CN101784557A - 用于治疗病毒感染的叠氮基嘌呤核苷 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于治疗或预防人类患者或其他动物宿主体内病毒感染，特别是HIV、HBV和HCV的化合物、组合物和方法。所述化合物是3’-叠氮基-2’，3’-双脱氧嘌呤核苷或其膦酸(衍生物)以及药用盐、药物前体及其他衍生物。特别地，该化合物表现出抗HIV-1耐药性突变体(包括HIV-1_K65R、HIV-1_K70E、HIV-1_L74V、HIV-1_M184V、HIV-1_Q151M)的有效抗病毒活性以及针对携带TAMS或插入突变(包括HIV-1_AZT3、HIV-1_AZT7、HIV-1_AZT9、HIV-1_Q151M或HIV-1_69插入)的HIV-1RT的抑制活性。在一个实施方式中，所述化合物是3’-叠氮基-ddA、3’-叠氮基-ddG或它们的组合，与一种或多种另外的针对TAM突变和/或M184V突变选择的抗病毒剂以及药用载体一起给予。

Description

用于治疗病毒感染的叠氮基嘌呤核苷

相关申请的引用

本申请要求2007年5月14日提交的美国临时专利申请第60/930,154(35 USC 119)号的优先权。由此将所述美国临时专利申请第60/930,154号的全部披露内容以引用方式结合于此，用于所有目的。

技术领域

本发明涉及利用核苷类似物来治疗或预防病毒感染的化合物、方法和组合物。更具体地说，本发明描述了3’-叠氮基3’-脱氧嘌呤和改良的嘌呤核苷类似物、其药用盐类、药物前体或其他衍生物，以及其在治疗病毒感染，并且特别是人类免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)或乙型肝炎病毒(HBV)感染中的应用。

背景技术

核苷类似物作为一类药物，具有广受认可的监管史，其中多于10种现在已经被美国食品药品管理局(US FDA)批准用于治疗人类免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)。开发抗病毒疗法的挑战在于抑制病毒复制而不损伤宿主细胞。在HIV中，药物开发的关键目标是逆转录酶(HIV-RT)，一种独特的病毒聚合酶。该酶在病毒复制周期的早期具有活性，并将病毒的遗传信息从RNA转化入DNA内，这是持续病毒复制必需的一个过程。核苷逆转录酶抑制剂(NRTI)模拟天然核苷。在三磷酸形式中，每一个NRTI均与四种天然存在的2’-脱氧核苷-5’-三磷酸(dNTP)，即dCTP、TTP、dATP或dGTP之一竞争结合以及HIV-1RT活性位置附近的DNA链延伸。

逆转录是HIV-1复制周期中的一个必要事件，并且是开发抗逆转录病毒药物的一个主要目标(参见Parniak MA，Sluis-Cremer N.Inhibitors of HIV-1 reverse transcriptase.Adv.Pharmacol.2000，49，67-109；Painter GR，Almond MR，Mao S，Liotta DC.Biochemical andmechanistic basis for the activity of nucleoside analogue inhibitors ofHIV reverse transcriptase.Curr.Top.Med.Chem.2004，4，1035-44；Sharma PL，Nurpeisov V，Hernandez-Santiago B，Beltran T，SchinaziRF.Nucleoside inhibitors of human immunodeficiency virus type 1reverse transcriptase.Curr.Top.Med.Chem.2004，4 895-919)。现在已经鉴定了两组不同的化合物，其能抑制HIV-1RT。它们是核苷或核苷酸RT抑制剂(NRTI)和非核苷RT抑制剂(NNRTI)。

NRTI是脱氧核糖核苷的类似物，其核糖上缺乏3’-OH基团。它们是最早用来治疗HIV-1感染的药物，并且它们保持几乎所有抗逆转录病毒方案(rigimen)的完整组成。

1985年，报道了，合成的核苷3’-叠氮基-3’-脱氧胸苷(齐多夫定，AZT，一种代表性的NRTI)抑制HIV的复制。自那时起，已证实几种其他NRTI，包括但不限于2’，3’-双脱氧肌苷(地达诺新，ddI)，2’，3’-双脱氧胞苷(扎西他滨，ddC)，2’，3’-双脱氧-2’，3’-双脱氢胸苷(司他夫定，d4T)，(-)-2’，3’-双脱氧-3’-硫代胞苷(拉米夫定，3TC)，(-)-2’，3’-双脱氧-5-氟代-3’-硫代胞苷(恩曲他滨，FTC)，(1S，4R)-4-[2-氨基-6-(环丙基-氨基)-9H-嘌呤-9-基]-2-环戊烯-1-甲醇琥珀酸盐(阿巴卡韦，ABC)，(R)-9-(2-膦酰甲氧丙基)腺嘌呤(PMPA，富马酸替诺福韦二吡呋酯)(TDF)和(-)-碳环2’，3’-双脱氢-2’，3’-双脱氧鸟苷(卡波佛)及其药物前体阿巴卡韦可有效抗HIV。通过细胞激酶磷酸化为5’-三磷酸酯(或盐)后，这些NRTI整合入正形成的病毒DNA链中而引起链终止，因为它们缺乏3’-羟基基团。某些三磷酸酯形式的核苷还抑制病毒酶逆转录酶。

通常，为了表现出抗病毒活性，NRTI必须通过宿主细胞激酶代谢转化为其相应的三磷酸酯形式(NRTI-TP)。该NRTI-TP通过作为DNA合成的链终止剂而抑制HIV-1RT DNA合成(参见GoodyRS，Muller B，Restle T.Factors contributing to the inhibition of HIVreverse transcriptase by chain terminating nucleotides in vitro and invivo.FEBS Lett.1991，291，1-5)。尽管包含一种或多种NRTI的组合疗法已经广泛降低了与AIDS相关的发病率和死亡率，但已批准的NRTI可能还具有明显的局限性。它们包括急性和慢性毒性、与其他抗逆转录病毒的药动学相互作用以及选择对其他NRTI表现出交叉耐药性的HIV-1的耐药变体。

个体的HIV-1耐药性来自于该病毒群体的遗传变异性以及治疗对耐药变体的选择(参见Chen R，Quinones-Mateu ME，Mansky LM.Drug resistance，virus fitness and HIV-1 mutagenesis.Curr.Pharm.Des.2004，10，4065-70)。HIV-1遗传变异性是由于复制过程中HIV-1RT无法校正核苷酸序列引起的。该变异性随着高速HIV-1复制、HIV-1感染过程中前病毒变体的累积以及不同序列病毒感染同一细胞时的遗传重组而增加。结果，初次感染后几年内个体体内会发展无数种遗传不同的变体(称为准种)。耐药性的发展依赖于药物治疗过程中病毒复制持续的程度、获得特定突变(或一组突变)的容易性以及耐药性突变对药物易感性和病毒适合度的影响。通常，对于具有RT突变的病毒选择NRTI疗法。取决于所选择的NRTI耐药性突变，该突变病毒通常表现出对某些或者在某些情况下对所有NRTI的易感性降低。从临床角度，耐药性HIV-1的发展通过有效地减少可采用的保留了针对耐药性病毒的效力的药物数量而限制了未来的治疗选择。这经常需要更复杂的药物方案，其涉及强化剂量方案并且由于药物毒性引起的严重副作用的风险增大。这些因素经常造成对药物方案的不完全依从性。因此，具有优异的活性和安全性以及与目前可用的药物具有有限或无交叉耐药性的新型NRTI的开发对于HIV-1感染的有效治疗是非常关键的。

对耐药性HIV-1具有活性的核苷类似物的开发需要详细了解对该类化合物耐药所涉及的分子机制。因此，我们提供了HIV-1对NRTI耐药的突变和分子机制的简单总结。现在已经提出了HIV-1对NRTI的耐药性的两种动力学不同的分子机制(参见Sluis-CremerN，Arion D，Parniak MA.Molecular mechanisms of HIV-1 resistance tonucleoside reverse transcriptase inhibitors(NRTIs).Cell Mol.Life Sci.2000；57，1408-22)。一种机制涉及病毒DNA合成过程中NRTI-TP对正常dNTP掺入的选择性减少。这种耐药机制已命名为辨别。第二种机制涉及从过早终止的DNA链上选择性去除链终止性NRTI单磷酸酯(NRTI-MP)(参见Arion D，Kaushik N，McCormick S，Borkow G，Parniak MA.Phenotypic mechanism of HIV-1 resistance to3′-azido-3′-deoxythymidine(AZT)：increased polymerizationprocessivity and enhanced sensitivity to pyrophosphate of the mutantviral reverse transcriptase.Biochemistry.1998，37，15908-17；MeyerPR，Matsuura SE，Mian AM，So AG，Scott WA.A mechanism of AZTresistance：an increase in nucleotide-dependent primer unblocking bymutant HIV-1 reverse transcriptase.Mol.Cell.1999，4，35-43)。该机制已经命名为切除(或切割)。

所述辨别机制涉及在RT中获得一个或多个耐药性突变，从而提高了该酶在天然dNTP底物与NRTI-TP之间辨别的能力。在这点上，耐药性通常与NRTI-TP掺入的降低的催化效率相关。NRTI-TP(和dNTP)催化效率受两个动力学参数驱动，(i)核苷酸与RT聚合酶活性位点的亲和性(K_d)和(ii)核苷酸掺入的最大速率(kpol)，两个参数均可利用前稳态动力学分析来确定(参见Kati WM，Johnson KA，Jerva LF，Anderson KS.Mechanism and fidelity of HIVreverse transcriptase.J.Biol.Chem.1992，26，：25988-97)。通常，NRTI-TP辨别通过仅影响这些动力学参数之一的耐药性突变而实现，如下文所述。

a)K65R：HIV-1RT中的K65R突变降低了对除AZT之外所有FDA批准的NRTI的易感性(参见Parikh UM，Koontz DL，ChuCK，Schinazi RF，Mellors J W.In vitro activity of structurally diversenucleoside analogs against human immunodeficiency virus type 1withthe K65R mutation in reverse transcriptase.Antimicrob.AgentsChemother.2005，49，1139-44)。该突变还显著降低了对目前正开发的几乎所有NRTI的易感性。残基K65位于HIV-1RT的66kDa亚单位的“手指”亚区的β3-β4环内，并且位于三元HIV-1RT-模板/引物(T/P)-dNTP复合体的晶体结构内，K65的ε氨基与所结合的dNTP底物的γ-磷酸盐/酯相互作用(参见Huang H，Chopra R，Verdine GL，Harrison SC.Structure of a covalently trapped catalyticcomplex of HIV-1reverse transcriptase：implications for drug resistance.Science.1998，282，1669-75)。前稳态动力学分析已经证实K65R在不影响K_d的情况下通过选择性降低kpol而赋予了对ddATP(ddI的活性代谢产物)、3TCTP、卡巴韦-三磷酸(CBVTP，ABC的活性代谢产物)和二磷酸泰诺福韦(泰诺福韦-DP)的耐药性(参见SelmiB，Boretto J，Sarfati SR，Guerreiro C，Canard B.Mechanism-basedsuppression of dideoxynucleotide resistance by K65R humanimmunodeficiency virus reverse transcriptase using analpha-boranophosphate nucleoside analogue.J.Biol.Chem.2001，276，48466-72；Deval J，White KL，Miller MD，Parkin NT，CourcambeckJ，Halfon P，Selmi B，Boretto J，Canard B.Mechanistic basis forreduced viral and enzymatic fitness of HIV-1 reverse transcriptasecontaining both K65R and M184V mutations.J.Biol.Chem.2004，279，509-16)。然而，对于ddCTP和DXGTP(DAPD的活性代谢产物)，耐药机制同时涉及kpol的降低和K_d的增加(参见Selmi B，Boretto J，Sarfati SR，Guerreiro C，Canard B.Mechanism-basedsuppression of dideoxynucleotide resistance by K65R humanimmunodeficiency virus reverse transcriptase using analpha-boranophosphate nucleoside analogue.J.Biol.Chem.2001，276，48466-72；Furman PA，Jeffrey J，Kiefer LL，Feng JY，Anderson KS，Borroto-Esoda K，Hill E，Copeland WC，Chu CK，Sommadossi JP，Liberman I，Schinazi RF，Painter GR.Mechanism of action of1-beta-D-2，6-diaminopurine dioxolane，a prodrug of the humanimmunodeficiency virus type 1 inhibitor 1-beta-D-dioxolane guanosine.Antimicrob.Agents Chemother.2001，45，158-65)。结构研究表明，HIV-1RT中的K65R突变改变了NRTI-TP在活性部位的最佳定位，从而引起掺入的催化效率下降(参见Selmi B，Boretto J，Sarfati SR，Guerreiro C，Canard B.Mechanism-based suppression ofdideoxynucleotide resistance by K65R human immunodeficiency virusreverse transcriptase using an alpha-boranophosphate nucleosideanalogue.J.Biol.Chem.2001，276，48466-72；Sluis-Cremer N，ArionD，Kaushik N，Lim H，Parniak MA.Mutational analysis of Lys65 ofHIV-1 reverse transcriptase.Biochem.J.2000，348，77-82)。

b)K70E：K70E突变最初是在体外用阿德福韦筛选出来的(参见Cherrington JM，Mulato AS，Fuller MD，Chen MS.Novel mutation(K70E)in human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptaseconfers decreased susceptibility to 9-[2-(phosphonomethoxy)ethyl]adenine in vitro.Antimicrob.Agents Chemother.1996，40，2212-6)，但最近还在利用D-d4FC(Reverset)的筛选实验中观察到(参见Hammond JL，Parikh UM，Koontz DL，Schlueter-Wirtz S，Chu CK，Bazmi HZ，Schinazi RF，Mellors JW.In vitro selection andanalysis of human immunodeficiency virus type 1 resistant toderivatives of beta-2′，3′-didehydro-2′，3′-dideoxy-5-fluorocytidine.Antimicrob.Agents Chemother.2005，49，3930-2)。有趣的是，由于引入了替诺福韦，K70E突变在临床样品中变得更加普遍，并且最近在10％的接受替诺福韦、ABC和3TC的三联NRTI组合的天然抗逆转录病毒的受治疗者中报道了该突变(参见Ross L，GerondelisP，Liao Q，Wine B，Lim M，Shaefer M，Rodriguez A，Limoli K，Huang W，Parkin NT，Gallant J，Lanier R.Selection of the HIV-1reverse transcriptase mutation K70E in antiretroviral-

subjectstreated with tenofovir/abacavir/lamivudine therapy.Antiviral Ther.2005；10，S102)。我们已证实K70E通过辨别机制而赋予对替诺福韦-DP、CBVTP和3TCTP的耐药性，其中涉及kpol的降低且对K_d的影响极小(参见Sluis-Cremer N，Argoti Tores P，Grzybowski J，Parikh U，Mellors，JW.Molecular Mechanism of Tenofovir，Abacavirand Lamivudine Resistance by the K70E Mutation in HIV-1 ReverseTranscriptase，13th Conference on Retroviruses and OpportunisticInfections，February 5-9 2006，Denver，CO，Abstract 152)。

c)L74V：L74V突变最初鉴定为能引起ddI耐药性(参见Winters MA，Shafer RW，Jellinger RA，Mamtora G，Gingeras T，Merigan TC.Human immunodeficiency virus type 1 reversetranscriptase genotype and drug susceptibility changes in infectedindividuals receiving dideoxyinosine monotherapy for 1 to 2 years.Antimicrob.Agents Chemother.1997，41，757-62)，但还与ABC、ddC和DXG/DAPD(Amdoxovir)耐药性相关(参见Hammond JL，Parikh UM，Koontz DL，Schlueter-Wirtz S，Chu CK，Bazmi HZ，Schinazi RF，Mellors JW.In vitro selection and analysis of humanimmunodeficiency virus type 1 resistant to derivatives ofbeta-2′，3′-didehydro-2′，3′-dideoxy-5-fluorocytidine.Antimicrob.AgentsChemother.2005，49，3930-2；Winters MA，Shafer RW，Jellinger RA，Mamtora G，Gingeras T，Merigan TC.Human immunodeficiency virustype 1 reverse transcriptase genotype and drug susceptibility changes ininfected individuals receiving dideoxyinosine monotherapy for 1 to 2years.Antimicrob.Agents Chemother.1997，41，757-62；Miller V，Ait-Khaled M，Stone C，Griffin P，Mesogiti D，Cutrell A，HarriganR，Staszewski S，Katlama C，Pearce G，Tisdale M.HIV-1 reversetranscriptase(RT)genotype and susceptibility to RT inhibitors duringabacavir monotherapy and combination therapy.AIDS.2000，14，163-71；Bazmi HZ，Hammond JL，Cavalcanti SC，Chu CK，SchinaziRF，Mellors JW.In vitro selection of mutations in the humanimmunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase that decreasesusceptibility to (-)-beta-D-dioxolane-guanosine and suppressresistance to 3′-azido-3′-deoxythymidine.Antimicrob.AgentsChemother.2000，44，1783-8)。前稳态动力学实验已证实L74V突变通过降低kpol而不影响K_d来赋予对ddATP的耐药性。分子模型表明该L74V突变导致所引入核苷酸(incoming nucleotide)的核苷酸碱基与Leu-74的侧链之间稳定性相互作用的丧失。这可引起碱基的转动(与dATP相比，ddATP转动7°)，从而间接影响磷酸盐(或酯)的定位(参见DevalJ，Navarro JM，Selmi B，Courcambeck J，Boretto J，Halfon P，Garrido-Urbani S，Sire J，Canard B.A loss of viralreplicative capacity correlates with altered DNA polymerizationkinetics by the human immunodeficiency virus reverse transcriptasebearing the K65R and L74V dideoxynucleoside resistance substitutions.J.Biol.Chem.2004，279，25489-96)。

d)Q151M复合物：Q151M复合物由HIV-1RT中的一组(一串)突变组成，该一组突变包括Q151M突变加上四种另外的突变：A62V、V75I、F77L和F116Y。所述Q151M突变通常在获得其他突变之前发生(参见Ueno T，Shirasaka T，Mitsuya H.Enzymaticcharacterization of human immunodeficiency virus type 1 reversetranscriptase resistant to multiple 2′，3′-dideoxynucleoside5′-triphosphates.J.Biol.Chem.1995，270，23605-11；Matsumi S，Kosalaraksa P，Tsang H，Kavlick MF，Harada S，Mitsuya H.Pathwaysfor the emergence of multi-dideoxynucleoside-resistant HIV-1 variants.AIDS.2003，17，1127-37)。尽管罕见(占耐药性数据库的～1％)，但该Q151M复合物最经常被包含d4T和ddI的方案选择(参见Balotta C，Violin M，Monno L，Bagnarelli P，Riva C，Facchi G，Berlusconi A，Lippi M，Rusconi S，Clementi M，Galli M，AngaranoG，Moroni M.Prevalence of multiple dideoxynucleoside analogueresistance(MddNR)in a multicenter cohort of HIV-1-infected Italianpatients with virologic failure.J.Acquir.Immune Defic.Syndr.2000，24，232-40)。由Q151M和该Q151M复合物介导的耐药性机制涉及用于NRTI-TP掺入的催化速率常数(kpol)的选择性降低(参见Deval J，Selmi B，Boretto J，Egloff MP，Guerreiro C，Sarfati S，Canard B.The molecular mechanism of multidrug resistance by theQ151M human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptaseand its suppression using alpha-boranophosphate nucleotide analogues.J.Biol.Chem.2002，277，42097-104)。

e)M184I/V：HIV-1RT中的M184I/V突变引起高水平(＞100倍)的对3TC的耐药性以及FTC耐药性(参见Schinazi RF，LloydRM Jr，Nguyen MH，Cannon DL，McMillan A，Ilksoy N，Chu CK，Liotta DC，Bazmi HZ，Mellors JW.Characterization of humanimmunodeficiency viruses resistant to oxathiolane-cytosine nucleosides.Antimicrob.Agents Chemother.1993，37，875-81；Faraj A，AgrofoglioLA，Wakefield JK，McPherson S，Morrow CD，Gosselin G，MatheC，Imbach JL，Schinazi RF，Sommadossi JP.Inhibition of humanimmunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase by the5′-triphosphate beta enantiomers of cytidine analogs.Antimicrob.Agents Chemother.1994，38，2300-5)。然而，该突变还赋予了对ABC、ddC、ddI、(-)dOTC和L-d4FC的耐药性(参见Hammond JL，Parikh UM，Koontz DL，Schlueter-Wirtz S，Chu CK，Bazmi HZ，Schinazi RF，Mellors JW.In vitro selection and analysis of humanimmunodeficiency virus type 1 resistant to derivatives of beta-2′，3′-didehydro-2′，3′-dideoxy-5-fluorocytidine.Antimicrob.AgentsChemother.2005，49，3930-2；Winters MA，Shafer RW，Jellinger RA，Mamtora G，Gingeras T，Merigan TC.Human immunodeficiency virustype 1 reverse transcriptase genotype and drug susceptibility changes ininfected individuals receiving dideoxyinosine monotherapy for 1 to 2years.Antimicrob.Agents Chemother.1997，41，757-62；Miller V，Ait-Khaled M，Stone C，Griffin P，Mesogiti D，Cutrell A，HarriganR，Staszewski S，Katlama C，Pearce G，Tisdale M.HIV-1 reversetranscriptase(RT)genotype and susceptibility to RT inhibitors duringabacavir monotherapy and combination therapy.AIDS.2000，14，163-71)。前稳态动力学分析已经证实M184V对3TCTP的K_d发挥深远作用，而不影响kpol(参见Deval J，White KL，Miller MD，Parkin NT，Courcambeck J，Halfon P，Selmi B，Boretto J，Canard B.Mechanistic basis for reduced viral and enzymatic fitness of HIV-1reverse transcriptase containing both K65R and M184V mutations.J.Biol.Chem.2004，279，509-16；Feng JY，Anderson KS.Mechanisticstudies examining the efficiency and fidelity of DNA synthesis by the3TC-resistant mutant(184V)of HIV-1 reverse transcriptase.Biochemistry.1999，38，9440-8)。M184构成了高度保守的YMDD基序的一部分，并且在存在或者不存在核酸底物的情况下获得的3TC耐药性M184I RT的晶体结构均表明，3TCTP的草酰硫酸环(草酰硫代坊环，oxathiolane ring)与β分支氨基酸(Val或Ile)的侧链(在第184位)之间的空间位阻减少了抑制剂结合，从而增加了K_d(参见Gao HQ，Boyer PL，Sarafianos SG，Arnold E，Hughes SH.The role of steric hindrance in 3TC resistance of humanimmunodeficiency virus type-1 reverse transcriptase.J.Mol.Biol.2000，300，403-18)。

