CN101541965A

CN101541965A - Tlr配体与抗病毒剂的组合物

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Publication number: CN101541965A
Application number: CNA2007800440368A
Authority: CN
Inventors: 乔格·沃尔默; 玛丽昂·朱尔克; 尤金·乌尔曼; 哈拉尔德·德贝拉克; 罗伯特·L·布拉茨勒; 阿兰·维卡里
Original assignee: Coley Pharmaceutical Group Ltd; Coley Pharmaceutical GmbH; Coley Pharmaceutical Group Inc
Current assignee: Coley Pharmaceutical Group Ltd; Coley Pharmaceutical GmbH; Coley Pharmaceutical Group Inc
Priority date: 2006-09-27
Filing date: 2007-09-27
Publication date: 2009-09-23
Also published as: KR20090057468A; EP2068912A2; CA2664156A1; WO2008039538A3; NO20091576L; US20100189772A1; BRPI0719445A2; JP2010504982A; AU2007300378A1; MX2009003403A; WO2008039538A2

Abstract

本发明涉及使用抗病毒剂与TLR配体的组合来治疗病毒感染的方法和产品。本发明还涉及筛查分析、相关产品、试剂盒及体外方法。

Description

TLR配体与抗病毒剂的组合物

技术领域

本发明一般涉及由TLR配体和抗病毒剂构成的组合物，及其在诸如病毒感染治疗和筛查分析的方法中的用途。

背景技术

Toll样受体(TLR)是一族识别与病原体相关的分子模式(PAMP)的高度保守的模式识别受体(PRR)多肽，并且在哺乳动物的先天免疫中起关键作用。目前已经鉴定出了至少十个家族成员，它们被称为TLR1-TLR10。各种TLR的细胞质域由Toll-白细胞介素1受体(TIR)域来表征。见Medzhitov R等，(1998)Mol Cell 2：253-8。TLR对微生物侵袭的识别引发在果蝇和哺乳动物中进化保守(evolutionarily conserved)的信号级联的激活。据报道，含TIR域的衔接蛋白质MyD88与TLRs结合，且将白细胞介素1受体结合激酶(IRAK)和肿瘤坏死因子(TNF)受体结合因子6(TRAF6)补充到所述TLR中。人们认为，MyD88依赖性信号传导途径导致NF-KB转录因子和c-Jun NH₂末端激酶(Jnk)、促分裂素激活的蛋白激酶(MAPK)的激活，这是免疫激活和炎性细胞因子产生的关键步骤。有关综述参见Aderem A等，(2000)Nature 406：782-87和Akira S等，(2004)Nat Rev Immunol 4：499-511。

近来报道了某些低分子量合成化合物，如咪唑并喹啉咪喹莫特(imiquimod)(R-837)和瑞喹莫特(resiquimod)(R-848)，是TLR7和TLR8的配体。见Hemmi H等，(2002)Nat Immunol 3：196-200；Jurk M等，(2002)Nat Immunol 3：499。

从对未甲基化的细菌DNA及其合成类似物(CpG DNA)是TLR9配体的近期发现开始(Hemmi H等，(2000)Nature 408：740-5；Bauer S等，(2001)Proc Natl Acad Sci USA 98，9237-42)，已有报道称某些TLR的配体包括某些核酸分子。近来，已有报道称某些类型的RNA以非序列依赖性或序列依赖性形式具有免疫刺激性。另外，已有报道称这些不同免疫刺激性RNA刺激TLR3、TLR7或TLR8。此外，报道了某些低分子量合成化合物，如咪唑并喹啉咪喹莫特(R-837)和瑞喹莫特(R-848)，是TLR7和TLR8的配体。Hemmi H等，(2002)Nat Immunol 3：196-200；Jurk M等，(2002)Nat Immunol 3：499。近来报道了源自病毒的双链RNA(dsRNA)和dsRNA的合成类似物poly I：C是TLR3的配体。Alexopoulou L等，(2001)Nature 413：732-8。更近一段时间，Lipford与同事公开了某些含G，U的RNA序列是免疫刺激性的，其通过刺激TLR7和TLR8起作用。Heil F等，(2004)Science 303：1526-9和美国专利申请2003/0232074A1。

Heil等人报道了源自HIV-1并与阳离子型脂质DOTAP复合的富含鸟苷和尿苷的硫代磷酸酯ssRNA寡核苷酸刺激树突细胞(DC)和巨噬细胞以分泌α干扰素(IFN-α)、肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素12(IL-12)和白细胞介素6(IL-6)。Heil F等，(2004)Science 303：1526-9。据报道小鼠TLR7会引起富含GU的ssRNA的应答，并且据报道人类TLR8会引起富含GU和富含U的ssRNA的应答。虽然测试了特定的序列，但是没有鉴定出模体。Ibid。

Diebold等近期报道了病毒或合成来源的单链RNA(ssRNA)激活TLR7。Diebold SS等，(2004)Science 303：1529-31。他们报道了源自流感病毒的病毒基因组ssRNA以及polyU会触发浆细胞样树突细胞(pDC)的IFN-α产生。除了polyU没有鉴定出序列特异的模体。小鼠脾和一些短ssRNA寡核苷酸(用于制造短干扰dsRNA的类型)也诱导IFN-α。Ibid。

发明内容

根据本发明，提供了用于预防和/或治疗病毒感染的方法和产品。本发明的一个方面是免疫刺激性寡核苷酸和抗病毒剂的组合物，其中所述抗病毒剂不是C-8取代的鸟苷，并且该抗病毒剂连接至所述免疫刺激性寡核苷酸。

所述免疫刺激性寡核苷酸可以是RNA寡核苷酸(ORN)或DNA寡核苷酸(ODN)。所述DNA寡核苷酸在某些实施方式中是A-类、B-类、C-类、P-类、T-类或E类寡核苷酸，并且可任选地包括至少一个未甲基化的CpG二核苷酸。在其它实施方式中，所述DNA寡核苷酸包括至少三个未甲基化的CpG二核苷酸。所述至少一个、两个或三个未甲基化的CpG二核苷酸可包括磷酸二酯或者类磷酸二酯核苷酸间键(linkage)，且其中所述寡核苷酸包括至少一个稳定的核苷酸间键。在其他实施方式中，所述免疫刺激性寡核苷酸包括嵌合的骨架(chimericbackbone)。

根据本发明的其他方面，提供了免疫刺激性RNA寡核苷酸和抗病毒剂的组合物，其中所述抗病毒剂与所述免疫刺激性RNA寡核苷酸相关联。

所述免疫刺激性寡核苷酸可间接或直接连接到所述抗病毒剂。在一种实施方式中，所述免疫刺激性寡核苷酸和抗病毒剂是同一分子的组成部分。所述抗病毒剂可连接至内部核苷或末端核苷，任选为3’末端核苷或5’末端核苷。

所述组合物在免疫刺激性寡核苷酸和抗病毒剂之间可包括易受核酸酶作用的位点。

在某些实施方式中，所述免疫刺激性寡核苷酸包含至少一个3’-3’键和/或5’-5’键。

所述组合物可包括可药用载体。在某些实施方式中，所述组合物是无菌的。

所述抗病毒剂可以是，例如一种或多种核苷类似物、洛索立宾(loxoribine)、艾沙托立宾(isatoribine)、利巴韦林(ribavirin)、瓦洛皮他宾(valopicitabine)、BILN 2061、VX-950。

在某些实施方式中，所述组合物包括与所述免疫刺激性寡核苷酸一起配制的第二抗病毒剂。所述第二抗病毒剂可连接至所述免疫刺激性寡核苷酸。在其他实施方式中，所述组合物包括容纳所述免疫刺激性寡核苷酸和抗病毒剂的微粒或脂质体。

在某些实施方式中，所述抗病毒剂是C-8取代的鸟苷。所述C-8取代的鸟苷可以结合在所述RNA寡核苷酸内，或者可以连接至所述RNA。在某些实施方式中，所述C-8取代的鸟苷位于所述RNA寡核苷酸的5’末端。在其他实施方式中，所述C-8取代的鸟苷位于所述RNA寡核苷酸5’末端的3’侧相距一个、二个或三个核苷处’。

在某些实施方式中，所述DNA寡核苷酸不是含脱碱基的寡核苷酸或衔接寡核苷酸(adapter oligonucleotide)。

在其他方面，本发明是连接至抗病毒剂的TLR7/8/9配体的组合物。在某些实施方式中，所述TLR7/8/9配体是免疫刺激性寡核苷酸。所述TLR7/8/9配体直接或间接连接至所述抗病毒剂。在某些实施方式中，所述组合物在TLR7/8/9配体和抗病毒剂之间包括易受核酸酶作用的位点。

根据本发明的其他方面，提供了治疗病毒性疾病的方法。所述方法包括向需要这种治疗的受试对象施用有效治疗该病毒性疾病的量的本文所述的本发明组合物。在某些实施方式中，所述病毒性疾病是人类免疫缺陷性病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)或者乙型肝炎病毒(HBV)。所述载体可以是缓冲剂。

在某些实施方式中，所述受试对象对非CpG治疗无应答。在其他实施方式中，所述受试对象对采用抗病毒剂的治疗无应答。

根据本发明的其他方面，提供了能表达抑制性病毒蛋白和TLR的细胞，以及载体的组合物。

在一个实施方式中，所述细胞被TLR报道子构建体(construct)所转染。所述TLR可以是TLR7、TLR8或TLR9。

在另一个实施方式中，所述细胞被抑制性病毒蛋白表达构建体所转染。所述抑制性病毒蛋白可以是例如NS3/4蛋白酶。

在某些实施方式中，所述细胞是来自病毒感染患者的免疫细胞。

在其他实施方式中，所述抑制性病毒蛋白由所述细胞内源性地表达。

根据本发明的其他方面，提供了鉴定免疫刺激性抗病毒组合物的方法。该方法包括使本文所述的细胞与测试化合物接触，并检测细胞因子产生和抗病毒报道子的读数(readout)，其中细胞因子产生的提高和抗病毒报道子读数的提高表明所述测试化合物是免疫刺激性的抗病毒组合物。

