配结合导致GvHD发生的可能性。

因此，为了TCR融合蛋白的高效表达并避免引起移植物抗宿主病，以下实验均采用TCRα/TCRβ双敲除T细胞来制备本发明的TRUE-T细胞。

按照以下配对方式，将相应的纯化mRNA通过电穿孔的方式转染进TCRα/TCRβ双敲除T细胞，获得本发明的TRUE-T细胞：VL-CL-TRGC+VH-CH1-TRDC；VL-(G4S)3-TRGC+VH-(G4S)3-TRDC；VL-CD8α-TRGC+VH-CD8α-TRDC；VL-IgG4-TRGC+VH-IgG4-TRDC；VL-TRGC+VH-TRDC；scFv-TRG+scFv-TRD；scFv-TRGC+TRDC。并且同时将抗CD19 scFv-CAR T细胞作为阳性对照。

使用Biotin-SP(long spacer)AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG,F(ab')₂Fragment Specific(min X Hu,Bov,Hrs Sr Prot)(jackson immunoresearch，货号115-065-072)作为一抗，APC Streptavidin(BD Pharmingen，货号554067)或PE Streptavidin(BD Pharmingen，货号554061)作为二抗，通过流式细胞仪检测上述TRUE-T细胞、scFv-CART细胞(阳性对照)和未经转染的TCRα/TCRβ双敲除T细胞(NT，阴性对照)中scFv的表达水平，结果如图6所示。

可以看出，本发明的TRUE-T细胞中的scFv表达量基本与scFv-CAR T细胞的表达量相当，没有显著性差异，而携带VL-CL-TRGC+VH-CH1-TRDCT细胞中的scFv的表达量则显著低于对照的scFv-CAR T细胞。

同时也可以看出，包含或不包含连接肽的转染T细胞中的scFv表达量均大幅高于包含CD19 scFv的重链/轻链恒定区(CL/CH1)的转染T细胞。这可能是由于CL/CH的长度形成的空间位阻影响了CD19 scFv的折叠，进而影响了其细胞表面的表达水平。

实施例4.TRUE-T细胞的杀伤效果

当T细胞对靶细胞有杀伤时，靶细胞的数量就会减少。将T细胞和带有可表达荧光素酶的靶细胞共培养后，靶细胞数量减少的同时，分泌的荧光素酶也会随之减少。荧光素酶可以催化荧光素转化为氧化性荧光素，而在此氧化过程中，会产生生物发光，并且这种发光的强度将取决于靶细胞表达的荧光素酶的水平。因此，检测的荧光强度能够反应T细胞对靶细胞的杀伤能力。

为了检测TRUE-T细胞对靶细胞的杀伤能力，首先以1x10⁴/孔将携带荧光素基因的Nalm6靶细胞铺入96孔板中，然后以4:1的效靶比(即效应T细胞与靶细胞之比)将TRUE-T、未转染T细胞(阴性对照)和抗CD19 scFv-CAR T细胞(阳性对照)铺入到96孔板进行共培养，16-18小时后利用酶标仪测定荧光值。根据计算公式：(靶细胞荧光均值-样品荧光均值)/靶细胞荧光均值×100％，计算得到杀伤效率，结果如图7所示。

可以看出，与NT相比，携带VL-(G4S)3-TRGC+VH-(G4S)3-TRDC；VL-CD8α-TRGC+VH-CD8α-TRDC；VL-IgG4-TRGC+VH-IgG4-TRDC；VL-TRGC+VH-TRDC；scFv-TRG+scFv-TRD的TRUE-T细胞都能够有效杀伤靶细胞，并且杀伤效果均不低于scFv-CAR T细胞。

实施例5.TRUE-T细胞的细胞因子释放

T细胞杀伤靶细胞时，靶细胞数量减少的同时也会释放细胞因子IL2和IFN-γ等。根据以下步骤，使用酶联免疫吸附法(ELISA)来测定TRUE-T细胞杀伤靶细胞时细胞因子IL2和IFN-γ的释放水平。

(1)细胞共培养上清收集

以1x10⁵/孔将靶细胞Nalm6和非靶细胞K562分别铺于96孔板中，然后以1:1的比例将TRUE-T细胞、未转染T细胞(阴性对照)和抗CD19 scFv-CAR T细胞(阳性对照)分别与靶细胞和非靶细胞共培养，18-24小时后收集上清液。

(2)ELISA检测上清中IL2、IFNγ分泌量

用ELISA测定上清液中细胞因子IL2、IFNγ分泌量。使用捕获抗体Purified anti-human IL-2Antibody(Biolegend，货号500302)和Purified anti-human IFN-γAntibody(Biolegend，货号506502)分别包被96孔板4℃孵育过夜，然后移除上清液，加入250μL含有2％BSA(sigma，货号V900933-1kg)的PBST(含0.1％吐温的1XPBS)溶液，37℃孵育2小时。移除上清液后，加入250μL PBST(含0.1％吐温的1XPBS)，清洗3次。然后每孔加入50μL细胞共培养上清液或标准品，并在37℃孵育1小时。移除上清液，然后加入250μL PBST(含0.1％吐温的1XPBS)，清洗3次。然后向各孔分别加入50μL检测抗体Biotin anti-human IL-2Antibody(Biolegend，货号517605)和Anti-Interferon gamma抗体[MD-1](Biotin)(abcam，货号ab25017)，在37℃孵育1小时后，弃上清液，加入250μL PBST(含0.1％吐温的1XPBS)，清洗5次。加入HRP Streptavidin(Biolegend，货号405210)，在37℃孵育30分钟后，向各孔加入50μL TMB底物溶液。使反应在室温下于暗处发生30分钟，之后向各孔中加入50μL 1mol/L H2SO4以停止反应。在停止反应的30分钟内，使用酶标仪检测450nm处吸光度，并根据标准曲线(根据标准品的读值和浓度绘制)计算细胞因子的含量，结果如图8所示。

可以看出，携带VL-(G4S)3-TRGC+VH-(G4S)3-TRDC；VL-CD8α-TRGC+VH-CD8α-TRDC；VL-IgG4-TRGC+VH-IgG4-TRDC；VL-TRGC+VH-TRDC；scFv-TRG+scFv-TRD的TRUE-T细胞在杀伤靶细胞时，细胞因子IL2和IFN-γ的释放水平远远低于抗CD19 scFv-CAR T细胞杀伤靶细胞时的释放水平，从而能够有效降低CRS。

实施例6.使用慢病毒载体构建TRUE-T细胞

(1)TRUE-T慢病毒的包装

合成以下编码序列：完整CD19 scFv序列(SEQ ID NO：11)、(G4S)3连接肽(SEQ IDNO：21)、hTGC(SEQ ID NO：13)、2A肽(SEQ ID NO：39)、hTRDC(SEQ ID NO：15)，并将其依次克隆至pLv-BHAm慢病毒载体(图9)，获得TRUE-T质粒。同时制备mTRUE-T质粒，其包含mTRGC(SEQ ID NO：31)和mTRDC(SEQ ID NO：33)，其他元件与TRUE-T质粒相同。