对于NRTI耐药性的切除机制，该突变HIV-1RT不能在核苷酸掺入步骤辨别天然dNTP底物与NRTI-TP(参见Kerr SG，AndersonKS.Pre-steady-state kinetic characterization of wild type and3′-azido-3′-deoxythymidine(AZT)resistant human immunodeficiencyvirus type 1 reverse transcriptase：implication of RNA directed DNApolymerization in the mechanism of AZT resistance.Biochemistry.1997，36，14064-70)。相反，包含“切除”突变的RT在存在生理浓度的ATP(通常在0.8-4mM的范围内)或焦磷酸盐(或酯)(PPi)的情况下，表现出增强的开启NRTI-MP终止的引物的能力(参见Arion D，Kaushik N，McCormick S，Borkow G，Parniak MA.Phenotypic mechanism of HIV-1 resistance to3′-azido-3′-deoxythymidine(AZT)：increased polymerizationprocessivity and enhanced sensitivity to pyrophosphate of the mutantviral reverse transcriptase.Biochemistry.1998，37，15908-17；MeyerPR，Matsuura SE，Mian AM，So AG，Scott WA.A mechanism of AZTresistance：an increase in nucleotide-dependent primer unblocking bymutant HIV-1 reverse transcriptase.Mol.Cell.1999，4，35-43)。与切除机制相关的NRTI耐药性突变包括胸苷类似物突变(TAMS)和T69S插入性突变，这些中的每一种均在下文中描述。

a)TAMS：AZT耐药性与RT中的多种突变相关，包括M41L、D67N、K70R、L210W、T215F/Y和K219E/Q(Kerr SG，AndersonKS.Pre-steady-state kinetic characterization of wild type and3′-azido-3′-deoxythymidine(AZT)resistant human immunodeficiencyvirus type 1 reverse transcriptase：implication of RNA directed DNApolymerization in the mechanism of AZT resistance.Biochemistry.1997，36，14064-70；Larder BA，Kemp SD.Multiple mutations inHIV-1 reverse transcriptase confer high-level resistance to zidovudine(AZT).Science.1989，246，1155-8；Kellam P，Boucher CA，LarderBA.Fifth mutation in human immunodeficiency virus type 1 reversetranscriptase contributes to the development of high-level resistance tozidovudine.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1992，89，1934-8；HarriganPR，Kinghorn I，Bloor S，Kemp SD，Najera I，Kohli A，Larder BA.Significance of amino acid variation at human immunodeficiency virustype 1 reverse transcriptase residue 210 for zidovudine susceptibility.J.Virol.1996，70，5930-4)。因为这些突变中的每一种也已经由D4T治疗失败而被筛选出(参见Hooker DJ，Tachedjian G，Solomon AE，Gurusinghe AD，Land S，Birch C，Anderson JL，Roy BM，Arnold E，Deacon NJ An in vivo mutation from leucine to tryptophan at position210 in human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptasecontributes to high-level resistance to 3′-azido-3′-deoxythymidine.J.Virol.1996，70，8010-8)，它们已经被命名为胸苷类似物突变或TAMS。通常，需要3种或更多种TAMS，以表现出对AZT的高水平耐药性以及对其他NRTI的交叉耐药性。可获得的生物化学数据表明AZTMP和d4TMP是通过包含TAMS的HIV-1RT所执行的切割反应的最好底物(参见Meyer PR，Matsuura SE，Schinazi RF，So AG，Scott WA.Differential removal of thymidine nucleotideanalogues from blocked DNA chains by human immunodeficiencyvirus reverse transcriptase in the presence of physiologicalconcentrations of 2′-deoxynucleoside triphosphates.Antimicrob.AgentsChemother.2000，44，3465-72；Naeger LK，Margot NA，Miller MD.ATP-dependent removal of nucleoside reverse transcriptase inhibitorsby human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase.Antimicrob.Agents Chemother.2002，46，2179-84)。然而，ddAMP也可被切割，尽管效率比AZTMP低。相反，报道了胞苷类似物和CBVTP是切割反应的较差底物(参见Naeger LK，Margot NA，MillerMD.ATP-dependent removal of nucleoside reverse transcriptaseinhibitors by human immunodeficiency virus type 1 reversetranscriptase.Antimicrob.Agents Chemother.2002；46，2179-84)。为了使HIV-1RT能够从引物的3’末端有效切割AZT，链终止AZT-MP必须定位于RT活性位置的核苷酸结合位点(N-位点)(Naeger LK，Margot NA，Miller MD.ATP-dependent removal of nucleoside reversetranscriptase inhibitors by human immunodeficiency virus type 1reverse transcriptase.Antimicrob.Agents Chemother.2002，46，2179-84)。在生理条件下，随后校正的dNTP(the hext-correct dNTP)的结合可驱动终止核苷酸进入引物结合位点(P-位点)，从而形成死端式(dead-end)复合物。该复合物的形成能防止切割反应的发生。许多研究已表明，通过包含TAMS的HIV-1RT切割AZT-MP对随后校正的dNTP抑制的敏感性比其他缺乏3’-叠氮基的NRTI类似物低得多(＞50倍)(参见Meyer PR，Matsuura SE，Schinazi RF，So AG，Scott WA.Differential removal of thymidine nucleotide analogues fromblocked DNA chains by human immunodeficiency virus reversetranscriptase in the presence of physiological concentrations of2′-deoxynucleoside triphosphates.Antimicrob.Agents Chemother.2000，44，3465-72；Boyer PL，Sarafianos SG，Arnold E，Hughes SH.Selective excision of AZTMP by drug-resistant humanimmunodeficiency virus reverse transcriptase.J.Virol.2001，75，4832-42)。这些数据有助于解释为什么TAMS可赋予对AZT的耐药性比对d4T高。尽管已经表明AZT-MP-终止的引物的3’叠氮基是该切割表型的主要结构决定簇(或决定子)(参见Boyer PL，Sarafianos SG，Arnold E，Hughes SH.Selective excision of AZTMP bydrug-resistant human immunodeficiency virus reverse transcriptase.J.Virol.2001，75，4832-42；Sarafianos SG，Clark AD Jr，Das K，TuskeS，Birktoft JJ，Ilankumaran P，Ramesha AR，Sayer JM，Jerina DM，Boyer PL，Hughes SH，Arnold E.Structures of HIV-1 reversetranscriptase with pre-and post-translocation AZTMP-terminated DNA.EMBO J.2002，21，6614-24)，但我们证实了3’-叠氮基-2’，3’-ddA和3’-叠氮基-2’，3’-ddG保留了它们的抗AZT耐药性病毒的效力(参见Sluis-Cremer N，Arion D，Parikh U，Koontz D，Schinazi RF，Mellors JW，Parniak MA.The 3′-azido group is not the primarydeterminant of 3′-azido-3′-deoxythymidine(AZT)responsible for theexcision phenotype of AZT-resistant HIV-1.J.Biol.Chem.2005，280，29047-52)。这表明该核苷碱基对TAMS引起的切割效率具有重要的影响。

b)T69S插入：密码子69与70之间包含二肽插入(通常为Ser-Ser、Ser-Gly或Ser-Ala)以及氨基酸取代T69S、T215Y和其他TAMS的HIV-1RT已在经历严重NRTI的患者中得到鉴定，虽然比率较低(0.5-2.7％)(参见Winters MA，Merigan TC.Insertions in thehuman immunodeficiency virus type 1 protease and reversetranscriptase genes：clinical impact and molecular mechanisms.Antimicrob.Agents Chemother.2005，49，2575-82)。在表型分析中，包含RT中的插入突变的病毒分离物证实对AZT的高水平耐药性以及对其他NRTI如d4T、ddC、ddI、ABC和替诺福韦的中等水平耐药性。在与TAMS(特别是T215Y)结合方面，HIV-1RT中的二肽插入赋予了增强的ATP依赖性磷酸解活性，其有利于去除终止性AZTMP、d4TMP、ddAMP或替诺福韦，甚至当在反应中存在相对高水平的dNTP时(参见Meyer PR，Lennerstrand J，Matsuura SE，Larder BA，Scott WA.Effects of dipeptide insertions between codons69 and 70 of human immunodeficiency virus type 1 reversetranscriptase on primer unblocking，deoxynucleoside triphosphateinhibition，and DNA chain elongation.J.Virol.2003，77，3871-7；Boyer PL，Sarafianos SG，Arnold E，Hughes SH.Nucleoside analogresistance caused by insertions in the fingers of humanimmunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase involvesATP-mediated excision.J.Virol.2002，76，9143-51；Mas A，Parera M，Briones C，Soriano V，Martinez MA，Domingo E，Menendez-Arias L.Role of a dipeptide insertion between codons 69 and 70 of HIV-1reverse transcriptase in the mechanism of AZT resistance.EMBO J.2000，19，5752-61)。

基于上面描述的结构-活性结果，某些3’-叠氮基嘌呤核苷(APN)成为一类主要的核苷类似物，其表现出良好的抗HIV-1_AZT2和HIV-1_K65R活性。为了进一步表征这些核苷的活性，针对一组突变病毒评价了3’-叠氮基-ddA和3’-叠氮基-2’，3’-ddG。该组突变病毒包括含有K65R(HIV-1_K65R)、L74V(HIV-1_L74V)、M184V(HIV-1_M184V)、TAMS的不同组合(例如，M41L/L210W/T215Y(HIV-1_AZT3)，M41L/D67N/K70R/T215F/K219Q(HIV-1_AZT7)，或M41L/D67N/K70R/L210W/T215Y/K219Q(HIV-1_AZT9)，以及多NRTI耐药复合物(例如，A62V/V75I/F77L/F116Y/Q151M(HIV-1_Q151M)或M41L/69SS/L210W/T215Y(HIV-1_69插入))的重组病毒。结果表明，3’-叠氮基-ddA和3’-叠氮基-ddG对含有K65R、L74V或M184V突变的病毒均有活性。与AZT相比，这两种化合物也均对所有含TAM的病毒有显著活性。例如，HIV-1AZT7对AZT的耐药性大于500倍，然而可注意到对于该病毒对3’-叠氮基-ddA和3’-叠氮基-ddG的耐药性低于3.5倍。然而，3’-叠氮基-ddA和3’-叠氮基-ddG对HIV-1_Q151M的活性均较低，并且3’-叠氮基-ddG还丧失了抗HIV-1_{69 插入}的活性。

另一种引起严重人类健康问题的病毒是乙型肝炎病毒(HBV)。HBV是仅次于烟草的人类癌症起因。HBV诱发癌症的机制尚不清楚。推测其可能直接触发肿瘤形成或者通过慢性炎症、肝硬化以及与感染相关的细胞再生而间接触发肿瘤。

在2-6个月潜伏期(其间宿主通常未意识到感染)后，HBV感染可导致急性肝炎和肝损伤，引起腹痛、黄疸以及某些酶的血液水平升高。HBV可引起暴发性肝炎，一种进展迅速、经常致死的疾病形式，其中大部分肝受损。

患者通常可从HBV感染的急性期恢复。然而，在某些患者中，病毒持续复制延长的期间或无限期，引起慢性感染。慢性感染可导致慢性迁延性肝炎。感染了慢性迁延性HBV的患者在发展中国家最普遍。截至1991年中期，仅亚洲已有约2.25亿名慢性HBV携带者，并且世界范围有几乎3亿名携带者。慢性迁延性肝炎可引起疲劳、肝硬化以及肝细胞癌(一种原发性肝癌)。

在工业化国家，HBV感染的高危人群包括那些接触HBV携带者或它们的血液样品的人。HBV的流行病学与HIV/AIDS非常类似，这就是HBV感染在感染HIV或患有AIDS的患者中非常普遍的原因。然而，HBV比HIV是更有传染性的。

3TC(拉米夫定)、干扰素α-2b、聚乙二醇化干扰素(peginterferon)α-2a、贺维力(hepsera)(阿德福韦二匹伏酯(adefovirdipivoxil))、博路定(baraclude)(恩替卡韦(entecavir))和Tyzeka(替比夫定(Telbivudine))是目前FDA批准的用于治疗HBV感染的药物。然而，这些药物中的一些具有严重的副作用，并且用这些药物治疗的患者迅速形成病毒耐药性。

HIV和HBV治疗的一个主要问题是耐药性的选择。短期服用抗病毒药物后，病毒突变被筛选，这使得该药物成为效力低很多的病毒生成抑制剂。即使目前的联合治疗也不能避免耐药性。

鉴于获得性免疫缺陷综合症、AIDS相关综合症状以及乙型肝炎病毒均已达到世界流行水平，并且对已感染的患者具有严重影响，因此，仍然急需提供新型有效的药物试剂(pharmaceuticalagents)来治疗这些疾病，其中该试剂对宿主具有较低的毒性。

提供新型的抗病毒剂、包含这些试剂的组合物以及利用这些试剂的治疗方法，特别是治疗耐药性突变病毒将是有利的。本发明提供了这样的试剂、组合物和方法。

发明内容

本发明提供了用于治疗或预防宿主体内的HIV-1、HIV-2、HBV或黄病毒科感染(flaviviridae infection)如HCV感染的化合物、方法和组合物。该方法涉及给予如本文所述的治疗或预防有效量的至少一种化合物以治疗或预防HIV-1、HIV-2、HBV或HCV感染或者给予足以降低HIV-1、HIV-2、HBV或HCV生物学活性的量。本文中还公开了药物组合物，该药物组合物包括一种或多种本文描述的化合物以及药用载体或赋形剂，用于治疗感染HIV-1、HIV-2、HBV或HCV的宿主。该制剂可以进一步包括至少一种另外的治疗剂(治疗试剂)。此外，本发明包括用于制备这样的化合物的方法。

本文描述的化合物包括β-D和β-L-3’-叠氮基-2’，3’-二脱氧嘌呤核苷和其膦酸(衍生物)。在一个实施方式中，该活性化合物具有化学式(I)-(IV)：

或者其药用盐或药物前体，其中

i)X是O、CH₂、S、SO₂、NH、P＝O(OH)、C＝CH₂、C＝CHF或C＝CF₂；

ii)Y是O或S；

iii)Z是-CH₂、-CH₂CH₂、-CH₂O、-CH₂S或CH₂NH(均为碳原子连接至磷原子)；

iv)R¹是氢、烷基、卤代烷基(包括但不限于CH₂F、CF₃)、卤素、叠氮基、氰基、硝基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、链烯基、炔基、卤代链烯基(包括但不限于Br-乙烯基)、烷氧基、链烯氧基、烷硫基(alkylthio)、酰氧基、烷氧酰基(烷氧基酰基，alkyloxyacyl)、烷基羰基、酰基硫基(acylthio)或酰氨基；

v)R²是H、磷酸酯(phosphate)(包括但不限于单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或稳定化的磷酸酯药物前体)、磷硫酰(phosphothioate，硫代磷酸酯)、用烷基(包括但不限于C₁-C₆)、链烯基(包括但不限于C₂-C₆)、炔基(包括但不限于C₂-C₆)、芳基(包括但不限于C₆-C₁₀)或其他药用离去基团取代的羰基，当体内给予时其能够提供一种这样的化合物，其中R²是H或磷酸酯、磺酸酯(包括但不限于烷基或芳基烷基磺酰基，例如甲基磺酰基)、苄基(其中苯基基团可选地被如在上文给出的芳基定义中描述的一种或多种取代基所取代)、脂质(包括但不限于磷脂)、氨基酸、肽或胆固醇；

vi)R³和R⁴独立地是氢、磷酸酯、二磷酸酯或一种在肝细胞中优先去除以生成相应的H基团的基团，如本文中使用的术语“在肝细胞中优先去除”是指该基团的至少部分在肝细胞中以高于同一基团在非肝细胞(例如，成纤维细胞或淋巴细胞)中去除的速率的速率被去除。因此，可以设想，该可去除基团(除去基团)包括所有可通过还原酶、酯酶、细胞色素P450或任何其他特异性肝酶而被去除的药用基团。可替换地，设想的基团还可包括那些无需在肝细胞中优先被去除但实现至少一些积累和/或特异性递送至肝细胞(例如，含所选氨基酸，包括缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或聚精氨酸或聚天冬氨酸的酯类)的基团；以及

vii)碱基是具有通式(III)-(IV)的嘌呤或修饰的嘌呤：

其中：

W、W¹、W²和W³均独立地为N、CCF₃、CC(O)NH₂、CC(O)NHR’、CC(O)N(R’)₂、CC(O)OH、CC(O)OR’或CR⁵；

W⁴独立地是O、S、NH或NR’；

R⁵和R⁶均独立地选自H、卤素(F、Cl、Br、I)、CN、N₃、NO₂、OH、NH₂、SH、OR’、NHR’、N(R’)₂，SR’、OCOR’、NHCOR’、N(COR’)COR’、SCOR’、OCOOR’、NHCOR’、CH₂OH，CH₂CN、CH₂N₃、COOH、COOR’、CONH₂、CONHR、CON(R’)₂、CH₂COOH、CH₂COOR’、CH₂CONH₂、CH₂CONHR’、CH₂CON(R’)₂、烷基(包括但不限于C₁-C₆)、链烯基(包括但不限于C₂-C₆)和炔基(包括但不限于C₂-C₆)、环烷基((包括但不限于C₃-C₈)、芳基(包括但不限于C₆-C₁₀)、杂芳基(包括但不限于C₆-C₁₀)、酰基(包括但不限于C₂-C₆)、芳烷基和烷芳基；

其中，对于其中碱基是式(III)的式(I)，R⁵不能是Cl、Br、I、C_1-6烷氧基、C_3-6环烷氧基、芳氧基、芳基烷氧基、被一种或两种取代基取代的氨基，所述取代基独立地选自C_1-6烷基和C_3-6环烷基、或含有至少一个氮原子的四至六元杂环，该环通过氮原子键合于嘌呤碱；如果R¹和R²是H，则W是CH，W¹、W²和W³是N，并且R⁶是NH₂或NHR⁷，其中R⁷是酰基；