在本发明的又一方面，提供了鉴定免疫刺激性抗病毒组合物的方法，包括使本文所述的细胞与测试化合物接触，并检测Th1应答、类Th-1应答或前炎症(pro-inflammatory)细胞因子产生，其中Th1应答、类Th-1应答或前炎症细胞因子产生的提高表明所述测试化合物是免疫刺激性抗病毒组合物。

在本发明的又一方面，提供了鉴定免疫刺激性抗病毒组合物的方法，包括从病毒感染的患者分离免疫细胞，使该细胞与测试化合物接触，并检测细胞因子产生和病毒滴定量，其中Th1细胞因子产生的提高和病毒滴定量的降低表明所述测试化合物是免疫刺激性抗病毒组合物。

在本发明的其他方面，提供了筛查具有抗病毒活性的包含抗病毒剂和免疫刺激性寡核苷酸的分子的方法，包括从病毒感染的患者分离免疫细胞，使该细胞与所述分子接触并检测病毒滴定量，其中病毒滴定量的降低表明所述分子具有抗病毒活性。

在某些实施方式中，所述外周血单核细胞包括树突细胞。该树突细胞可以是浆细胞样树突细胞。

所述接触步骤可以在体外进行，并且所述外周血单核细胞可以是经过培养的。

本发明的另一方面还提供了本发明组合物用于刺激免疫应答的用途。

还提供了制造用于刺激免疫应答的本发明组合物的药物的方法。

根据本发明的某些方面，还提供了治疗癌症的方法。所述方法包括向患有癌症的受试对象施用有效治疗癌症的量的免疫刺激性寡核苷酸与抗病毒剂的组合物。

在本发明的其他方面，包括治疗细菌感染的方法，包括向患有细菌感染的受试对象施用有效治疗细菌感染的量的免疫刺激性寡核苷酸与抗病毒剂的组合物。

在某些实施方式中，所述抗病毒剂连接至所述免疫刺激性寡核苷酸。所述抗病毒剂可以是利巴韦林。所述组合物还可包括C-8取代的鸟苷。

在某些实施方式中，所述免疫刺激性寡核苷酸是RNA寡核苷酸。在其他实施方式中，所述免疫刺激性寡核苷酸是DNA寡核苷酸，诸如A-类、B-类、C-类、P-类、T-类或E类寡核苷酸。所述DNA寡核苷酸包括至少一个未甲基化的CpG二核苷酸。

还提供了本文所述的用于治疗癌症、或者病毒或细菌感染的组合物。

还提供了本文所述的组合物与抗原组合用于制造用于对受试对象进行预防接种的药物的用途。

本发明还包括本文所述的组合物用于制造用于治疗受试对象的癌症、病毒感染或细菌感染的药物的用途。

本发明的每一条限制可包含本发明的各种实施方式。因此，可预期的是，涉及任一要素或要素组合的每一条本发明的限制均能包含在本发明的每个方面之中。本发明并非将其应用局限于在以下描述中阐述的或者在附图中描述的各个部分的构造和布局的细节之中。本发明可具有其它实施方式并且以各种方式得以实践或进行实施。同样，在本文中使用的短语和术语是出于描述的目的而不应当被当作进行限制。本文中“包括”、“包含”或“具有”、“含有”、“涉及”，以及其各种变化方式的使用意指涵盖其后所罗列的条目及其等效方式以及额外的条目。

附图说明

图1是三幅证实8-氧代-rG对ORN-介导的免疫刺激的正影响的示图。将8-氧代-rG修饰的ORN(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：8)引起的细胞因子刺激与对照ORN(SEQ ID NO：11)进行比较。测量细胞因子IFN-α(图1a)，IL-12p40(图1b)和TNF-α(图1c)。x轴是ORN的浓度(单位μM)，y轴为细胞因子浓度(单位pg/ml)。

图2是证实8-修饰的G的正影响取决于在RNA序列中的位置的示图。在ORN的不同位置具有单个8-氧代-rG的ORN(SEQ ID NO：1-4)和未修饰的ORN(SEQ ID NO：8)引起的IFN-α刺激。x轴是ORN的浓度(单位μM)，y轴为IFN-α浓度(单位pg/ml)。

图3是证实在ORN 5’末端的不同的8-修饰的脱氧核苷酸和核糖核苷酸增强免疫刺激活性的示图。将ORN的5’末端具有单个8-氧代-rG/Dg(SEQ ID NO：1，5)、8-溴-dG(SEQ ID NO：7)或7-硫代-8氧代-鸟苷(Immunosine)(艾沙托立宾)(SEQ ID NO：6)(具有5’-5’键)的ORN引起的IFN-α刺激与8-溴-dA修饰的ORN(SEQ ID NO：10)、对照ORNSEQ ID NO：11和未修饰的ORN(SEQ ID NO：8)进行比较(图3)。x轴是ORN的浓度(单位μM)，y轴为IFN-α浓度(单位pg/ml)。

图4是一组描述RBV与CpG ODN(SEQ ID No：14)的组合对T细胞IFN-γ产生的作用(图4B)，以及不存在CpG ODN的情况下RBV对IFN-γ产生的作用(图4A)的示图。

图5是一组描述不依赖在先ODN/RBV处理的RBV对CD3-介导的IFN-γ产生的体外(ex vivo)作用的示图。不依赖在先的体内处理的体外低浓度的RBV提高IFN-γ的水平(图5A)。与CpG ODN(SEQ ID No.14)的组合的作用显示在图5B中。

图6是证实RBV减少SEQ ID NO：14-诱导的IL-10的图像。

图7是一组描述使用源自骨髓(BM)的树突细胞(DC)进行的实验的示图。用SEQ ID NO：14、RBV(1μM、5μM、10μM、100μM或120μM)或者用SEQ ID NO：14及RBV对保持在GM-CSF中的源自BM的DC进行处理，并测试IL-12p40(图7A)、IL-12p70(图7B)。

图8是描述CpG ODN(SEQ ID NO：14)与RBV的组合在小鼠癌症模型中的作用的体内研究结果的示图。

具体实施方式

本发明涉及使用抗病毒剂与诸如免疫刺激性寡核苷酸的TLR配体的组合来治疗病毒感染、细菌感染或癌症的方法和产品。本发明还包括使用所述试剂组合的体外分析。

组合物的联合施用可通过将各组分结合到一个分子中或者结合到输送载体中来实现，该输送载体将它们同时输送到靶细胞。本发明的结合TLR配体和抗病毒剂可用于治疗病毒病症，例如急性病毒感染或慢性病毒感染。急性病毒感染指可以自我消除(self-resolve)的短期感染，通常少于6个月。慢性感染是复发或持续超过6个月时间，并且需要干预来消除的感染。

病毒是小的传染性媒介，其通常含有核酸核心和蛋白质外壳，但不是独立存活的生物体。病毒也可以采取缺失蛋白的传染性核酸的形式。病毒在没有活体细胞时不能存活，其能在活体细胞中进行复制。病毒通过细胞内吞作用或直接注入DNA(噬菌体)而进入特定活体细胞并繁殖，导致疾病。繁殖的病毒随后能被释放并感染其它细胞。一些病毒是含有DNA的病毒，其它是含有RNA的病毒。DNA病毒包括痘病毒(Pox)、疱疹病毒(Herpes)、腺病毒(Adeno)、乳多空病毒(Papova)、细小病毒(Parvo)和嗜肝DNA病毒(Hepadna)。RNA病毒包括微小核糖核酸病毒(Picorna)、杯状病毒(Calici)、Astro、披膜样病毒(Toga)、黄病毒(Flavi)、冠状病毒(Corona)、副粘液病毒(Paramyxo)、正粘病毒(Orthomyxo)、布尼亚病毒(Bunya)、沙粒病毒(Arena)、弹状病毒(Rhabdo)、丝状病毒(Filo)、波尔纳病毒(Borna)、呼肠孤病毒(Reo)和逆转录病毒(Retro)。在一些方面，本发明也意图治疗其中在病程中牵涉到朊病毒的疾病诸如例如动物中的牛海绵状脑病(即疯牛病，BSE)或羊瘙痒症，或人类中的克罗伊茨费尔特-雅各布病。

病毒包括但不限于肠道病毒(包括但不限于小RNA病毒科(picornaviridae)病毒家族，诸如脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、艾柯病毒)、轮状病毒(rotaviruses)、腺病毒和肝炎病毒比如肝炎甲、乙、丙、丁、戊型病毒。已在人类中发现的病毒的具体例子包括但不局限于：逆转录病毒科(Retroviridae)(例如，人类免疫缺陷性病毒，诸如HIV-1(也称为HTLV-III、LAV或HTLV-III/LAV，或HIV-III；以及其它分离株，诸如HIV-LP))；小RNA病毒科(Picornaviridae)(例如，骨髓灰白质炎病毒、甲肝病毒；肠道病毒，人柯萨奇病毒、鼻病毒、艾柯病毒)；Calciviridae(例如，导致胃肠炎的病毒株)；披盖病毒科(Togaviridae)(例如，马脑炎病毒、风疹病毒)；黄病毒科(Flaviviridae)(例如，登革热病毒、脑炎病毒、黄热病毒)；管状病毒科(Coronaviridae)(例如，日冕形病毒)；弹状病毒科(Rhabdoviridae)(例如，水泡性口膜炎病毒、狂犬病病毒)；纤丝病毒科(Filoviridae)(例如，埃博拉病毒)；副粘病毒科(例如，副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒)；正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(例如，流感病毒)；布尼亚病毒科(Bunyaviridae)(例如，汉坦病毒、布尼亚病毒、phlebo病毒和内罗病毒)；沙粒病毒科(Arenaviridae)(出血热病毒)；呼肠孤病毒科(Reoviridae)(例如，呼肠孤病毒、orbiviurses和轮状病毒)；双核糖核酸病毒科(Birnaviridae)；嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)(乙肝病毒)；微细小病毒科(Parvoviridae)(微细小病毒)；乳多泡病毒科(Papovaviridae)(乳头瘤病毒、多形瘤病毒)；腺病毒科(Adenoviridae)(最主要是腺病毒)；疱疹病毒科(Herpesviridae)(单纯疱疹病毒(HSV)1和2、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV))；痘病毒科(Poxviridae)(天花病毒、牛痘病毒、痘病毒)；虹彩病毒科(Iridoviridae)(例如，非洲猪瘟病毒)；及其它病毒急性哮吼伴随病毒、α病毒、考波希肉瘤相关的疱疹疱疹病毒、新城疫病毒、尼帕病毒(Nipahvirus)、诺沃克病毒(Norwalkvirus)、乳头瘤病毒(Papillomavirus)、副流感病毒、禽流感、SARs病毒和西尼罗河病毒。

