CN102058575A - 丝氨酸蛋白酶抑制剂在抗胚胎着床和抗肿瘤方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了丝氨酸蛋白酶抑制剂在抗胚胎着床和抗肿瘤方面的应用。具体地，本发明公开了4-(2-氨乙基)苯磺酰氟和加贝酯等丝氨酸蛋白酶抑制剂(或其活性衍生物或其药学上可接受的盐)在抗胚胎着床和抗肿瘤方面的应用。本发明还提供了所述丝氨酸蛋白酶抑制剂在制备抑制胚胎着床或抑制肿瘤细胞生长的组合物或器具中的用途。

Description

丝氨酸蛋白酶抑制剂在抗胚胎着床和抗肿瘤方面的应用

技术领域

本发明属于生物技术和生育调节领域，具体地说，本发明涉及丝氨酸蛋白酶抑制剂及其在抗胚胎着床和抗肿瘤方面的应用。

背景技术

胚胎着床(植入)是哺乳动物和人类特有的一种能决定妊娠成功与否的生殖生理步骤，也是进行生殖调控的理想环节。着床过程一般包括胚胎在子宫内膜的定位、粘附和侵入等阶段，涉及母-胎界面的细胞的生长、分化和迁移，以及细胞间的相互识别、粘附、信号转导等具共性的细胞生理机制。同时，侵袭转移也是恶性肿瘤细胞最具特征的生物学行为，而这一行为与胚胎着床的生理过程极为相似，都表现为细胞的快速增殖和分化、持续的血管生成、局部免疫耐受状态的形成、对周围组织的侵入等。

胚胎相对于母体来说，是一个半异体组织，易受母体排斥，只能在一个特定的时间段内(即“着床窗”)才能被母体子宫内膜组织接纳。胚胎着床过程的完成有赖于母体子宫与胚胎的同步发育、母体子宫内膜容受性和″着床窗″的形成、以及母体子宫组织局部免疫耐受性的形成，涉及细胞的增殖和分化、局部免疫功能的调节。雌、孕激素在着床中的作用已很明确，现有的甾体类避孕药就是基于它们在生殖过程中的作用发展起来的。但是，由于雌、孕激素是内分泌激素，其作用是全身性的，因此还不是最理想的生育调控因子。

在胚胎着床的过程中，胚胎的合体滋养细胞分泌一系列蛋白酶，通过降解子宫内膜的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)，促进子宫内膜的重构。细胞外基质是细胞产生的一些大分子物质，包括胶原蛋白、非胶原糖蛋白和蛋白多糖三大类。人子宫内膜ECM的大多数成分随着月经周期的不同阶段的变化而变化，与着床相关的是分泌中期和蜕膜化。早孕期胚泡粘附在蜕膜化的子宫内膜。着床时，透明带已完全溶解消失，内细胞群侧的滋养层首先与子宫内膜接触，分泌蛋白酶，在内膜溶出一个缺口，然后胚泡陷入缺口，逐渐被包埋其中。为使着床后的胚胎能够存活，合体滋养细胞要破坏蜕膜的毛细血管和静脉血管并穿透螺旋动脉，诱导螺旋动脉成为低阻力高血流的血管，以满足早期胚胎的营养需要。

由于种种原因，人们对与胚胎着床有关的因素还知之甚少，目前已知的抑制胚胎着床的也很少，因此本领域迫切需要开发新的可用于抑制胚胎着床的物质。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的可用于抑制胚胎着床的抑制剂及其在生育调节中的用途。

在本发明的第一方面，提供了一种丝氨酸蛋白酶抑制剂的用途，所述的丝氨酸蛋白酶抑制剂选自下组：4-(2-氨乙基)苯磺酰氟或其活性衍生物或其药学上可接受的盐；加贝酯或其活性衍生物或其药学上可接受的盐，其中，所述抑制剂被用于制备抑制胚胎着床或抑制肿瘤细胞生长的组合物或器具。