在无菌管中加入3ml Opti-MEM(Gibco，货号31985-070)稀释上述两种质粒后，再根据质粒:病毒包装载体：病毒包膜载体＝4:2:1的比例加入包装载体psPAX2(Addgene，货号12260)和包膜载体pMD2.G(Addgene，货号12259)。然后，加入120ul X-treme GENE HPDNA转染试剂(Roche，货号06366236001)，立即混匀，于室温下孵育15min，然后将质粒/载体/转染试剂混合物逐滴加入到293T细胞的培养瓶中。在24小时和48小时收集病毒，将其合并后，超速离心(25000g，4℃，2.5小时)获得浓缩的TRUE-T或mTRUE-T慢病毒。

(2)制备TRUE-T细胞

用DynaBeads CD3/CD28 CTSTM(Gibco,货号40203D)激活T细胞，并在37℃和5％CO2下培养1天。然后，加入浓缩的TRUE-T或mTRUE-T慢病毒，持续培养3天后，使用BTX AgilePulse Max电穿孔仪(Harvard Apparatus BTX)，400V、0.7ms将10ug Cas9蛋白和10ugsgRNA(5ug TRAC sgRNA+5ug TRBC sgRNA)电转染进激活的T细胞内，获得TCRα/TCRβ双敲除的TRUE-T细胞(TRUE-T-dKO)和mTRUE-T细胞(mTRUE-T-dKO)。未进行Cas9+sgRNA电转染的病毒感染T细胞(即，TRUE-T-Mock和mTRUE-T-Mock)作为对照。

将T细胞放入1ml预暖的培养基中，并在IL-2(300IU/ml)存在下，在37℃和5％CO2下培养。11天之后，使用Biotin-SP(long spacer)AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG,F(ab')₂Fragment Specific(min X Hu,Bov,Hrs Sr Prot)(jackson immunoresearch，货号115-065-072)作为一抗，APC Streptavidin(BD Pharmingen，货号554067)或PEStreptavidin(BD Pharmingen，货号554061)作为二抗，通过流式细胞仪检测上述scFv的表达水平，结果如图10所示。

可以看出，mTRUE-T细胞中的scFv表达量与TRUE-T细胞相当，并且同样地，在TCRα/TCRβ双敲除的T细胞中的表达量高于野生型T细胞。

综上，发明人发现，包含本发明的TCR融合蛋白的TRUE-T细胞能够在保持与传统CART细胞相当的靶细胞杀伤效果的同时，还能显著降低细胞因子的释放水平，从而有效降低CRS的风险。并且，发明人还出乎意料地发现，在缺失TCRα/β链的TRUE-T细胞中，scFv的表达量远远高于野生型T细胞，即，对靶细胞的杀伤效果更好。

需要说明的是，以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。本领域技术人员理解的是，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 南京北恒生物科技有限公司

<120> T细胞受体融合蛋白及其用途

<160> 40

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atagagagtc tctcagctgg taca 24

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggagaatgac gagtggaccc 20

<210> 3

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaggtgaaac tgcaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccgtc 60

acatgcactg tctcaggggt ctcattaccc gactatggtg taagctggat tcgccagcct 120

ccacgaaagg gtctggagtg gctgggagta atatggggta gtgaaaccac atactataat 180

tcagctctca aatccagact gaccatcatc aaggacaact ccaagagcca agttttctta 240

aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccatttact actgtgccaa acattattac 300

tacggtggta gctatgctat ggactactgg ggccaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360

<210> 4

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr

20 25 30

Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 5

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gacatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60

atcagttgca gggcaagtca ggacattagt aaatatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gatggaactg ttaaactcct gatctaccat acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180

aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240

gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg 300

gggaccaagc tggagatcac a 321

<210> 6

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr

100 105

<210> 7

<211> 636

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atccagatga cacagactac atcctccctg tctgcctctc tgggagacag agtcaccatc 60

agttgcaggg caagtcagga cattagtaaa tatttaaatt ggtatcagca gaaaccagat 120

ggaactgtta aactcctgat ctaccataca tcaagattac actcaggagt cccatcaagg 180

ttcagtggca gtgggtctgg aacagattat tctctcacca ttagcaacct ggagcaagaa 240

gatattgcca cttacttttg ccaacagggt aatacgcttc cgtacacgtt cggagggggg 300

accaagctgg agatcacagg ccagcctaaa gcaaatccca ctgtaacact cttccctccc 360

agcagcgagg aattgcaggc caacaaagca acacttgtgt gtctgatctc cgacttttac 420

cctggagccg taaccgtagc ctggaaggcc gatggctccc cagttaaagc aggtgtagaa 480

actacaaagc catccaaaca gtccaacaat aagtatgcag cttcaagtta tctctcactt 540

acccccgagc aatggaagtc tcataggtcc tactcctgtc aagttaccca tgaggggtcc 600

acagtagaaa agacggtagc accgacggaa tgtagc 636

<210> 8

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gln Pro Lys Ala

100 105 110

Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala

115 120 125

Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala

130 135 140

Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys Ala Gly Val

145 150 155 160

Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser

165 170 175

Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr

180 185 190

Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala

195 200 205

Pro Thr Glu Cys Ser

210

<210> 9

<211> 669

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gaggtgaaac tgcaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccgtc 60

acatgcactg tctcaggggt ctcattaccc gactatggtg taagctggat tcgccagcct 120

ccacgaaagg gtctggagtg gctgggagta atatggggta gtgaaaccac atactataat 180

tcagctctca aatccagact gaccatcatc aaggacaact ccaagagcca agttttctta 240

aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccatttact actgtgccaa acattattac 300

tacggtggta gctatgctat ggactactgg ggccaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360

gcgtccacga aggggccttc cgtatttcca ctggcaccct cttctaaatc aacgtctggg 420

ggtacggcag cgctcgggtg cctcgtgaaa gattacttcc cagaacctgt gacagtgtca 480

tggaacagtg gggcacttac atcaggcgtt catacttttc cagcagtgtt gcaatcaagc 540

ggactttatt ccctgtcatc cgttgtaacc gtaccttcaa gtagtttggg cacccagact 600

tacatctgca atgtaaacca taaaccgtct aataccaaag tggacaaaag ggttgaaccg 660

aagtcatgc 669

<210> 10

<211> 223

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr

20 25 30

Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

<210> 11

<211> 726

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gacatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60

atcagttgca gggcaagtca ggacattagt aaatatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gatggaactg ttaaactcct gatctaccat acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180

aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240

gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg 300

gggaccaagc tggagatcac aggtggcggt ggctcgggcg gtggtgggtc gggtggcggc 360

ggatctgagg tgaaactgca ggagtcagga cctggcctgg tggcgccctc acagagcctg 420

tccgtcacat gcactgtctc aggggtctca ttacccgact atggtgtaag ctggattcgc 480

cagcctccac gaaagggtct ggagtggctg ggagtaatat ggggtagtga aaccacatac 540

tataattcag ctctcaaatc cagactgacc atcatcaagg acaactccaa gagccaagtt 600

ttcttaaaaa tgaacagtct gcaaactgat gacacagcca tttactactg tgccaaacat 660

tattactacg gtggtagcta tgctatggac tactggggcc aaggaacctc agtcaccgtc 720

tcctca 726

<210> 12

<211> 242

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu

115 120 125

Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys

130 135 140

Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg

145 150 155 160

Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser

165 170 175

Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile

180 185 190

Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln

195 200 205

Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly

210 215 220

Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val

225 230 235 240

Ser Ser

<210> 13

<211> 519

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gacaagcagc tggacgccga cgtgagcccc aagcctacca tcttcctgcc cagcatcgcc 60

gagaccaagc tgcagaaggc cggcacctac ctgtgcctgc tggaaaagtt cttccccgac 120

gtgatcaaga tccactggga ggaaaagaag agcaacacca tcctgggcag ccaggaaggc 180

aataccatga aaaccaacga cacctacatg aagttcagct ggctgaccgt gcccgagaag 240

agcctggaca aagagcacag atgcatcgtc cggcacgaga acaacaagaa cggcgtggac 300

caggaaatca tcttcccccc catcaagacc gatgtgatca caatggaccc caaggacaac 360

tgcagcaagg acgccaacga taccctgctg ctgcagctga ccaacaccag cgcctactac 420

atgtatctcc tgctgctgct gaagagcgtg gtgtacttcg ccatcatcac ctgctgtctg 480

ctgcggcgga ccgccttctg ctgcaacggc gagaagagc 519

<210> 14

<211> 173

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Asp Lys Gln Leu Asp Ala Asp Val Ser Pro Lys Pro Thr Ile Phe Leu

1 5 10 15

Pro Ser Ile Ala Glu Thr Lys Leu Gln Lys Ala Gly Thr Tyr Leu Cys

20 25 30

Leu Leu Glu Lys Phe Phe Pro Asp Val Ile Lys Ile His Trp Glu Glu

35 40 45

Lys Lys Ser Asn Thr Ile Leu Gly Ser Gln Glu Gly Asn Thr Met Lys

50 55 60

Thr Asn Asp Thr Tyr Met Lys Phe Ser Trp Leu Thr Val Pro Glu Lys

65 70 75 80

Ser Leu Asp Lys Glu His Arg Cys Ile Val Arg His Glu Asn Asn Lys

85 90 95

Asn Gly Val Asp Gln Glu Ile Ile Phe Pro Pro Ile Lys Thr Asp Val

100 105 110

Ile Thr Met Asp Pro Lys Asp Asn Cys Ser Lys Asp Ala Asn Asp Thr

115 120 125

Leu Leu Leu Gln Leu Thr Asn Thr Ser Ala Tyr Tyr Met Tyr Leu Leu

130 135 140

Leu Leu Leu Lys Ser Val Val Tyr Phe Ala Ile Ile Thr Cys Cys Leu

145 150 155 160

Leu Arg Arg Thr Ala Phe Cys Cys Asn Gly Glu Lys Ser

165 170

<210> 15

<211> 459

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

agccagcccc acaccaagcc cagcgtgttc gtgatgaaga acggcaccaa cgtggcctgc 60

ctggtgaaag agttctaccc caaggacatc cggatcaacc tggtgtccag caagaagatc 120

accgagttcg accccgccat cgtgatcagc cccagcggca agtacaacgc cgtgaagctg 180

ggcaagtacg aggacagcaa cagcgtgacc tgcagcgtgc agcacgacaa caagaccgtg 240

cacagcaccg acttcgaggt gaaaaccgac tccaccgacc acgtgaagcc caaagagacc 300

gagaacacca agcagcccag caagagctgc cacaagccca aggccatcgt gcacaccgag 360

aaggtgaaca tgatgagcct gaccgtgctg ggcctgcgga tgctgttcgc caagacagtg 420

gccgtgaact tcctgctgac cgccaagctg ttcttcctg 459

<210> 16

<211> 153

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Ser Gln Pro His Thr Lys Pro Ser Val Phe Val Met Lys Asn Gly Thr

1 5 10 15

Asn Val Ala Cys Leu Val Lys Glu Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Arg Ile

