CN103732755A - 通过发酵生产天然l-半胱氨酸的方法 - Google Patents

Abstract

一种在生产发酵罐中通过发酵生产天然L-半胱氨酸的方法，其中微生物菌株在发酵培养基中进行培养，其特征在于，化合物L-半胱氨酸、L-胱氨酸和噻唑烷在发酵培养基中的比例通过在培养基中使铁浓度最高为8mg/l的目标方式进行控制。

Description

通过发酵生产天然L-半胱氨酸的方法

技术领域

本发明涉及一种通过发酵生产天然L-半胱氨酸的方法。

背景技术

氨基酸L-半胱氨酸被用作例如食品添加剂(尤其是在烘烤业中)，作为化妆品的原料，也用作生产药学活性成分(尤其是N-乙酰半胱氨酸和S-羧甲基半胱氨酸)的起始原料，因此其具有经济上的重要性。

L-半胱氨酸在所有生物体的硫代谢中发挥着关键作用，并且被用于蛋白质、谷胱甘肽、生物素、硫辛酸、甲硫氨酸和其它含硫代谢产物的合成。另外，L-半胱氨酸是辅酶A生物合成的前体。细菌特别是大肠杆菌中L-半胱氨酸的生物合成已有深入研究，并且被Kredich详细地记载(1996，Biosynthesis of cysteine，p.514-527.In F.C.Neidhardt，R.Curtiss III，J.L.Ingraham，E.C.C.Lin，K.B.Low，B.Magasanik，W.S.Reznikoff，M.Riley，M.Schaechter和H.E.Umbarger(ed.)，Escherichia coli and Salmonella：cellular andmolecular biology，2nd ed.ASM Press，Washington，D.C.)。

除传统的生产L-半胱氨酸的方法，即通过从例如毛发、猪鬃、角、蹄和羽毛的含角蛋白的材料中提取，或经由前体的酶促转换进行的生物转化外，通过发酵生产L-半胱氨酸的方法在几年前也已经研发。使用微生物发酵生产L-半胱氨酸的相关现有技术已经被详细地记载于例如US6218168B1、US5972663A、US2004038352A2、CA2386539A2、EP1769080和EP2138585中。此处所用的细菌宿主生物体尤其是棒杆菌属(Corynebacterium)以及肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的代表性菌株，例如大肠杆菌(Escherichia coli)或成团泛菌(Pantoea ananatis)。

除了通过突变和筛选来改进L-半胱氨酸生产的传统方法之外，针对菌株的靶向遗传修饰也已经进行以便实现有效的L-半胱氨酸的超产。

例如，插入编码丝氨酸O-乙酰基转移酶cysE的等位基因致使半胱氨酸产量增加，其中丝氨酸O-乙酰基转移酶能够降低L-半胱氨酸的反馈抑制(US6218168B1)。作为CysE酶反馈抗性的结果，O-乙酰基-L-丝氨酸(其是L-半胱氨酸的直接前体)的生成在很大程度上与细胞中L-半胱氨酸水平无关。

O-乙酰基-L-丝氨酸是由L-丝氨酸和乙酰-CoA产生的。因此，提供足够量的L-丝氨酸用于生产L-半胱氨酸是非常重要的。这可以通过引入一个编码3-磷酸甘油酸脱氢酶的serA等位基因而实现，其中3-磷酸甘油酸脱氢酶能够降低L-丝氨酸的反馈抑制。因此，3-羟基丙酮酸(其是L-丝氨酸的前体)的生成在很大程度上与细胞中L-丝氨酸的水平无关。这类SerA酶的示例被描述于EP0620853、US7582460B2和EP0931833中。

此外，已知的是在发酵中L-半胱氨酸的收率可以通过降低或摧毁编码L-半胱氨酸-降解酶的基因而得到提高，所述酶例如是色氨酸酶TnaA或胱硫醚-β-裂解酶MalY或MetC(EP1571223)。