在另一优选例中，所述的组合物或器具是通过阴道给药的组合物或器具。

在另一优选例中，所述抑制剂是下式所示的4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐

或者，所述活性衍生物是具有丝氨酸蛋白酶抑制活性的4-(2-氨乙基)苯磺酰氟的衍生物。

在另一优选例中，所述抑制剂是下式所示的加贝酯甲磺酸盐

或者，所述活性衍生物是具有丝氨酸蛋白酶抑制活性的加贝酯的衍生物。

在另一优选例中，所述的组合物是药物组合物。

在另一优选例中，所述的药物组合物为抑制胚胎着床的组合物。

在另一优选例中，所述药物组合物是避孕药；或所述的器具是避孕器具。

在另一优选例中，所述的避孕器具包括(但并不限于)：阴道环、或宫内节育器等。

在另一优选例中，所述的避孕药包括阴道用凝胶。

在另一优选例中，所述的抑制剂被用于制备(同时)抑制胚胎着床和抑制肿瘤细胞生长的组合物或器具。

在本发明的第二方面，提供了一种抑制胚胎着床的器具，所述器具是用于女性的避孕器具，其特征在于，所述的避孕器具还包括用于在阴道或子宫内释放丝氨酸蛋白酶抑制剂的释放部件，其中所述的丝氨酸蛋白酶抑制剂选自下组：4-(2-氨乙基)苯磺酰氟或其活性衍生物或其药学上可接受的盐；加贝酯或其活性衍生物或其药学上可接受的盐。

在另一优选例中，所述的释放部件设置于或固定于避孕器具的本体。

在另一优选例中，所述的释放部件是缓释层。

在另一优选例中，所述的器具是避孕器具包括(但并不限于)：阴道环、或宫内节育器等。

在本发明的第三方面，提供了一种非治疗目的的避孕方法，该方法包括：给需要避孕的雌性哺乳动物施用丝氨酸蛋白酶抑制剂，其中所述的丝氨酸蛋白酶抑制剂选自下组：4-(2-氨乙基)苯磺酰氟或其活性衍生物或其药学上可接受的盐；加贝酯或其活性衍生物或其药学上可接受的盐。

在另一优选例中，所述的施用是局部施用，更佳地为阴道内或子宫内局部施用。

在本发明的第四方面，提供了一种丝氨酸蛋白酶抑制剂的用途，其中所述的丝氨酸蛋白酶抑制剂选自下组：4-(2-氨乙基)苯磺酰氟或其活性衍生物或其药学上可接受的盐；加贝酯或其活性衍生物或其药学上可接受的盐，所述的抑制剂被用作抑制胚胎着床的抑制剂。

本发明的其它方面由于本文的技术公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1显示了2种丝氨酸蛋白酶抑制剂(AEBSF和GM)阴道给药的抗大鼠着床作用。

图2显示了AEBSF子宫角给药的抗小鼠胚胎着床作用。AEBSF组(用药30-3000μg/单侧子宫角)和生理盐水(PS)对照组的结果比较表明，AEBSF剂量依赖性地抑制小鼠胚胎着床。

图3显示了AEBSF对肿瘤细胞生长的影响。图中显示，A549肺癌细胞株和HCC-94子宫鳞癌细胞株的细胞存活率随着AEBSF用药浓度的升高而逐渐降低。

图4显示了甲磺酸加贝酯对肿瘤细胞生长的影响。图中显示，在高剂量情况下，甲磺酸加贝酯抑制A549细胞和HCC-94的生长。

图5显示了对照抑制剂Antipain子宫角给药对小鼠着床的抑制试验结果。图中显示，Antipain处理组(用药0，300或1000μg/单侧子宫角)的结果比较表明，Antipain处理对小鼠胚胎着床无显著的影响。

具体实施方式

本发明人通过深入研究发现，首次意外地发现某些丝氨酸蛋白酶抑制剂或其活性衍生物(包括药学上可接受的盐)可抑制胚胎着床，而且该抑制作用是可逆的，因此特别适合将这类化合物用于抑制胚胎着床。此外，这些丝氨酸蛋白酶抑制剂还具有抑制肿瘤细胞生长。