其中，对于其中碱基是式(III)的式(I)，当R⁵是OH时，R⁶不能是NH₂，并且当R⁵是NH₂时，R⁶不能是H，如果R¹和R²是H，则W是CH，W¹、W²和W³是N；并且

每一个R’均独立地是低级烷基(C₁-C₆烷基)、低级链烯基、低级炔基、低级环烷基(C₃-C₆环烷基)芳基、烷芳基或者芳烷基，其中所述基团可以被如上文所定义的一种或多种取代基取代，例如羟烷基、氨基烷基和烷氧基烷基。

在一个方面，W是CH，而W¹-W³是N。在另一个方面，与W²相邻的R⁵是卤素基团、羟基基团、烷氧基基团或胺基基团，其中所述胺基基团可选地被烷基基团、羟烷基基团、氨基烷基基团、环烷基基团、链烯基基团或炔基基团取代。在又一方面，R⁶是H或NH₂。

在另一方面，所述化合物是3’-叠氮基-ddA和/或3’-叠氮基-ddG，与针对TAM突变选择的药物和/或针对M184V突变选择的药物组合。本文描述的化合物可以为分离的β-L-或β-D-构型的形式或者其混合物，包括但不限于外消旋混合物。

此外，本文所描述的化合物是HBV和/或HCV的抑制剂。因此，这些化合物还可用来治疗共同感染HIV-1或HIV-2与HBV和/或HCV的患者。

附图说明

图1是xxLAI病毒的基因型的图示。

图2A-2B是3’-叠氮基-2’，3’-ddA和3’-叠氮基-2’，3’-ddG对一组耐药性HIV-1的抗HIV活性的图示。

图4A-4B是通过腺苷脱氨酶进行的脱氨作用的图示。

图5是示出了一种抗3’-叠氮基-2’，3’-双脱氧鸟苷(3’-叠氮基-ddG，本文中也称为化合物56)的病毒随时间(周)的发展的图表。

图6是用3’-叠氮基-ddG进行处理以及随时间选择的突变的总结。

具体实施方式

本文描述的3’-叠氮基-2’，3’-二脱氧嘌呤核苷表现出改善的对HIV、HBV及黄病毒科病毒(包括那些含有突变的RT酶的病毒)的抑制活性。因此，该化合物可用来治疗或预防宿主体内的病毒感染，或者降低该病毒的生物学活性。宿主可以为哺乳动物，特别是人类，其感染了HIV-1、HIV-2、HBV和/或黄病毒科病毒如HCV。该方法涉及给予有效量的本文描述的一种或多种3’-叠氮基-2’，3’-二脱氧嘌呤核苷。

还披露了一种药物制剂，其包括本文描述的一种或多种化合物以及药用载体或赋形剂。在一个实施方式中，该制剂包括本文描述的至少一种化合物以及至少一种另外的治疗剂。

参照下面的定义将更好的理解本发明：

I.定义

术语“独立地”在本文中用来表示作为独立采用的该变量随应用不同而独立地变化。因此，在化合物如R”XYR”中，其中R”独立地是“碳或氮”，两个R”均可为碳，两个R”均可为氮，或者一个R”为碳而另一个R”为氮。

如本文中使用的，术语“光学异构纯(enantiomerically pure)”是指一种核苷组合物，其至少包括约95％，优选约97％，98％，99％或100％的所述核苷的单一对映体。

如本文中使用的，术语“基本上无”或者“基本上缺乏”是指一种这样的核苷组合物，其至少包括按重量计85-90％，优选按重量计95％-98％，并且甚至更优选按重量计99％-100％的所述核苷的指定对映体。在一个优选的实施方式中，本文所描述的化合物基本上无对映体。

类似地，术语“分离的”是指一种这样的核苷组合物，其至少包括按重量计85-90％，优选按重量计95％-98％，并且甚至更优选按重量计99％-100％的所述核苷，其余部分包含其他化学物质或对映体。

如本文中使用的，除非另有说明，否则术语“烷基”是指饱和的直链、支链或环状的伯、仲或叔烃，包括取代的或未取代的烷基基团。所述烷基基团可以可选地被任何不以其他方式干扰反应或能够在该方法中提供改善的部分(moiety)所取代，该部分包括但不限于卤素、卤代烷基、羟基、羧基、酰基、芳基、酰氧基、氨基、胺基(amido)、羧基衍生物、烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、烷氧基、芳氧基、硝基、氰基、磺酸、硫羟、亚胺、磺酰基、硫烷基(sulfanyl)、亚磺酰基、磺胺基(sulfamonyl)、酯、羧酸、酰胺、膦酰(phosphonyl)、氧膦基、磷酰基、膦、硫酯、硫醚、酸性卤化物、酸酐、肟、肼、氨基甲酸酯、磷酸、磷酸盐(或酯)，未保护或者有必要加以保护的，如本领域的技术人员所已知的，例如，如在Greene、et al.，Protective Groups in Organic Synthesis、John Wileyand Sons、Second Edition、1991中所教导的，结合于本文作为参考。特别包括CF₃和CH₂CF₃。

在上下文中，无论何时使用术语C(烷基范围)，该术语独立地包括该类的每一种成员，如同具体并单独列出的一样。术语“烷基”包括C_1-22烷基部分，并且术语“低级烷基”包括C_1-6烷基部分。本领域的普通技术人员应该理解，相关烷基通过用后缀“-基”代替后缀“-烷”来命名。

术语“链烯基”是指线性或支链的不饱和烃基团，因为其包含一个或多个双键。本文中披露的链烯基可以可选地用任何不会负面影响该反应过程的部分所取代，所述部分包括但不限于针对烷基部分上的取代基所描述的那些取代基。链烯基基团的非限制性实例包括乙烯基、甲基亚乙基(methylethylene)、异亚丙基、1，2-乙烷-二基、1，1-乙烷-二基、1，3-丙烷-二基、1，2-丙烷-二基、1，3-丁烷-二基以及1，4-丁烷-二基。

术语“炔基”是指线性或支链的不饱和无环烃基团，因为其包含一个或多个三键。所述炔基基团可以可选地用任何不会负面影响该反应过程的部分所取代，所述部分包括但不限于上面针对烷基部分描述的那些取代基。合适的炔基基团的非限制性实例包括乙炔基、丙炔基、羟丙炔基、丁炔-1-基、丁炔-2-基、戊炔-1-基、戊炔-2-基、4-甲氧基戊炔-2-基、3-甲基丁炔-1-基、己炔-1-基、己炔-2-基和己炔-3-基、3，3-二甲基丁炔-1-基基团。

术语“烷基氨基”或“芳基氨基”分别指具有一个或两个烷基或芳基取代基的氨基基团。

如本文中使用的，并且除非另有定义，否则术语“受保护的”是指添加了氧、氮或磷原子以防止其进一步反应或用于其他目的的基团。大量氧和氮保护基团对于有机合成领域中的技术人员来说是已知的，并且例如描述在上文的Greene et al.，Protective Groups inOrganic Synthesis中。

术语“芳基”单独或一起表示一种包含一个、两个或三个环的碳环芳香族体系(carbocyclic aromatic system)，其中这样的环可以悬挂方式(pendent manner)连接在一起或者可稠合在一起。芳基的非限制性实例包括苯基、联苯基或萘基或者在从芳环去除一个氢后剩余的其他芳族基团。术语芳基包括取代的或未取代的部分。所述芳基基团可以可选地用任何不会负面影响该过程的部分所取代，所述部分包括但不限于上述针对烷基部分所描述的基团。取代的芳基的非限制性实例包括杂芳基氨基、N-芳基-N-烷基氨基、N-杂芳基氨基-N-烷基氨基、杂芳氧基、芳基氨基、芳烷基氨基、芳硫基、单芳基胺基磺酰基、芳基磺酰胺基、二芳基胺基磺酰基、单芳基氨基磺酰基、芳基亚磺酰基、芳基磺酰基、杂芳硫基、杂芳亚磺酰基、杂芳磺酰基、芳酰基、杂芳酰基、芳烷酰基(aralkanoyl)、杂芳烷酰基(heteroaralkanoyl)、羟基芳烷基、羟基杂芳烷基、、卤代烷氧基烷基、芳基、芳烷基、芳氧基、芳烷氧基、芳氧基烷基、饱和杂环、部分饱和的杂环、杂芳基、杂芳氧基、杂芳氧基烷基、芳烷基、杂芳烷基、芳基链烯基和杂芳基链烯基、碳芳烷氧基(carboaralkoxy)。

术语“烷芳基”是指用含芳基取代基的烷基基团。术语“芳烷基”是指含烷基取代基的芳基基团。

如本文中使用的，术语“卤素”包括氯、溴、碘和氟。

术语“酰基”是指羧酸酯，其中该酯基团的非羰基部分选自直链、支链或环状烷基或低级烷基、烷氧基烷基(包括但不限于甲氧基烷基)、芳烷基(包括但不限于苄基)、芳氧基烷基如苯氧基甲基、芳基(包括但不限于可选地用卤素(F、Cl、Br、I)取代的苯基)、烷基(包括但不限于C₁、C₂、C₃和C₄)或烷氧基(包括但不限于C₁、C₂、C₃和C₄)、磺酸酯如烷基或芳烷基磺酰基(包括但不限于甲基磺酰基)、单、二或三磷酸酯、三苯甲基或单甲氧基三苯甲基、取代的苄基、三烷基甲硅烷基(例如二甲基-叔丁基甲硅烷基)或二苯基甲硅烷基。酯中的芳基基团最优地包括苯基基团。术语“低级酰基”是指其中非羰基部分是低级烷基的酰基基团。

术语“烷氧基”和“烷氧基烷基”包括具有烷基部分的线性或支链的含氧基团，如甲氧基基团。术语“烷氧基烷基”还包括具有一个或多个连接于烷基基团的烷氧基基团的烷基基团，即用于形成单烷氧基烷基和双烷氧基烷基基团。术语“烷氧基”基团可进一步用一个或多个卤素原子如氟、氯或溴取代以提供“卤代烷氧基”基团。这样的基团的实例包括氟代甲氧基、氯代甲氧基、三氟甲氧基、二氟甲氧基、三氟乙氧基、氯代乙氧基、四氟乙氧基、五氟乙氧基和氟代丙氧基。

术语“烷基氨基”表示“单烷基氨基”和“二烷基氨基”，其分别包含一个或两个连接于氨基基团的烷基基团。术语芳基氨基表示“单芳基氨基”和“二芳基氨基”，其分别包含一个或两个连接于氨基基团的芳基基团。术语“芳烷基氨基”包括连接于氨基基团的芳烷基基团。术语芳烷基氨基表示“单芳烷基氨基”和“二芳烷基氨基”，其分别包含一个或两个连接于氨基基团的芳烷基基团。术语芳烷基氨基进一步表示“单芳烷基单烷基氨基”，其包含一个芳烷基基团和一个烷基基团，其连接于氨基基团。

如本文中使用的，术语“杂原子”是指氧、硫、氮和磷。

如本文中使用的，术语“杂芳基”或“芳香杂环”是指在芳环中包括至少一个硫、氧、氮或磷的芳香烃(芳香族化合物)。

术语“杂环”是指非芳香族环状基团，其中在环中存在至少一种杂原子如氧、硫、氮或磷。

杂芳基和杂环基团的非限制性实例包括呋喃基、呋喃(furanyl)、吡啶基、嘧啶基、噻吩基、异噻唑基、咪唑基、四唑基、吡嗪基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、喹啉基、异喹啉基、苯并噻吩基、异苯并呋喃基、吡唑基、吲哚基、异吲哚基、苯并咪唑基、嘌呤基、咔唑基、噁唑基、噻唑基、异噻唑基、1，2，4-噻二唑基、异噁唑基、吡咯基、喹唑啉基、噌嗪、酞嗪基、黄嘌呤基(xanthinyl)、次黄嘌呤基(hypoxanthinyl)、噻吩、呋喃、吡咯、异吡咯、吡唑、咪唑、1，2，3-三唑、1，2，4-三唑、噁唑、异噁唑、噻唑、异噻唑、嘧啶或哒嗪、和喋啶基、氮丙啶、噻唑、异噻唑、1，2，3-噁二唑、噻嗪、吡啶、吡嗪、哌嗪、吡咯烷、oxaziranes、吩嗪、吩噻嗪、吗啉基、吡唑基、哒嗪基、吡嗪基、喹喔啉基、黄嘌呤基(xanthinyl)、次黄嘌呤基(hypoxanthinyl)、喋啶基、5-氮杂胞苷基、5-氮杂尿苷基、三唑吡啶基、咪唑吡啶基、吡咯并嘧啶基、吡唑并嘧啶基、腺嘌呤、N⁶-烷基嘌呤、N⁶-苄基嘌呤、N⁶-卤代嘌呤、N⁶-乙烯基嘌呤、N⁶-乙炔基嘌呤、N⁶-酰基嘌呤、N⁶-羟烷基嘌呤、N⁶-硫烷基嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、6-氮杂嘧啶、2-巯基嘧啶、尿嘧啶、N⁵-烷基嘧啶、N⁵-苄基嘧啶、N⁵-卤代嘧啶、N⁵-乙烯基嘧啶、N⁵-乙炔基嘧啶、N⁵-酰基嘧啶、N⁵-羟烷基嘌呤和N⁶-硫烷基嘌呤以及异噁唑基。所述杂芳基基团可以可选地用如上面针对芳基描述的基团取代。杂环或杂芳基基团可以可选地用一种或多种选自卤素、卤代烷基、烷基、烷氧基、羟基、羧基衍生物、胺基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基的取代基取代。如果需要，芳香杂环(heteroaromatic)可部分或全部氢化。作为一个非限制性实例，代替吡啶，可以使用二氢吡啶。如有必要或需要，可对杂环或杂芳基基团上的官能性氧或氮基加以保护。合适的保护基团对于本领域的技术人员来说是已知的，并且包括三甲基甲硅烷基、二甲基己基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、和叔丁基二苯基甲硅烷基、三苯甲基或取代的三苯甲基、烷基基团、酰基基团如乙酰基和丙酰基，甲基磺酰基和对甲苯基磺酰基。所述杂环或芳香杂环基团可以用任何不会负面影响反应的基团所取代，包括但不限于上述那些针对芳基描述的基团。

如本文中使用的，术语“宿主”是指其中病毒可以复制的单细胞或多细胞生物，包括但不限于细胞系和动物，以及优选地，人类。可替换地，宿主可以携带该病毒基因组的一部分，其复制或功能可被本发明的化合物改变。术语宿主具体是指受感染的细胞、转染有全部或部分该病毒基因组的细胞以及动物，特别是灵长类(包括但不限于黑猩猩)和人类。在本发明的大多数动物应用中，宿主是人类患者。然而，在某些适应症中，很明显兽医应用是本发明预期的(例如用于治疗黑猩猩)。

术语“药用盐或药物前体”在整个说明书中均用来描述核苷化合物的任何药用形式(例如酯、磷酸酯、酯或相关基团的盐)，一旦给予患者，将提供该核苷化合物。药用盐包括那些来自药用无机或有机碱和酸的盐类。合适的盐类包括那些来自碱金属如钾和钠、碱土金属如钙和镁以及制药领域中熟知的多种其他酸的盐。药用药物前体是指一种这样的化合物，其在宿主体内代谢如水解或氧化以形成本发明的化合物。药物前体的典型实例包括在活性化合物的官能部分上具有生物学不稳定的保护基团的化合物。药物前体包括可以被氧化、还原、胺化、脱氨、羟基化、脱羟、水解、脱水、烷基化、去烷基化、酰化、去酰化、磷酸化、去磷酸化以生成活性化合物的化合物。本发明的化合物的药物前体形式可具有抗病毒活性，可被代谢以形成表现出这样的活性的化合物或者既具有抗病毒活性又可被代谢形成表现出这样的活性的化合物。

药物前体还包括所披露的核苷的氨基酸的酯类(参见，例如欧洲专利说明书第99493号，其正文结合于此作为参考，其描述了阿昔洛韦(acyclovir)的氨基酸酯类，特别是甘氨酸和丙氨酸酯，与阿昔洛韦本身相比，其表现出改善的水溶性；以及美国专利第4,957,924号(Beauchamp)，其披露了阿昔洛韦的缬氨酸酯，其特征在于α碳原子相邻的侧链分支，与丙氨酸和甘氨酸酯相比，其在口服后表现出改善的生物利用度。)。美国专利第4,957,924号(Beauchamp)中披露了一种用于制备这样的氨基酸酯的方法，该专利正文结合于此作为参考。作为使用缬氨酸本身的替代品，可以使用氨基酸的功能等价物(例如，酸性卤化物如酸性氯化物或酸酐)。在这样的情况下，为了避免不期望的副反应，使用氨基保护的衍生物可能是有利的。

II.活性化合物

在本发明的一个实施方式中，该活性化合物具有化学式(I)-(IV)

或者其药用盐或药物前体，其中

i)X是O、CH₂、S、SO₂、NH、P＝O(OH)、C＝CH₂、C＝CHF或C＝CF₂；

ii)Y是O或S；

iii)Z是-CH₂、-CH₂CH₂、-CH₂O、-CH₂S或CH₂NH(均为碳原子连接至磷原子)；

iv)R¹是氢、烷基、卤代烷基(包括但不限于CH₂F和CF₃)、卤素、叠氮基、氰基、硝基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、链烯基、炔基、卤代链烯基(包括但不限于Br-乙烯基)、烷氧基、链烯氧基、烷硫基(alkylthio)、酰氧基、烷氧基酰基(烷氧酰基，alkyloxyacyl)、烷基羰基、酰基硫基(acylthio)或酰氨基；

v)R²是H、磷酸酯(phosphate)(包括但不限于单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或稳定化的磷酸酯药物前体)、磷硫酰(phosphothioate)、用烷基(包括但不限于C₁-C₆)、链烯基(包括但不限于C₂-C₆)、炔基(包括但不限于C₂-C₆)、芳基(包括但不限于C₆-C₁₀)或其他药用离去基团取代的羰基，当体内给予时其能够提供一种这样的化合物，其中R²是H或磷酸酯、磺酸酯(包括但不限于烷基或芳烷基磺酰基，例如甲基磺酰基(methanesulfonyl))、苄基(其中苯基基团可选地被如在上文给出的芳基定义中描述的一种或多种取代基所取代)、脂质(包括但不限于磷脂)、氨基酸、肽或胆固醇；

vi)R³和R⁴独立地是氢、磷酸酯、二磷酸酯或一种在肝细胞中优先去除以生成相应的H基团的基团，如本文中使用的术语“在肝细胞中优先去除”是指该基团的至少部分在肝细胞中以高于同一基团在非肝细胞(例如，成纤维细胞或淋巴细胞)中去除的速率的速率被去除。因此，可以设想，该可去除基团(除去基团)包括所有药用基团，其可通过还原酶、酯酶、细胞色素P450或任何其他特异性肝酶而被去除。可替换地，设想的基团还可包括那些无需在肝细胞中优先被去除但实现至少一些积累和/或特异性递送至肝细胞(例如，含所选氨基酸，包括缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或聚精氨酸或聚天冬氨酸的酯类)的基团；以及

vii)碱基是具有通式(III)-(IV)的嘌呤或修饰的嘌呤：

其中：

W、W¹、W²和W³均独立地为N、CCF₃、CC(O)NH₂、CC(O)NHR’、CC(O)N(R’)₂、CC(O)OH、CC(O)OR’或CR⁵；

W⁴独立地是O、S、NH或NR’；

R⁵和R⁶均独立地选自H、卤素(F、Cl、Br、I)、CN、N₃、NO₂、OH、NH₂、SH、OR’、NHR’、N(R’)₂，SR’、OCOR’、NHCOR’、N(COR’)COR’、SCOR’、OCOOR’、NHCOR’、CH₂OH，CH₂CN、CH₂N₃、COOH、COOR’、CONH₂、CONHR、CON(R’)₂、CH₂COOH、CH₂COOR’、CH₂CONH₂、CH₂CONHR’、CH₂CON(R’)₂、烷基(包括但不限于C₁-C₆)、链烯基(包括但不限于C₂-C₆)和炔基(包括但不限于C₂-C₆)、环烷基((包括但不限于C₃-C₈)、芳基(包括但不限于C₆-C₁₀)、杂芳基(包括但不限于C₆-C₁₀)、酰基(包括但不限于C₂-C₆)、芳烷基和烷芳基；