20 25 30

Asn Leu Val Ser Ser Lys Lys Ile Thr Glu Phe Asp Pro Ala Ile Val

35 40 45

Ile Ser Pro Ser Gly Lys Tyr Asn Ala Val Lys Leu Gly Lys Tyr Glu

50 55 60

Asp Ser Asn Ser Val Thr Cys Ser Val Gln His Asp Asn Lys Thr Val

65 70 75 80

His Ser Thr Asp Phe Glu Val Lys Thr Asp Ser Thr Asp His Val Lys

85 90 95

Pro Lys Glu Thr Glu Asn Thr Lys Gln Pro Ser Lys Ser Cys His Lys

100 105 110

Pro Lys Ala Ile Val His Thr Glu Lys Val Asn Met Met Ser Leu Thr

115 120 125

Val Leu Gly Leu Arg Met Leu Phe Ala Lys Thr Val Ala Val Asn Phe

130 135 140

Leu Leu Thr Ala Lys Leu Phe Phe Leu

145 150

<210> 17

<211> 948

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

atggtgtccc tgctgcacgc cagcaccctg gccgtgctgg gcgccctgtg cgtgtatggc 60

gccggacacc tggaacagcc ccagatcagc agcaccaaga ccctgagcaa gaccgccagg 120

ctggaatgcg tggtgtccgg catcaccatc agcgccacct ccgtgtactg gtacagagag 180

agacccggcg aggtcatcca gttcctggtg tccatcagct acgacggcac cgtgcggaaa 240

gagagcggca tccccagcgg caagttcgag gtggacagaa tccccgagac cagcacctcc 300

accctgacca tccacaacgt ggagaagcag gacatcgcca cctactactg cgccctgtgg 360

gaggcccagc aggaactggg caagaaaatc aaggtgttcg gccctggcac caagctgatc 420

atcaccgaca agcagctgga cgccgacgtg agccccaagc ctaccatctt cctgcccagc 480

atcgccgaga ccaagctgca gaaggccggc acctacctgt gcctgctgga aaagttcttc 540

cccgacgtga tcaagatcca ctgggaggaa aagaagagca acaccatcct gggcagccag 600

gaaggcaata ccatgaaaac caacgacacc tacatgaagt tcagctggct gaccgtgccc 660

gagaagagcc tggacaaaga gcacagatgc atcgtccggc acgagaacaa caagaacggc 720

gtggaccagg aaatcatctt cccccccatc aagaccgatg tgatcacaat ggaccccaag 780

gacaactgca gcaaggacgc caacgatacc ctgctgctgc agctgaccaa caccagcgcc 840

tactacatgt atctcctgct gctgctgaag agcgtggtgt acttcgccat catcacctgc 900

tgtctgctgc ggcggaccgc cttctgctgc aacggcgaga agagctga 948

<210> 18

<211> 315

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

Met Val Ser Leu Leu His Ala Ser Thr Leu Ala Val Leu Gly Ala Leu

1 5 10 15

Cys Val Tyr Gly Ala Gly His Leu Glu Gln Pro Gln Ile Ser Ser Thr

20 25 30

Lys Thr Leu Ser Lys Thr Ala Arg Leu Glu Cys Val Val Ser Gly Ile

35 40 45

Thr Ile Ser Ala Thr Ser Val Tyr Trp Tyr Arg Glu Arg Pro Gly Glu

50 55 60

Val Ile Gln Phe Leu Val Ser Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Val Arg Lys

65 70 75 80

Glu Ser Gly Ile Pro Ser Gly Lys Phe Glu Val Asp Arg Ile Pro Glu

85 90 95

Thr Ser Thr Ser Thr Leu Thr Ile His Asn Val Glu Lys Gln Asp Ile

100 105 110

Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Glu Ala Gln Gln Glu Leu Gly Lys

115 120 125

Lys Ile Lys Val Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Ile Ile Thr Asp Lys

130 135 140

Gln Leu Asp Ala Asp Val Ser Pro Lys Pro Thr Ile Phe Leu Pro Ser

145 150 155 160

Ile Ala Glu Thr Lys Leu Gln Lys Ala Gly Thr Tyr Leu Cys Leu Leu

165 170 175

Glu Lys Phe Phe Pro Asp Val Ile Lys Ile His Trp Glu Glu Lys Lys

180 185 190

Ser Asn Thr Ile Leu Gly Ser Gln Glu Gly Asn Thr Met Lys Thr Asn

195 200 205

Asp Thr Tyr Met Lys Phe Ser Trp Leu Thr Val Pro Glu Lys Ser Leu

210 215 220

Asp Lys Glu His Arg Cys Ile Val Arg His Glu Asn Asn Lys Asn Gly

225 230 235 240

Val Asp Gln Glu Ile Ile Phe Pro Pro Ile Lys Thr Asp Val Ile Thr

245 250 255

Met Asp Pro Lys Asp Asn Cys Ser Lys Asp Ala Asn Asp Thr Leu Leu

260 265 270

Leu Gln Leu Thr Asn Thr Ser Ala Tyr Tyr Met Tyr Leu Leu Leu Leu

275 280 285

Leu Lys Ser Val Val Tyr Phe Ala Ile Ile Thr Cys Cys Leu Leu Arg

290 295 300

Arg Thr Ala Phe Cys Cys Asn Gly Glu Lys Ser

305 310 315

<210> 19

<211> 879

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

atggagcgga tcagcagcct gatccacctg agcctgttct gggccggagt gatgagcgcc 60

atcgagctgg tgcccgagca ccagaccgtg cccgtgagca tcggcgtgcc cgccaccctg 120

cggtgcagca tgaagggcga ggccatcggc aactactaca tcaactggta cagaaagacc 180

cagggcaaca ccatgacctt catctaccgg gagaaggaca tctacggccc tggcttcaag 240

gacaacttcc agggcgacat cgacatcgcc aagaacctgg ccgtgctgaa gatcctggcc 300

cccagcgaga gggacgaggg cagctactac tgcgcctgcg acaccctggg catgggcggc 360

gagtacaccg acaagctgat cttcggcaag ggcacccggg tgaccgtgga gcccagaagc 420

cagccccaca ccaagcccag cgtgttcgtg atgaagaacg gcaccaacgt ggcctgcctg 480

gtgaaagagt tctaccccaa ggacatccgg atcaacctgg tgtccagcaa gaagatcacc 540

gagttcgacc ccgccatcgt gatcagcccc agcggcaagt acaacgccgt gaagctgggc 600

aagtacgagg acagcaacag cgtgacctgc agcgtgcagc acgacaacaa gaccgtgcac 660

agcaccgact tcgaggtgaa aaccgactcc accgaccacg tgaagcccaa agagaccgag 720

aacaccaagc agcccagcaa gagctgccac aagcccaagg ccatcgtgca caccgagaag 780

gtgaacatga tgagcctgac cgtgctgggc ctgcggatgc tgttcgccaa gacagtggcc 840

gtgaacttcc tgctgaccgc caagctgttc ttcctgtga 879

<210> 20

<211> 292

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

Met Glu Arg Ile Ser Ser Leu Ile His Leu Ser Leu Phe Trp Ala Gly

1 5 10 15

Val Met Ser Ala Ile Glu Leu Val Pro Glu His Gln Thr Val Pro Val

20 25 30

Ser Ile Gly Val Pro Ala Thr Leu Arg Cys Ser Met Lys Gly Glu Ala

35 40 45

Ile Gly Asn Tyr Tyr Ile Asn Trp Tyr Arg Lys Thr Gln Gly Asn Thr

50 55 60

Met Thr Phe Ile Tyr Arg Glu Lys Asp Ile Tyr Gly Pro Gly Phe Lys

65 70 75 80

Asp Asn Phe Gln Gly Asp Ile Asp Ile Ala Lys Asn Leu Ala Val Leu

85 90 95

Lys Ile Leu Ala Pro Ser Glu Arg Asp Glu Gly Ser Tyr Tyr Cys Ala

100 105 110

Cys Asp Thr Leu Gly Met Gly Gly Glu Tyr Thr Asp Lys Leu Ile Phe

115 120 125

Gly Lys Gly Thr Arg Val Thr Val Glu Pro Arg Ser Gln Pro His Thr

130 135 140

Lys Pro Ser Val Phe Val Met Lys Asn Gly Thr Asn Val Ala Cys Leu

145 150 155 160

Val Lys Glu Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Arg Ile Asn Leu Val Ser Ser

165 170 175

Lys Lys Ile Thr Glu Phe Asp Pro Ala Ile Val Ile Ser Pro Ser Gly

180 185 190

Lys Tyr Asn Ala Val Lys Leu Gly Lys Tyr Glu Asp Ser Asn Ser Val

195 200 205

Thr Cys Ser Val Gln His Asp Asn Lys Thr Val His Ser Thr Asp Phe

210 215 220

Glu Val Lys Thr Asp Ser Thr Asp His Val Lys Pro Lys Glu Thr Glu

225 230 235 240

Asn Thr Lys Gln Pro Ser Lys Ser Cys His Lys Pro Lys Ala Ile Val

245 250 255

His Thr Glu Lys Val Asn Met Met Ser Leu Thr Val Leu Gly Leu Arg

260 265 270

Met Leu Phe Ala Lys Thr Val Ala Val Asn Phe Leu Leu Thr Ala Lys

275 280 285

Leu Phe Phe Leu

290

<210> 21

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ggtggcggtg gctcgggcgg tggtgggtcg ggtggcggcg gatct 45