具体地，本发明人的研究表明，4-(2-氨乙基)苯磺酰氟和加贝酯可以非常有效而安全地抑制胚胎的着床。

在胚胎着床中起作用的蛋白酶，可根据它们的催化活性分为三大类：基质金属蛋白酶，半胱氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶。其中，MMP的主要生物学功能是降解ECM和修饰一些重要的生物活性分子，在细胞迁移、侵袭、增殖和凋亡过程中发挥重要作用。在已知的与着床相关的MMP分子中，MMP-1(胶原酶)的作用底物是多种胶原类型；MMP-3(基质水解酶)的底物是蛋白多糖、纤维连接蛋白、层粘连蛋白、IV型胶原等；MMP-2(明胶酶A)和MMP-9(明胶酶B)的底物则包括多种胶原、明胶、纤维连接蛋白、层粘连蛋白等。

在生物学中，对丝氨酸蛋白酶研究最多。它们的共同特点是在其活性中心有丝氨酸残基，在中性pH环境活性最强。丝氨酸蛋白酶的分布很广、种类也最多，共有20多个家族，在免疫应答反应、肿瘤细胞的侵袭转移、血液凝固、伤口愈合等生理和病理过程中发挥重要作用。目前已发现的与胚胎着床相关的丝氨酸蛋白酶有尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)、血管舒缓素、类胰蛋白酶、着床丝氨酸蛋白酶-1(ISP-1)和-2(ISP-2)等，均属于糜蛋白酶中的S1家族，大都参与ECM的重构，部分参与调节MMP的活性。

小鼠白细胞分泌丝氨酸蛋白酶抑制因子(secretory leukocyte proteaseinhibitor，SLPI)在子宫内膜中着床窗口期表达下调，其可以通过抑制ISP活性在胚胎侵入子宫内膜过程中发生作用。

Monzon等发现，人滋养细胞产生的u-PA在体外具有明显的蛋白溶解活性，能降解细胞外的纤维粘连蛋白，在胚胎着床中发挥重要作用。最近，O′Sullivan等发现的两种丝氨酸蛋白酶，ISP1和ISP2也可能在胚胎着床中发挥重要作用。本发明人经研究发现，将抗ISP2抗体注入宫腔，可抑制胚胎着床，并呈剂量效应。4-(2-氨乙基)苯磺酰氟和加贝酯(或其活性衍生物或其药学上可接受的盐)对胚胎着床的抑制作用与抗ISP2抗体的抑制作用可能有相似之处。

本发明人的研究提示，4-(2-氨乙基)苯磺酰氟和加贝酯(或其活性衍生物或其药学上可接受的盐)抑制胚胎着床的机理可能是通过抑制丝氨酸蛋白酶(其中可能包括tPA，uPA、血管舒缓素、ISP1、ISP2等糜蛋白酶S1家族的各种丝氨酸蛋白酶)的活性而干扰胚胎的着床。当然，应理解本发明的保护范围并不受该机理的影响。

此外，4-(2-氨乙基)苯磺酰氟和加贝酯(或其活性衍生物或其药学上可接受的盐)还可有效地抑制肿瘤细胞的生长，尤其是肺癌细胞和子宫癌细胞的生长。

如本文所用，“丝氨酸蛋白酶抑制剂”或“活性成分”可互换使用，指4-(2-氨乙基)苯磺酰氟或其活性衍生物或其药学上可接受的盐；和/或加贝酯或其活性衍生物或其药学上可接受的盐。

如本文所用，术语“4-(2-氨乙基)苯磺酰氟”指下式化合物：

4-(2-氨乙基)苯磺酰氟的英文名：4-(2-Aminoethyl)benzenesulfonylfluoride(缩写：AEBSF)；分子式：C₈H₁₀NSO₂F。AEBSF是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，能抑制胰蛋白酶、糜蛋白酶、纤溶酶、凝血酶及激肽释放酶。

如本文所用，术语“加贝酯”指下式化合物：

加贝酯(Gabexate mesilate，简称为GM)，是一种人工合成的丝氨酸蛋白酶抑制剂。迄今为止，未公开过加贝酯对肺癌和子宫癌的抑制作用。

如本文所用，术语“本发明化合物”和“本发明抑制剂”可互换使用，指①AEBSF及其活性衍生物和/或②GM及其活性衍生物，该术语还包括AEBSF和GM的药学上可接受的盐。