其中，对于其中碱基是化学式(III)的化学式(I)，R⁵不能是Cl、Br、I、C_1-6烷氧基、C_3-6环烷氧基、芳氧基、芳基烷氧基、被一种或两种取代基取代的氨基，所述取代基独立地选自C_1-6烷基和C_3-6环烷基、或含有至少一个氮原子的四至六元杂环，该环通过氮原子键合于嘌呤碱；如果R¹和R²是H，则W是CH，W¹、W²和W³是N，并且R⁶是NH₂或NHR⁷，其中R⁷是酰基；

其中，对于其中碱基是化学式(III)的化学式(I)，当R⁵是OH时，R⁶不能是NH₂，并且当R⁵是NH₂时，R⁶不能是H，如果R¹和R²是H，则W是CH，W¹、W²和W³是N；并且

每一个R’均独立地是低级烷基(C₁-C₆烷基)、低级链烯基、低级炔基、低级环烷基(C₃-C₆环烷基)芳基、烷芳基或者芳烷基，其中所述基团可以被如上文所定义的一种或多种取代基取代，例如羟烷基、氨基烷基和烷氧基烷基。

在一个方面，W是CH，而W¹-W³是N。在另一个方面，与W²相邻的R⁵是卤素基团、羟基基团、烷氧基基团或胺基基团，其中所述胺基基团可选地被烷基基团、羟烷基基团、氨基烷基基团、环烷基基团、链烯基基团或炔基基团取代。在又一方面，R⁶是H或NH₂。

在另一个实施方式中，所述化合物是3’-叠氮基-ddA或3’-叠氮基-ddG，单独或一起，每一种或两种均与一种或多种针对TAM突变和/或M184V突变选择的抗病毒化合物联用。

本文描述的化合物可以为β-L-或β-D构型的形式或者其混合物，包括但不限于外消旋混合物。

III.立体异构现象和多态性

本文描述的化合物可以具有不对称中心，并且作为外消旋化合物、外消旋混合物、单个非对映体或对映体存在，其中所有的异构体形式均包括在本发明中。本发明的具有手性中心的化合物可以以旋光和外消旋形式存在和分离。某些化合物可表现出多态性。本发明涵盖本发明的化合物的外消旋、旋光、多态或立体异构形式或其混合物，其均具有本文描述的有用特性。所述旋光形式可通过例如重结晶技术进行的该消旋形式的拆分、通过从旋光原料合成、通过手性合成或通过利用手性静止状态进行层析分离或通过酶性拆分来制备。

所述化合物的旋光形式可利用本领域已知的任何方法来制备，包括但不限于通过例如重结晶技术进行外消旋形式的拆分、通过从旋光原料合成、通过手性合成或通过利用手性静止状态进行层析分离。

获得旋光材料的方法的实例至少包括如下方法。

i)结晶(晶体)的物理分离：借助该技术，可手工分离单个对映体的肉眼结晶。如果存在独立对映体的结晶，即该材料聚集且肉眼可区别该结晶，则可以使用该技术。

ii)同时结晶作用：借助该技术，单个对映体从外消旋化合物的溶液中独立结晶，可能只要后者(外消旋化合物)在固态是聚集物。

iii)酶法拆分：借助该技术，可根据对映体的不同反应速率用酶将消旋体部分或完全分离。

iv)酶促不对称合成：一种合成技术，借此该合成的至少一个步骤利用酶促反应来获得期望的对映体的对映纯化或富集合成的前体。

v)化学不对称合成：一种合成技术，借此期望的对映体在可使产物中产生不对称性(即手性)的条件下由手性前体合成，其可利用手性催化剂或手性助剂而实现；

vi)非对映体分离：借助该技术，外消旋化合物与对映体纯试剂(手性助剂)反应，该试剂将单个对映体转变为非对映体。然后借助于其目前更加明显的结构差异通过层析或结晶来分离所得的非对映体，随后去除手性助剂，从而得到期望的对映体；

vii)一级和二级不对称性转化：借助该技术，来自外消旋化合物平衡体系的非对映体产生了该非对映体从期望的对映体溶解的优势或者该非对映体从期望的对映体的优先结晶干扰了平衡，使得最终理论上所有物质均从期望的对映体转化为结晶非对映体。随后期望的对映体从非对映体中释放；

viii)动力学拆分：该技术是指借助于在动力学条件下，对映体与手性非消旋试剂或催化剂的不同的反应速率来实现外消旋化合物的部分或全部拆分(或者进一步拆分已部分拆分的化合物)。

ix)从非消旋前体进行对映体特异性合成：借助该合成技术从非手性原料获得期望的对映体，并且其中在合成过程中没有或仅最小程度地损坏了立体化学完整性；

x)手性液相色谱法：借助该技术，在液态流动相中通过其与固定相不同的相互作用来分离外消旋化合物的对映体(包括但不限于通过手性HPLC)。所述固定相可由手性材料制成或者所述流动相可包含另外的手性材料以激发不同的相互作用；

xi)手性气相色谱法：借助该技术，外消旋化合物被挥发，并且对映体通过其在气态流动相中与柱(包含固定的非消旋手性吸收剂相)不同的相互作用而分离；

xii)利用手性溶剂提取：借助该技术，对映体通过将一种对映体优先溶解到特定的手性溶剂中而分离；

xiii)跨手性膜转运：借助该技术，使外消旋化合物与薄隔膜接触。该隔膜通常分离两种互溶流体，一种包含该外消旋化合物，并且诸如浓度或压力差的驱动力引起跨隔膜的优先转运。由于该膜的非消旋手性性质仅允许外消旋化合物的一种对映体通过从而实现分离。

在一个实施方式中使用手性色谱，包括但不限于模拟移动床色谱。各种手性固定相是商业上可获得的。

IV.核苷酸盐或药物前体制剂

在化合物足够碱性或酸性以形成稳定的非毒性酸或碱盐的情况下，该化合物作为药用盐给予可能是适当的。药用盐的实例是与形成生理可接受阴离子的酸形成的有机酸加成盐，如甲苯磺酸盐、甲烷磺酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、丙二酸盐、酒石酸盐(tartarate)、琥珀酸盐、苯甲酸盐、抗坏血酸盐、α-酮戊二酸盐和α-甘油磷酸盐。还可形成合适的无机盐，包括但不限于硫酸盐、硝酸盐、碳酸氢盐和碳酸盐。

药用盐可利用本领域中熟知的标准步骤而获得，例如通过使足够碱性的化合物如胺与合适的酸(提供生理可接受的阴离子)反应。还可制备碱性金属(如钠、钾或锂)或碱土金属(如钙)的羧酸盐。

本文描述的任何一种核苷均可作为核苷酸药物前体而给予，以增加该核苷的活性、生物利用度、稳定性或以其他方式改变其特性。已知大量的核苷药物前体的配体。通常，该核苷的单、二或三磷酸酯的烷基化、酰化或其他亲脂性修饰将增加该核苷酸的稳定性。可取代磷酸酯部分上的一个或多个氢的取代基的实例为烷基、芳基、类固醇、碳水化合物，包括但不限于糖类、1，2-甘油二酯和醇类。许多描述在R.Jones&N.Bischofberger，Antiviral Research，1995，27，1-17中。这些中的任何一种均可与所披露的核苷联用以达到期望的效果。

活性核苷还可作为5’-磷醚脂质(phosphoether lipid)或5’-醚脂质而提供，如在下面的文献(均结合于此作为参考)中所披露的：Kucera，L.S.，N.Iyer，E.Leake，A.Raben，Modest E.K.，D.L.W.，and C.Piantadosi，“Novel membrane-interactive ether lipid analogs thatinhibit infectious HIV-1 production and induce defective virusformation，”AIDS Res.Hum.Retroviruses，1990，6，491-501；Piantadosi，C.，J.Marasco C.J.，S.L.Morris-Natschke，K.L.Meyer，F.Gumus，J.R.Surles，K.S.Ishaq，L.S.Kucera，N.Iyer，C.A.Wallen，S.Piantadosi，and E.J.Modest，“Synthesis and evaluation of novel etherlipid nucleoside conjugates for anti-HIV activity，”J.Med.Chem.，1991，34，1408-14；Hosteller，K.Y.，D.D.Richman，D.A.Carson，L.M.Stuhmiller，G.M.T.van Wijk，and H.van den Bosch，“Greatlyenhanced inhibition of human immunodeficiency virus type 1replication in CEM and HT4-6C cells by 3’-deoxythymidinediphosphate dimyristoylglycerol，a lipid prodrug of3，-deoxythymidine，”Antimicrob.Agents Chemother.，1992，36，2025-29；Hostetler，K.Y.，L.M.Stuhmiller，H.B.Lenting，H.van denBosch，and D.D.Richman，“Synthesis and antiretroviral activity ofphospholipid analogs of azidothymidine and other antiviralnucleosides.”J.Biol.Chem.，1990，265，61127。

披露合适的亲脂性取代基(其可共价掺入核苷中，优选在该核苷或亲脂性制剂的5’-OH位置)的美国专利的非限制性实例包括美国专利第5,149,794号(Yatvin et al.)；5,194,654(Hostetler et al.)、5,223,263(Hostetler et al.)；5,256,641(Yatvin et al.)；5,411,947(Hostetler et al.)；5,463,092(Hostetler et al.)；5,543,389(Yatvin etal.)；5,543,390(Yatvin et al.)；5,543,391(Yatvin et al.)和5,554,728(Basava et al.)，将全部结合于此作为参考。披露可连接于本发明的核苷或亲脂性制剂的亲脂性取代基的外国专利申请包括WO89/02733、WO 90/00555、WO 91/16920、WO 91/18914、WO93/00910、WO 94/26273、WO 96/15132、EP 0350287、EP 93917054.4和WO 91/19721。

V.联合或交替治疗

在一个实施方式中，本发明的化合物可与至少一种其他抗病毒剂联合应用，该抗病毒剂选自侵入抑制剂(entry inhibitors)、逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂和基于免疫的治疗剂。

例如，当用来治疗或预防HIV或HBV感染时，该活性化合物或其药物前体或药用盐可与另一种抗病毒剂联合或交替给予，例如抗HIV、抗HBV或抗HCV试剂，包括但不限于具有上面的化学式的那些试剂。通常，在联合治疗中，将有效剂量的两种或多种试剂一起给予，而在交替治疗过程中，顺次给予有效剂量的每一种试剂。该剂量将依赖于该药物的吸收、灭活和清除速率以及本领域中的技术人员已知的其他因素。应注意，剂量值还将随着待缓解病症的严重程度而变化。还应理解，对于任何特定个体，特定剂量方案以及时间表均应根据个体需要以及给药或监督组合物的给药人员的专业判断而随时间加以调整。

可与本文披露的化合物组合使用的抗病毒剂的非限制性实例包括下表中的那些抗病毒剂。

乙型肝炎治疗

HIV治疗：蛋白酶抑制剂(PIs)

HIV治疗：核苷/核苷酸逆转录酶抑制剂(NRTI)

HIV治疗：非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)

HIV治疗：其他种类的药物

商标名称	通用名	缩略词	实验编码	制药公司
					VireadTM	富马酸替诺福韦酯(tenofovirdisoproxilfumarate)(DF)	TDF 或Bis(POC)PMPA		Gilead Sciences

细胞抑制剂

侵入抑制剂(entry inhibitor)(包括融合抑制剂)

HIV治疗：基于免疫的疗法

在一个实施方式中，本文描述的化合物可与至少一种其他抗病毒剂一起应用，所述抗病毒剂选自逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、融合抑制剂、侵入抑制剂(entry inhibitor)和聚合酶抑制剂。

此外，根据本发明的化合物可与一种或多种抗逆转录病毒、抗HBV、抗HCV或抗疱疹试剂或干扰素、抗癌或抗细菌试剂(包括但不限于本发明的其他化合物)联合或交替给予。本文所描述的某些化合物可通过降低其他化合物的代谢、分解代射或灭活来有效的增强根据本发明的某些试剂的生物学活性，并且像这样被共同给予用于该期望的效应。

VI.药物组合物

感染了人免疫缺陷病毒、乙型或丙型肝炎病毒或者其基因片段的宿主(包括但不限于人类)可通过在药用载体(或称药学上可接受的载体)或稀释剂存在的条件下给予患者有效量的活性化合物或者其药用药物前体或盐来加以治疗。该活性物质可通过任何适当的途径，例如口服、胃肠外、静脉内、皮内、皮下或局部以液体或固体形式加以给予。

用于HIV、HBV或HCV感染的化合物的优选剂量将在约1-50mg/kg体重/天，优选1-20mg/kg体重/天的范围内，更通常地为0.1至约100mg/kg受者体重/天。药用盐和药物前体的有效剂量范围可基于待递送的亲本核苷的重量来计算。如果该盐或药物前体本身表现出活性，则有效剂量可以如上利用该盐或药物前体的重量而估计或通过本领域的技术人员已知的其他方式来估计。

该化合物可以任何合适的单位剂型方便地给予，包括但不限于包含7-3000mg，优选70-1400mg活性成分/单位剂型。50-1000mg的口服剂量通常是适宜的。

理论上，应该给予该活性成分以达到约0.2-70μM，优选约1.0-15μM的该活性化合物的峰值血浆浓度。这可以例如通过静脉注射0.1-5％的活性成分溶液(可选地，在盐水中)而实现，或者以该活性成分的大药丸而给予。

药物组合物中活性化合物的浓度将依赖于该药物的吸收、灭活和排泄速率以及本领域中技术人员已知的其他因素。应该注意，剂量值还将随着待缓解病症的严重程度而变化。应进一步理解，对于任何特定个体，具体剂量方案应根据个体需要以及负责或监督该组合物给药的医师的专业判断而随时间加以调整，并且本文中阐述的浓度范围仅是示例性的，并且不用于限制所要求保护的组合物的范围或实践。活性成分可一次给予或者可分为多个较小剂量以不同的时间间隔给予。

该活性化合物的给药的优选模式是口服。口服组合物通常将包括惰性稀释剂或可食用载体。它们可以包封在明胶胶囊中或压缩成片剂。为了用于口服治疗性给药，该活性化合物可与赋形剂结合并以片剂、锭剂或胶囊的形式使用。可以包含药学上相容的粘合剂和/或佐剂材料作为该组合物的一部分。

片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可包含下列成分中的任何一种或者类似性质的化合物：粘合剂如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂如淀粉或乳糖；崩解剂如褐藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂如胶体二氧化硅；甜味剂如蔗糖或糖精；或调味剂如薄荷、水杨酸甲酯或柑橘调味剂。当单位剂型是胶囊时，除了上述类型的物质以外，其还可包含液体载体如脂肪油。此外，单位剂型可包含各种能改良该剂量单位的物理形式的其他物质，例如糖包衣、虫胶或其他肠溶性试剂。

该化合物可作为酏剂、混悬剂、糖浆剂、糯米纸囊剂、口香糖等的组成部分加以给予。除了该活性化合物以外，糖浆剂还可包含蔗糖作为甜味剂以及某些防腐剂、染料以及着色剂和调味剂。

该化合物或者其药用药物前体或盐还可与其他并不减弱期望的作用的活性物质或者与增补期望作用的物质相混合，例如抗生素、抗真菌药、抗炎药或其他抗病毒药(包括但不限于其他核苷化合物)。用于胃肠外、皮内、皮下或局部施加的溶液或混悬剂可包括下列组分：无菌稀释剂如注射用水、盐溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂如苯甲醇或羟苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲液如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐以及用于张力调节的试剂如氯化钠或葡萄糖。胃肠外制剂可封入安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的倍剂量瓶中。

如果静脉内给药，则优选的载体是生理盐水或磷酸盐缓冲的盐水(PBS)。

在一个优选的实施方式中，该活性化合物与将保护该化合物免于从机体快速清除的载体一起制备，例如控释制剂包括但不限于植入物和微囊递送系统。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、多原酸酯和聚乳酸。例如，肠溶衣化合物可用来保护其免受胃酸分裂。用于制备这样的制剂的方法对于本领域的技术人员来说将是显而易见的。合适的材料还可以商购获得。

脂质体混悬液(包括但不限于用针对病毒抗原的单克隆抗体靶向于感染细胞的脂质体)也优选作为药用载体。这些混悬液可按照本领域技术人员已知的方法而制备，如在美国专利第4,522,811号(结合于此供参考)中所描述的。例如，脂质体制剂可通过将适当的脂质(如硬脂酰磷脂酰乙醇胺、硬脂酰磷脂酰胆碱、花生四烯酰(arachadoyl)磷脂酰胆碱和胆固醇)溶解在无机溶剂(其随后蒸发)中，在容器的表面上留下一薄层干燥的脂质来制备。随后将该活性化合物或其单磷酸、二磷酸和/或三磷酸衍生物的水溶液引入到该容器中。然后手动涡旋该容器以从该容器的侧面上释放脂质物质并使脂质聚集体分散，从而形成脂质体混悬液。

在描述本发明时使用的术语是通用的，并且对于本领域的技术人员来说是已知的。如本文中使用的，下列缩略词具有指定含义：

AIBN 2，2’-偶氮二异丁腈

BuLi 正丁基锂

DMF N，N-二甲基甲酰胺

DMSO 二甲亚砜

EtOAc 醋酸乙酯

h 小时

M 摩尔

MeCN 乙腈

MeOH 甲醇

min 分钟

NaOMe 甲醇钠

Py 吡啶

rt或RT 室温

TBAF 四-N-丁基氟化铵

TBAT 四丁基铵三苯基二氟硅酸盐

TBDMSCl 叔丁基二甲基甲硅烷基氯化物

THF 四氢呋喃

TMSBr 三甲基甲硅烷基溴化物

TMSOTf 三甲基甲硅烷基三氟甲烷磺酸酯

TsCl 对甲基苯磺酰氯

VII.用于制备活性化合物的总体方案

还提供了用于容易的制备3’-叠氮基-2’，3’-双脱氧嘌呤核苷和3’-叠氮基-2’，3’-双脱氧嘌呤核苷膦酸(phosphonate，膦酸盐/酯)的方法。3’-叠氮基-2’，3’-双脱氧嘌呤核苷和其膦酸(衍生物)可以如下文详细描述的或通过本领域中的技术人员已知的其他方法加以制备。本领域的普通技术人员将理解，这些方案决不是限制性的，并且在不偏离本发明的精神和范围的情况下可以对细节进行变动。

各种反应方案总结如下：

方案1是合成本发明的活性化合物，并且特别是从9-(2-脱氧-β-D-苏型-呋喃戊糖基)嘌呤合成3’-叠氮基-2’，3’-双脱氧嘌呤核苷I的一个非限制性实例。

方案2是合成本发明的活性化合物，并且特别是从核糖或核糖核苷合成9-(2-脱氧-β-D-苏型-呋喃戊糖基)嘌呤的一个非限制性实例。

方案3是合成本发明的活性化合物，并且特别是从木糖合成9-(2-脱氧-β-D-苏型-呋喃戊糖基)嘌呤的一个非限制性实例。

方案4是合成本发明的活性化合物，并且特别是从脱氧核糖合成9-(2-脱氧-β-D-苏型-呋喃戊糖基)嘌呤的一个非限制性实例。

方案5是合成本发明的活性化合物，并且特别是合成碳环嘌呤核苷的一个非限制性实例。

方案6是合成本发明的活性化合物，并且特别是通过处理3’-叠氮基-2’，3’-双脱氧嘌呤核苷的2或6位而合成3’-叠氮基-2’，3’-双脱氧嘌呤核苷的一个非限制性实例。