本发明的方法在一些实施方式中特别有用于治疗人类免疫缺陷性病毒(HIV)和肝炎病毒。HIV，一种逆转录病毒，也称为人类T-细胞淋巴细胞病毒III(HTLV III)，其造成导致称之为AIDS的疾病的恶化。HIV感染并摧毁T细胞，扰乱免疫系统的整体平衡，导致患者与其它感染斗争的能力，使患者有更大的机会患通常为致命的感染。

病毒性肝炎是肝脏的炎症，其可造成肿胀、触痛并且有时候造成肝脏的永久损伤。如果肝脏的炎症持续至少六个月或者更长，则称之为慢性肝炎。已知存在至少五种不同的病毒导致肝炎，包括甲、乙、丙、丁、戊型肝炎。甲型肝炎通常通过被人类粪便污染的食物或饮用水传染。乙型肝炎通常通过体液诸如血液传播。例如，可在分娩时由母亲传染给婴儿、通过性接触、污染的血液输血和针头传播。丙型肝炎很常见并且类似于乙型肝炎，其通常通过输血和污染的针头传播。丁型肝炎大多在为与之共同相关的乙肝病毒携带者的IV药物使用者中发现。戊型肝炎与病毒性甲型肝炎相似，通常与较差的卫生状况有关。

本文所用的术语“受试对象“指人或非人的脊推动物。非人脊推动物包括家畜动物，伴侣动物(companion animals)和实验室动物。非人受试对象还特别包括非人的灵长类以及啮齿动物。非人受试对象还特别包括，但不限于，鸡、马、牛、猪、山羊、狗、猫、豚鼠、仓鼠、貂和兔。在某些事实方式中，所述受试对象是患者。本文所用的“患者”指接受医生、其他保健工作者的护理的受试对象，包括咨询过医生或其他保健工作者，接受其意见或者接受其处方或其他建议的受试对象。患者通常是已经患有病毒感染，或者有发生病毒感染的风险的受试对象。

“患有病毒感染的受试对象”是患有病症或者有患病风险的受试对象，该病症源于传染性病毒对所述受试对象的浅表、局部或全身侵入。有发生病毒感染的风险的受试对象可以是已知暴露于特定病毒的受试对象，例如迁移至已发现该病毒的地方的那些受试对象，居住在已发现该病毒的地方的那些受试对象，以及密切接触已感染病毒的受试对象的那些受试对象。本发明用于治疗患有病毒感染或者有风险发生病毒感染的受试对象的病毒感染的方法包括：向需要这类治疗的受试对象施用有效治疗该病毒感染的量的本发明组合物。

TLR配体-抗病毒剂组合物在某些方面通过同时诱导固有的和抗原特异的免疫应答来发挥作用，该免疫应答导致免疫系统对病毒的多层面的攻击。所述抗病毒剂特异性地攻击所述病毒，而所述免疫刺激性寡核苷酸提供长效的作用。该组合用来减少剂量方案(dosing regimes)、改善依从性并维持治疗、减少紧急状况并改善生活质量。

TLR配体刺激免疫系统来治疗病毒感染。由所述寡核苷酸的免疫刺激能力导致的强烈但平衡的、细胞和体液免疫应答反映了受试对象对抗入侵病毒的天然防御系统。本文针对疾病或病况(condition)所用的术语“治疗”应当指干预这类疾病或病况，以防止或减缓所述疾病或病况的发展，预防、抑制或减缓其进程，阻止其进程，或者消除该疾病或病况。本文所用的术语“抑制”应当指相对于正常情况减少结果或作用。

本发明组合物包括连接至一个或多个抗病毒剂的TLR配体。Toll样受体(TLR)是在哺乳动物的先天免疫性中起关键作用的高度保守的多肽家族。目前鉴定了10个家族成员，命名为TLR1-TLR10。各种TLR的胞质域由Toll-白细胞介素1(IL-1)受体(TIR)域来表征。Medzhitov R等，(1998)Mol cell 2：253-8。TLR对微生物侵袭的识别引发在果蝇和哺乳动物中进化保守(evolutionarily conserved)的信号级联的激活。据报道，含TIR域的衔接蛋白MyD88与TLR结合，且将白细胞介素1受体结合激酶(IRAK)和肿瘤坏死因子(TNF)受体结合因子6(TRAF6)补充到所述TLR中。人们认为，MyD88依赖性信号传导途径导致NF-κB转录因子和c-Jun NH2端激酶(Jnk)、促分裂素激活的蛋白激酶(MAPK)的激活，这是免疫激活和炎性细胞因子产生的关键步骤。有关综述参见Aderem A等，(2000)Nature 406：782-87和Akira S等，(2004)Nat RevImmunol 4：499-511。

据认为TLR在各种组织和各种类型的免疫细胞中差别表达。例如，据报道，人TLR7在胎盘、肺、脾、淋巴结、扁桃体中，以及在浆细胞样前体树突细胞(pDC)上表达。Chuang T-H等，(2000)Eur CytokineNetw 11：372-8)；Kadowaki N等，(2001)JExp Med 194：863-9。据报道，人TLR8在肺、外周血白细胞(PBL)、胎盘、脾、淋巴结中，以及在单核细胞上表达。Kadowaki N等，(2001)JExp Med 194：863-9；ChuangT-H等，(2000)Eur Cytokine Netw 11：372-8。据报道，人TLR9在脾、淋巴结、骨髓、PBL中，以及在pDC和B细胞上表达。KadowakiN等，(2001)JExp Med 194：863-9；Bauer S等，(2001)Proc Natl Acad Sci USA98：9237-42；Chuang T-H等，(2000)Eur Cytokine Netw 11：372-8。

人和小鼠TLR7的核苷酸序列和氨基酸序列是已知的。参见，例如GenBank登记号AF240467、AF245702、NM_016562、AF334942、NM_133211；和AAF60188、AAF78035、NP_057646、AAL73191和AAL73192，本文将它们所有的内容引入作为参考。据报道，人TLR7为1049个氨基酸长度。据报道，小鼠TLR7为1050个氨基酸长度。TLR7多肽包括具有富含亮氨酸的重复区的胞外域、跨膜域和包括TIR域的胞内域。

人和小鼠TLR8的核苷酸和氨基酸序列是已知的。参见，例如GenBank登记号AF246971、AF245703、NM_016610、XM_045706、AY035890、NM_133212；和AAF64061、AAF78036、NP_057694，XP_045706，AAK62677和NP_573475，本文将它们所有的内容引入作为参考。据报道，人TLR8存在至少两种同工型，一种为1041个氨基酸长度，而另一种为1059个氨基酸长度。小鼠TLR8为1032个氨基酸长度。TLR8多肽包括具有富含亮氨酸的重复区的胞外域、跨膜域和包括TIR域的胞内域。

人和小鼠TLR9的核苷酸和氨基酸序列是已知的。参见，例如GenBank登记号NM_017442、AF259262、AB045180、AF245704、AB045181、AF348140、AF314224、NM_031178；和NP_059138、AAF72189、BAB19259、AAF78037、BAB19260、AAK29625、AAK28488和NP_112455，本文将它们所有的内容引入作为参考。据报道，人TLR9存在至少两种同工型，一种为1032个氨基酸长度，而另一种为1055个氨基酸长度。小鼠TLR9为1032个氨基酸长度。TLR9多肽类包括具有富含亮氨酸的重复区的胞外域、跨膜域和包括TIR域的胞内域。

本文所用的术语“TLR信号传导”指与通过TLR的信号传导相关的任何方面的胞内信号传导。本文所用的术语“TLR介导的免疫应答”指与TLR信号传导相关的免疫应答。

TLR7介导的免疫应答是与TLR7信号传导相关的应答。TLR7介导的免疫应答的特征通常在于IFN-α和IFN可诱导细胞因子诸如IP-10和I-TAC的诱导。在TLR7介导的免疫应答中被诱导的细胞因子IL-1α/β、IL-6、IL-8、MIP-1α/β和MIP-3α/β的水平低于在TLR8介导的免疫应答中被诱导的水平。

TLR8介导的免疫应答是与TLR8信号传导相关的应答。该应答进一步的特征在于促炎性细胞因子如IFN-γ、IL-12p40/70、TNF-α、IL-1α/β、IL-6、IL-8、MIP-1α/β和MIP-3α/3的诱导。

TLR9介导的免疫应答是与TLR9信号传导相关的应答。该应答进一步的特征至少在于IFN-γ和IL-12的产生/分泌，不过在水平上低于通过TLR8介导的免疫应答获得的水平。