<210> 22

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 23

<211> 135

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120

gacttcgcct gtgat 135

<210> 24

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

35 40 45

<210> 25

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

gaatcaaaat atggtcctcc ttgcccgcca tgtccggat 39

<210> 26

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Asp

1 5 10

<210> 27

<211> 4242

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

atggcgtatc cttatgacgt gcctgactat gccagcctga tggccccaaa gaagaagcgg 60

aaggtcggta tccacggagt cccagcagcc gacaagaagt acagcatcgg cctggacatc 120

ggcaccaact ctgtgggctg ggccgtgatc accgacgagt acaaggtgcc cagcaagaaa 180

ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac agcatcaaga agaacctgat cggagccctg 240

ctgttcgaca gcggcgaaac agccgaggcc acccggctga agagaaccgc cagaagaaga 300

tacaccagac ggaagaaccg gatctgctat ctgcaagaga tcttcagcaa cgagatggcc 360

aaggtggacg acagcttctt ccacagactg gaagagtcct tcctggtgga agaggataag 420

aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac atcgtggacg aggtggccta ccacgagaag 480

taccccacca tctaccacct gagaaagaaa ctggtggaca gcaccgacaa ggccgacctg 540

cggctgatct atctggccct ggcccacatg atcaagttcc ggggccactt cctgatcgag 600

ggcgacctga accccgacaa cagcgacgtg gacaagctgt tcatccagct ggtgcagacc 660

tacaaccagc tgttcgagga aaaccccatc aacgccagcg gcgtggacgc caaggccatc 720

ctgtctgcca gactgagcaa gagcagacgg ctggaaaatc tgatcgccca gctgcccggc 780

gagaagaaga atggcctgtt cggaaacctg attgccctga gcctgggcct gacccccaac 840

ttcaagagca acttcgacct ggccgaggat gccaaactgc agctgagcaa ggacacctac 900

gacgacgacc tggacaacct gctggcccag atcggcgacc agtacgccga cctgtttctg 960

gccgccaaga acctgtccga cgccatcctg ctgagcgaca tcctgagagt gaacaccgag 1020

atcaccaagg cccccctgag cgcctctatg atcaagagat acgacgagca ccaccaggac 1080

ctgaccctgc tgaaagctct cgtgcggcag cagctgcctg agaagtacaa agagattttc 1140

ttcgaccaga gcaagaacgg ctacgccggc tacattgacg gcggagccag ccaggaagag 1200

ttctacaagt tcatcaagcc catcctggaa aagatggacg gcaccgagga actgctcgtg 1260

aagctgaaca gagaggacct gctgcggaag cagcggacct tcgacaacgg cagcatcccc 1320

caccagatcc acctgggaga gctgcacgcc attctgcggc ggcaggaaga tttttaccca 1380

ttcctgaagg acaaccggga aaagatcgag aagatcctga ccttccgcat cccctactac 1440

gtgggccctc tggccagggg aaacagcaga ttcgcctgga tgaccagaaa gagcgaggaa 1500

accatcaccc cctggaactt cgaggaagtg gtggacaagg gcgcttccgc ccagagcttc 1560

atcgagcgga tgaccaactt cgataagaac ctgcccaacg agaaggtgct gcccaagcac 1620

agcctgctgt acgagtactt caccgtgtat aacgagctga ccaaagtgaa atacgtgacc 1680

gagggaatga gaaagcccgc cttcctgagc ggcgagcaga aaaaggccat cgtggacctg 1740

ctgttcaaga ccaaccggaa agtgaccgtg aagcagctga aagaggacta cttcaagaaa 1800

atcgagtgct tcgactccgt ggaaatctcc ggcgtggaag atcggttcaa cgcctccctg 1860

ggcacatacc acgatctgct gaaaattatc aaggacaagg acttcctgga caatgaggaa 1920

aacgaggaca ttctggaaga tatcgtgctg accctgacac tgtttgagga cagagagatg 1980

atcgaggaac ggctgaaaac ctatgcccac ctgttcgacg acaaagtgat gaagcagctg 2040

aagcggcgga gatacaccgg ctggggcagg ctgagccgga agctgatcaa cggcatccgg 2100

gacaagcagt ccggcaagac aatcctggat ttcctgaagt ccgacggctt cgccaacaga 2160

aacttcatgc agctgatcca cgacgacagc ctgaccttta aagaggacat ccagaaagcc 2220

caggtgtccg gccagggcga tagcctgcac gagcacattg ccaatctggc cggcagcccc 2280

gccattaaga agggcatcct gcagacagtg aaggtggtgg acgagctcgt gaaagtgatg 2340

ggccggcaca agcccgagaa catcgtgatc gaaatggcca gagagaacca gaccacccag 2400

aagggacaga agaacagccg cgagagaatg aagcggatcg aagagggcat caaagagctg 2460

ggcagccaga tcctgaaaga acaccccgtg gaaaacaccc agctgcagaa cgagaagctg 2520

tacctgtact acctgcagaa tgggcgggat atgtacgtgg accaggaact ggacatcaac 2580

cggctgtccg actacgatgt ggaccatatc gtgcctcaga gctttctgaa ggacgactcc 2640

atcgacaaca aggtgctgac cagaagcgac aagaaccggg gcaagagcga caacgtgccc 2700

tccgaagagg tcgtgaagaa gatgaagaac tactggcggc agctgctgaa cgccaagctg 2760

attacccaga gaaagttcga caatctgacc aaggccgaga gaggcggcct gagcgaactg 2820

gataaggccg gcttcatcaa gagacagctg gtggaaaccc ggcagatcac aaagcacgtg 2880

gcacagatcc tggactcccg gatgaacact aagtacgacg agaatgacaa gctgatccgg 2940

gaagtgaaag tgatcaccct gaagtccaag ctggtgtccg atttccggaa ggatttccag 3000

ttttacaaag tgcgcgagat caacaactac caccacgccc acgacgccta cctgaacgcc 3060

gtcgtgggaa ccgccctgat caaaaagtac cctaagctgg aaagcgagtt cgtgtacggc 3120

gactacaagg tgtacgacgt gcggaagatg atcgccaaga gcgagcagga aatcggcaag 3180

gctaccgcca agtacttctt ctacagcaac atcatgaact ttttcaagac cgagattacc 3240

ctggccaacg gcgagatccg gaagcggcct ctgatcgaga caaacggcga aaccggggag 3300

atcgtgtggg ataagggccg ggattttgcc accgtgcgga aagtgctgag catgccccaa 3360

gtgaatatcg tgaaaaagac cgaggtgcag acaggcggct tcagcaaaga gtctatcctg 3420

cccaagagga acagcgataa gctgatcgcc agaaagaagg actgggaccc taagaagtac 3480

ggcggcttcg acagccccac cgtggcctat tctgtgctgg tggtggccaa agtggaaaag 3540

ggcaagtcca agaaactgaa gagtgtgaaa gagctgctgg ggatcaccat catggaaaga 3600

agcagcttcg agaagaatcc catcgacttt ctggaagcca agggctacaa agaagtgaaa 3660

aaggacctga tcatcaagct gcctaagtac tccctgttcg agctggaaaa cggccggaag 3720

agaatgctgg cctctgccgg cgaactgcag aagggaaacg aactggccct gccctccaaa 3780

tatgtgaact tcctgtacct ggccagccac tatgagaagc tgaagggctc ccccgaggat 3840

aatgagcaga aacagctgtt tgtggaacag cacaagcact acctggacga gatcatcgag 3900

cagatcagcg agttctccaa gagagtgatc ctggccgacg ctaatctgga caaagtgctg 3960

tccgcctaca acaagcaccg ggataagccc atcagagagc aggccgagaa tatcatccac 4020

ctgtttaccc tgaccaatct gggagcccct gccgccttca agtactttga caccaccatc 4080

gaccggaaga ggtacaccag caccaaagag gtgctggacg ccaccctgat ccaccagagc 4140

atcaccggcc tgtacgagac acggatcgac ctgtctcagc tgggaggcga caaaaggccg 4200

gcggccacga aaaaggccgg ccaggcaaaa aagaaaaagt aa 4242

<210> 28

<211> 1413

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

Met Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Met Ala Pro

1 5 10 15

Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Ile His Gly Val Pro Ala Ala Asp Lys

20 25 30

Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala

35 40 45

Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys Val Leu

50 55 60

Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly Ala Leu

65 70 75 80

Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys Arg Thr

85 90 95

Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr Leu Gln

100 105 110

Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe Phe His

115 120 125

Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys His Glu Arg

130 135 140

His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr His Glu Lys

145 150 155 160

Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser Thr Asp

165 170 175

Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His Met Ile Lys

180 185 190

Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp Asn Ser

195 200 205

Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn Gln Leu

210 215 220

Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys Ala Ile

225 230 235 240

Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu Ile Ala

245 250 255

Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu Ile Ala

260 265 270

Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp Leu Ala

275 280 285

Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp Asp Leu

290 295 300

Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu Phe Leu

305 310 315 320

Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile Leu Arg

325 330 335

Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met Ile Lys

340 345 350

Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala Leu Val

355 360 365

Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp Gln Ser

370 375 380

Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln Glu Glu

385 390 395 400

Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly Thr Glu

405 410 415

Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys Gln Arg

420 425 430

Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu Gly Glu Leu

435 440 445

His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu Lys Asp

450 455 460

Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro Tyr Tyr

465 470 475 480

Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met Thr Arg

485 490 495

Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu Val Val Asp

500 505 510

Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr Asn Phe Asp

515 520 525

Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser Leu Leu Tyr

530 535 540

Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr Val Thr

545 550 555 560

Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys Lys Ala

565 570 575

Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr Val Lys Gln

580 585 590

Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser Val Glu

595 600 605

Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr Tyr His

610 615 620

Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn Glu Glu

625 630 635 640

Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu Phe Glu

645 650 655

Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His Leu Phe

660 665 670

Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr Gly Trp

675 680 685

Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys Gln Ser

690 695 700

Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala Asn Arg

705 710 715 720

Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys Glu Asp

725 730 735

Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu His Glu His

740 745 750

Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile Leu Gln

755 760 765

Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly Arg His Lys

770 775 780

Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr Thr Gln

785 790 795 800

Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu Glu Gly

805 810 815

Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro Val Glu Asn

820 825 830

Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly

835 840 845

Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asp

850 855 860

Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser

865 870 875 880

Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly Lys Ser

885 890 895

Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn Tyr Trp

900 905 910

Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe Asp Asn

915 920 925

Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys Ala Gly

930 935 940

Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys His Val

945 950 955 960

Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu Asn Asp

965 970 975

Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys Leu Val

980 985 990

Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu Ile Asn

995 1000 1005

Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val Gly Thr

1010 1015 1020

Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val Tyr Gly

1025 1030 1035 1040

Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys Ser Glu Gln

1045 1050 1055

Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met

1060 1065 1070

Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys

1075 1080 1085

Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp

1090 1095 1100

Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln

1105 1110 1115 1120

Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys

1125 1130 1135

Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys

1140 1145 1150

Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val

1155 1160 1165

Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys

1170 1175 1180

Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg

1185 1190 1195 1200

Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr

1205 1210 1215

Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu

1220 1225 1230

Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly Glu

1235 1240 1245

Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val Asn Phe

1250 1255 1260

Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser Pro Glu Asp

1265 1270 1275 1280

Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His Tyr Leu Asp

1285 1290 1295

Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val Ile Leu Ala

1300 1305 1310

Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp

1315 1320 1325

Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu Phe Thr Leu

1330 1335 1340

Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile

1345 1350 1355 1360

Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu

1365 1370 1375

Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser

1380 1385 1390

Gln Leu Gly Gly Asp Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln

1395 1400 1405

Ala Lys Lys Lys Lys

1410

<210> 29

<211> 1395

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

atccagatga cacagactac atcctccctg tctgcctctc tgggagacag agtcaccatc 60

agttgcaggg caagtcagga cattagtaaa tatttaaatt ggtatcagca gaaaccagat 120

ggaactgtta aactcctgat ctaccataca tcaagattac actcaggagt cccatcaagg 180

ttcagtggca gtgggtctgg aacagattat tctctcacca ttagcaacct ggagcaagaa 240

gatattgcca cttacttttg ccaacagggt aatacgcttc cgtacacgtt cggagggggg 300

actaagttgg aaataacagg tggcggtggc tcgggcggtg gtgggtcggg tggcggcgga 360

tctgaggtga aactgcagga gtcaggacct ggcctggtgg cgccctcaca gagcctgtcc 420

gtcacatgca ctgtctcagg ggtctcatta cccgactatg gtgtaagctg gattcgccag 480

cctccacgaa agggtctgga gtggctggga gtaatatggg gtagtgaaac cacatactat 540

aattcagctc tcaaatccag actgaccatc atcaaggaca actccaagag ccaagttttc 600

ttaaaaatga acagtctgca aactgatgac acagccattt actactgtgc caaacattat 660

tactacggtg gtagctatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 720

tcaaccacga cgccagcgcc gcgaccacca acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc 780

ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg 840

ctggacttcg cctgtgatat ctacatctgg gcgcccttgg ccgggacttg tggggtcctt 900

ctcctgtcac tggttatcac cctttactgc aaacggggca gaaagaaact cctgtatata 960

ttcaaacaac catttatgag accagtacaa actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc 1020

cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt gaactgagag tgaagttcag caggagcgca 1080

gacgcccccg cgtacaagca gggccagaac cagctctata acgagctcaa tctaggacga 1140

agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga cgtggccggg accctgagat ggggggaaag 1200

ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg 1260

gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc 1320

ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag gacacctacg acgcccttca catgcaggcc 1380

ctgccccctc gctaa 1395

<210> 30

<211> 465

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu

115 120 125

Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys

130 135 140

Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg

145 150 155 160

Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser

165 170 175

Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile

180 185 190

Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln

195 200 205

Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly

210 215 220

Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val

225 230 235 240

Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr

245 250 255

Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala

260 265 270

Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile

275 280 285

Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser

290 295 300

Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr

305 310 315 320

Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu

325 330 335

Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu

340 345 350

Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln

355 360 365

Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu

370 375 380

Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly

385 390 395 400

Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

405 410 415

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

420 425 430

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

435 440 445

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

450 455 460

Arg

465

<210> 31

<211> 513

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

aaaagactcg atgcggacat ctcaccaaaa cccactatct ttctgccgtc cgtcgcggag 60

accaatcttc ataagactgg gacttacctt tgcctgttgg aaaagttctt tccagatgtg 120

attcgagttt actggaagga gaaggatggg aatacgatat tggactccca ggaaggagac 180

actttgaaga cgaatgacac ctacatgaaa ttttcatggt tgacggtgcc cgaaagagcg 240

atgggaaagg aacataggtg catagttaag cacgagaaca acaagggtgg ggcagatcaa 300

gagatttttt ttccaagcat taagaaagtg gccgtttcta ctaaacctac aacttgttgg 360

caagacaaaa acgatgtttt gcagctgcaa tttacaataa catctgcgta ctacacctat 420

cttctgcttt tgctgaagtc agttatatat ttggcgataa tctctttcag tctcctgaga 480

cgcacaagtg tgtgcgggaa tgagaagaaa agc 513

<210> 32

<211> 171

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

Lys Arg Leu Asp Ala Asp Ile Ser Pro Lys Pro Thr Ile Phe Leu Pro

1 5 10 15

Ser Val Ala Glu Thr Asn Leu His Lys Thr Gly Thr Tyr Leu Cys Leu

20 25 30

Leu Glu Lys Phe Phe Pro Asp Val Ile Arg Val Tyr Trp Lys Glu Lys

35 40 45

Asp Gly Asn Thr Ile Leu Asp Ser Gln Glu Gly Asp Thr Leu Lys Thr

50 55 60

Asn Asp Thr Tyr Met Lys Phe Ser Trp Leu Thr Val Pro Glu Arg Ala

65 70 75 80

Met Gly Lys Glu His Arg Cys Ile Val Lys His Glu Asn Asn Lys Gly

85 90 95

Gly Ala Asp Gln Glu Ile Phe Phe Pro Ser Ile Lys Lys Val Ala Val

100 105 110

Ser Thr Lys Pro Thr Thr Cys Trp Gln Asp Lys Asn Asp Val Leu Gln

115 120 125

Leu Gln Phe Thr Ile Thr Ser Ala Tyr Tyr Thr Tyr Leu Leu Leu Leu

130 135 140

Leu Lys Ser Val Ile Tyr Leu Ala Ile Ile Ser Phe Ser Leu Leu Arg

145 150 155 160

Arg Thr Ser Val Cys Gly Asn Glu Lys Lys Ser

165 170

<210> 33

<211> 456

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

agccaacctc cggccaagcc cagtgtattt attatgaaga acggtacgaa cgttgcgtgc 60

cttgtcaaag atttctatcc caaagaagtg accatatcct tgcgaagtag caaaaagatt 120

gttgagtttg atccagcaat tgtcatatca cctagcggga aatacagcgc cgtcaaactc 180

ggccagtacg gtgatagtaa ttctgtgacc tgttctgttc agcataattc agagacagtc 240

cactcaacgg actttgagcc gtatgctaat tcatttaaca atgagaagct gccggaacca 300

gaaaatgaca cgcaaatatc tgagccctgt tacggcccca gagtgactgt ccacaccgaa 360

aaagtcaaca tgatgtccct cacggtgctg ggacttcggt tgttgttcgc taaaaccata 420

gcaataaact tcttgctcac agtgaaactt ttcttt 456

<210> 34

<211> 152

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

Ser Gln Pro Pro Ala Lys Pro Ser Val Phe Ile Met Lys Asn Gly Thr

1 5 10 15

Asn Val Ala Cys Leu Val Lys Asp Phe Tyr Pro Lys Glu Val Thr Ile

20 25 30

Ser Leu Arg Ser Ser Lys Lys Ile Val Glu Phe Asp Pro Ala Ile Val

35 40 45

Ile Ser Pro Ser Gly Lys Tyr Ser Ala Val Lys Leu Gly Gln Tyr Gly

50 55 60

Asp Ser Asn Ser Val Thr Cys Ser Val Gln His Asn Ser Glu Thr Val

65 70 75 80

His Ser Thr Asp Phe Glu Pro Tyr Ala Asn Ser Phe Asn Asn Glu Lys

85 90 95

Leu Pro Glu Pro Glu Asn Asp Thr Gln Ile Ser Glu Pro Cys Tyr Gly

100 105 110

Pro Arg Val Thr Val His Thr Glu Lys Val Asn Met Met Ser Leu Thr

115 120 125

Val Leu Gly Leu Arg Leu Leu Phe Ala Lys Thr Ile Ala Ile Asn Phe

130 135 140

Leu Leu Thr Val Lys Leu Phe Phe

145 150

<210> 35

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

atgtcccgct ctgttgcttt ggctgtgctg gcccttttgt cccttagcgg actggaggcc 60

<210> 36

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser

1 5 10 15

Gly Leu Glu Ala

20

<210> 37

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccg 63

<210> 38

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 39

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

gtgaaacaga ctttgaattt tgaccttctc aagttggcgg gagacgtgga gtccaaccca 60

gggccg 66

<210> 40

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Ser Asn Pro Gly Pro

20

Claims (35)