方案7是合成本发明的活性化合物，并且特别是合成3’-叠氮基-2’，3’-双脱氧嘌呤核苷膦酸(phosphonate)的一个非限制性实例。

方案8是合成本发明的活性化合物，并且特别是合成碳环3’-叠氮基-2’，3’-双脱氧嘌呤核苷膦酸(衍生物)的一个非限制性实例。

方案9是合成本发明的活性化合物，并且特别是合成3’-叠氮基-2’，3’-双脱氧嘌呤核苷膦酸(衍生物)的一个非限制性实例。

方案10是合成本发明的活性化合物，并且特别是合成3’-叠氮基-2’，3’-双脱氧鸟苷的一个非限制性实例。

方案11是合成本发明的活性化合物，并且特别是合成3’-叠氮基-2’，3’-双脱氧鸟苷类似物(62-65)的一个非限制性实例。

在一个实施方式中，所述方法包括9-(2-脱氧-β-D-苏型-呋喃戊糖基)嘌呤I的叠氮基取代，在Mitsunobu条件下直接取代(参见Marchand et al.，Nucleosides Nucleotides&Nucleic Acids，2000，19，205-17)或者通过磺酸酯中间体用叠氮化锂、叠氮化钠或叠氮化铵，随后脱保护，如方案1中所述。该磺酸酯可为甲烷磺酸酯、甲苯磺酸酯、三甲基硅酯(triflate)或其他合适的离去基团，并且去保护条件可随5’-O-保护而变化。5’位置的保护基团可以为酯(如Bz，Ac)、醚(如三苯甲基或MOM)、甲硅烷基(如TBDMS或TBDPS)或其他保护基团。通常，甲醇铵用于去除酯保护，并且酸性条件如HOAc或HCl可用于去除三苯甲基保护。为了去保护甲硅烷基基团，可以使用TBAF或NH₄F。

方案1.从9-(2-脱氧-β-D-苏型-呋喃戊糖基)嘌呤合成3’-叠氮基-2’，3’-双脱氧嘌呤核苷I。

化合物1可以通过各种途径来制备。方案2中所示的第一种途径基于Robins’过程，其通过脱氧作用以及同时以一锅方式翻转3’-羟基而将2’-O-甲苯磺酰基核苷5转化为2’-脱氧-3’-向上核苷6(参见Hansske et al.，J.Am.Chem.Soc.1983，105，6736)。该甲苯磺酸盐5可通过Wagner-Moffatt过程(参见Wagner et al.，J.Org.Chem.1974，39，24)由嘌呤核苷4而制备，而嘌呤核苷4则可从核糖3(X＝O，S)与嘌呤(或修饰嘌呤)碱基缩合而制备或者可以由商购来源获得。5’-羟基保护后，获得了3’-羟基-向上核苷1a。

方案2.从核糖或核糖核苷合成9-(2-脱氧-β-D-苏型-呋喃戊糖基)嘌呤1a。X＝O、S、CH₂；B＝保护或未保护的嘌呤碱；试剂和条件；(a)当X＝O或S时：i)TMSOTf，甲苯，保护或硅烷化的嘌呤；ii)NH₃，MeOH；(b)i)Bu₂SnO，MeOH；ii)TsCl，Et₃N；(c)LiEt₃BH，THF，DMSO；(d)TBDMSCl，咪唑，DMF。

第二种途径利用木糖7与硅烷化或保护的嘌呤或修饰的嘌呤碱的缩合。所得到的木糖核苷8可被选择性脱酰并被脱氧以得到化合物10。去保护和硅烷化后，化合物10可以被转化为1a(方案3)。

方案3.从木糖合成9-(2-脱氧-β-D-苏型-呋喃戊糖基)嘌呤1a。X＝O或S；B＝保护或未保护的嘌呤碱；试剂和条件(a)TMSOTf，甲苯；(b)H₂NNH₂.H₂O，AcOH，Py；(c)i)PhOCSCl，DMAP，MeCN；ii)(Me₃Si)₃SiH，AIBN，二氧杂环己烷；(d)NH₃，MeOH；(e)TBDMSCl，咪唑，DMF。

用于制备化合物1的第三种途径涉及2-脱氧-糖12与硅烷化或保护的嘌呤碱或修饰的嘌呤碱的缩合。获得的苯甲酰化的2’-脱氧嘌呤核苷13可通过去保护和选择性苯甲酰化而转化为3’-未保护的化合物14。利用Herdewijn的过程翻转3’-羟基，将14转化为1b(方案4)。

方案4.从脱氧核糖合成9-(2-脱氧-β-D-苏型-呋喃戊糖基)嘌呤1b。X＝O或S；B＝保护或未保护的嘌呤碱；试剂和条件：(a)MeCN；(b)i)NH₃，MeOH；ii)BzCl，Py；(c)i)(CF₃SO₂)₂O，Py，CH₂Cl₂，H₂O；ii)MeOH，NaHCO₃。

为了合成碳环核苷4，可采用Jung’s法。该方法涉及将Vince内酰胺15转化为戊烯基氨基磺酸酯16以及随后的Trost加成(参见Jung et al.，J.Org.Chem.1994，59，4719-20)。所得到的不饱和碳环核苷17可以被氧化成18，并且后者化合物可去保护成碳环核苷4(方案5)。按照方案1和2中描述的步骤，可从化合物4制备碳环类似物I。

方案5.合成碳环嘌呤核苷4。B＝保护或未保护的嘌呤碱；试剂和条件：(a)参照Jung et al.，J.Org.Chem.1994，59，4719-4720；(b)i)Pd(OAc)₂，P(OiPr)₃，THF，n-BuLi；ii)NaH，DMSO，嘌呤碱；(c)OsO₄；(d)NH₃，MeOH。

为了合成4’-取代的3’-叠氮基嘌呤核苷，在嘌呤碱基偶联之前或之后，可以使用多种方法学。例如，可以使用4’-5’-不饱和糖从而通过环氧化物(参见Haraguchi et al.，J.Org.Chem.2006，71，4433-38)或碘/亲核基团组合(参见Connolly et al.，2005，WO2005/000864A1)在4’位置引入各种取代基。在另一个实例中，该4’-C-羟甲基可由甲醛或其等价物制备，并被转化为4’-位置的多种取代基(参见Kohgo，et al.，Nucleosides&Nucleotides 2004，23，671-90；Siddiqui，et al.，J.Med.Chem.2004，47，5041-8)。

为了合成2-和/或6-修饰的3’-叠氮基嘌呤核苷，可采用功能性处理的方法学(方案6)。例如，Robins’重氮化法可用来合成2-或6-取代的嘌呤核苷，其中氨基基团通过重氮中间体转化为卤素或氢。6-氟代核苷可通过三甲基铵盐中间体从6-氯代化合物23而合成(参见ref.Gurvich et al.，Nucleosides&Nucleotides 1999，18，2327-33；Kim et al.，J.Med.Chem.1999，42，324-8)。从6-氯代化合物23，还可制备其他6-烷基氨基取代的核苷。方案6中描述了这些制备过程。在不背离本发明的精神和范围的情况下，其他功能性转化还可通过本领域技术人员已知的其他反应来进行。

方案6.通过处理3’-叠氮基-2’，3’-双脱氧嘌呤核苷的2或6位来合成3’-叠氮基-2’，3’-双脱氧嘌呤核苷。X＝O、S、CH₂；试剂和条件：(a)ref.Francom et al.，J.Org.Chem.2002，67，6788-96；Francomet al.，J.Org.Chem.2003，68，666-669；(b)NH₃，MeOH，0℃；(c)i)NMe₃，二甲氧基乙烷；ii)TBAT，DMF；(d)i)NMe₃，DMF，THF；ii)KF，DMF；(e)NH₃或烷基胺。

3’-叠氮基-2’，3’-双脱氧嘌呤核苷膦酸II(R³和R⁴＝H，X＝O，S)可通过采用Kim’s法而合成(参见Kim et al.，J.Org.Chem.1991，56，2642)。关键中间体呋喃烯糖27可利用Horwitz法(参见Zemlickaet al.，J.Am.Chem.Soc.1972，94，3213-8)从2’-脱氧核苷25而制备。从烯糖27，通过氯化苯硒加成以及随后在高氯酸银存在下用二甲基(羟甲基)膦酸酯取代或者直接在N-(苯硒)酞酰亚胺或溴化碘的辅助下引入(二甲基膦酰基)甲氧基功能性。苯硒或碘基的清除导致形成双键产物29，其一旦氧化即产生核糖核苷30。该核糖核苷30可通过采用Robins’过程(参见Hansske et al.，J.Am.Chem.Soc.1983，105，6736)以及随后的甲磺酰化而转变为甲磺酸盐33，与方案2中所述类似的合成。用叠氮化物取代随后去保护，将33转化为3’-叠氮基-2’，3’-二脱氧嘌呤核苷膦酸II，如方案7中所描述的。

方案7.3’-叠氮基-2’，3’-双脱氧嘌呤核苷膦酸II的合成。X＝O或S；B＝保护或未保护的嘌呤碱；试剂和条件：(a)Pt，pH 9或CrO₃，Py或KMnO₄；(b)DMF，二甲基甲酰胺二新戊基乙缩醛，80-90℃；(c)i)PhSeCl，-70℃；ii)AgClO₄，(MeO)₂P(＝O)CH₂OH；或N-(苯硒)酞酰亚胺，(MeO)₂P(＝O)CH₂OH；(d)NaIO₄；(e)OsO₄；(f)i)Bu₂SnO，MeOH；ii)TsCl，Et₃N；(g)LiEt₃BH，THF，DMSO；(h)MsCl，Py；(i)LiN₃，DMF；(j)TMSBr。

由于4’-羟基碳环核苷的稳定性，因此该碳环核苷36可直接通过Trost反应从环戊烯醇酯35而制备。36的保护和氧化产生了碳环核苷37，其可以与方案2中所描述的类似的方式转化为甲磺酸盐40。用叠氮化物取代甲磺酸盐40随后去保护可得到3’-叠氮化合物42，其可与(EtO)(OH)P(＝O)CH₂Ots缩合以得到磷酸酯43。通过去保护反应，可获得碳环3’-叠氮基核苷膦酸II(R³和R⁴＝H，X＝CH₂)(方案8)。

方案8.碳环3’-叠氮基-2’，3’-双脱氧嘌呤核苷膦酸II的合成。B＝保护或未保护的嘌呤碱；试剂和条件：(a)Pd(PPh₃)₄，PPh₃，NaH，Base；(b)i)CH₂(OMe)₂，CH₂Cl₂，TfOH；ii)OsO₄；(c)i)Bu₂SnO，MeOH；ii)TsCl，Et₃N；(d)LiEt₃BH，THF，DMSO；(e)MsCl，Py；(f)LiN₃，DMF；(g)CF₃COOH，CH₂Cl₂；(h)(EtO)(HO)P(＝O)CH₂OTs，NaH；(i)TMSBr。

5’-脱氧核苷膦酸II(Z＝CH₂)可从5’-碘代化合物46合成，46可通过甲苯磺酰化和碘化从核苷44而制备。用磷酸三乙酯取代碘代化合物46随后去保护，可获得3’-叠氮基嘌呤核苷膦酸II(方案9)。该方法已广泛用于合成5’-脱氧核苷膦酸(参见Holy，et al.，Tetrahedron Lett.1967，881-884)。

5’-亚甲基膦酸II(Z＝CH₂CH₂)也可通过与二异丙基锂代甲烷膦酸酯缩合随后去保护而从5’-碘代化合物46来合成，这是Wolff-Kugel和Halazy使用的一种方法(参见Wolff-Kungel，Halazy，Tetrahedron Lett.1991，32，6341-4)。方案9中描述了该过程。

方案9.3’-叠氮基-2’，3’-双脱氧嘌呤核苷膦酸II的合成。X＝O，S，CH₂；B＝保护或未保护的嘌呤碱；试剂和条件：(a)TsCl，Py；(b)NaI，EtCOMe；(c)(EtO)₃P；(d)TMSBr；(e)LiCH₂P(＝O)(iPrO)₂。

通式(IV)的修饰嘌呤可通过多种方法来制备，包括但不限于：1)糖与杂芳基溴化镁盐的C-杂芳基化(参见Cornia，M.et al.，J.Org.Chem.1991，40，19-34)；2)吲哚-2-硫酮(或嘌呤-8-硫酮)与呋喃核糖衍生物之间的Knoevenagel型缩合(参见Chen，JJ et al.，Nucleosides Nucleotides&Nucleic Acids，2005，24，1417-37)；或由SnCl₄/AgOTfa促进的苯并噻吩与1-O-Me-脱氧核糖的Friedel-Crafts型糖基化，(参见Hainke，S.et al.，Org.Biomol.Chem.2005，23，2233-8)；和4)一种用于芳基C-糖基化的通用方法，涉及有机镉化合物或诺尔芒铜酸盐(Normantcuprates)与受保护的呋喃核糖基氯的偶联(参见Ren，RXF，et al.，J.Am.Chem.Soc.1996，118，7671-78)。

除了上面描述的方法以外，其他方法如转糖基作用(参见Robins et al.，J.Med.Chem.1989，32，1763-8；Freeman et al.，Bioorg.Med.Chem.1995，3，447-58)，3’-叠氮基糖-碱基缩合(参见Fleet etal.，Tetrahedron 1988，44，625-36)以及那些在最近一篇综述性文章中阐述的方法(参见Pathak，Chem.Rev.2002，102，1623-67)，也可用来合成3’-叠氮基嘌呤核苷和其膦酸(衍生物)。

本发明将在下列实施例中得到进一步阐释。方案10-11和实施例1-13示出了用于合成3’-叠氮基嘌呤的制备方法，而实施例14-26示出了3’-叠氮基嘌呤核苷类似物的生物学评价。本领域的普通技术人员将能够理解，这些实施例决不是限制性的，并且在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以对细节进行改变。

具体的实施例

代表本发明的特定化合物按照下列实施例和反应顺序而制备；描述反应顺序的实施例和图通过举例说明的方式给出，以帮助理解本发明，并且不应解释为以任何方式限制其后将在权利要求中阐述的本发明。本发明的化合物还可在随后的实施例中用作中间体以产生本发明的另外的化合物。无需尝试优化在任何反应中获得的产量。本领域的技术人员将清楚如何通过反应时间、温度、溶剂和/或试剂的常改变来增加这样的产量。

无水溶剂购自Aldrich Chemical Company，Inc.(Milwaukee)。试剂由商业来源购买。除非另有指出，否则实施例中使用的物质易于从供应商处获得或者通过化学合成领域中的技术人员已知的标准方法来合成。熔点(mp)在电热数字熔点装置上测定，并且未经校正。¹H和¹³C NMR光谱在室温下在Varian Unity Plus 400光谱仪上采集并以距内在四甲基硅烷的ppm报告。进行氘交换，去偶实验或2D-COSY以确认质子分配。信号多样性由s(单一)、d(二重)、dd(双组双重)、t(三重)、q(四重)、br(宽)、bs(宽单一)、m(多重)来表示。所有J-值以Hz为单位。质谱在Micromass PlatformLC光谱仪上利用电喷射技术来确定。元素分析由Atlantic MicrolabInc.(Norcross，GA)实施。分析型TLC在Whatman LK6F硅胶板上实施，而制备型TLC在Whatman PK5F硅胶板上实施。柱层析在硅胶上或通过逆向高效液相色谱法而实施。

方案10.3’-叠氮基-2’，3’-二脱氧鸟苷(56)的合成。

实施例1

N²-异丁酰基-2’-脱氧鸟苷(50)

将2’-脱氧鸟苷(49)(5g，18.72mmol)与吡啶(100mL)共蒸发3次，并悬浮在干吡啶(100mL)中。加入三甲基氯硅烷(11.88mL，93.63mmol)，并在室温下搅拌所得溶液2h。加入异丁酸酐(15.54mL，93.65mmol)，并在氩气氛下在室温下搅拌混合物4h。在冰浴中冷却反应，然后加入水(30mL)。15分钟后，加入29％氨水(30mL)，并搅拌该反应15分钟。然后使溶液蒸发至仅干燥，并将残留物溶解在水(300mL)中。用二氯甲烷(150mL)冲洗含水层，并且在水中迅速出现结晶。过滤该化合物，随后在真空下过夜干燥，以获得标题化合物50(4.75g，75％)作为白色固体。¹H NMR(DMSO-d₆)δ1.01-1.10(m，6H，2xCH₃)，2.20-2.26(m，1H，H-2’)，2.46-2.57(m，1H，H-)，2.71-2.76(m，1H，H-)，3.43-3.55(m，2H，H-5’，H-5”)，3.77-3.81(m，1H，H-4’)，4.31-4.35(m，1H，H-)，4.93(br s，OH)，5.29(br s，OH)，6.17(t，1H，J＝6.0Hz，H-1’)，8.20(s，1H，H-8)，10.97(br s，2x NH)。

实施例2

5’-O-苯甲酰-N²-异丁酰基-2’-脱氧鸟苷(51)

向在无水DMF(44mL)中的N²-异丁酰基-2’-脱氧鸟苷(50)(1g，2.96mmol)的溶液中加入Et₃N(1.5mL)和4-二甲基氨基吡啶(15mg，0.12mmol)。在搅拌的情况下，将在无水DMF(10mL)中的苯甲酸酐(740mg，3.27mmol)的溶液在2h的时间内逐滴加入到该溶液中。该反应在室温下搅拌过夜。蒸发溶剂，并将该混合物通过柱层析在硅胶柱上纯化，并用CH₂Cl₂-MeOH(9∶1)洗脱，以给出标题化合物51(0.6g，46％)作为白色固体。¹H NMR(DMSO-d₆)δ1.03-1.09(m，6H，2xCH₃)，2.32-2.39(m，1H，H-2’)，2.47-2.73(m，2H，H-2”，异丁酰基CH)，4.08-4.12(m，1H，H-)，4.35-4.40(m，1H，H-5’)，4.44-4.48(m，1H，H-5”)，4.51-4.55(m，1H，H-)，5.52(br s，1H，5’-OH)，6.22(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，7.47-7.51(m，2H苯甲酰)，7.60-7.64(m，1H苯甲酰)，7.86-7.91(m，2H苯甲酰)，8.15(s，1H，H-8)，11.61(br s，NH)，12.04(br s，NH)。

实施例3

N²-异丁酰基-9-(5-O-苯甲酰-2-脱氧-β-D-苏型-呋喃戊糖基)-鸟嘌呤(52)

在0℃下向在无水二氯甲烷(200mL)和无水吡啶(30mL)中的51(5g，11.33mmol)的混悬液中逐滴加入三氯甲烷磺酸酐(5.8mL，33.99mmol)。移走冷却浴后，在室温下搅动反应30分钟，直至反应混合物澄清。随后加入水(20mL)，并在室温下继续搅拌反应3h。使有机层分离并蒸发。然后将残留的油通过柱层析在硅胶上纯化，并用CH₂Cl₂-MeOH(95∶5)洗脱，得到标题化合物52(0.5g，10％)以及N²-异丁酰基-9-(3-O-苯甲酰-2-脱氧-β-D-苏型-呋喃戊糖基)-鸟嘌呤(53)(1.93g，39％)和N²-异丁酰基-9-(5-O-苯甲酰-2，3-双脱氧-β-D-苏型-呋喃戊糖基)-(N³→3’)-环鸟苷(54)(0.89g，18％)。

52的数据：¹H NMR(DMSO-d₆)β1.06-1.08(m，6H，2xCH₃)，2.27-2.31(m，1H，H-2’)，2.67-2.77(m，2H，H-2”，异丁酰基CH)，4.26-4.42(m，1H)，4.44-4.47(m，2H)，4.54-4.59(m，1H)，5.65(d，1H，J＝4.0Hz，3’-OH)，6.15(d，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，7.46-7.51(m，2H苯甲酰)，7.59-7.62(m，1H苯甲酰)，7.90-7.92(m，2H苯甲酰)，8.20(s，1H，H-8)，11.68(br s，NH)，12.04(br s，NH)。

53的数据：¹H NMR(DMSO-d₆)δ1.05-1.08(m，6H，2xCH₃)，2.68-2.76(m，2H，H-2’，异丁酰基CH)，2.91-2.99(m，1H，H-2”)，3.68-3.76(m，2H，H-5’，H-5”)，4.25-4.29(m，1H，H-4’)，4.93(t，1H，J＝5.6Hz，5’-OH)，5.63-5.65(m，1H，H-3’)，5.18-5.23(m，1H，H-1’)，7.45-7.49(m，2H苯甲酰)，7.61-7.65(m，1H苯甲酰)，7.79-7.82(m，2H苯甲酰)，8.11(s，1H，H-8)，11.68(br s，NH)，11.99(br s，NH)。