本文所用的“TLR7/8配体”或“TLR7/8激动剂”泛指任何能够增强TLR7和/或TLR8信号传导的试剂(即TLR7和/或TLR8的激动剂)。某些TLR7/8配体仅诱导TLR7信号传导(例如，TLR7特异性配体)，某些仅诱导TLR8信号传导(例如，TLR8特异性配体)，而其它同时诱导TLR7和TLR8信号传导。

本文所用的术语“TLR7配体”或“TLR7激动剂”指任何能够增强TLR7信号传导的试剂(即TLR7的激动剂)。在这方面，TLR7信号传导水平可以被增强超过预先存在的信号传导水平，或其可以被诱导超过信号传导的本底水平(background level)。TLR7配体包括，但不限于，鸟苷类似物诸如C8-取代的鸟苷，主要由G和U构成的核糖核苷的混合物，鸟苷核苷酸和RNA或类RNA分子((PCT/US03/10406)，以及基于腺苷的化合物(例如6-氨基-9-苄基-2-(3-羟基-丙氧基)-9H-嘌呤-8-醇和Sumitomo制造的类似化合物(如CL-029))。TLR7配体还公开在Gorden等，J.Immunol.2005，174：1259-1268中(例如，3M-001，N-[4-(4-氨基-2-乙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基)丁基-]甲磺酰胺；C17H23N5O2S；mw 361)。

本文所用的术语“鸟苷类似物”指具有涉及鸟嘌呤碱基、鸟苷核苷糖、或同时涉及鸟嘌呤碱基及鸟苷核苷糖的化学修饰的类鸟苷核苷酸(不包括鸟苷)。鸟苷类似物具体包括，但不限于，7-脱氮-鸟苷。

鸟苷类似物还包括C8-取代的鸟苷，诸如7-硫代-8-氧代鸟苷(immunosine)、8-巯基鸟苷、8-溴鸟苷、8-甲基鸟苷、8-氧代-7，8-二氢鸟苷、C8-芳氨基-2’-脱氧鸟苷、C8-丙炔基-鸟苷，C8-和N7-取代的鸟嘌呤核糖核苷，如7-烯丙基-8-氧代鸟苷(洛索立宾)和7-甲基-8-氧代鸟苷、8-氨基鸟苷、8-羟基-2’-脱氧鸟苷、8-羟基鸟苷和7-脱氮-8-取代的鸟苷。

本文所用的术语“TLR8配体”或“TLR8激动剂”指任何能够增强TLR8信号传导的试剂(即TLR8的激动剂)。在这方面，TLR8信号传导水平可以被增强超过预先存在的信号传导水平，或者其可以被诱导超过信号传导的本底水平。TLR8配体包括主要由G和U构成的核糖核苷混合物，鸟苷核苷酸和RNA或类RNA分子(PCT/US03/10406)。其他TLR8配体还公开在Gorden等，J.Immunol.2005，174：1259-1268中。

一些TLR7/8配体同时是TLR7和TLR8的配体。它们包括咪唑并喹啉，主要由G和U构成的核糖核苷混合物，鸟苷核苷酸和RNA或类RNA分子(PCT/US03/10406)。其他TLR7/8配体还公开在Gorden等，J.Immunol.2005，174：1259-1268中(例如，3M-003，4-氨基-2-(乙氧基甲基)-α，α-二甲基-6，7，8，9-四氢-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-乙醇水合物；C17H26N4O2；mw 318)。

咪唑并喹啉是免疫应答调节剂，其被认为诱导几种细胞因子的表达，包括干扰素(例如，IFN-α)、TNF-α和某些白细胞介素(例如，IL-1、IL-6和IL-12)。咪唑并喹啉能够刺激Th1免疫应答，正如其诱导IgG2a水平提高的能力能部分证实。据报道，咪唑并喹啉试剂还能够抑制Th2细胞因子诸如IL-4、IL-5和IL-13的产生。咪唑并喹啉诱导的某些细胞因子由巨噬细胞或树突细胞产生。据报道，咪唑并喹啉的某些种类能增加NK细胞的胞解活性，并且刺激B细胞增殖和分化，从而诱导抗体产生和分泌。

本文所用的咪唑并喹啉试剂包括咪唑并喹啉胺，咪唑并吡啶胺，6，7-稠合的环烷基咪唑并吡啶胺类和1，2桥连的咪唑并喹啉胺类。在美国专利4689338、4929624、5238944、5266575、5268376、5346905、5352784、5389640、5395937、5494916、5482936、5525612、6039969和6110929中描述了这些化合物。咪唑并喹啉试剂的具体种类包括R-848(S-28463)；4-氨基-2-乙氧基甲基-α，α-二甲基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-乙醇；1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺(R-837或咪喹莫特)和S-27609。咪喹莫特目前用于疣的局部治疗，如生殖器和肛门疣，并且还在基底细胞癌的局部治疗中进行了测试.

本文所用的术语“TLR9配体”或“TLR9激动剂”意指任何能够增强TLR9信号传导的试剂(即TLR9的激动剂)。TLR9配体具体包括，但不限于，免疫刺激性核酸，特别是CpG免疫刺激性核酸。

本文所用的术语“免疫刺激性CpG核酸”或“免疫刺激性CpG寡核苷酸”指任何能够活化免疫细胞的含CpG的核酸。至少所述CpG二核苷酸中的C通常但并非必须是未甲基化的。在许多授权专利和公布的专利申请中均描述了免疫刺激性CpG核酸，包括美国专利6,194,388；6,207,646；6,218,371；6,239,116；6,339,068；6,406,705和6,429,199。

在某些实施方式中，所述TLR配体是免疫刺激性寡核苷酸。本文所用的“免疫刺激性寡核苷酸”是任何包含能诱导免疫应答的免疫刺激性模体或骨架的核酸(DNA或RNA)。诱导免疫应答指免疫细胞的数量或活性的提升，或者免疫因子(如细胞因子)的表达或绝对水平的提高。免疫细胞包括但不限于NK细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、B细胞、树突细胞、巨噬细胞和其他抗原呈递细胞。细胞因子包括但不限于白细胞介素类、TNF-α、IFN-α、β和γ、Flt-配体和共同刺激(co-stimulatory)分子。

免疫刺激性模体包括但不限于CpG模体和富含T的模体。免疫刺激性骨架包括但不限于磷酸酯修饰的骨架，例如硫代磷酸酯骨架。免疫刺激性寡核苷酸在现有技术中已经有广泛描述，并且以下给出了这些核酸的概述。

术语“寡核苷酸”和“核酸”可以互换使用，指多核苷酸(即包含有连接至磷酸酯基团和连接至可交换有机碱基的糖的分子(例如核糖或脱氧核糖))，所述有机碱基为取代的嘧啶(例如，胞嘧啶(C)，胸苷(T)或尿嘧啶(U))或取代的嘌呤(例如，腺嘌呤((A)或鸟嘌呤((G))。因此，该术语同时涵盖了DNA和RNA寡核苷酸。该术语还应包括多核苷(polynucleosides)(即除去磷酸酯的多核苷酸)和任何其它含碱基的聚合物。寡核苷酸可以获自现有的核酸源(例如，基因组或cDNA)，但优选为合成的(例如，通过核酸合成制得)。

所述寡核苷酸可以是双链或单链的。在某些实施方式中，当所述寡核苷酸为单链时，它能够形成形成二级和三级结构(例如，通过其自身折叠(folding back)，或者通过自身杂交(或者贯穿其整体或者沿其长度在选定的片段处)。因此，尽管这类寡核苷酸的一级结构可以是单链的，但其高级结构可以是双链或三链的。

免疫刺激性寡核苷酸可具有免疫刺激性模体，例如未甲基化的CpG模体和非-CpG模体如富含T的模体。根据本发明的实施方式，某些免疫刺激性模体优于其它模体。在本发明的某些实施方式中，所述免疫刺激性寡核苷酸不含poly-G模体。在某些实施方式中，任何核酸，不管其是否具有可识别的模体，均可与抗病毒剂结合。免疫刺激性寡核苷酸还包括具有修饰的骨架的核酸，例如硫代磷酸酯修饰的骨架。在具体的实施方式中，所述具有硫代磷酸酯修饰的骨架的免疫刺激性寡核苷酸同样不具有可识别的模体，然而其仍是免疫刺激性的。

虽然在人DNA中相对稀少，但是CpG序列广泛发现于诸如细菌的传染性生物体的DNA中。人体免疫系统已经明显发展到识别CpG序列作为感染的早期警告信号，并且启动即刻且强力的对抗入侵病原体的免疫应答，而不会引起使用其他免疫刺激试剂时经常见到的不利反应。因此，依赖这种固有的免疫防御机制，含CpG的核酸可利用独特的天然途径进行免疫治疗。CpG核酸对免疫调节的作用已经在美国专利6,194,388和公开的专利申请如PCT/US95/01570、PCT/US97/19791、PCT/US98/03678；PCT/US98/10408；PCT/US98/04703；PCT/US99/07335和PCT/US99/09863中做了广泛描述。

“CpG寡核苷酸”是包括至少一个未甲基化的CpG二核苷酸的核酸。在某些实施方式中，所述核酸包括三个或更多个未甲基化的CpG二核苷酸。包含至少一个“未甲基化的CpG二核苷酸”的核酸是在胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸序列中包含未甲基化的胞嘧啶(即“CpG DNA”或者包含5’胞嘧啶以及随后的3’鸟嘌呤并通过磷酸酯键连接的DNA)，并且激活免疫系统的核酸分子。

为了促进摄取进入细胞中，所述免疫刺激性的寡核苷酸的长度优选为6-100个碱基。然而，如果存在足够的免疫刺激性模体，超过6核苷的任意尺寸的核酸(甚至几kb长)均能够根据本发明诱导免疫应答。优选地，所述免疫刺激性核酸的尺寸为8-100个核苷，在某些实施方式中为8-50或8-30个核苷。