增加L-半胱氨酸从细胞的转运是一个进一步提高培养基中产物收率的途径。这可以通过所谓的外排基因(efflux gene)的过表达来实现。这些基因编码介导L-半胱氨酸从细胞中外排的膜结合蛋白。用于L-半胱氨酸外排的各种外排基因已有记载(US5972663A、US2004038352A2、US2005221453、WO2004113373)。

L-半胱氨酸从细胞中外排到培养基内具有以下优点：

1)L-半胱氨酸被连续地从细胞内反应平衡移除，其结果是，细胞内这种氨基酸的水平被维持在较低水平，因而由L-半胱氨酸导致的敏感酶反馈抑制作用没有发生：

2)释放到培养基中的L-半胱氨酸在氧气存在的条件下被氧化为二硫化L-胱氨酸，氧气是在培养过程中引入的(US5972663A)：

由于在中性pH水溶液中，L-胱氨酸的溶解度非常低，特别是相比于L-丝氨酸，因此二硫化物甚至在低浓度下就已经沉淀并且形成白色沉淀物：

凭借着L-胱氨酸的沉淀，在培养基中溶解产物的水平被降低，由此在(1)和(2)的每种情况下反应平衡均被引向产物方向。

3)如果该氨基酸可以直接从培养基中获得而不是在细胞内将产物聚集并先进行细胞破碎，那么纯化产物的技术复杂性是相对较低的。

将两分子L-半胱氨酸进行氧化可形成二硫化L-胱氨酸。该反应是可逆的，这意味着L-胱氨酸可通过还原被转化为L-半胱氨酸。如果，从细胞中分离之后(例如，使用倾析器)，L-胱氨酸再次通过电解被还原为L-半胱氨酸，那么根据调味剂条例(flavorings regulation)，这种化学转化意味着该L-半胱氨酸不能被称为天然产物。

根据欧盟的调味剂条例(1334/2008第22条，食品法条例下的标签更改条例)，天然调味剂的定义如下：“天然”调味剂是指天然存在的和已经在自然界中发现的具有调味特性的化学物质。其可以植物、动物或微生物为起始原料经适宜的物理、酶或微生物方法获得，所得物质可直接使用，或经一种或多种常规的食品制备方法(包括微生物方法如发酵，参见附录II)制成人类消费品。

术语“天然的”在本申请中也是用作该含义。人们非常愿意在调味剂的制备中使用天然原材料。然而，到目前为止没有一种通过发酵生产天然半胱氨酸的方法。

有许多化合物可催化SH基团的氧化；例如，已知的是重金属盐如铁盐或锌盐是发酵中必不可少的添加剂，这些组分可以有效地催化半胱氨酸氧化为胱氨酸(US2008190854A2)。

US6218168B1描述了用于生产L-半胱氨酸和其衍生物的发酵培养基，其中含有15mg/l浓度的铁(75mg/l的硫酸亚铁七水合物)。

EP1389427A1描述了一种经发酵生产L-半胱氨酸、L-胱氨酸和噻唑烷的培养基，其中铁的浓度被指定为14.9mg/l(74mg/l硫酸亚铁七水合物)。

US2010/0093045A1描述了一种用于生产L-半胱氨酸的培养基，其仅含有2mg/l的铁(10mg/l硫酸亚铁七水合物)。但是，该培养基仅用于实验室规模下在摇瓶中的应用(培养基体积20ml)，而不是在生产发酵罐中发酵。EP2133429A1提及一种用于生产L-半胱氨酸、L-胱氨酸、其衍生物或它们的混合物的培养基，其仅含有0.34mg/l的铁(1.7mg/l硫酸亚铁七水合物)。这种培养基也没有被描述用于发酵中，但是可用于在小试管中的培养(培养基体积为2ml)。通常，在这些培养条件下(分批培养、供氧差、不调节pH)，只获得非常低的细胞密度(约0.5至2g/l干生物量)和低的产物产量。通过参考可知，在摇瓶或小试管中所获得的L-半胱氨酸产量为0.25g/l(US2003/0077766A1)、0.3g/l(EP2133429A1)和1.2g/l(US2010/0093045A1)。