本发明还包括AEBSF和GM的活性衍生物。如本文所用，术语“活性衍生物”是指基本上保持了AEBSF和GM的丝氨酸蛋白酶抑制活性的衍生物。

如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指相对无毒的本发明化合物的无机酸加成盐或有机酸加成盐。这些盐可在化合物最后的分离和提纯过程中现场制备，或者是使纯化的化合物以其游离碱形式与适宜的有机或无机酸进行反应，再将形成的盐分离而制成。代表性盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、亚硫酸盐、乙酸盐、草酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、硼酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯甲酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、葡萄糖酸盐、乳糖酸盐和月桂基磺酸盐等。它们可包含基于碱金属和碱土金属的阳离子，如钠、锂、钾、钙、镁等，以及无毒胺、季胺和胺阳离子，包括但不限于：胺、四甲基胺、四乙基胺、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。

对于AEBSF而言，一种优选的盐是无机酸加成盐，特别优选的是AEBSF的盐酸盐，其结构式如下：

4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐的分子式：C₈H₁₀NSO₂F·HCl；分子量为239.7。该化合物可溶于水，在pH＜7的水溶液中比较稳定，可于4℃储存6个月；在pH＞7的水溶液中，则不稳定，应在使用时配制。

对于GM而言，一种优选的盐是有机酸加成盐，特别优选的是GM的甲磺酸盐，其结构式如下：

如本文所用，术语“哺乳动物”包括(但并不限于)人、猴、牛、羊、猪、兔、鼠、猫、狗等动物。优选的哺乳动物包括灵长动物、啮齿动物、犬科动物和猫科动物以及各种家畜和宠物等。

生育调节组合物

本发明还提供了一种生育调节组合物，它含有安全有效量的本发明化合物以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是避孕有效量，例如每天约1微克/千克体重-约10毫克/千克体重。此外，本发明的化合物还可与其他避孕剂一起使用。

本发明化合物或其药学上可接受的盐可以口服、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、局部给药(阴道内、或子宫内给药，例如作为粉剂、软膏剂或滴剂)。一种特别优选的施用方式是是局部施用，更佳地为阴道内或子宫内局部施用。

用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。

固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。

用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。

除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、娇味剂和香料。

除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。

用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。

用于局部给药的本发明化合物的剂型包括粉剂、软膏剂、散剂、或喷射剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。

使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明化合物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、使用对象的健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

避孕器具

本发明还提供了一种抑制胚胎着床的器具，所述器具为含有AEBSF和/或GM(或其活性衍生物或其药学上可接受的盐)的避孕器具。

在本发明的避孕器具中，包括用于在阴道或子宫内释放AEBSF和/或GM(或其活性衍生物或其药学上可接受的盐)的释放部件。在另一优选例中，所述的避孕器具是阴道环、或宫内节育器。

应理解，所述的释放部件可以是单独的、也可以是组合的。例如，释放部件可以是一个单独的释放元件或与其他部件组合在一起的组合式释放元件，或者是粘合于或整合于其他部件的释放层。

一种优选方式是在常规的阴道环、或宫内节育器上添加一个释放层(例如缓释层)，该释放层可以在阴道内或宫内在一段时间内释放AEBSF和/或GM(或其活性衍生物或其药学上可接受的盐)，从而抑制胚胎着床。

通常，一个避孕器具中的释放元件宜含有5-5000毫克，更佳地10-2500毫克，最佳地20-1000毫克的AEBSF和/或GM或其活性衍生物或其药学上可接受的盐。

本发明的主要优点在于，

(a)AEBSF和/或GM(或其活性衍生物或其药学上可接受的盐)对胚胎着床有明显的抑制作用；

(b)通过阴道内或子宫内局部给药AEBSF和/或GM(或其活性衍生物或其药学上可接受的盐)，具有很高的安全性好。

(c)对胚胎着床的抑制作用是可逆的。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1

AEBSF对胚胎着床的抑制作用

(一)实验动物的饲养和交配；

将8～10周龄的成年雄性ICR小鼠(体重35～40克)和雌性ICR小鼠(体重25～30克)按2∶1比例合笼饲养，次日早晨通过检查雌小鼠阴道栓以判断是否交配，以见栓当日作为孕D1天，并将同一批检测到得的孕D1天小鼠随机进行分组。