所述免疫刺激性寡核苷酸可包含回文结构(palindrome)或反向重复序列(即诸如ABCDEE’D’C’B’A’的序列，其中A和A’是能够形成常规Watson-Crick碱基对的碱基)。在体内，这种序列可形成双链结构。在一实施方式中，所述CpG核酸包含回文序列。本文中所用的回文序列指CpG构成该回文一部分的回文，并且优选是该回文的中心。在另一实施方式中，所述CpG核酸不含六聚(hexameric)回文。不含六聚回文的免疫刺激性核酸是CpG二核苷酸不构成长度至少为6核苷的回文的一部分的核酸。这类寡核苷酸可包括回文，其中所述CpG不在该回文中。

在本发明的某些实施方式中，使用非-CpG免疫刺激性核酸。非-CpG免疫刺激性核酸是序列中不具有CpG模体的核酸，而不管该二核苷酸的C残基是甲基化的还是未甲基化的。根据其序列、输送模式和施用剂量，非-CpG免疫刺激性寡核苷酸可诱导Th1或Th2免疫应答。

在本发明的所选方面，所述非-CpG免疫刺激性寡核苷酸可以是富含T的核酸。富含T的核酸是具有富含T的模体的核酸。在Krieg等人于2000年9月25递交的美国专利申请第09/669,187号中描述了富含T的模体和具有这类模体的核酸，本文将其全部内容引入作为参考。本发明采用的其他非-CpG核酸如2001年1月22日递交的美国专利申请第09/768,012号中所述，本文将其内容全文引入作为参考。

在某些实施方式中，所述免疫刺激性寡核苷酸具有修饰的骨架，例如硫代磷酸酯修饰的骨架。授权给Hutcherson等人的美国专利第5,723,335和5,663,153号和相关PCT公开WO95/26204描述了使用硫代磷酸酯寡核苷酸类似物的免疫刺激。这些专利描述了硫代磷酸酯骨架以非序列特异方式刺激免疫应答的能力。因此，本发明的某些实施方式依赖于缺少甲基化和未甲基化CpG模体和富含T模体的磷酸酯骨架寡核苷酸的使用。

本发明方法还包括使用前述类型的免疫刺激性寡核苷酸，包括ODN类型如A类、B类、C类、E类、T类和P类。在本发明的某些实施方式中，所述免疫刺激性寡核苷酸包括为“CpG二核苷酸”的免疫刺激性模体。CpG二核苷酸可以是甲基化的或者未甲基化的。含有至少一个未甲基化CpG二核苷酸的免疫刺激性核酸是包含未甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸序列(即未甲基化的5’胞嘧啶之后是3’鸟嘌呤并且通过磷酸酯键连接)，并且能激活免疫系统的核酸分子；这类免疫刺激性核酸是CpG核酸。在众多授权专利、公开的专利申请和其他公开文献中描述了CpG核酸，包括美国专利第6,194,388；6,207,646；6,214,806；6,218,371；6,239,116和6,339,068号。包含至少一个甲基化的CpG二核苷酸的免疫刺激性核酸是包含甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸序列(即甲基化的5’胞嘧啶之后是3’鸟嘌呤并且通过磷酸酯键连接)，并且能激活免疫系统的核酸分子。在其他实施方式中，所述免疫刺激性寡核苷酸不含CpG二核苷酸。这些不含CpG二核苷酸的寡核苷酸称为非-CpG寡核苷酸，并且它们具有非-CpG的免疫刺激性模体。优选地，这些是富含T的ODN，如具有至少80％T的ODN。

“B类”ODN能有效激活B细胞，但是在诱导IFN-α和NK细胞活化方面相对较弱。所述B类CpG核酸通常是完全稳定的，并且在某些优选的碱基内容中包括未甲基化的CpG二核苷酸。参见，例如美国专利第6,194,388；6,207,646；6,214,806；6,218,371；6,239,116和6,339,068号。另一类能有效地诱导IFN-α和NK细胞活化，但是在刺激B细胞方面相对较弱；这一类被定义为“A类”。A类CpG核酸通常在5’和3’末端具有稳定的poly-G序列，并且具有包含至少6个核苷酸的含磷酸二酯CpG二核苷酸的回文序列。参见，例如公开的专利申请PCT/US00/26527(WO 01/22990)。另一类CpG核酸激活B细胞和NK细胞并诱导IFN-α；这一类被定义为C-类。

包含至少两个不同模体的“C类”免疫刺激性核酸对免疫系统的细胞具有独特的和所需要的刺激作用。这些ODN中有些同时具有常规“刺激性”CpG序列和“富含GC”或“B-细胞中和”模体。这些组合模体核酸具有免疫刺激作用，该刺激作用一定程度上介于与作为B细胞活化和树突细胞(DC)活化的强诱导剂的常规“B类”CpG ODN相关的作用以及与一类最近描述的作为IFN-α和自然杀伤(NK)细胞活化的强诱导剂但相对较弱的B-细胞核DC活化诱导剂的免疫刺激性核酸(“A类”CpGODN)相关的作用之间。Krieg AM等，(1995)Nature 374：546-9；BallasZK等，(1996)J Immunol 157：1840-5；Yamamoto S等，(1992)J Immunol148：4072-6。虽然优选的B类CpG ODN通常具有硫代磷酸酯骨架，而优选的A类CpG ODN具有混合的或嵌合的骨架，C类组合模体免疫刺激核酸可具有稳定的如硫代磷酸酯、嵌合或磷酸二酯骨架，并且在某些优选实施方式中，它们具有半软(semi-soft)的骨架。这一类在2002年8月19日递交的美国专利申请US 10/224,523中进行了描述，本文将其内容全文引入作为参考。

“P类”免疫刺激性寡聚核苷酸具有若干域，这些域包括5′TLR活化域、2双链形成区域和选择性的间隔子及3′尾部。与C类相比，这类寡聚核苷酸在一些情况下具有诱导更高水平的IFN-α分泌的能力。P类寡聚核苷酸具有在体外和/或体内自发地自组装为串联体的能力。不希望受任何关于这些分子的作用方法的具体理论的约束，一种可能的假设是该性质使P类寡聚核苷酸与先前描述的CpG寡聚核苷酸类别相比具有在某些免疫细胞中更大程度地交联TLR9、诱导独特的免疫活化模式的能力。TLR9受体的交联可通过浆细胞样树突状细胞中的I型IFNR反馈回路来诱导更强的IFN-α活化。P类寡聚核苷酸至少在美国专利11/706,561中描述。

当没有如同本发明的ODN一样进行修饰时，与B类和C类寡聚核苷酸相比，“T类”寡聚核苷酸诱导较低水平的IFN-α分泌和IFN-相关的细胞因子和趋化因子，但同时保留了与B类寡聚核苷酸相似的IL-10诱导水平。T类寡聚核苷酸至少在美国专利申请11/099,683中有所描述，上述专利申请的全部内容在此以引用的方式引入。

“E类”寡核苷酸具有增强的诱导IFN-α分泌的能力。这些ODN具有YGZ模体的亲脂性的取代的核苷类似物5’和/或3’。E类通式的化合物可以是例如任意的以下亲脂性取代的核苷类似物：取代的嘧啶、取代的尿嘧啶、疏水的T类似物、取代的甲苯、取代的咪唑或吡唑、取代的三唑、5-氯-尿嘧啶、5-溴-尿嘧啶、5-碘-尿嘧啶、5-乙基-尿嘧啶、5-丙基-尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、(E)-5-(2-溴乙烯基)-尿嘧啶或者2，4-二氟-甲苯。至少在临时专利申请US 60/847,811中描述了E类寡核苷酸。

在本发明的某些实施方式中，所述免疫刺激性寡核苷酸是寡核糖核苷酸(ORN)。免疫刺激性ORNs包括例如那些刺激TLR7/8模体的ORN。TLR7/8刺激性ORN可包括例如，诸如5’-C/U-U-G/U-U-3’、5’-R-U-R-G-Y-3’、5’-G-U-U-G-B-3’、5’-G-U-G-U-G/U-3’或5’-G/C-U-A/C-G-G-C-A-C-3’的核糖核苷酸序列。C/U是胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)，G/U是鸟嘌呤或U，R是嘌呤，Y是嘧啶，B是U、G或C，G/C是G或C，且A/C是腺嘌呤(A)或C。所述5’-C/U-U-G/U-U-3’可以是CUGU、CUUU、UUGU或UUUU。在各种实施方式中，5’-R-U-R-G-Y-3’是GUAGU、GUAGC、GUGGU、GUGGC、AUAGU、AUAGC、AUGGU或AUGGC。在一个实施方式中，所述碱模体列是GUAGUGU。在各种实施方式中，5’-G-U-U-G-B-3’是GUUGU、GUUGG或GUUGC。在各种实施方式中，5’-G-U-G-U-G/U-3’是GUGUG或GUGUU。在一实施方式中，所述碱模体列是GUGUUUAC。在各种其它实施方式中，5’-G/C-U-A/C-G-G-C-A-C-3’是GUAGGCAC、GUCGGCAC、CUAGGCAC或CUCGGCAC。

在某些实施方式中，所述寡核苷酸不是衔接寡核苷酸或脱碱基寡核苷酸。

衔接寡核苷酸包含式5’X_a-TTTTT-X_b 3’，其中X_a和X_b独立为任何核苷酸，并且可以存在也可以不存在。X_a和X_b可以表示一个或多个核苷酸(例如，1-100个核苷酸)。寡核苷酸的长度可以是7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23个或更多个核苷酸。寡核苷酸可以包括6、7个或更多个连续的T。优选地，所述衔接寡核苷酸为dT均聚物(即具有本文所述长度的寡dT)。更优选地，所述衔接寡核苷酸为胸苷(dT)均聚物，长度17个核苷酸。最优选地，它包含至少一个硫代磷酸化核苷酸间键(直到并且包括完整的硫代磷酸化骨架)。

根据实施方式的不同，所述衔接寡核苷酸可以由100％T、99％T、98％T、97％T、96％T、95％T、94％T、93％T、92％T、91％T、90％T、85％T、80％T、75％T、70％T、65％T、60％T、55％T、50％T、45％T或更少的T组成。

另一类衔接寡核苷酸包含式5’X_a-UUUUU-X_b 3’，其中X_a和X_b独立地为任何核苷酸，并且可以存在也可以不存在。X_a和X_b可以表示一个或多个核苷酸(例如，1-100个核苷酸)。所述寡核苷酸的长度可以是7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23个或更多个核苷酸。所述寡核苷酸可以包括6、7个或更多个连续的U。在一种重要的实施方式中，所述寡核苷酸为dU均聚物，其优选为17个核苷酸长度，并且具有至少一个硫代磷酸化的核苷酸间键(直到并且包括完整的硫代磷酸化骨架).