然而在生产发酵罐中，仅出于在工业规模下生产经济的考虑，人们期望在特定生物质的产物形成速率下得到更高的细胞密度，以便获得相应高体积的产率。用于微生物物质生产的工业化生产质量一般是参照生产率评估的。这个参数描述了每个发酵时间内每升培养基上形成的产物总量。

所述通过发酵生产L-半胱氨酸的方法的一个缺点是氨基酸在培养液中以各种形式存在。除了沉淀物中析出的L-胱氨酸，溶解的L-半胱氨酸外，在培养物上清液中还发现了溶解形式的L-胱氨酸和噻唑烷(US6218168B1、US5972663A、CA2386539A2)。该噻唑烷(2-甲基噻唑烷-2，4-二羧酸)是L-半胱氨酸和丙酮酸的缩合产物，其产生于纯化化学反应中。在本发明的上下文中，术语“总半胱氨酸”包括L-半胱氨酸和L-胱氨酸以及由此衍生的噻唑烷化合物，它们在发酵过程中形成，并在培养物上清液和沉淀中积聚。

在已知的方法中，发酵结束时总半胱氨酸的组成会发生波动：沉淀的L-胱氨酸比例在40-66％间(US5972663A、CA2386539A2)，剩余的34-60％是以可溶性产物的形式-主要是L-半胱氨酸和噻唑烷-存在于培养物上清液中。该产物的异质性阻碍了从培养液中回收和纯化目标产物天然L-半胱氨酸。

因此，最终产物主要是水溶性L-半胱氨酸的方法是令人满意的。而且，尽可能地没有噻唑烷形成。使用该方法将目标产物L-半胱氨酸从培养物上清液中纯化将是相当容易的，因为沉淀形式的L-胱氨酸能通过简单的分离步骤从相关的细胞中分离出来，并且可溶性L-半胱氨酸能够通过离子交换吸附而被分离。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于在生产发酵罐中生产天然L-半胱氨酸的方法，将微生物菌株在发酵培养基中进行培养，其中最终产物主要以可溶L-半胱氨酸的形式存在于培养基中。

该目的是通过一种方法实现的，所述方法的特征在于，在发酵培养物中制备的化合物L-半胱氨酸、L-胱氨酸和噻唑烷的比例通过在培养基中使最高8mg/l的铁浓度的目标方式进行控制。

发酵培养基中的铁浓度优选为最高4mg/l，特别优选最高2mg/l铁。已经发现，在这些较低的铁浓度下，发酵罐培养物中存在一个明显更均匀的产物谱系，因为形成的产物中主要是可溶性L-半胱氨酸和沉淀的L-胱氨酸，而不是噻唑烷。然而，铁的浓度不应低于0.2mg/l，因为其对发酵结束时存在的L-半胱氨酸的数量和比例有负面影响。

一个令人惊讶的发现是，在这些低铁浓度的培养基中，总半胱氨酸中L-半胱氨酸的比例是增加的，并且在发酵结束时至少为65％。这一发现尤为令人惊讶，因为被记载的使用肠杆菌科细菌生产氨基酸，特别是L-半胱氨酸及其衍生物的发酵培养基中，含至少14.9mg/l的铁(US6218168B1)。

本发明的另一个优点是，与已知方法相反(EP1389427)，在根据本发明的方法中，在制备过程中不需要加入还原剂，如维生素C、维生素E，或甲酸及它们的盐，来稳定L-半胱氨酸。

在根据本发明的发酵方法中，半胱氨酸形成阶段开始于半胱氨酸在培养液中首次可以被检测到之时，并且持续直至培养结束。通常，该阶段开始于生产发酵罐接种后两小时。

不同于现有技术中描述的方法(US2003/0077766A1、EP2133429A1、US2010/0093045A1)，在根据本发明的发酵方法中，可以获得至少20g/l的干生物质细胞密度，优选为至少30g/l，特别优选至少40g/l，以及至少10g/l的半胱氨酸体积产物产量。