54的数据：¹H NMR(DMSO-d₆)δ0.94-0.96(m，3H，CH₃)，1.00-1.02(m，3H，CH₃)，2.26-2.34(m，1H)，2.55-2.58(m，1H)，2.73-2.78(m，1H)，4.20(dd，1H，J＝4.5Hz，J＝9.0Hz，H-5’)，4.41(dd，1H，J＝4.5Hz，J＝9.0Hz，H-5”)，4.73-4.78(m，1H，H-4’)，5.61-5.64(m，1H，H3’)，6.44(d，1H，J＝3.0Hz，H-1’)，7.40-7.44(m，2H苯甲酰)，7.58-7.62(m，1H苯甲酰)，7.69-7.72(m，2H苯甲酰)，8.00(s，1H，H-8)，12.69(br s，NH)。

实施例4

53部分异构化为52

将在MeOH(30mL)中的53(3.05g，6.91mmol)和NaHCO₃(488mg，5.8mmol)的溶液在室温下搅拌3h。溶剂蒸发后，残留物通过层析在硅胶上纯化，并用CH₂Cl₂-MeOH(95∶5)洗脱，以给出52(1.3g，43％)和53(1.7g，56％)。

实施例5

N²-异丁酰基-9-(3-叠氮基-5-O-苯甲酰-2，3-双脱氧-β-D-苏型-呋喃戊糖基)-鸟嘌呤(55)

向在二氯甲烷(30mL)中的52(290mg 0.65mmol)的混合物中加入4-二甲基氨基吡啶(12mg，0.065mmol)和Et₃N(0.45mL)，随后在0℃下逐滴加入甲磺酰氯(0.121mL，1.30mmol)。所得的混合物在0℃下在氩气中搅拌40min，然后用水(20mL)进行水解。使有机层分离并蒸发。将残留的油稀释在无水DMF(20mL)中。向该溶液中加入叠氮化钠(410mg，6.5mmol)，并将该混合物在120℃下在氩气下加热2h。将反应冷却至室温，用AcOEt稀释并用水冲洗。使有机层蒸发，然后将残留物通过柱层析在硅胶柱上纯化，并用CH₂Cl₂-MeOH(9∶1)洗脱，以给出55(200mg，65％)作为白色固体。IR 2104cm^-1(N₃)；¹H NMR(DMSO-d₆)δ1.08-1.12(m，6H，2xCH₃)，2.50-2.79(m，2H，H-2’，异丁酰基CH)，2.91-3.01(m，1H，H-2’)，4.18-4.23(m，1H，H-4’)，4.42-4.56(m，2H，H-5’，H-5”)，4.83-4.89(m，1H，H-3’)，6.21(t，1H，J＝5.4Hz，H-1’)，7.45-7.50(m，2H苯甲酰)，7.62-7.66(m，1H苯甲酰)，7.85-7.88(m，2H苯甲酰)，8.20(s，1H，H-8)，11.53(br s，NH)，11.91(br s，NH)。

实施例6

3’-叠氮基-2’，3’-双脱氧鸟苷(56)(也称为3’-叠氮基-ddG)

向在CH₂Cl₂(180mL)中的55(1.4g，3.00mmol)的溶液中加入NaOMe(在MeOH中的0.5M溶液，2mL)。在45℃下搅拌该反应溶液4h，随后蒸发至干燥。将残留物通过柱层析在硅胶柱上纯化，并用AcOEt/MeOH/H₂O(75∶20∶5)洗脱，以给出标题化合物56(500mg，57％)作为白色固体。IR 2104cm^-1(N₃)；¹H NMR(DMSO-d₆)δ2.35-2.50(m，1H，H-2’)，2.71-2.78(m，1H，H-2”)，3.51-3.57(m，2H，H-5’，H-5”)，3.83-3.86(m，1H，H-4’)，4.51-4.58(m，1H，H-3’)，5.08-5.14(m，1H，5’-OH)，6.05(t，1H，J＝6.3Hz，H-1’)，6.53(br s，2H，NH₂)，7.91(s，1H，H-8)，1068(br s，1H，NH)。

方案11.3′-叠氮基-2′，3′-双脱氧鸟苷类似物(62-65)的合成。

实施例7

2-异丁基氨基-9-(5-O-苯甲酰-3’-叠氮基-2’，3’-双脱氧-β-D-赤-呋喃戊糖基)-6-(2，4，6-三异丙基磺酰基)-9H-嘌呤(57)

向在CH₂Cl₂(10mL)中的化合物55(0.08g，0.17mmol)的溶液中加入三乙胺(0.04mL，0.42mmol)，双脱氧氨基吡啶(0.004g，0.03mmol)和三异丙基苯磺酰氯(0.07g，0.24mmol)，并在室温下搅拌6-10h。将反应混合物蒸发至干燥，并通过柱层析EtOAc∶己烷(3∶2)来纯化残留物，以获得57(0.08g，88％)作为浅黄色固体。¹H NMR(DMSO-d₆)：δ0.90-0.96(m，6H，2x CH₃)，1.06-1.18(m，18H，异丙基)，2.56-2.59(m，1H，H-2’a)，2.69-2.74(m，1H，H-2’b)，2.90-2.95(m，1H)，3.01-3.06(m，1H，CH-异丙基)，4.01-4.11(m，3H，H-4’，CH-异丙基)，4.40-4.50(m，2H，H-5’b，H-5’a)，5.62-5.5(m，1H，H-3’)，6.29-6.30(m，1H，H-1’)，7.33-7.39(m，4H，Ar)，7.53-7.57(m，1H，Ar)，7.73-7.74(m，2H，Ar)，8.49(s，1H，H-8)。针对C₃₆H₄₄N₈O₇S计算的LCMS为732.3，观察到的(M+1)为733.4。

实施例8

2-异丁基氨基-9-(5-O-苯甲酰-3’-叠氮基-2’，3’-双脱氧-β-D-赤-呋喃戊糖基)-6-烯丙基氨基-9H-嘌呤(58)

向在THF(10mL)中的化合物57(0.07g，0.09mmol)的溶液中加入丙烯胺(0.03g，0.47mmol)并在55℃下回流15h。将反应混合物蒸发至干燥，并通过柱层析CH₂Cl₂∶MeOH(9∶1)来纯化残留物，以获得58(0.04g，83％)作为一种浆剂。¹H NMR(CDCl₃)：δ1.18-1.20(s，6H，2xCH₃)，2.43-2.50(m，1H，H-2’a)，3.01-3.03(m，1H，H-2’b)，4.09-4.18(m，2H，H-5’a)，4.25-4.28(m，1H，H-5’b)，4.44-4.53(m，2H，H-4’，CH₂烯丙基)，5.10-5.25(m，3H，H-3’，烯丙基)，5.90-5.96(m，1H，CH烯丙基)，6.10-6.13(m，1H，H-1’)，7.32-7.35(m，2H，Ar)，7.46-7.48(m，1H，Ar)，7.55(s，1H，H-8)，7.89-7.91(m，2H，Ar)。针对C₂₄H₂₇N₉O₄计算的LCMS为505.2，观察到的(M+1)为506.3。

实施例9

2-氨基-9-(3’-叠氮基-2’，3’-双脱氧-β-D-赤-呋喃戊糖基)-6-烯丙基氨基-9H-嘌呤(62)

向在CH₂Cl₂(10mL)中的化合物58(0.04g，0.07mmol)的溶液中加入在MeOH中的0.5M的NaOMe(0.03mL)的溶液。在室温下搅拌该反应混合物24h，蒸发至干燥并通过柱层析在硅胶CH₂Cl₂∶MeOH(9∶1)上纯化，以获得62(0.019g，73％)作为白色固体。¹H NMR(CDCl₃)：δ2.26-2.31(dd，1H，J＝5.6Hz，13.6Hz，H-2’a)，3.09-3.12(m，1H，H-2’b)，3.69-3.73(d，1H，J＝12.8Hz，H-5’a)，3.97-4.01(d，1H，J＝12.8Hz，H-5’b)，4.19(m，3H，H-4’，CH₂烯丙基)，4.53-4.55(d，1H，J＝6.0Hz，H-3’)，4.83(brs，2H，NH₂)，5.14-5.16(d，1H，J＝8.0Hz，烯丙基)，5.23-5.27(d，1H，J＝16.0Hz，烯丙基)，5.88-5.92(m，2H，CH烯丙基，NH)，6.04-6.08(m，1H，H-1’)，7.46(s，1H，H-8)。针对C₁₃H₁₉N₉O₂计算的LCMS为331.1，观察到的(M+1)为332.1。

实施例10

2-异丁基氨基-9-(5-O-苯甲酰-3’-叠氮基-2’，3’-双脱氧-β-D赤-呋喃戊糖基)-6-N-甲基烯丙基氨基-9H-嘌呤(59)

向在THF(10mL)中的化合物57(0.07g，0.09mmol)的溶液中加入N-甲基丙烯胺(0.04mL，0.63mmol)并在55℃下回流15h。将反应混合物蒸发至干燥，并通过柱层析CH₂Cl₂∶MeOH(9∶1)来纯化残留物，以获得59(0.035g，73％)作为一种浆剂。¹H NMR(CDCl₃)：δ1.20(s，6H，2x CH₃)，2.47-2.54(m，1H，H-2’a)，3.10-3.17(m，1H，H-2’b)，4.19-4.24(m，1H，H-5’a)，4.49-4.54(m，2H，H-5’b，H-4’)，4.68-4.72(m，2H，CH₂烯丙基)，5.13-5.18(m，3H，H-3’，CH₂烯丙基)，5.89-5.95(m，1H，CH烯丙基)，6.12-6.15(m，1H，H-1’)，7.35-7.37(m，2H，Ar)，7.48-7.50(m，1H，Ar)，7.66(s，1H，H-8)，7.91-7.93(m，2H，Ar)。针对C₂₅H₂₉N₉O₄计算的LCMS为519.2，观察到的(M+1)为520.3。

实施例11

2-氨基-9-(3’-叠氮基-2’，3’-双脱氧-β-D-赤-呋喃戊糖基)-6-N-甲基烯丙基氨基-9H-嘌呤(63)

向在CH₂Cl₂(10mL)中的化合物59(0.03g，0.05mmol)的溶液中加入在MeOH中的0.5M的NaOMe(0.015mL)的溶液。在室温下搅拌该反应混合物24h，蒸发至干燥并通过柱层析在硅胶CHC₂l₂∶MeOH(9∶1)上纯化，以获得63(0.015g，75％)作为白色固体。¹H NMR(CDCl₃)：δ2.26-2.31(m，1H，H-2’a)，2.45(s，3H，CH₃)，3.10-3.14(m，1H，H-2’b)，3.71-3.80(m，1H，H-5’a)，3.97-4.01(d，1H，J＝13Hz，H-5’b)，4.18(m，1H，H-4’)，4.65(m，1H，H-3’)，4.85(brs，2H，NH₂)，5.14-5.16(m，2H，CH₂烯丙基)，5.88-5.92(m，1H，CH-烯丙基)，6.04-6.08(m，1H，H-1’)，7.62(s，1H，H-8)。针对C₁₄H₁₉N₉O₂计算的LCMS为345.3，观察到的(M+1)为346.2。

实施例12

2-异丁基氨基-9-(5-O-苯甲酰-3’叠氮基-2’，3’-双脱氧-β-D-赤-呋喃戊糖基)-6-氨基戊醇-9H-嘌呤(60)

向在THF(10mL)中的化合物57(0.08g，0.1mmol)的溶液中加入氨基戊醇(0.05g，0.54mmol)并在55℃下回流15h。将反应混合物蒸发至干燥，并通过柱层析CH₂Cl₂∶MeOH(9∶1)来纯化残留物，以获得60(0.03g，56％)作为一种浆剂。¹H NMR(CDCl₃)：δ1.19-1.21(s，6H，2x CH₃)，1.43-1.492(m，2H，烷基)，1.56-1.67(m，8H，烷基)，2.49-2.56(m，2H，H-2’a，CH(CH₃)₂)，3.13-3.19(m，1H，H-2’b)，3.45-3.62(m，4H，H-5’a，H-5’b，CH₂OH)，4.20-4.25(m，1H，H-4’)，4.50-4.55(m，1H，H-3’)，6.12-6.15(m，1H，H-1’)，6.20(s，1H，NH)，7.36-7.38(m，2H，Ar)，7.49-7.53(m，1H，Ar)，7.68(s，1H，H-8)，7.91-7.94(m，2H，Ar)。针对C26H33N9O5计算的LCMS为551.2，观察到的(M+1)为552.3。

2-氨基-9-(3’-叠氮基-2’，3’-双脱氧-β-D-赤-呋喃戊糖基)-6-氨基戊醇-9H-嘌呤(64)

向在CH₂Cl₂(10mL)中的化合物57(0.04g，0.07mmol)的溶液中加入在MeOH中的0.5M的NaOMe(0.03mL)的溶液。在室温下搅拌该反应混合物24h，蒸发至干燥并通过柱层析在硅胶CH₂Cl₂∶MeOH(9∶1)上纯化，以获得64(0.019g，73％)作为白色固体。¹H NMR(CDCl₃)：δ1.40(s，6H，2XCH₃)，2.29-2.33(dd，1H，J＝4.4Hz，12.4Hz，H-2’a)，3.03-3.08(m，1H，H-2’b)，3.62-3.72(m，4H，H-5’a，CH₂OH)，3.96-3.99(d，1H，J＝13.2Hz，H-5’b)，4.18(s，1H，H-4’)，4.53-4.54(d，1H，J＝6.4Hz，H-3’)，4.87(brs，2H，NH₂)，6.03-6.07(m，1H，H-1’)，6.27(brs，1H，NH)，7.46(s，1H，H-8)。针对C₁₅H₂₅N₉O₃计算的LCMS为377.4；观察到的(M+1)为378.2。

实施例13

2-氨基-9-(3’-叠氮基-2’，3’-双脱氧-β-D-赤-呋喃戊糖基)-6-N-2-甲基-2-氨基-丙醇-9H-嘌呤(65)

向在THF(10mL)中的化合物57(0.03g，0.04mmol)的溶液中加入2-甲基-2-氨基丙醇(0.01mL，0.13mmol)并在55℃下回流4h。将反应混合物蒸发至干燥，并用于随后的反应而无需纯化。向在CH₂Cl₂(10mL)中的残留物中加入在MeOH中的0.5M的NaOMe(0.02mL)的溶液。然后在室温下搅拌24h，蒸发至干燥并通过柱层析在硅胶CH₂Cl₂∶MeOH(9∶1)上纯化，以获得65(0.015g，75％)作为白色固体。¹H NMR(CDCl₃)：δ1.25(m，8H，烷基)，2.25-2.30(dd，1H，J＝5.2Hz，14.8Hz，H-2’a)，3.07-3.14(m，1H，H-2’b)，3.49(brs，2H，2X OH)，3.59-3.62(m，2H，CH₂OH)，3.68-3.72(d，1H，J＝13.2Hz，H-5’a)，3.96-3.99(d，1H，J＝12.8Hz，H-5’b)，4.17(m，1H，H-4’)，4.52-4.53(d，1H，J＝5.6Hz，H-3’)，4.93(brs，2H，NH₂)，6.02-6.06(m，1H，H-1’6.27(brs，1H，NH)，7.45(s，1H，H-8)。针对C₁₄H₂₁N₉O₃计算的LCMS为363.3，观察到的(M+1)为364.2。

实施例14

抗-HIV(在PBM细胞中)分析

所述化合物的抗-HIV-1活性在人外周血单核(PBM)细胞中进行测定，如前所述(参见Schinazi R.F.，McMillan A.，Cannon D.，Mathis R.，Lloyd R.M.Jr.，Peck A.，Sommadossi J.-P.，St.Clair M.，Wilson J.，Furman P.A.，Painter G.，Choi W.-B.，Liotta D.C.Antimicrob.Agents Chemother.1992，36，2423；Schinazi R.F.，Sommadossi J.-P.，Saalmann V.，Cannon D.，Xie M.-Y.，Hart G.，Smith G.，Hahn E.Antimicrob.Agents Chemother.1990，34，1061)。在无菌DMSO中制备该化合物的储存液(20-40mM)，随后在生长培养基中稀释至期望的浓度。细胞以0.01的感染复数感染原型HIV-1LAI。感染后第6天，通过逆转录测定对由细胞上清液获得的病毒进行量化，其中使用(rA)_n·(dT)_12-18作为模板-引物。稀释液中存在的DMSO(＜0.1％)对病毒产量没有影响。包括AZT作为阳性对照。利用之前描述的中位有效法(median effective method)从浓度-效应曲线获得抗病毒EC₅₀和EC₉₀。(参见Chou T.-C.&Talalay P.Adv.EnzymeRegul.1984，22，27-55；Belen’kii M.S.&Schinazi R.F.Antiviral Res.1994，25，1-11)。

实施例15

评估通过HIV-1RT进行的新型APN-TPs掺入

i)蛋白表送和纯化：利用p6HRT-PROT表达载体在细菌中过表达HIV-1RT(xxLAI背景)(参见Shi C，Mellors JW.Arecombinant retroviral system for rapid in vivo analysis of humanimmunodeficiency virus type 1 susceptibility to reverse transcriptaseinhibitors.Antimicrob Agents Chemother.1997；41：2781-5)，并如前述进行均匀纯化(参见Le Grice SF，Gruninger-Leitch F.Rapidpurification of homodimer and heterodimer HIV-1 reverse transcriptaseby metal chelate affinity chromatography.Eur J Biochem.1990；187：307-14；Le Grice SF，Cameron CE，Benkovic SJ.Purification andcharacterization of human immunodeficiency virus type 1 reversetranscriptase.Methods Enzymol.1995；262：130-44)。所纯化酶的蛋白浓度利用分光光度计在280nm处进行测定，其中采用260450M-1cm-1的消光系数(ε280)。RT的活性位点浓度根据前稳态冲击实验进行计算，如前所述(参见Kati WM，Johnson KA，JervaLF，Anderson KS.Mechanism and fidelity of HIV reverse transcriptase.J Biol.Chem.1992；267：25988-97)。下文所述的所有反应均采用活性位点浓度而实施。

ii)前稳态动力学分析：在所有实验中均采用一种与57个核苷酸的DNA模板(5’-CTCAGACCCTTTTAGTCAGAATGGAAANTCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACA-3’)退火且5’-末端标记[γ32P]-ATP的20核苷酸DNA引物(5’-TCGGGCGCCACTGCTAGAGA-3’)。该DNA模板的第30位(N)包含T或C，这允许利用相同的20核苷酸引物来评估单核苷酸掺入动力学。快速淬灭实验利用Kintek RQF-3仪(KintekCorporation，Clarence，PA)来进行。在所有实验中，300nM RT和60nM DNA模板/引物(T/P)均在反应缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.5，50mM KCl)中预孵育，然后与等体积的含20mM MgCl₂的相同反应缓冲液中的核苷酸混合。反应在10ms至30min的时间范围内通过用0.5M EDTA，pH 8.0淬灭而终止。将淬灭的样品与等体积的凝胶加样缓冲液(98％去离子甲酰胺，10mM EDTA以及1mg/mL溴酚兰和1mg/mL二甲苯蓝)混合，在85℃变性5min，并将产物在7M尿素-16％聚丙烯酰胺凝胶上与底物分离。采用Bio-RadGS525分子成像仪(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA)分析产物形成。

iii)数据分析：利用Sigma绘图软件(Jandel Scientific)以及适当的方程，将从动力学分析获得的数据通过非线性回归进行拟合(参见Johnson KA.Rapid quench kinetic analysis of polymerases，adenosinetriphosphatases，and enzyme intermediates.MethodsEnzymol.1995；249：38-61)。用于每一个特定浓度的dNTP的表观冲击速率常数(kobs)均通过将产物形成的时程拟合于方程：[产物]＝A[1-exp(-kobst)]而测定，其中A表示冲击幅度。转换数(kpol)和dNTP的表观解离常数(K_d)通过绘制表观催化速率、kobs对dNTP浓度的曲线并将数据与以下双曲线方程：kobs＝(kpol[dNTP])/([dNTP]+K_d)拟合而获得。