根据实施方式的不同，所述衔接寡核苷酸可以由100％U、99％U、98％U、97％U、96％U、95％U、94％U、93％U、92％U、91％U、90％U、85％U、80％U、75％U、70％U、65％U、60％U、55％U、50％U、45％U或更少的U组成。

另一类衔接寡核苷酸包含式5’X_a-AAAAA-X_b 3’，其中X_a和X_b独立地为任意核苷酸，并且可以存在也可以不存在。X₃和X_b可以表示一个或多个核苷酸(例如，1-100个核苷酸)。所述寡核苷酸的长度可以为7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23个或更多个核苷酸。所述寡核苷酸可以包括6、7或更多个连续的A。在一种重要的实施方式中，所述寡核苷酸为dA均聚物，其优选为17个核苷酸长度，并且具有至少一个硫代磷酸化核苷酸间键(直到并且包括完整的硫代磷酸化骨架)。

根据实施方式的不同，所述衔接寡核苷酸可以由100％A、99％A、98％A、97％A、96％A、95％A、94％A、93％A、92％A、91％A、90％A、85％A、80％A、75％A、70％A、65％A、60％A、55％A、50％A、45％A或更少的A组成。

另一类衔接寡核苷酸包含式5’C_n-T_m-C_p3’，其中n为0-100的整数(例如，3-7)，P为0-100的整数(例如，4-8)，且m为0-100的整数(例如，2-10)。优选地，n与P之和等于或低于m的值，使得C含量低于60％、低于55％、低于50％、低于45％、低于40％、低于35％、低于30％、低于25％、低于20％、低于15％、低于10％、低于5％或更低。在某些实施方式中，n为3-7，m为2-10且p为4-8，前提是满足上述百分比。

脱碱基寡核苷酸类似DNA或RNA分子的骨架，其中不含所述核碱基(如腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶和鸟嘌呤)且任选地不含糖残基。因此，所述脱碱基寡核苷酸是由含磷酸酯的键连接的单元的聚合物。所述聚合脱碱基寡核苷酸的每一单元均包括共价连接至包含至少三个碳原子的有机残基的磷酸基，或其硫代衍生物。所述有机残基包括可以是链状或环状、饱和或不饱和的烷基，其可包含O、N和S杂原子，并且还可以包括含有C、H、N、O、S、卤原子及其任意组合的取代基。

所述有机残基优选衍生自丙烷-1，3-二醇或糖残基，例如β-D-脱氧呋喃核糖或β-D-呋喃核糖。其他残基包括丁烷-1，4-二醇、三乙二醇单元、或六乙二醇单元((OCH₂CH₂)_PO，其中p为3或6)，羟基-烷基-氨基连接子如C3、C6、C12氨基连接子、以及烷硫基连接子如C3或C6巯基连接子。所述糖衍生物还可包含环扩展，如吡喃糖。

所述脱碱基寡核苷酸还可包含双倍体(Doubler)或三倍体(Trebler)单元(Glen Research，Sterling，VA)，特别是包含3’3’-键。由多个双倍体、三倍体或其他多倍体单元形成寡核苷酸分枝导致形成树状聚合物(dendrimers)，它们是本发明进一步的实施方式。

一种单元可以是如下所示的脱碱基脱氧核糖核苷酸：

其中R代表氧、硫、甲基或O-烷基。

一种单元可以是如下所示的脱碱基核糖核苷酸：

其中R代表氧、硫、甲基或O-烷基。

一种单元可以是如下所示的C3间隔基/磷酸酯：

其中R代表氧、硫、甲基或O-烷基。

所述脱碱基寡核苷酸可以是脱碱基脱氧核糖核酸的均聚物(poly-D)。在这种实施方式中，每一单元包括脱碱基2’-脱氧核糖的糖残基和5’磷酸基。在另一实施方式中，所述脱碱基寡核苷酸是脱碱基核糖核酸的均聚物。在这种实施方式中，每一单元包括脱碱基2’-羟基核糖的糖残基和5’磷酸基。在另一实施方式中，所述脱碱基寡核苷酸是脱碱基核糖核酸和脱碱基脱氧核糖核酸的杂聚物。

本发明的有用的免疫刺激性寡核苷酸可具有修饰的骨架。例如，它们可包含至少一个非磷酸二酯键的核苷酸间键。这类键可以是硫代磷酸酯键。在某些实施方式中，所述寡核苷酸可具有嵌合骨架(即骨架由至少两种不同类型的核苷酸间链接构成)。

本文所用的术语“硫代磷酸酯骨架”指其中至少一个核苷酸间键中的非桥连磷酸酯氧被硫所替代的寡核苷酸的稳定糖磷酸酯骨架。在一种实施方式中，每一个并且所有核苷酸间键中的非桥连磷酸酯氧均被硫替代。

相比天然RNA和DNA，本发明的寡核苷酸可以包括各种化学修饰和取代，涉及磷酸二酯核苷间桥，β-D-核糖单元和/或天然核苷碱基(腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，胞嘧啶，尿嘧啶)。化学修饰的例子是本领域技术人员公知的，并且在下列文献中进行了描述，例如：Uhlmann E等，(1990)Chem Rev 90：543；“Protocols for Oligonucleotides andAnalogs”Synthesis and Properties&Synthesis and Analytical Techniques，S.Agrawal，Ed，Humana Press，Totowa，USA 1993；Crooke ST等，(1996)Annu Rev Pharmacol Toxicol 36：107-29；和Hunziker J等，(1995)ModSynth Methods 7：331-417。相比构成天然DNA或RNA的相同序列的寡核苷酸，本发明的寡核苷酸可以具有一个或多个修饰，其中每一个修饰位于特定的磷酸二酯核苷间桥处和/或特定的β-D-核糖单元处和/或特定的天然核苷碱基位置处。

例如，所述寡核苷酸可以包括一个或多个修饰，并且其中每一修饰独立地选自：

a)在核苷酸的3′和/或5′端由经修饰的核苷酸间桥替代磷酸二酯核苷酸间桥，

b)在核苷酸的3′和/或5′端由脱磷桥替代磷酸二酯核苷酸间桥，

c)由另一个单元替代来自糖磷酸酯骨架的糖磷酸酯单元，

d)由经修饰的糖单元替代β-D-核糖单元，和

e)由经修饰的核苷酸碱基替代天然核苷酸碱基。

寡核苷酸化学修饰的更具体的实例如下。

寡核苷酸可以包括经修饰的核苷酸间键，例如以上(a)或(b)中所述的那些。这些经修饰的键可以部分耐受降解(例如稳定化的)。“稳定化的寡核苷酸”应当指由这种修饰导致相对耐受体内降解(例如通过核酸外切酶或核酸内切酶)的寡核苷酸。在某些实施方式中，具有硫代磷酸酯键的寡核苷酸可以提供最大的活性，并且保护所述寡核苷酸免于细胞内核酸外切酶或核酸内切酶的降解。

位于核苷的3’和/或5’末端处的磷酸二酯核苷间桥可以被经修饰的核苷间桥替代，其中所述修饰的核苷间桥选自，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、NR¹R²-氨基磷酸酯、硼烷磷酸酯(boranophosphate)、α-羟基苄基膦酸酯、磷酸-(C₁-C₂₁)-O-烷基酯、磷酸-[(C₆-C₁₂)芳基-(C₁-C₂₁)-O-烷基]酯、(C₁-C₈)烷基膦酸酯和/或(C₆-C₁₂)芳基膦酸酯桥、(C₇-C₁₂)-α-羟甲基-芳基(例如，WO 95/01363中公开的)，其中(C₆-C₁₂)芳基、(C₆-C₂₀)芳基和(C₆-C₁₄)芳基任选被卤素、烷基、烷氧基、硝基、氰基取代，并且其中R¹和R²相互独立地为氢、(C₁-C₁₈)-烷基、(C₆-C₂₀)-芳基、(C₆-C₁₄)-芳基-(C₁-C₈)-烷基，优选氢、(C₁-C₈)-烷基，优选(C₁-C₄)-烷基和/或甲氧基乙基，或者R¹和R²与携带它们的氮一起构成5-6-元杂环，该杂环可另外包含选自O、S和N的其它杂原子。

位于核苷的3‘和/或5’末端处的磷酸二酯桥可以被脱磷桥替代(脱磷桥公开在，例如Uhlmann E和Peyman A的“Methods inMolecularBiology”，Vol.20，“Protocols for Oligonucleotides and Analogs”，S.Agrawal，Ed.，Humana Press，Totowa 1993，Chapter 16，pp.355ff中)，其中脱磷桥例如选自脱磷桥缩甲醛(formacetal)、3’-硫代缩甲醛、甲基羟基胺、肟、亚甲基二甲基-肼撑、二亚甲基砜和/或甲硅烷基。