根据本发明方法中所使用的微生物是在现有技术中所描述的全部半胱氨酸生产菌株。这些菌株被公开于例如US6218168B1、US5972663A、US2004038352A2、CA2386539A2、US2009053778A2和EP2138585A1中。

作为微生物菌株，优选的是肠杆菌科的代表，特别优选埃希氏菌属或泛菌属的代表，非常特别优选的菌株是大肠杆菌或成团泛菌品种。

在这些微生物菌株中，优选的是交替给予以下菌株，其或具有一种修饰的丝氨酸O-乙酰转移酶，与相应的野生型酶相比，其具有降低至少2倍的L-半胱氨酸反馈抑制，或是，作为外排基因过表达的结果，与野生型细胞相比从细胞中排出的半胱氨酸增加至少2倍。特别优选的微生物菌株是那些既具有丝氨酸O-乙酰转移酶，其相比于相应的野生型酶能够降低至少2倍的L-半胱氨酸的反馈抑制，同时也具有，作为外排基因过表达的结果，相比于野生型细胞从细胞中排出的半胱氨酸增加至少2倍的菌株。这样的菌株是已知的，例如参见US6218168B1和US5972663A。非常特别优选的菌株是额外具有一种修饰的3-磷酸甘油酸脱氢酶，相比于相应的野生型酶，其能够降低至少2倍的L-丝氨酸反馈抑制(US7582460B2)，并且其中至少一种L-半胱氨酸-降解酶已经被减弱，使得相比于野生型细胞此酶活性最高仅50％仍存在于细胞中。

相比于相应的野生型酶，丝氨酸O-乙酰转移酶优选变体具有降低至少5倍的半胱氨酸反馈抑制，特别优选至少10倍，非常特别优选至少50倍。

该外排基因优选来自于大肠杆菌中的ydeD(US5972663A)、yfiK(US2004038352A2)、cydDC(WO2004113373)、bcr(US2005221453)和emrAB(US2005221453)，或是不同微生物的相应同源基因。同源基因可以被理解为所述基因的序列与相应的大肠杆菌基因的DNA序列至少80％是相同的。与野生型细胞相比，外排基因的过表达优选导致从细胞中外排的半胱氨酸增加至少5倍，更优选至少10倍，更优选为至少20倍。

相比于相应的野生型酶，3-磷酸甘油酸脱氢酶优选的变体具有降低至少5倍的L-丝氨酸反馈抑制，特别优选至少10倍，非常特别优选至少50倍。

L-半胱氨酸-降解酶优选来自于色氨酸酶(TnaA)和胱硫醚-β-裂解酶(MalY，MetC)。

特别优选的菌株是，其中的这些酶中至少一种已经被减弱，由此在细胞中该酶的活性仅仅以相对于野生型菌株的最高酶活的10％存在。非常特别优选的菌株是，其中的这些酶中至少一种完全失活。

在本发明的上下文中，生产发酵罐优选被理解为额定体积≥1m³的发酵罐。特别优选的是使用额定体积≥5m³的发酵罐，非常特别优选的是额定体积≥50m³的发酵罐。

在L-半胱氨酸生产期间的细胞培养是在需氧生长的条件下进行的，即有氧存在。在L-半胱氨酸发酵的生产期间氧含量应为30至1％的氧饱和度，优选为10至1％，特别优选5至1％。

碳源优选为糖、糖醇、有机酸或含糖的植物水解产物。特别优选使用葡萄糖、果糖、乳糖、甘油或含有两种或多种的这些化合物的混合物，作为根据本发明所述方法的碳源。

优选地，碳源被计量加入培养基中，由此在半胱氨酸生产阶段期间发酵罐内的碳源含量不会超过10g/l。优选2g/l的最高浓度，特别优选为0.5g/l，非常特别优选为0.1g/l。

根据本发明的方法中所使用的N源优选为氨、铵盐或蛋白质水解物。当使用氨作为pH稳定的校正手段时，该氮源在发酵期间应定期补充。

作为额外的培养基添加剂，可以添加元素磷、氯、钠、镁、氮、钾、钙、铁的盐以及痕迹量(即，μM浓度)的，元素钼、硼、钴、锰、锌和镍的盐。根据本发明，对于L-半胱氨酸发酵重要的是培养基中铁浓度要低于8mg/l，优选低于4mg/l，特别优选低于2mg/l。铁浓度应不低于0.2mg/l。