1.一种αβ-T细胞，其包含一种重组的T细胞受体(TCR)融合蛋白并且缺失TCRα链和TCRβ链，其中所述融合蛋白包括：

(a)与表面抗原结合的抗原结合区；

(b)TCRγ链的恒定区；和

(c)TCRδ链的恒定区。

2.权利要求1所述的T细胞，其中所述融合蛋白还包括TCRγ链的可变区和/或TCRδ链的可变区。

3.权利要求1或2所述的T细胞，其中所述恒定区和/或可变区来自于人、鼠或人鼠嵌合。

4.权利要求1所述的T细胞，其中所述抗原结合区直接与TCRγ链的恒定区和/或TCRδ链的恒定区连接。

5.权利要求1所述的T细胞，其中所述抗原结合区通过连接肽与TCRγ链的恒定区和/或TCRδ链的恒定区连接。

6.权利要求5所述的T细胞，其中所述连接肽选自(G4S)n、CD8和IgG4，其中n为1-4的整数。

7.权利要求1所述的T细胞，其中所述抗原结合区结合相同或不同的表面抗原。

8.权利要求1所述的T细胞，其中所述表面抗原选自：TSHR、CD19、CD123、CD22、BAFF-R、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、GPRC5D、Tn Ag、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-l lRa、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、Folate受体α、ERBB2、MUC1、EGFR、NCAM、Claudin18.2、Prostase、PAP、ELF2M、Ephrin B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gplOO、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、Fucosyl GMl、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、Folate受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD 179a、ALK、多聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-A1、豆荚蛋白、HPV E6、E7、MAGE Al、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺特异性蛋白、存活蛋白和端粒酶、PCTA-l/Galectin 8、MelanA/MARTl、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、TMPRSS2-ETS融合基因、NA17、PAX3、雄激素受体、Cyclin Bl、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B 1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES 1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠道羧酸酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1和它们的任意组合。

9.权利要求8所述的T细胞，其中所述表面抗原选自：CD19、CD20、CD22、BAFF-R、CD33、EGFRvIII、BCMA、GPRC5D、PSMA、ROR1、FAP、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、CAIX、WT1、NY-ESO-1、CD79a、CD79b、GPC3、Claudin18.2和它们的任意组合。

10.权利要求1所述的T细胞，其中所述抗原结合区选自scFv、单结构域抗体、纳米抗体、抗原结合配体、重组纤连蛋白结构域、anticalin和DARPIN，其中所述抗原结合配体选自PD1、PDL1、PDL2、TGFβ、APRIL和NKG2D。

11.权利要求10所述的T细胞，其中所述抗原结合区是单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、鼠源抗体、嵌合抗体及其功能片段。

12.权利要求1的T细胞，其中所述抗原结合区选自抗CD19 scFv、抗CD19抗体的重链可变区或轻链可变区。

13.权利要求1所述的T细胞，其中所述TCRγ链的恒定区选自SEQ ID NO：14、32；其中

所述TCRδ链的恒定区选自SEQ ID NO：16、34。

14.权利要求1所述的T细胞，其中所述TCRγ链如SEQ ID NO：18所示；其中所述TCRδ链如SEQ ID NO：20所示。

15.权利要求1所述的T细胞，其中所述融合蛋白还包括跨膜结构域。

16.权利要求15所述的T细胞，其中所述跨膜结构域选自以下蛋白质的跨膜结构域：TCRγ链、TCRδ链、CD3ζ亚基、CD3ε亚基、CD3γ亚基、CD3δ亚基、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154及其功能性片段。

17.权利要求1所述的T细胞，其特征在于，所述融合蛋白还包括共刺激结构域。

18.权利要求17所述的T细胞，其中所述共刺激结构域是从以下蛋白质获得的功能性信号传导结构域：TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54、CD83、CD134、CD137、CD150、CD152、CD223、CD270、CD273、CD274、CD278、DAP10、LAT、NKD2C SLP76、TRIM、ZAP70、41BB及其功能性片段。

19.权利要求1-18任一项所述的T细胞，其特征在于，所述融合蛋白还包括信号肽。

20.权利要求1-18任一项所述的T细胞，其特征在于，所述融合蛋白还包括2A肽。

21.权利要求1-18任一项所述的T细胞，其特征在于，所述融合蛋白与至少一种内源性CD3亚基或内源性CD3复合物形成蛋白质复合物。

22.权利要求21所述的T细胞，其中所述T细胞选自CD4+/CD8+双阳性T细胞、CD4+辅助T细胞、CD8+T细胞。

23.权利要求21所述的T细胞，其中所述T细胞选自记忆T细胞和幼稚T细胞。

24.一种药物组合物，包含权利要求1-23任一项所述的T细胞，和一种或多种药学上可接受的赋型剂。

25.权利要求24所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物通过动脉内、肌内、皮下、髓内、鞘内、心室内、静脉内、腹膜内、子宫内、阴道内、舌下或鼻内途径施用。

26.权利要求24所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物是软膏剂、乳膏剂、透皮贴剂、凝胶剂、粉剂、片剂、溶液剂、气雾剂、颗粒剂、丸剂、混悬剂、乳剂、胶囊剂、糖浆剂、酏剂、浸膏剂、酊剂或流浸膏提取物的形式。

27.权利要求24-26任一项所述的组合物，其特征在于，所述药物组合物与选自以下的一种或多种药剂组合施用：顺铂、美登素衍生物、雷查霉素(rachelmycin)、卡里奇霉素(calicheamicin)、多西紫杉醇、依托泊苷、吉西他滨、异环磷酰胺、伊立替康、美法仑、米托蒽醌、sorfimer卟啉钠II(sorfimer sodiumphotofrin II)、替莫唑胺、拓扑替康、葡萄糖醛酸曲美沙特(trimetreate glucuronate)、奥利斯他汀E(auristatin E)、长春新碱、阿霉素、蓖麻毒素、白喉毒素、假单胞菌细菌外毒素A、DNA酶、RNA酶、碘131、铼186、铟111、铱90、铋210和213、锕225、砹213、IL-2、IL-8、血小板因子4。

28.权利要求1-23任一项所述的T细胞或权利要求24-27任一项所述的药物组合物在制备用于治疗受试者的与表面抗原表达有关的疾病的药物中的用途。

29.权利要求28所述的用途，其中所述T细胞是自体或同种异体的T细胞。

30.权利要求28所述的用途，其中所述受试者是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛。

31.权利要求28所述的用途，其中所述与表面抗原表达有关的疾病选自：胚细胞瘤、白血病、基底细胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脑和CNS癌症、乳腺癌、腹膜癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠和直肠癌、结缔组织癌症、子宫内膜癌、食管癌、眼癌、头颈癌、胃癌、胶质母细胞瘤、肝癌、上皮内肿瘤、肾癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、睾丸癌、子宫癌、外阴癌、母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤、骨髓发育不良、浆细胞样树突状细胞瘤、以及移植后淋巴细胞增生性紊乱(PTLD)。

32.权利要求31所述的用途，其中所述肺癌选自小细胞肺癌、非小细胞肺癌、腺状肺癌和鳞状肺癌；所述白血病选自Waldenstrom巨球蛋白血症、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、B细胞幼淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病、毛细胞白血病、白血病前期；所述淋巴瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。

33.权利要求31所述的用途，其中所述淋巴瘤选自B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、MALT淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤。

34.权利要求31所述的用途，其中所述头颈癌选自喉癌、口腔癌、甲状腺癌。

35.权利要求32所述的用途，其中所述急性淋巴细胞白血病选自B细胞急性淋巴细胞白血病、T细胞急性淋巴细胞白血病。

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