来自糖磷酸酯骨架(即由糖磷酸酯单元组成的糖磷酸酯骨架)的糖磷酸酯单元(即一起构成糖磷酸酯单元的β-D-核糖和磷酸二酯核苷间桥)可以被其它单元替代，其中所述其它单元例如适合于构成“吗琳代-衍生物”寡聚体(例如，如Stirchak EP等，(1989)Nucleic Acids Res 17：6129-41中所述)，即例如被吗啉代-衍生物单元替代；或者构成聚酰胺核酸(″PNA″；例如，如Nielsen PE等，(1994)Bioconjug Chem 5：3-7中所述)，即例如被PNA骨架单元替代，例如被2-氨基乙基甘氨酸替代。所述寡核苷酸可以具有其它碳水化合物骨架修饰和替代，例如具有磷酸基的肽核酸(PHONA)，锁定核酸(LNA)和具有带烷基连接子或氨基连接子的骨架部分的寡核苷酸。所述烷基连接子可以是支链的或无支链的，取代或未取代的，以及手性纯或外消旋混合物。

β-核糖单元或β-D-2’-脱氧核糖单元可以被经修饰的糖单元替代，其中所述经修饰的糖单元例如选自β-D-核糖、α-D-2’-脱氧核糖、L-2’-脱氧核糖、2’-F-2’-脱氧核糖、2’-F-阿拉伯糖、2’-O-(C₁-C₆)烷基-核糖、2’-O-甲基核糖、2’-O-(C₂-C₆)链烯基-核糖、2’-[O-(C₁-C₆)烷基-O-(C₁-C₆)烷基]-核糖、2’-NH₂-2’-脱氧核糖、β-D-呋喃木糖、α-阿拉伯呋喃糖、2，4-双脱氧-β-D-赤型-吡喃己糖和碳环(例如，在Froehler(1992)JAm ChemSoc 114：8320中所述的)和/或开链糖类似物(例如，在Vandendriessche等，(1993)Tetrahedron 49：7223中所述的)和/或双环糖类似物(例如，在Tarkov M等，(1993)Helv Chim Acta 76：481中所述的)。在某些实施方式中，所述经修饰的糖为2’修饰的核糖。

在某些实施方式中，所述糖为2’-O-甲基核糖，尤其是由磷酸二酯或类磷酸二酯核苷间键所连接的核苷酸中的一个或两个。

核酸还包括取代的嘌呤和嘧啶，如C-5丙炔嘧啶和7-脱氮-7-取代的嘌呤修饰的碱基。Wagner RW等，(1996)Nat Biotechnol 14：840-4。嘌呤和嘧啶包括但不限于腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶，以及其它天然和非天然存在的核碱基(nucleobases)，取代和未取代的芳族部分。

经修饰的碱基是与通常在DNA和RNA中发现的诸如T、C、G、A和U之类的天然碱基化学上不同但与这些天然碱基共用基本化学结构的任何碱基。经修饰的核苷碱基可以例如选自次黄嘌呤、尿嘧啶、二氢尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶、5-(C₁-C₆)-烷基尿嘧啶、5-(C₂-C₆)-链烯基尿嘧啶、5-(C₂-C₆)-炔基尿嘧啶、5-(羟甲基)尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羟基胞嘧啶、5-(C₁-C₆)-烷基胞嘧啶、5-(C₂-C₆)-链烯基胞嘧啶、5-(C₂-C₆)-炔基胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、N²-二甲基鸟嘌呤、2，4-二氨基-嘌呤、8-氮杂嘌呤、取代的7-脱氮嘌呤，优选7-脱氮-7-取代的和/或7-脱氮-8-取代的嘌呤、5-羟甲基胞嘧啶、N4-烷基胞嘧啶如N4-乙基胞嘧啶、5-羟基脱氧胞苷、5-羟甲基脱氧胞苷、N4-烷基脱氧胞苷如N4-乙基脱氧胞苷、6-硫代脱氧鸟苷和硝基吡咯的脱氧核糖核苷、C5-丙炔基嘧啶和二氨基嘌呤如2，6-二氨基嘌呤、肌苷、5-甲基胞嘧啶、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、次黄嘌呤或天然核苷碱基的其它修饰物。该列表仅为示例性的，并不应解释为限定性的。

在本文所述的具体结构式中，可以引入经修饰的碱基。例如，胞嘧啶可以被经修饰的胞嘧啶替代。本文所用的经修饰的胞嘧啶为胞嘧啶的天然存在的或非天然存在的嘧啶碱基类似物，其可以替代该碱基而不会损及所述寡核苷酸的免疫刺激活性。修饰的胞嘧啶包括但不限于5-取代的胞嘧啶(例如，5-甲基-胞嘧啶、5-氟-胞嘧啶、5-氯-胞嘧啶、5-溴-胞嘧啶、5-碘-胞嘧啶、5-羟基-胞嘧啶、5-羟甲基-胞嘧啶、5-二氟甲基-胞嘧啶和未取代的或取代的5-炔基-胞嘧啶)、6-取代的胞嘧啶、N4-取代的胞嘧啶(例如N4-乙基-胞嘧啶)、5-氮杂-胞嘧啶、2-巯基-胞嘧啶、异胞嘧啶、假-异胞嘧啶、具有缩合环系的胞嘧啶类似物(例如N，N’-丙烯胞嘧啶或吩噁嗪)，以及尿嘧啶及其衍生物(例如5-氟-尿嘧啶、5-溴-尿嘧啶、5-溴乙烯基-尿嘧啶、4-硫-尿嘧啶、5-羟基-尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶)。一些优选的胞嘧啶包括5-甲基-胞嘧啶、5-氟-胞嘧啶、5-羟基-胞嘧啶、5-羟甲基-胞嘧啶和N4-乙基-胞嘧啶。在本发明的另一实施方式中，所述胞嘧啶碱基被通用(universal)碱基(例如，3-硝基吡咯，P-碱基)，芳族环系(例如，氟苯或二氟苯)或氢原子(dSpacer)所替代。

鸟嘌呤可以被经修饰的鸟嘌呤碱基替代。本文所用的经修饰的鸟嘌呤为鸟嘌呤的天然存在或非天然存在的嘌呤碱基类似物，它可以替代该碱基而不会损及所述寡核苷酸的免疫刺激活性。经修饰的鸟嘌呤包括但不限于7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮-7-取代的鸟嘌呤(如7-脱氮-7-(C₂-C₆)炔基鸟嘌呤)、7-脱氮-8-取代的鸟嘌呤、次黄嘌呤、N2-取代的鸟嘌呤(例如N2-甲基-鸟嘌呤)、5-氨基-3-甲基-3H，6H-噻唑并[4，5-d]嘧啶-2，7-二酮、2，6-二氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、嘌呤、吲哚、腺嘌呤、取代的腺嘌呤(例如N6-甲基-腺嘌呤、8-氧代-腺嘌呤)、8-取代的鸟嘌呤(例如8-羟基鸟嘌呤和8-溴鸟嘌呤)，以及6-硫代鸟嘌呤。在本发明的另一实施方式中，所述鸟嘌呤碱基被通用碱基(例如，4-甲基-吲哚、5-硝基-吲哚和K-碱基)，芳族环系(例如苯并咪唑或二氯苯并咪唑、1-甲基-1H-[1，2，4]三唑-3-羧酰胺)或氢原子(dSpacer)所替代。

就本发明中的应用而言，可以使用本领域公知的诸多方法中的任何方法从头开始合成本发明的寡核苷酸，例如β-氰乙基亚磷酰胺法(Beaucage SL等，(1981)Tetrahedron Lett 22：1859)；或核苷H-膦酸酯法(Garegg等，(1986)Tetrahedron Lett 27：4051-4；Froehler BC等，(1986)Nucleic Acid Res 14：5399-407；Garegg等，(1986)Tetrahedron Lett27：4055-8；Gaffnhey等，(1988)Tetrahedron Lett 29：2619-22)。这些化学方法可以通过各种市售的自动化核酸合成仪来进行。这些寡核苷酸称为合成寡核苷酸。分离的寡核苷酸通常指从通常与其天然结合的成分中分离出的寡核苷酸。作为实例，分离的寡核苷酸可以为从细胞、细胞核、线粒体或染色质中分离的寡核苷酸。

可使用采用氨基磷酸酯或H-膦酸酯化学的自动化技术来合成经修饰的骨架如硫代磷酸酯。例如，可以如美国专利4,469,863中所述制备芳基-和烷基-膦酸酯；并且可以使用市售的试剂通过自动化固相合成来制备烷基磷酸三酯(其中对带电荷的氧部分进行如美国专利5,023,243和欧洲专利092,574中所述的烷基化)。制备其它DNA骨架修饰和取代的方法已有记载(例如，Uhlmann E等，(1990)Chem Rev 90：544；Goodchild J(1990)Bioconjugate Chem 1：165)。

在某些实施方式中，所述寡核苷酸可以是软或半软的寡核苷酸。软寡核苷酸是具有部分稳定的骨架的免疫刺激性寡核苷酸，其中磷酸二酯或类磷酸二酯核苷酸间键仅出现在至少一个内部嘧啶-嘌呤二核苷酸(YZ)之内，并且紧邻至少一个内部嘧啶-嘌呤二核苷酸(YZ)。优选地，YZ是YG，嘧啶-鸟嘌呤(YG)二核苷酸。所述至少一个内部YZ二核苷酸本身具有磷酸二酯或类磷酸二酯核苷酸间键。紧邻所述至少一个内部YZ二核苷酸出现的磷酸二酯或类磷酸二酯核苷酸间键对于所述至少一个内部YZ二核苷酸而言可以是5’、3’或者既有5’又有3’。