实施例16

评估新型APNs的抗HIV活性和细胞毒性

i)病毒：通过将5-10μg的质粒DNA电穿孔(Gene Pulser；Bio-Rad)入1.3×10⁷MT-2细胞中，利用xxHIV-1LAI克隆75来制备原种病毒(stock virus，繁殖用的病毒)。转染后第7天，收集无细胞上清液并储存在-80℃下。通过从病毒体提取RNA、用DNaseI处理该提取物、通过RT-PCR扩增RT的全长编码区(氨基酸1-56)、纯化该PCR产物并利用Big Dye terminator kit(v.3.1)在ABI 3100自动化DNA测序仪上(Applied Biosystems，Foster City，Calif.)对PCR产物进行测序来确定原种病毒的基因型。对MT-2细胞、P4/R5细胞或PBM细胞，该病毒原种的50％组织培养感染剂量(TCID₅₀)利用三倍终点稀释试验(6孔/稀释度)进行测定，并利用Reed和Muench的方程进行计算(参见Reed LJ，Muench H.Asimple method of estimating fifty per cent endpoints.Am.J.Hyg.1938；27：493-497)。

ii)单复制周期药物敏感性测定：在96孔板中，将2或3倍连续稀释的抑制剂一式三份加入到P4/R5细胞中。用在无药物、病毒感染的对照细胞中产生相对光单位值100的病毒量来感染细胞。感染后48h，向每一个孔中加入细胞裂解缓冲液和发光底物(Gal-Screen；Tropix/Applied Biosystems)，而相对光单位值利用光度计(ThermoLabSystems，Waltham，Mass.)进行测定。病毒复制的抑制计算为抑制50％病毒复制所需的化合物浓度(EC₅₀)。

iii)多复制周期药物敏感性测定：在96孔板中，将3倍连续稀释的抑制剂一式三份加入到MT-2细胞中。细胞以0.01的感染复数进行感染，如通过终点稀释在MT-2细胞中所测定的。在感染后第7天，收集培养上清液并用0.5％Triton X-100处理。利用商品化的酶联免疫吸附分析(DuPont，NEN Products，Wilmington，Del.)测定上清液中的p24抗原浓度。EC₅₀值如前所述进行计算。

iv)PBM细胞中的药物敏感性测定：通过Ficoll-Hypaque不连续梯度离心从健康血清阴性供者分离PBM细胞，如前所述(参见Schinazi RF，Cannon DL，Arnold BH，Martino-Saltzman D.Combinations of isoprinosine and 3′-azido-3′-deoxythymidine inlymphocytes infected with human immunodeficiency virus type 1.Antimicrob.Agents Chemother.1988；32：1784-1787；Schinazi RF，Sommadossi JP，Saalmann V，Cannon DL，Xie MY，Hart GC，SmithGA.Hahn E.F.Activities of 3′-azido-3′-deoxythymidine nucleotidedimers in primary lymphocytes infected with human immunodeficiencyvirus type 1.Antimicrob.Agents Chemother.1990；34：1061-1067)。使用前，细胞用植物凝集素A(PHA，Difco，Sparks，MD)刺激2-3天。批量进行感染1h，培养瓶(T25)分析为100TCID50/1×10⁷个细胞，或者24孔板分析为200TCID50/6×10⁷个细胞/孔。将细胞加入含10倍连续稀释的测试化合物的培养板或培养瓶中。在感染后第5天，收集培养上清液并用0.5％Triton X-100处理。上清液中的p24抗原浓度如上所述进行测定。EC₅₀和抗性倍数值如上所述进行计算。

v)细胞毒性测定：评估所有APNs对P4/R5细胞、MT-2细胞以及未感染的PHA刺激的人PBM细胞的潜在毒性作用。将对数期P4/R5、MT-2和PHA刺激的人PBM细胞以5×10³至5×10⁴个细胞/孔接种在含该测试药物的10倍连续稀释液的96孔细胞培养板中。将该培养物孵育2-4天，然后向每个孔中加入3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)染料溶液(Promega，Madison，WI)并孵育过夜。用终止增容溶液(Promega，Madison，WI)来终止反应，并将培养板在570nm的波长读数。中位50％细胞毒性浓度(CC₅₀)利用中位有效法从浓度-效应曲线而确定。

实施例17

评估APNs抗耐药性HIV的活性

进一步评价在上文已鉴定为与其亲本类似物相比具有改善的活性且更少的细胞毒性的类似物的抗一组耐药性病毒的活性。这允许阐明新型类似物的交叉耐药谱并与已针对3’-叠氮基-ddA和3’-叠氮基-ddG测定的耐药性进行比较。本研究中采用的耐药性病毒包括HIV-1_K65R、HIV-1_K70E、HIV-1_L74V、HIV-1_M184V、HIV-1_AZT2、HIV-1_AZT3、HIV-1_AZT7、HIV-1_AZT9、HIV-1_Q151M和HIV-1_69插入。这些病毒的基因型如上所述，并且提供在图1中。所有这些突变病毒均在我们的HIV-1xxLAI克隆中产生。

实施例18

评估APNs针对耐药性HIV的活性

i)病毒和药物敏感性测定：病毒原种如上所述进行制备。药物敏感性测定利用单和多复制周期试验而实施，上文也已经阐述。病毒复制的抑制计算为抑制50％病毒复制所需的化合物浓度(EC₅₀)。抗性倍数值通过突变HIV-1的EC₅₀除以WT HIV-1的EC₅₀而确定。

ii)统计分析：为了确定抗性倍数值是否具有统计学显著性，将来自至少3次独立实验的EC₅₀值进行log10转化，并通过SigmaStat软件(Jandel Scientific)利用两样本学生t(Student’s t)检验进行比较。低于0.05的P值认为具有统计学显著性。

为了进一步表征这些核苷的活性，评估了3’-叠氮基-ddA和3’-叠氮基-2’，3’-ddG针对一组突变病毒的活性。该组突变病毒包括含K65R。L74V(HIV-1_L74V)。M184V(HIV-1_M184V)的重组病毒，TAMS的不同组合(例如M41L/L210W/T215Y(HIV-1_AZT3)，M41L/D67N/K70R/T215F/K219Q(HIV-1_AZT7)或M41L/D67N/K70R/L210W/T215Y/K219Q(HIV-1_AZT9)，以及多重NRTI耐药复合体(例如，A62V/V75I/F77L/F116Y/Q151M(HIV-1_Q151M)或M41L/69SS/L210W/T215Y(HIV-1_69插入))。结果在图13中示出，表明3’-叠氮基-ddA和3’-叠氮基-ddG均具有抗含K65R、L74V或M184V突变的病毒的活性。与AZT相比，这两种化合物还具有抗所有含TAM病毒的显著活性。例如，HIV-1AZT7具有对AZT＞500抗性倍数，然而该病毒对3’-叠氮基-ddA和3’-叠氮基-ddG均低于3.5抗性倍数。然而，3’-叠氮基-ddA和3’-叠氮基-ddG对HIV-1_Q151M的活性均较弱，并且3’-叠氮基-ddG还丧失了抗HIV-1_69插入的活性。

实施例19

评估通过突变HIV-1RTs进行的APN核苷酸的掺入和切除

i)酶：在本研究使用下列突变的HIV-1RT酶：K65R RT、K70ERT、L74V RT、M184V RT、AZT2 RT、AZT3 RT、Q151M RT和69插入RT。AZT2、AZT3、Q151M和69插入RT的基因型等同于图12中描述的那些。构建用于这些突变RTs中的每一种的E.coli蛋白表达载体，并如前所述进行蛋白表达和纯化。如上所述测定蛋白浓度和活性位点浓度。

ii)核苷酸掺入的动力学分析：前稳态动力学分析用来测定每一种新型APN-TPs对于K65R、K70E RT、L74V RT、M184V RT和Q151M RT的动力学参数Kd和kpol。如上所述进行实验设计和数据分析。

iii)切除测定：ATP介导的从链终止模板/引物磷酸解切除该新型类似物利用WT RT、AZT2RT、AZT3RT和69插入RT来实施。上面描述的20个核苷酸的DNA引物5’-末端标记[γ32P]-ATP，然后与适当的57个核苷酸的DNA模板退火。该引物的3’-末端通过与WT RT和100μM适当的修饰核苷酸类似物一起在37℃孵育30min来进行链终止。该³²p-标记的、链终止的21核苷酸引物通过在7M尿素-16％丙烯酰胺变性凝胶电泳后提取适当的条带而被进一步纯化。纯化的链终止引物随后再次退火至适当的DNA模板以用于磷酸解实验中。通过将300nM(活性位点)WT或突变RT与60nM感兴趣的链终止T/P复合体在50mM Tris-HCl pH 8.0，50mM KCl中一起孵育来实现磷酸解去除APN-MP。通过加入3.0mM ATP和10mM MgCl₂启动反应。整个反应过程中始终存在无机焦磷酸酶(0.01U)。孵育一定时间后，从反应管中取出部分并用等体积的凝胶加样缓冲液(98％去离子甲酰胺，10mM EDTA以及1mg/mL溴酚蓝和1mg/mL二甲基蓝)淬灭。通过变性凝胶电泳来分离产物，并利用Bio-Rad GS525分子成像仪同时分析底物的消失以及产物的形成。将数据拟合于下列单指数方程以确定ATP介导切除的表观速率(kATP)：[product]＝A[exp(-kATPt)]，其中A表示产物形成的幅度。死端式(dead-end)复合体的形成如前述来确定(参见MeyerPR，Matsuura SE，Mian AM，So AG，Scott WA.A mechanism of AZTresistance：an increase in nucleotide-dependent primer unblocking bymutant HIV-1 reverse transcriptase.Mol Cell.1999；4：35-43；Sluis-Cremer N，Arion D，Parikh U，Koontz D，Schinazi RF，MellorsJW，Parniak MA.The 3′-azido group is not the primary determinant of3′-azido-3′-deoxythymidine(AZT)responsible for the excisionphenotype of AZT-resistant HIV-1.J Biol Chem.2005；280：29047-52)。

实施例20

HepG2细胞中的线粒体毒性测定：

i)APNs对细胞生长和乳酸产生的影响：通过在0μM、0.1μM、1μM、10μM和100μM药物存在的情况下孵育细胞来测定APNs对HepG2细胞生长的影响。将细胞(5×10⁴/孔)平铺在12孔细胞培养皿上，含非必需氨基酸并补充10％胎牛血清、1％丙酮酸钠和1％青霉素/链霉素的最低必需培养基中，并在37℃下孵育4天。孵育结束时，利用血细胞计数仪测定细胞数量。为了测量核苷酸类似物对乳酸生成的影响，稀释来自原种培养的HepG2细胞并以每孔2.5×10⁴个细胞平铺在12孔培养板中。加入不同浓度(0μM，0.1μM，1μM，10μM和100μM)的核苷酸类似物，并将培养物在37℃下在湿润的5％CO₂气氛中孵育4天。在第4天时，测定每孔中的细胞数量并收集培养基。过滤该培养基，并利用乳酸比色分析(Sigma-Aldrich)测定培养基中的乳酸含量。由于乳酸产物可认为是损坏线粒体功能的一个标志物，因此在APN类似物存在的情况下在细胞生长中检测的乳酸生成的增加水平将指示药物诱导的细胞毒性效应。

ii)APNs对线粒体DNA合成的影响：已经开发了一种准确定量线粒体DNA含量的实时PCR分析(参见Stuyver LJ，Lostia S，Adams M，Mathew JS，Pai BS，Grier J，Tharnish PM，Choi Y，ChongY，Choo H，Chu CK，Otto MJ，S chinazi RF.Antiviral activities andcellular toxicities of modified 2′，3′-dideoxy-2′，3′-didehydrocytidineanalogues.Antimicrob.Agents Chemother.2002；46：3854-60)。该分析用于本申请中描述的确定核苷类似物对线粒体DNA含量影响的所有研究中。在该分析中，将低代数HepG2细胞以5,000个细胞/孔接种在包被胶原的96孔板中。将APN类似物加入到培养基中以获得0μM、0.1μM、10μM和100μM的最终浓度。在培养的第7天，通过利用商业上可获得的柱子(RNeasy 96kit；Qiagen)来制备细胞核酸。这些试剂盒同时纯化RNA和DNA，因此从柱子洗脱总核酸。通过用于目标扩增和参照扩增的合适引物和探针，利用多重Q-PCR程序从5μl的洗脱的核酸中扩增线粒体细胞色素C氧化酶亚单位II(COXII)基因以及β-肌动蛋白或rRNA基因。对于COXII，分别采用下列正义引物、探针和反义引物：5′-TGCCCGCCATCATCCTA-3′，5′-四氯-6-羧基荧光素-TCCTCATCGCCCTCCCATCCC-TAMRA-3′和5′-CGTCTGTTATGTAAAGGATGCGT-3′。对于β-肌动蛋白基因的外显子3(GenBank登录号E01094)，正义引物、探针和反义引物分别为：5′-GCGCGGCTACAGCTTCA-3′，5′-6-FAMCACCACGGCCGAGCGGGATAMRA-3′和5′-TCTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′。用于rRNA基因的引物和探针从Applied Biosystems购得。由于所有基因均获得相同的扩增效率，因此采用比较CT法来研究线粒体DNA合成的可能抑制。比较CT法采用运算公式，其中目标(COXII基因)的量对内源性参照(β-肌动蛋白或rRNA基因)的量进行标准化，并且是相对于校准值(第7天时的一个无药对照)。该方法的运算公式以2-ΔΔCT给出，其中ΔΔCT是(平均目标测试样品的CT-目标对照的CT)-(平均参考测试的CT-参考对照的CT)(参见Johnson MR，K Wang，JB Smith，MJ Heslin，RB Diasio.Quantitation of dihydropyrimidinedehydrogenase expression by real-time reverse transcriptionpolymerase chain reaction.Anal.Biochem.2000；278：175-184)。药物存在时生长的细胞中线粒体DNA含量的下降将指示线粒体毒性。

iii)电子显微镜形态评估：NRTI诱发的毒性已表明可引起线粒体的形态变化(例如，嵴丧失，基质溶出和肿胀以及脂滴形成)，其可利用透射电子显微镜通过超结构分析来观察(参见Cui L，Schinazi RF，Gosselin G，Imbach JL.Chu CK，Rando RF，RevankarGR，Sommadossi JP.Effect of enantiomeric and racemic nucleosideanalogues on mitochondrial functions in HepG2 cells.Biochem.Pharmacol.1996；52：1577-1584；Lewis W，Levine ES，GriniuvieneB，Tankersley KO，Colacino JM，Sommadossi JP，Watanabe KA，Perrino FW.Fialuridine and its metabolites inhibit DNA polymerasegamma at sites of multiple adjacent analog incorporation，decreasemtDNA abundance，and cause mitochondrial structural defects incultured hepatoblasts.Proc Natl Acad Sci U S A.1996；93：3592-7；Pan-Zhou XR，L Cui，XJ Zhou，JP Sommadossi，VM Darley-Usmar.Differential effects of antiretroviral nucleoside analogs onmitochondrial function in HepG2 cells.Antimicrob.Agents Chemother.2000，44，496-503)。例如，与10μM非阿尿苷(fialuridine)(FIAU；1，2′-脱氧-2′-氟-1-D-阿拉伯呋喃糖基-5-碘-尿嘧啶)一起孵育的HepG2细胞的电子显微镜照片示出存在线粒体增大以及与线粒体功能障碍相一致的形态变化。为了确定APN是否促进线粒体中的形态变化，在0μM、0.1μM、1μM、10μM和100μM APN类似物存在的情况下，将HepG2细胞(2.5×10⁴个细胞/mL)接种在组织培养皿中(35mm×10mm)。在第8天，如前所述固定细胞、脱水并包埋在Eponas中。制备薄切片，用醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色，随后利用透射电子显微镜进行检查。

实施例21

Neuro2A细胞中的线粒体毒性测定

为了评估APN核苷类似物引起神经毒性的可能性，采用小鼠Neuro2A细胞(American Type Culture Collection 131)作为模式系统(参见Ray AS，Hernandez-Santiago BI，Mathew JS，Murakami E，Bozeman C，Xie MY，Dutschman GE，Gullen E，Yang Z，HurwitzS，Cheng YC，Chu CK，McClure H，Schinazi RF，Anderson KS.Mechanism of anti-human immunodeficiency virus activity ofbeta-D-6-cyclopropylamino-2′，3′-didehydro-2′，3′-dideoxyguanosine.Antimicrob.Agents Chemother.2005，49，1994-2001)。利用基于3-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑染料的分析，测量抑制50％细胞生长所需的浓度(CC₅₀)，如前所述。在确定的药物浓度下，如上所述进行细胞乳酸和线粒体DNA水平的干扰。在所有实验中，ddC和AZT均被用作对照核苷类似物。

实施例22

3’-叠氮基-2’，3’-双脱氧嘌呤核苷酸类似物对线粒体DNA聚合酶γ的DNA聚合酶和核酸外切酶活性的影响

i)人聚合酶γ的纯化：聚合酶γ的重组大和小亚单位如前所述进行纯化(参见Graves SW，Johnson AA，Johnson KA.Expression，purification，and initial kinetic characterization of the large subunit ofthe human mitochondrial DNA polymerase.Biochemistry.1998，37，6050-8；Johnson AA，Tsai Y，Graves SW，Johnson KA.Humanmitochondrial DNA polymerase holoenzyme：reconstitution andcharacterization.Biochemistry.2000；39：1702-8)。蛋白浓度利用分光光度计在280nm进行测定，其中用于聚合酶γ大和小亚单位的消光系数分别为234,420和71,894M-1cm-1。

ii)核苷酸掺入的动力学分析：进行前稳态动力学分析以测定对APN-TP和天然dNTP底物而言，DNA聚合酶γ的掺入催化效率(k/K)。这允许确定该酶掺入修饰类似物的相对能力并预测毒性。通过DNA聚合酶γ进行的APN核苷酸掺入的前稳态动力学分析基本上如前所述来进行(参见Murakami E，Ray AS，Schinazi RF，Anderson KS.Investigating the effects of stereochemistry onincorporation and removal of 5-fluorocytidine analogs by mitochondrialDNA polymerase gamma：comparison of D-and L-D4FC-TP.AntiviralRes.2004，62，57-64；Feng JY，Murakami E，Zorca SM，JohnsonAA，Johnson KA，Schinazi RF，Furman PA，Anderson KS.Relationshipbetween antiviral activity and host toxicity：comparison of theincorporation efficiencies of2′，3′-dideoxy-5-fluoro-3′-thiacytidine-triphosphate analogs by humanimmunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase and humanmitochondrial DNA polymerase.Antimicrob Agents Chemother.2004，48，1300-6)。简单而言，将在50mM Tris-HCl，100mM NaCl，pH 7.8中的聚合酶γ的大(250nM)和小(1.25mM)亚单位以及60nM DNA模板/引物的预孵育混合物加入到包含MgCl₂(2.5mM)和不同浓度的核苷酸类似物的溶液中。反应如前所述淬灭和分析。将数据拟合于上述相同的方程。

iii)用于人聚合酶γ3′5′核酸外切酶活性的分析：人聚合酶γ的核酸外切酶活性通过在没有dNTP的情况下测量切割产物的形成速率来研究。通过将MgCl₂(2.5mM)加入到在50mM Tris-HCl，100mM NaCl，pH 7.8中的聚合酶γ大亚单位(40nM)、小亚单位(270nM)和1,500nM链终止模板/引物的预孵育混合物中来启动反应，并在指定的时间点用0.3M EDTA淬灭。所有反应混合物均在20％变性聚丙烯酰胺测序凝胶(8M尿素)上分析，在Bio-Rad GS-525分子成像系统上成像，并用Molecular Analyst(Bio-Rad)定量。将较早时间点形成的产物作为时间的函数而作图。数据通过SigmaPlot(Jandel Scientific)利用线性回归而拟合。将线的斜率除以反应中的活性酶浓度来计算核酸外切酶活性的kexo(参见Murakami E，Ray AS，Schinazi RF，Anderson KS.Investigating the effects ofstereochemistry on incorporation and removal of 5-fluorocytidineanalogs by mitochondrial DNA polymerase gamma：comparison of D-and L-D4FC-TP.Antiviral Res.2004；62：57-64；Feng JY，MurakamiE，Zorca SM，Johnson AA，Johnson KA，Schinazi RF，Furman PA，Anderson KS.Relationship between antiviral activity and host toxicity：comparison of the incorporation efficiencies of2′，3′-dideoxy-5-fluoro-3′-thiacytidine-triphosphate analogs by humanimmunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase and humanmitochondrial DNA polymerase.Antimicrob Agents Chemother.2004；48：1300-6)。