(二)注射溶液的配制：

使用的化合物是AEBSF的盐酸盐，其结构式如下：

1、AEBSF高剂量组：200μg/μl(用生理盐水配制)，

2、AEBSF中剂量组：20μg/μl(用生理盐水配制)，

3、AEBSF低剂量组：2μg/μl(用生理盐水配制)。

(三)注射时间和方法：

于孕D3天上午8:00～10:00，从小鼠两侧子宫角上端靠近卵巢的部位，用微量注射器将预先配制并在35℃下预热的注射溶液注入子宫腔内，每个子宫角注入15μl溶液。同只小鼠的两个子宫角内注入相同的溶液，不同组小鼠按设定注射不同的注射溶液。于孕D8天(肉眼可见胚胎)上午9:00处死小鼠，将完整的子宫组织和卵巢剥离，对每侧子宫角的胚胎数和卵巢黄体数(即排卵数)进行记数。

(四)结果：

与对照组相比，抑制率为32％，低、中、高剂量组的抑制率分别为16％、53％、87％；有明显的剂量效应。

表1AEBSF对胚胎着床的抑制作用

实施例2

AEBSF抗生育作用的可逆性

考虑到避孕药物的抗生育作用必须是可逆的，在本实施例中通过动物实验对AEBSF的抗着床效应的可逆性进行了观察分析。方法如下：

将同一批次雌性成年小鼠分为两组，于第一次妊娠期的孕第3天分别用生理盐水和200μg/μl浓度的AEBSF处理，观察其妊娠结局；放置一个月后，再次交配，不予以任何处理，观察其妊娠结局。

结果如表2所示。结果表明，200μg/μl浓度的AEBSF具有明显的抗生育作用，而且该作用可逆(表2)

表2.AEBSF抗生育作用的可逆性研究结果

实施例3

含4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐的药物组合物

在本实施例中，制备一阴道给药的凝胶剂。方法如下：

将18克Poloxamer127(购自上海昌为医药辅料技术有限公司)和0.65克F68(购自上海昌为医药辅料技术有限公司)置于搅拌器中，加入60毫升0.4M醋酸缓冲液，在23-25℃搅匀，搅拌速度100-300rpm，使其完全溶解，过程约3-4小时，10毫升甘油、0.5毫升聚二甲基硅氧烷和0.1毫升的苯甲酸(购自上海昌为医药辅料技术有限公司)，再搅拌1-2小时，静置过夜，离心15min，除去气泡。最后，用0.4M醋酸缓冲液配成总量为100毫升的凝胶基质。测定凝胶的pH和粘度(室温23-25℃)。结果pH为3.5。用NDJ-1型旋转式粘度计(购自上海昌为医药辅料技术有限公司)，测定粘度为11-15Pa·S.。

在10ml凝胶基质中，加入5g丝氨酸蛋白酶抑制剂，室温下搅拌均匀成为终浓度为0.5g/ml的凝胶制剂，于4℃下储存备用。

该凝胶剂可用于阴道给药。

实施例4

含4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐的避孕器具

在常规的阴道环内侧或者在阴道环内外侧施涂一层实施例3制备的凝胶剂，凝固后，该凝胶剂形成一含有4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐的释放层，从而制得含4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐的避孕器具。

在胚胎着床前期，通过阴道环、宫内节育器等子宫局部给药系统，在子宫内释放一定剂量的AEBSF，可抑制胚胎的着床，从而达到避孕节育的目的。

实施例5

丝氨酸蛋白酶抑制剂抑制大鼠着床的作用

5.1材料

4-(2-氨乙基)苯磺酰氟(4-(2-aminoethyl)benzenesulfonyl fluoridehydrochloride，AEBSF)，购自Amresco公司。甲磺酸加贝酯(Gabexatemesylate，GM)，购自济南高德医药科技有限公司。

SD大鼠，4月龄，购自上海斯莱克实验动物公司。

凝胶剂的成分为活性成分(AEBSF或GM)和基质，其中基质的主要成分为聚氧乙烯聚氧丙烯聚合物。

5.2实验方法

大鼠雌雄合笼，雌∶雄为1∶1合笼。第二天雌鼠阴道涂片，显微镜下观察发现精子的当日定为孕第1天(孕d1)。

宫腔给药组在孕d4上午，麻醉后，自子宫角部位注入宫腔，每侧子宫角注入20mg或10mg药物(溶于50μl生理盐水)，分别注射双侧子宫。用溶剂，及50μl生理盐水代替AEBSF，同样操作用为对照。