此外，有机酸(如，醋酸盐、柠檬酸盐)、氨基酸(如，异亮氨酸)和维生素(如，B1、B6)可以被添加到培养基中。

可使用的复杂营养源是酵母提取物、玉米浆、大豆粉或麦芽提取物。

用于如大肠杆菌或成团泛菌的嗜热微生物的培养温度优选为15-45℃，特别优选为30-37℃。

发酵期间发酵培养基pH优选范围为5.0至8.5，特别优选pH为7.0。

为了生产L-半胱氨酸和L-半胱氨酸的衍生物，在发酵期间需要添加硫源。为此优选使用硫酸盐或硫代硫酸盐。对L-半胱氨酸的发酵而言，培养基中硫代硫酸盐的浓度应低于5g/l，优选低于3g/l，特别优选低于1g/l，非常特别优选低于0.5g/l，但是应不低于0.1g/l。

在最初生长阶段后的分批培养或分批补料式培养中，通过所述方法发酵的微生物能在2到30小时的时间内高效地将L-半胱氨酸和由此衍生的化合物分泌到培养基中。

为了进一步纯化目标产物，可以进行以下步骤：

-用于除去细胞和以沉淀形式存在的L-胱氨酸的分离步骤，

-通过离子交换吸附分离L-半胱氨酸，

-沉淀结晶，

这样的方法是现有技术中已知的。

下列实施例用于进一步说明本发明。

实施例

实施例1：半胱氨酸生产菌株的制备

将大肠杆菌W3110(ATCC 27325)和成团泛菌(ATCC 11530)的野生型菌株分别用质粒pACYC184/cysEX-GAPDH-ORF306(在US5972663A实施例2中公开)通过US5972663A描述的电穿孔法转化。质粒pACYC184/cysEX-GAPDH-ORF306除含有复制起点和四环素抗性基因之外，还含有cysEX等位基因(其编码能降低L-半胱氨酸反馈抑制的丝氨酸O-乙酰转移酶)，以及外排基因ydeD(ORF306)(其表达受组成型GAPDH启动子的控制)。

负载质粒细胞的选择在含有15mg/l四环素的LB琼脂平板上进行。

在使用QIAprep Spin质粒试剂盒(Qiagen GmbH)进一步分离质粒和进行酶切分析之后，所需的转化子，即已经掺入质粒pACYC184/cysEX-GAPDH-ORF306的细胞，被分离并用于发酵，如实施例2中所述。

实施例2：半胱氨酸生产菌株在不同硫酸亚铁七水合物补充量下的培养

为了检测半胱氨酸的生成，将实施例1中所述的微生物在具有葡萄糖和硫代硫酸盐连续补料的分批补料模式的发酵罐中培养。所使用的生产发酵罐是额定体积为5m³的生物反应器。用于生产发酵罐的接种物质通过两步预培养步骤而制备。

预培养1(摇瓶)：

将每一个含有15mg/l四环素的400毫升LB培养基接种到10个含有特定菌株(大肠杆菌W3110pACYC184/cysEX-GAPDH-ORF306或成团泛菌pACYC184/cysEX-GAPDH-ORF306)的锥形烧瓶(2000ml)中，并在振荡器上孵育7小时(150rpm，30℃)。

预培养2(发酵罐)：

合并预培养1中的10个锥形瓶。将4L的预培养1转移到无菌接种烧瓶中并将它们全部倒入额定体积为5001的预发酵罐中。发酵培养基(2001)含有20g/l葡萄糖、10g/l胰蛋白胨(Difco)、5g/l酵母提取物(Difco)、5g/l(NH₄)₂SO₄、1.5g/l KH₂PO₄、0.5g/l NaCl、0.3g/l MgSO₄×7H₂O、0.015g/lCaCl₂×2H₂O、0.002g/l FeSO₄×7H₂O、1g/l柠檬酸钠×2H₂O、0.005g/l维生素B1、1ml/l微量元素溶液(含有0.15g/l Na₂MoO₄×2H₂O、2.5g/l H₃BO₃、0.7g/lCoCl₂×6H₂O、0.25g/l CuSO₄×5H₂O、1.6g/lMnCl₂×4H₂O、0.3g/l ZnSO₄×7H₂O)和15mg/l四环素。