实施例23

骨髓细胞毒性的分析

原代人骨髓单核细胞商业上获自Cambrex Bioscience(Walkersville，MD)。CFU-GM分析利用双层软琼脂在50单位/mL人重组粒细胞/巨细胞克隆刺激因子存在的情况下实施，而BFU-E分析利用含1单位/mL促红细胞生成素的甲基纤维素基质(参见Sommadossi JP，Carlisle R.Toxicity of 3’-azido-3’-deoxythymidineand 9-(1，3-dihydroxy-2-propoxymethyl)guanine for normal humanhepatopoietic progenitor cells in vitro.Antimicrob.Agents Chemother.1987；31：452-454；Sommadossi，JP，Schinazi，RF，Chu，CK，and Xie，MY.Comparison of Cytotoxicity of the(-)and(+)enantiomerof 2’，3’-dideoxy-3’-thiacytidine in normal human bone marrowprogenitor cells.Biochem.Pharmacol.1992；44：1921-1925)。每一个实验均在来自3个不同供者的细胞中一式两份进行。AZT用作阳性对照。细胞在该化合物存在的情况下在37℃下用5％CO₂孵育14-18天，并利用倒置显微镜计数大于50个细胞的克隆，以确定IC₅₀。50％抑制浓度(IC₅₀)通过最小二乘法线性回归分析药物浓度的对数值与BFU-E生存分数而获得。统计分析通过用于独立非成对样本的学生t检验来进行。

实施例24

抗HBV分析

所述化合物的抗HBV活性通过在四环素的控制下处理携带野生型HBV的AD-38细胞系来确定(参见Ladner S.K.，Otto M.J.，Barker C.S.，Zaifert K.，Wang G.H.，Guo J.T.，Seeger C.&King R.W.Antimicrob.Agents Chemother.1997，41，1715-20)。去除培养基中的四环素[Tet(-)]导致产生HBV。将来自用所述化合物处理的细胞的培养上清液中的HBV水平与未处理对照进行比较。并且维持含四环素[Tet(+)]的对照培养物，以确定HBV表达的基础水平。包括3TC作为阳性对照。

实施例25

细胞毒性分析

所述化合物的毒性在Vero，人PBM，CEM(人类淋巴母细胞)，MT-2和HepG2细胞中加以评价，如前所述(参见Schinazi R.F.，Sommadossi J.-P.，Saalmann V.，Cannon D.L.，Xie M.-Y.，Hart G.C.，Smith G.A.&Hahn E.F.Antimicrob.Agents Chemother.1990，34，1061-67)。包括环己酰亚胺作为阳性细胞毒性对照，并且包括暴露于溶剂的未处理细胞作为阴性对照。细胞毒性IC50利用前述的中位有效法从浓度-效应曲线而获得(参见Chou T.-C.&Talalay P.Adv.Enzyme Regul.1984，22，27-55；Belen’kii M.S.&Schinazi R.F.Antiviral Res.1994，25，1-11)。

实施例26

腺苷脱氨酶测定

为了确定通过腺苷脱氨酶进行的APN核苷脱氨的倾向，将化合物与商业上可获得的纯化酶一起孵育，随后对反应进行分光光度计测定。反应条件为50mM磷酸钾，pH 7.4以及50μM APN核苷(0.5mL)，25℃。0.002单位酶的反应时间为7分钟，并且0.2单位酶的反应时间为120分钟。(腺苷脱氨酶的单位定义为：在pH 7.5和25℃下，一个单位每分钟将1.0μmol腺苷脱氨为肌苷。)脱氧腺苷是阳性对照，其在给定的条件下利用0.002单位的酶在7分钟内脱氨59％。脱氧鸟苷是阴性对照。在265nm或285nm处测量光密度。将实验开始与结束之间的光密度差异除以消光系数，然后乘以反应体积，以确定转化为产物的底物摩尔数。产物摩尔数除以相当于100％完全反应的底物摩尔数然后乘以100从而获得脱氨百分比。检测限值为0.001光密度单位。

实施例27

筛选化合物56的抗性病毒

将外周血单核(PBM)细胞¹以1×10⁷个细胞接种在两个含5mL的RPMI-1640(Mediatech Inc.，Herndon，VA)的T25培养瓶中，而RPMI-1640包含100mL热灭活的胎牛血清(Hyclone，Logan，Utah)，83.3IU/mL青霉素，83.3μg/mL链霉素(Mediatech Inc.，Herndon，VA)，1.6mM L-谷氨酰胺(Mediatech Inc.，Herndon，VA)，0.0008％DEAE-葡聚糖(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)，0.047％碳酸氢钠和26IU/mL重组白细胞介素-2(Chiron Corporation，Emeryville，CA)，两个培养瓶中一个是对照(未处理)，一个用药物进行处理。

天然PBM细胞用0.1μM的化合物56处理1小时，然后以100×TCID₅₀接种HIV-1_LAI ²。处理的PBM细胞组和对照未处理PBM细胞组均允许感染1小时，向每个培养瓶中另外加入5mL RTU培养基，并在37℃孵育6天。

在第6天，从每一个培养瓶中取出1mL上清液，并以9,740g在4℃下离心2小时。随后将该病毒沉淀再悬浮在溶解缓冲液中用于RT分析。利用商品化QIAmp Viral RNA mini kit(Quiagen)从培养上清中分离总RNA。测序在对照病毒和化合物56处理的病毒之间平行进行，以确定如果该病毒表现出耐药，则所应用的药物压力能否在数周内产生任何突变。

¹PBM细胞通过ficoll-hypaque(Histopaque 1077：Sigma)密度梯度离心从获自American Red Cross(Atlanta，GA)的血沉棕黄层(Buffy coats)中分离，该血沉棕黄层来自健康的血清阴性供者。使用前2-3天，细胞用在500mL的RPMI-1640(Mediatech Inc.，Herndon，VA)中的3μg/mL植物凝集素A(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)活化，其中RPMI-1640包含100mL热灭活的胎牛血清(Hyclone，Logan，Utah)，83.3IU/mL青霉素，83.3ug/mL链霉素，1.6mM L-谷氨酰胺(Mediatech Inc.，Herndon，VA)。

²HIV-1/LAI获自疾病控制和预防中心(the Center for DiseaseControl and Prevention)，该病毒用于耐药池，且感染复数(MOI)为0.1，如通过限制性稀释法在PBM细胞中测定的，并经筛选来启动感染池。

计算经处理的病毒池相对于未处理的病毒池的抑制百分比，并在处理前每周密切监测。在47周内，病毒池的筛选压力已经从0.1μM增至3.5μM(EC₅₀值的40倍)。

V75I早在第21周在化合物56处理的病毒池中筛选到。在大约第41周，F77L和H221Y也在处理的病毒池中观察到。

实施例28

三磷酸核苷类似物的合成

三磷酸核苷类似物利用Ludwig和Eckstein′s法(Ludwig J，Eckstein F.“Rapid and efficient synthesis of nucleoside 5′-O-(1-thiotriphosphates)，5′-triphosphates and2′，3′-cyclophosphorothioates using 2-chloro-4H-1，3，2-benzodioxaphosphorin-4-one”J.Org.Chem.1989，54 631-5)由相应的核苷而合成。粗三磷酸核苷类似物将利用HiLoad 26/10Q Sepharose Fast FlowPharmacia column和梯度TEAB缓冲液(pH 7.0)通过FPLC而纯化。该产物将通过UV分光光度计、质子和磷NMR、质谱和HPLC来表征。

结论综述

图1是xxLAI病毒的基因型的图示。所列出的全部突变病毒均在HIV-1xxLAI克隆中产生。

图2A-2B是3’-叠氮基-2’，3’-ddA和3’-叠氮基-2’，3’-ddG对一组耐药性HIV-1的抗HIV活性的图示。数据表明，3’-叠氮基-ddA和3’-叠氮基-ddG均对含K65R、L74V或M184V突变的病毒具有活性。与AZT相比，两种化合物还对所有含TAM的病毒具有活性。

图4A-4B是通过腺苷脱氨酶进行的脱氨的图示。作为体外腺苷脱氨酶底物的化合物可在体内转化为6-氧代核苷。例如，脱氧腺苷在体外被转化为脱氧肌苷，并预期会在体内转化为脱氧肌苷。

图5是化合物56抗性病毒在47周内的发展的图示。V75I早在第21周在化合物56处理的病毒池中筛选出。在大约第41周，F77L和H221Y也在处理的病毒池中观察到。

图6是总结了用化合物56处理接种HIV-1_LAI的PBM细胞以及所得到的筛选突变的图示。化合物56处理的池首先早在第21周产生V75V/I，并且在来自化合物56的选择压力增加后，观察到了F77L和H221Y。

虽然前述说明书通过为了说明的目的提供的实例教导了本发明的原理，但应该理解，本发明的实施涵盖所有如在所附权利要求书的范围内的常见改变、调整和/或修改以及它们的等价物。

Claims (20)

1.一种式(I)的化合物：

或者其药用盐或药物前体，其中：

X是O、CH₂、S、SO₂、NH、P＝O(OH)、C＝CH₂，C＝CHF或C＝CF₂；

R¹是氢、烷基、卤代烷基(包括CH₂F、CF₃)、卤素、叠氮基、氰基、硝基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、链烯基、炔基、卤代链烯基(包括Br-乙烯基)、烷氧基、链烯氧基、烷硫基、酰氧基、烷氧基酰基、烷基羰基、酰基硫基或酰氨基；

R²是H，磷酸酯(包括单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或稳定的磷酸酯药物前体)，磷硫酰，用烷基(包括C₁-C₆)、链烯基(包括C₂-C₆)、炔基(包括C₂-C₆)、芳基(包括C₆-C₁₀)或其他药用离去基团取代的羰基，当体内给药时其能够提供一种化合物，其中R²是H或磷酸酯、磺酸酯(包括烷基或芳烷基磺酰基)、苄基(其中苯基基团可选地被如上文给出的芳基定义中所描述的一种或多种取代基取代)、脂质(包括磷脂)、氨基酸、肽或胆固醇，

其中，所述碱基是通式(III)的嘌呤或修饰的嘌呤：

其中：

W、W¹、W²和W³均独立地是N、CH、CF、CCl、CBr、CI、CCN、CCH₃、CCF₃、CC(O)NH₂、CC(O)NHR’、CC(O)N(R’)₂、CC(O)OH、CC(O)OR’或CR⁵；

R⁵和R⁶均独立地选自H、卤素、CN、N₃、NO₂、OH、NH₂、SH、OR’、NHR’、N(R’)₂、SR’、OCOR’、NHCOR’、N(COR’)COR’、SCOR’、OCOOR’、NHCOR’、CH₂OH、CH₂CN、CH₂N₃、COOH、COOR’、CONH₂、CONHR、CON(R’)₂、CH₂COOH、CH₂COOR’、CH₂CONH₂、CH₂CONHR’、CH₂CON(R’)₂、C_1-6烷基、C_2-6链烯基和C_2-6炔基、C_3-8环烷基、芳基、杂芳基、酰基、芳烷基以及烷芳基；

条件为：如果R¹和R²是H，W是CH，W¹、W²和W³是N，并且R⁶是NH₂或NHR⁷，其中R⁷是酰基，则R⁵不能是C1、Br、I、C_1-6烷氧基、C_3-6环烷氧基、芳氧基、芳基烷氧基、被一种或两种取代基取代的氨基，所述取代基独立地选自C_1-6烷基和C_3-6环烷基或含有至少一个氮原子的4至6元杂环，所述环通过所述氮原子键合于嘌呤碱；并且

条件为：对于其中碱基为式(III)的式(I)，当R⁵是OH时，R⁶不能是NH₂，并且当R⁵是NH₂时，R⁶不能是H；如果R¹和R²是H，则W是CH，W¹、W²和W³是N；并且

每一个R’均独立地为低级烷基(C₁-C₆烷基)，低级链烯基，低级炔基，低级环烷基(C₃-C₆环烷基)芳基，烷芳基或者芳烷基，其中所述基团可以用如上面定义的一种或多种取代基取代，例如羟烷基，氨基烷基和烷氧基烷基，或者

碱基是通式(IV)的嘌呤或修饰的嘌呤：

其中：

W、W²和W³均独立地为N、CCF₃、CC(O)NH₂、CC(O)NHR’、CC(O)N(R’)₂、CC(O)OH、CC(O)OR’或CR⁵；

W⁴独立地为O、S、NH或NR’；

每个R⁵和R⁶均独立地选自H、卤素、CN、N₃、NO₂、OH、NH₂、SH、OR’、NHR’、N(R’)₂、SR’、OCOR’、NHCOR’、N(COR’)COR’、SCOR’、OCOOR’、NHCOR’、CH₂OH、CH₂CN、CH₂N₃、COOH、COOR’、CONH₂、CONHR、CON(R’)₂、CH₂COOH、CH₂COOR’、CH₂CONH₂、CH₂CONHR’、CH₂CON(R’)₂、C_1-6烷基、C_2-6链烯基、C_2-6炔基、C_3-8环烷基、芳基、杂芳基、酰基、芳烷基和烷芳基；以及

每一个R’均独立地为C_1-6烷基、C_3-6环烷基、芳基、烷芳基或芳烷基。

2.一种式(II)的化合物：

或者其药用盐或药物前体，其中：

X是O、CH₂、S、SO₂、NH、P＝O(OH)、C＝CH₂、C＝CHF或C＝CF₂；

Y是O或S；

Z是CH₂、CH₂CH₂、CH₂O、CH₂S或CH₂NH(其中，碳原子连接至磷原子)；

R¹是氢，烷基，卤代烷基，卤素，叠氮基，氰基，硝基，氨基，烷基氨基，二烷基氨基，链烯基，炔基，卤代链烯基，烷氧基，链烯氧基，烷硫基，酰氧基，烷氧基酰基，烷基羰基，酰基硫基或酰氨基；

R³和R⁴独立地为氢、磷酸酯、二磷酸酯或一种在肝细胞中优先去除以生成相应的H基团的基团，其中术语“在肝细胞中优先去除”表示所述基团的至少部分在肝细胞中以高于同一基团在非肝细胞中去除的速率的速率被去除，或者可去除的基团是一种可以通过还原酶、酯酶、细胞色素P450或其他酶加以去除的药用基团；

其中，所述碱基是通式(III)的嘌呤或修饰的嘌呤：

其中：

每一个W、W²和W³均独立地为N、CH、CF、CCl、CBr、CI、CCN、CCH₃、CCF₃、CC(O)NH₂、CC(O)NHR’、CC(O)N(R’)₂、CC(O)OH、CC(O)OR’或CR⁵；

每一个R⁵和R⁶均独立地选自H、卤素(F、Cl、Br、I)、CN、N₃、NO₂、OH、NH₂、SH、OR’、NHR’、N(R’)₂、SR’、OCOR’、NHCOR’、N(COR’)COR’、SCOR’、OCOOR’、NHCOR’、CH₂OH、CH₂CN、CH₂N₃、COOH、COOR’、CONH₂、CONHR、CON(R’)₂、CH₂COOH、CH₂COOR’、CH₂CONH₂、CH₂CONHR’、CH₂CON(R’)₂、C_1-6烷基、C_2-6链烯基和C_2-6炔基、C_3-8环烷基、芳基、杂芳基、酰基、芳烷基、和烷芳基；

每一个R’均独立地为C_1-6烷基、C_3-6环烷基、芳基、烷芳基或芳烷基，或者

其中所述碱基是通式(IV)的嘌呤或修饰的嘌呤：

其中：

每一个W、W²和W³均独立地为N、CH、CF、CCl、CBr、CI、CCN、CCH₃、CCF₃、CC(O)NH₂、CC(O)NHR’、CC(O)N(R’)₂、CC(O)OH、CC(O)OR’或CR⁵；

W⁴独立地为O、S、NH或NR’；

每一个R⁵和R⁶均独立地选自H、卤素、CN、N₃、NO₂、OH、NH₂、SH、OR’、NHR’、N(R’)₂、SR’、OCOR’、NHCOR’、N(COR’)COR’、SCOR’、OCOOR’、NHCOR’、CH₂OH、CH₂CN、CH₂N₃、COOH、COOR’、CONH₂、CONHR、CON(R’)₂、CH₂COOH、CH₂COOR’、CH₂CONH₂、CH₂CONHR’、CH₂CON(R’)₂、C_1-6烷基、C_2-6链烯基、C_2-6炔基、C_3-8环烷基、芳基、杂芳基、酰基、芳烷基、和烷芳基；

每一个R’均独立地为C_1-6烷基、C_3-6环烷基、芳基、烷芳基、或芳烷基。

3.根据权利要求1-2中任一项所述的化合物，其中，所述化合物为β-L-或β-D构型或者它们的外消旋混合物。

4.一种用于治疗感染HIV-1或HIV-2的宿主的方法，包括将有效量的根据权利要求1-3中任一项所述的化合物给予需要该治疗的患者。

5.一种用于预防HIV-1或HIV-2感染的方法，包括将预防有效量的根据权利要求1-3中任一项所述的化合物给予需要该预防的患者。

6.一种用于降低宿主体内HIV-1或HIV-2感染的生物学活性的方法，包括将有效量的根据权利要求1-3中任一项所述的化合物给予需要该治疗的患者。

7.根据权利要求4所述的方法，其中，所述HIV-1或HIV-2感染由包含突变的病毒引起，所述突变选自由TAM突变和M184V突变组成的组。

8.一种用于治疗感染HIV-1或HIV-2的宿主的方法，其包括将有效量的根据权利要求1-3中任一项所述化合物在药用载体内与另一种抗HIV药剂一起给予。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述HIV-1或HIV-2感染由包含突变的病毒引起，所述突变选自由TAM突变和M184V突变组成的组。

10.一种用于预防HIV-1或HIV-2感染的方法，包括将预防有效量的根据权利要求1-3中任一项所述化合物在药用载体内与另一种抗HIV药剂一起给予需要该预防的患者。

11.一种用于治疗感染HBV的宿主的方法，包括将有效量的根据权利要求1-3中任一项所述的化合物给予需要该治疗的患者。

12.一种用于预防HBV感染的方法，包括将预防有效量的根据权利要求1-3中任一项所述的化合物给予需要该预防的患者。

13.一种用于降低宿主体内HBV感染的生物学活性的方法，包括将有效量的根据权利要求1-3中任一项所述的化合物给予需要该治疗的患者。

14.一种用于治疗感染HBV宿主的方法，其包括将有效量的根据权利要求1-3中任一项所述的化合物在药用载体内与另一种抗HBV药剂一起给予。

15.一种用于预防HBV感染的方法，包括将预防有效量的根据权利要求1-3中任一项所述的化合物在药用载体内与另一种抗HBV药剂一起给予需要该预防的患者。

16.一种用于治疗感染HCV的宿主的方法，包括将有效量的根据权利要求1-3中任一项所述的化合物给予需要该治疗的患者。

17.一种用于预防HCV感染的方法，包括将预防有效量的根据权利要求1-3中任一项所述的化合物给予需要该预防的患者。

18.一种用于治疗感染HCV的宿主的方法，其包括将有效量的根据权利要求1-3中任一项所述化合物在药用载体内与另一种抗HCV药剂一起给予。

19.一种治疗HIV-1或HIV-2感染的方法，包括将有效治疗量的3’-叠氮基-ddA、3’-叠氮基-ddG或它们的组合，以及一种或多种另外的抗病毒剂一起给予，其中所述一种或多种另外的抗病毒剂针对TAM突变和/或M184V突变加以选择。

20.一种药物组合物，包括3’-叠氮基-ddA、3’-叠氮基-ddG或它们的组合，和一种或多种针对TAM突变和/或M184V突变选择的另外的抗病毒剂以及药用载体。

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