阴道给药组向阴道内注入100mg/次药物(溶于0.2ml凝胶基质)，孕d3和d4上午2次给药。用不含药物的200μl凝胶基质作空白对照。

AEBSF和加贝酯2种药物实验的动物分组如下：

1)生理盐水宫腔对照组，3只

2)AEBSF宫腔给药组，3只

3)加贝酯宫腔给药组，3只

4)凝胶基质阴道给药对照组，7只

5)AEBSF阴道给药组，5只

6)加贝酯阴道给药组，3只

各实验组的大鼠，在孕d10上午，处死大鼠，取出子宫和卵巢，分别计数活胎数、死胎数，同时计数卵巢的黄体数，比较不同组之间的计数结果，分析2种药物的抗着床作用。

5.3结果分析

宫腔给药高剂量组，即20mg AEBSF/单侧子宫角的用药剂量，3只大鼠全部死亡。

AEBSF组(孕d3和孕d4各100mg/200μl阴道给药)和生理盐水(PS)对照组的结果比较表明，AEBSF显著减少胚胎的着床数(p＝0.03)。加贝酯处理组(孕d3和孕d4各100mg/200μl阴道给药)没有发现着床胚胎，与PS组比较显著差异(p＝0.00)(图1)。

这些结果表明，AEBSF和GM均可以显著抑制大鼠的胚胎着床。

实施例6

丝氨酸蛋白酶抑制剂抑制小鼠着床的作用

6.1材料

ICR小鼠，8-10周龄，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司。

6.1实验方法

小鼠雌雄合笼，雌∶雄为2∶1合笼。第二天雌鼠阴道发现阴栓，当日定为孕第1天(孕d1)。

宫腔给药组在孕d4上午，麻醉后，自子宫角部位注入宫腔，每侧子宫角注入30μg、300μg、1000μg或3000μg药物(溶于15μl生理盐水)，分别注射双侧子宫。用溶剂，即15μl生理盐水代替AEBSF，同样操作用为对照。

阴道给药组向阴道内注入10mg/次，药物(溶于0.2ml凝胶基质)，孕d3和d4上午2次给药。用不含药物的200μl凝胶基质作空白对照。

AEBSF药物实验的动物分组如下：

(1)生理盐水宫腔对照组，6只

(2)AEBSF宫腔给药组(30μg/子宫角)，6只

(3)AEBSF宫腔给药组(300μg/子宫角)，5只

(4)AEBSF宫腔给药组(1000μg/子宫角)，7只

(5)AEBSF宫腔给药组(3000μg/子宫角)，5只

各实验组的小鼠，在孕d8上午，处死小鼠，取出子宫和卵巢，分别计数活胎数、死胎数，同时计数卵巢的黄体数，比较不同组之间的计数结果，分析2种药物的抗着床作用。

6..3结果分析

子宫角注射给药AEBSF，剂量为30-3000μg/单侧子宫角，结果说明AEBSF能够显著性地抑制小鼠胚胎着床，而且具有显著的剂量依赖性。而卵巢黄体受影响不显著。结果如图2和表3-4所示。

表3小鼠子宫用药结果单因素方差分析

表4小鼠子宫用药结果的各组之间的比较

*在0.05水平上存在显著性差异

*Vehicle表示15μl生理盐水的空白对照组。

实施例7

丝氨酸蛋白酶抑制肿瘤细胞的生长

7.1材料

A549肺癌细胞株和HCC-94子宫鳞癌细胞株。

7.2测定方法

(1)以每孔5000个细胞的密度接种于96孔培养板，37℃、5％CO₂培养箱中培养至细胞贴壁，加入丝氨酸蛋白酶抑制剂，每种抑制剂设5个浓度，每一浓度重复3孔。

(2)37℃、5％CO₂培养箱中培养48h，每孔加入MTT(5mg/ml)20μL，继续培养4h。

(3)吸弃培养基，每孔加入150μL DMSO，振荡至结晶充分溶解。

(4)用酶标仪检测各组细胞的A570nm吸光值，以不加抑制剂的细胞孔作为对照组，其细胞存活率为100％，其余各组按：存活率＝(各浓度组吸光值/对照组吸光值)×100％与之比较，作图。