在接种之前，用25％的NH₄OH溶液调节预发酵罐中的pH值至7.0。在发酵期间，用25％的NH₄OH溶液自动校正以维持pH值为7.0。在200rpm下以及在经无菌过滤的0.5vvm无菌压缩空气的通气量下，搅拌该培养物。在接种前的这些起始条件下，将氧气探头校准到100％的饱和度。在发酵期间将所需的氧气饱和度的数值设置到30±1％。在氧气饱和度低于设定值时之后，调节器开始工作以恢复氧气饱和度至所需的数值。此时，空气供应被持续提高至最高值2vvm。

在30℃温度和50kPa压力下，进行培养15小时。孵育之后，600nm处的光密度(OD₆₀₀)在18至20之间。

主要培养(生产发酵罐)：

在额定体积为5m³的发酵罐中进行发酵。该发酵培养基(2300l)包含15g/l葡萄糖、10g/l胰蛋白胨(Difco)、5g/l酵母提取物(Difco)、5g/l(NH₄)₂SO₄、1.5g/l KH₂PO₄、0.5g/l NaCl、0.3g/l MgSO₄×7H₂O、0.015g/l CaCl₂×2H₂O、1g/l柠檬酸钠×2H₂O和1ml/l微量元素溶液(参见上文)、0.005g/l维生素B1和15mg/l四环素。根据实验混合物的情况，向培养基中补充75mg/l、40mg/l、20mg/l、10mg/l、3mg/l或0.5mg/l的FeSO₄×7H₂O。在接种之前，通过倒入25％的NH₄OH溶液调节生产发酵罐中的pH值至7.0。在发酵期间，用25％的NH₄OH溶液自动校正以维持pH值7.0。为了进行接种，将2001的预培养2倾入发酵罐容器中。由此初始体积达到约2500l。在120rpm下以及在经无菌过滤的1.5vvm无菌压缩空气的通气量下，开始搅拌培养物。在接种前的这些起始条件下，将氧气探头校准到100％饱和度。发酵期间所需的氧气饱和度数值被设置到30±1％。在氧气饱和度低于设定值时后，调节器开始工作以恢复氧气饱和度至所需的数值。此时，首先空气供应被持续续增加(至最高值2vvm)，然后搅拌速度被持续提高(至最高值300rpm)。

在30℃温度和50-60kPa压力下进行发酵。经2h发酵后，连续补充无菌贮备溶液形式的60％硫代硫酸钠×5H₂O的硫源。调节补料速率以便使培养基中的硫代硫酸盐浓度不会超过5g/l。一旦发酵罐中的葡萄糖含量从起始的15g/l降低至约2g/l，则连续计量加入56％的葡萄糖溶液。调节补料速率以便使发酵罐中的葡萄糖浓度不会超过10g/l。使用来自YSI(YellowSprings，Ohio，USA)的葡萄糖分析仪进行葡萄糖的测定。发酵时间为24小时。此时，所有发酵罐中测定的细胞密度均为40至45g/l干生物质。在发酵结束时进行取样，并且独立测定培养物上清液(L-胱氨酸和噻唑烷)和沉淀(L-胱氨酸)中L-半胱氨酸及由此衍生的衍生物浓度(参见表1和表2)。为了这个目的，将使用源自Gaitonde的茚三酮比色法(Gaitonde，M.K.(1967)，Biochem.J.104，627-633)。此时可以确定的是，在测试的强酸反应环境下，不但包括定量的游离L-半胱氨酸，而且还包括连接在噻唑烷上的L-半胱氨酸。溶解在培养物上清液中的L-胱氨酸经源自Gaitonde的茚三酮检测法进行检测，这与用pH8.0的二硫苏糖醇(DTT)稀溶液还原L-半胱氨酸是一样的。沉淀中的L-胱氨酸在能够以相同的方法定量之前，必须首先被溶解在8％盐酸中。

为了对溶解在培养物上清液中的组分L-半胱氨酸、L-胱氨酸和噻唑烷分别定量，还需要使用两种额外的测试方法：使用Sang-Han Lee等人所述的测试方法对游离L-半胱氨酸进行定量(1995，Biochemical and BiophysicalResearch Communications 213，837ff)，即通过5，5′-二硫代双-2-硝基苯甲酸(DTNB)进行定量，其中游离的-SH基团可被特异性地检测到。通过用PLC法对L-半胱氨酸和L-胱氨酸衍生物和噻唑烷进行区分，如DaBler等人所述(2000，Molecular Microbiology 36，1101ff)。

表1：24小时后大肠杆菌培养液中L-半胱氨酸和L-半胱氨酸衍生物的含量作为培养基中铁浓度的函数

¹：上清液中的L-半胱氨酸(DTNB测试)

²：溶解在上清液中的L-胱氨酸(HPLC)

³：上清液中的噻唑烷(HPLC)

⁴：沉淀物中的L-胱氨酸

⁵：总半胱氨酸中L-半胱氨酸的比例

表2：以培养基中铁浓度为函数，24小时后成团泛菌的培养液中L-半胱氨酸和L-半胱氨酸衍生物的含量

¹：上清液中的L-半胱氨酸(DTNB测试)

²：溶解在上清液中的L-胱氨酸(HPLC)

³：在上清液中的噻唑烷(HPLC)

⁴：沉淀物中的L-胱氨酸

⁵：总半胱氨酸中L-半胱氨酸的比例

Claims (10)

1.一种在生产发酵罐中通过发酵生产天然L-半胱氨酸的方法，其中微生物菌株在发酵培养基中培养，其特征在于，制备的化合物L-半胱氨酸、L-胱氨酸和噻唑烷在所述发酵培养基中的比例通过在所述发酵培养基中使铁浓度最高为8mg/l的目标方式进行控制。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基中铁浓度最高为4mg/l铁，优选最高2mg/l铁。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基中铁浓度不低于0.2mg/l。

4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，不添加还原剂，例如维生素C、维生素E或甲酸及其盐。

5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，使用的所述微生物菌株是来自肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的代表，优选埃希氏菌属(Escherichia)或泛菌属(Pantoea)的代表，特别优选的菌株是大肠杆菌(E.coli)或成团泛菌(P.ananatis)。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述微生物菌株具有修饰的丝氨酸O-乙酰转移酶，其相比于相应的野生型酶，具有降低至少2倍的L-半胱氨酸反馈抑制，或者具有因外排基因过表达导致的与野生型细胞相比至少增加2倍的半胱氨酸细胞外排。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述微生物菌株具有修饰的丝氨酸O-乙酰转移酶，其相比于相应的野生型酶，具有降低至少2倍的L-半胱氨酸反馈抑制，而且还具有因外排基因过表达导致的与野生型细胞相比至少增加2倍的半胱氨酸细胞外排。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述微生物菌株额外具有修饰的3-磷酸甘油酸脱氢酶，其相比于相应的野生型酶，具有降低至少2倍的L-丝氨酸反馈抑制，并且其中至少一种L-半胱氨酸-降解酶已经被减弱，使得相比于野生型细胞此酶活性最高仅50％仍存在于细胞中。

9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其特征在于，细胞的培养是在额定体积≥1m³的发酵罐中进行的，优选额定体积≥5m³的发酵罐，非常特别优选额定体积≥50m³的发酵罐。

10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其特征在于，在所述发酵培养基中存在的硫代硫酸盐的浓度低于5g/l，优选低于3g/l，特别优选低于1g/l，非常特别优选低于0.5g/l，但是所述浓度不低于0.1g/l。