7.3结果

AEBSF和甲磺酸加贝酯均能剂量依赖性地抑制A549细胞和HCC-94的生长，AEBSF半数抑制浓度在100μg/mL附近，而甲磺酸加贝酯的半数抑制浓度在700μg/mL附近(分别见图3和图4)。

对比例1

丝氨酸蛋白酶抑制剂Antipain的抗小鼠着床试验

材料

Antipain hydrochloride(购自Sigma公司)是一种自微生物分离的可逆丝氨酸蛋白酶抑制剂，其二盐酸盐的结构如下所示。

ICR小鼠，8-10周龄，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司。

实验方法

小鼠雌雄合笼，雌∶雄为2∶1合笼。第二天雌鼠阴道发现阴栓，当日定为孕第1天(孕d1)。

宫腔给药组在孕d4上午，麻醉后，自子宫角部位注入宫腔，每侧子宫角注入0μg、300μg、1000μg Antipain药物(溶于15μl生理盐水)，分别注射双侧子宫。

结果

黄体数代表的排卵数(CL)和孕8天的着床胚胎数(embryo)，在着床小鼠每侧子宫角给予300μg或1000μg剂量的antipain处理条件下，相对于生理食盐水对照(0μg antipain)均没有明显的变化(图5)。黄体数和胚胎数的差值表示不能着床的胚胎数，在antipain处理和对照之间无显著差异(表5)。

这些结果表明，与AEBSF和加贝酯相比，虽然的antipain同样属于丝氨酸蛋白酶抑制剂，但是却对胚胎着床的无抑制作用。

表5antipain处理对黄体数和着床胚胎数的差值的影响

参考文献：

1.Petruzzelli，G.J.，The biology of tumor invasion，angiogenesis andlymph node metastasis.ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec，2000.62(4)：p.178-85.

2.马芳和王智彪，肿瘤一个发育生物学问题.生命科学，2005.17：p.433-438.

3.Salamonsen，L.A.and G.Nie，Proteases at theendometrial-trophoblast interface：their role in implantation.RevEndocr Metab Disord，2002.3(2)：p.133-43.

4.Sharma，N.，et al.，Substrate specificity determination of mouseimplantation serine proteinase and human kallikrein-related peptidase6 by phage display.Biol Chem，2008.

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种丝氨酸蛋白酶抑制剂的用途，所述的丝氨酸蛋白酶抑制剂选自下组：4-(2-氨乙基)苯磺酰氟或其活性衍生物或其药学上可接受的盐；加贝酯或其活性衍生物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述抑制剂被用于制备抑制胚胎着床或抑制肿瘤细胞生长的组合物或器具。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物或器具是通过阴道给药的组合物或器具。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述抑制剂是下式所示的4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐

或者，所述活性衍生物是具有丝氨酸蛋白酶抑制活性的4-(2-氨乙基)苯磺酰氟的衍生物。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述抑制剂是下式所示的加贝酯甲磺酸盐

或者，所述活性衍生物是具有丝氨酸蛋白酶抑制活性的加贝酯的衍生物。

5.如权利要求1-4中任一所述的用途，其特征在于，所述的组合物是药物组合物。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的药物组合物为抑制胚胎着床的组合物。

7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物组合物是避孕药；或所述的器具是避孕器具；

较佳地，所述的避孕器具包括阴道环、或宫内节育器；或

较佳地，所述的避孕药包括阴道用凝胶。

8.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的抑制剂被用于制备抑制胚胎着床和抑制肿瘤细胞生长的组合物或器具。

9.一种抑制胚胎着床的器具，所述器具是用于女性的避孕器具，其特征在于，所述的避孕器具还包括用于在阴道或子宫内释放丝氨酸蛋白酶抑制剂的释放部件，其中所述的丝氨酸蛋白酶抑制剂选自下组：4-(2-氨乙基)苯磺酰氟或其活性衍生物或其药学上可接受的盐；加贝酯或其活性衍生物或其药学上可接受的盐。

10.一种化合物的用途，所述的化合物是加贝酯或其活性衍生物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述化合物被用作抑制胚胎着床的可逆性抑制剂。

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