具体地，磷酸二酯或类磷酸二酯核苷酸间键插入“内部二核苷酸”。内部二核苷酸通常应当指通过核苷酸间键所连接的任何相邻核苷酸对，其中该核苷酸对中的任一核苷酸都不是末端核苷酸，即该核苷酸对中的任一核苷酸都不是界定所述寡核苷酸的5’或3’末端的核苷酸。因此，n个核苷酸长的线性寡核苷酸总共具有n-1个二核苷酸，但仅有n-3个内部二核苷酸。每一内部二核苷酸内的核苷酸间键是内部核苷酸间键。因此，n个核苷酸长的线性寡核苷酸具有总共n-1个核苷酸间键，但仅有n-3个内部核苷酸间键。因此，按策略放置的磷酸二酯或类磷酸二酯核苷酸间键指位于核酸序列中任意核苷酸对之间的磷酸二酯或类磷酸二酯核苷酸间键。在某些实施方式中，所述磷酸二酯或类磷酸二酯核苷酸间键不位于任一紧邻5’或3’末端的核苷酸对之间。

优选地，紧邻所述至少一个内部YZ二核苷酸出现的磷酸二酯或类磷酸二酯核苷酸间键本身是内部核苷酸间键。因此，对于每一N₁和N₂相互独立地为任意单核苷酸的序列N₁YZ N₂，所述YZ二核苷酸具有磷酸二酯或类磷酸二酯核苷酸间键，并且(a)当N₁是内部核苷酸时，N₁和Y被磷酸二酯或类磷酸二酯核苷酸间键所连接，(b)当N₂是内部核苷酸时，Z和N₂被磷酸二酯或类磷酸二酯核苷酸间键所连接，或者(c)当N₁是内部核苷酸时N₁和Y被磷酸二酯或类磷酸二酯核苷酸间键所连接，并且当N₂是内部核苷酸时Z和N₂被磷酸二酯或类磷酸二酯核苷酸间键所连接。

与完全稳定的寡聚核苷酸相比，本发明的软寡聚核苷酸被认为相对更易被核酸酶切割。不希望受具体理论或机制的约束，相对于全长软寡聚核苷酸而言，认为本发明的软寡聚核苷酸可被切割为具有相对降低的免疫刺激活性或不具有免疫刺激活性的片段。加入至少一个对核酸酶敏感的内部核苷酸间键，尤其靠近寡聚核苷酸中部，则被认为提供了“关闭开关”，其将改变寡聚核苷酸的药代动力学，从而缩短寡聚核苷酸的最大免疫刺激活性的持续时间。这在诸如肾之类的其中需要避免与慢性局部发炎或免疫刺激相关的损伤的组织和临床应用中特别有价值。

半软寡聚核苷酸是具有部分稳定骨架的免疫刺激性寡聚核苷酸，其中磷酸二酯或类磷酸二酯核苷酸间键仅出现在至少一个内部嘧啶-嘌呤(YZ)二核苷酸内。与相应的完全稳定的免疫刺激性寡聚核苷酸相比，半软寡聚核苷酸通常具有提高的免疫刺激效力。由于半软寡聚核苷酸的更大的效力，在一些情况下，半软寡聚核苷酸可以以较低的有效浓度使用，并且与传统的完全稳定的免疫刺激性寡聚核苷酸相比以更小的有效剂量获得所希望的生物效果。

人们认为上述半软寡聚核苷酸的性质通常随着牵涉到内部YZ二核苷酸的磷酸二酯或类磷酸二酯核苷酸间键的“剂量”的增加而提高。因此，可认为，例如通常对于具有五个内部YZ二核苷酸的给定寡聚核苷酸序列而言，具有五个内部磷酸二酯或类磷酸二酯YZ核苷酸间键的寡聚核苷酸的免疫刺激性比具有四个内部磷酸二酯或类磷酸二酯YG核苷酸间键的寡聚核苷酸的免疫刺激性更强，后者的免疫刺激性又比具有三个内部磷酸二酯或类磷酸二酯YZ核苷酸间键的寡聚核苷酸的免疫刺激性更强，后者的免疫刺激性又比具有两个内部磷酸二酯或类磷酸二酯YZ核苷酸间键的寡聚核苷酸的免疫刺激性更强，后者的免疫刺激性又比具有一个内部磷酸二酯或类磷酸二酯YZ核苷酸间键的寡聚核苷酸的免疫刺激性更强。重要的是，即使包括一个内部磷酸二酯或类磷酸二酯YZ核苷酸间键也被认为比没有内部磷酸二酯或类磷酸二酯YZ核苷酸间键更加有利。除磷酸二酯或类磷酸二酯核苷酸间键的数目之外，沿核酸长度方向的位置也可影响效力。

除位于优选内部位置的磷酸二酯或类磷酸二酯核苷酸间键之外，所述软或半软寡聚核苷酸通常包括耐降解的5′和3′端。这些耐降解末端可包括使其与相应的未经修饰的末端相比具有提高的外切核酸酶消化耐受性的任何合适的修饰。例如，5′和3′端可通过加入骨架的至少一个磷酸酯修饰而稳定。在优选实施方式中，在骨架的每个末端处的至少一个磷酸酯修饰独立地是硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基磷酸酯或甲基硫代磷酸酯核苷酸间键。在另一个实施方式中，耐降解末端包括在3′端通过肽键或酰胺键相连的一个或多个核苷酸单元。

磷酸二酯核苷酸间键是在自然界中发现的核酸的特征键类型。如图20所示，磷酸二酯核苷酸间键包括与两个桥接氧原子侧面相连并与另外两个氧原子(一个带有电荷而另一个不带有电荷)相连的磷原子。当缩短寡聚核苷酸的组织半衰期非常重要时，特别优选磷酸二酯核苷酸间键。

类磷酸二酯核苷酸间键是含有磷的桥接基团，其与磷酸二酯化学地和/或非对映地相似。与磷酸二酯的相似性的量度包括对核酸酶消化的易受性和活化RNAse H的能力。因此，例如磷酸二酯(而不是硫代磷酸酯)寡聚核苷酸易被核酸酶消化，尽管磷酸二酯和硫代磷酸酯寡聚核苷酸均活化RNAse H。在优选实施方式中，类磷酸二酯核苷酸间键是硼代磷酸酯(或者相当于硼代磷酸酯)键。见美国专利5,177,198；美国专利5,859,231；美国专利6,160,109；美国专利6,207,819；Sergueev等，(1998)J.Am.Chem.Soc.120：9417-27。在另一个优选实施方式中，类磷酸二酯核苷酸间键是非对映的纯R_p硫代磷酸酯。据认为非对映的纯R_p硫代磷酸酯与混合的或非对映的纯S_p硫代磷酸酯更容易被核酸酶消化并能更好地活化RNAse H。CpG寡聚核苷酸的立体异构体是1999年6月27日提交的共同未决的美国专利申请09/361,575和已公开的PCT申请PCT/US99/17100(WO 00/06588)的主题。应当注意到出于本发明的目的，术语“类磷酸二酯核苷酸间键”特意排除了二硫代磷酸酯和甲基磷酸酯核苷酸间键。

如上所述，本发明的软和半软寡聚核苷酸可以在C和G之间具有类磷酸二酯键。类磷酸二酯键的一个例子是R_p构象的硫代磷酸酯键。根据活性测量的时间点，寡聚核苷酸p-手性对CpG寡聚核苷酸的免疫活性有明显的相反作用。在早期40分钟时间点，硫代磷酸酯CpG寡聚核苷酸的R_p而不是S_P立体异构体诱导了小鼠脾细胞中的JNK磷酰化。相反，当在较晚的44小时时间点，S_P而并非R_p立体异构体在刺激脾细胞增殖中起作用。R_p和S_p立体异构体的动力学和生物活性的差异并非源自于任何细胞摄取的差异，而最可能是由于p-手性的两种相反的生物角色。首先，在早期时间点R_p立体异构体相比S_p而言增强的刺激免疫细胞的活性表明R_p可更有效地与CpG受体TLR9相互作用，或者诱导下游信号途径。另一方面，与S_p相比，R_p PS-寡聚核苷酸的更快速降解导致了短得多的信号持续时间，因此当在较后期时间点，S_p PS-寡聚核苷酸似乎更具生物活性。

由CpG二核苷酸自身的p-手性实现了令人惊奇的强烈作用。与立体随机的CpG寡聚核苷酸相比，其中单一CpG二核苷酸以R_p连接的同类物的活性稍微高一些，而含有S_p键的同类物对于诱导脾细胞增殖几乎没有活性。

在本发明前述的每一方面中，所述组合物还可包括可药用载体，从而本发明还提供了本发明的包含TLR配体和抗病毒剂的药物组合物。本发明组合物还可用于制备用于治疗受试对象的病毒性病况的药物。本发明这一方面的用途包括将有效剂量的本发明组合物置于可药用载体内的步骤。

在某些实施方式中，所述TLR配体和抗病毒剂是分离的(isolated)。分离的分子是基本纯净并且不含其它物质(在自然界中或在体内系统中通常与其同时被找到的物质)，程度达到能实际应用且适合于其目标用途的分子。具体地，所述试剂足够纯并且基本不含细胞的其它生物成分，从而可用于例如生产药物制剂。因为本发明的分离试剂可与可药用载体混合在药物制剂中，所以该试剂可以仅占制剂重量的小百分比。尽管如此，对所述试剂进行分离，使其基本上与它在活体系统中所结合的物质分离。

抗病毒剂是能防止细胞被病毒感染或细胞内病毒复制的化合物。相比抗细菌剂药物，抗病毒药物少很多，这是因为病毒复制的过程与宿主细胞中的DNA复制紧密相关，而非特异性抗病毒剂通常对宿主也是有毒的。病毒感染过程中存在多个阶段可被抗病毒剂阻断或抑制。这些阶段包括病毒附着于宿主细胞(免疫球蛋白或结合肽)、病毒脱壳(例如金刚烷胺)、病毒mRNA的合成或翻译(例如干扰素)、病毒RNA或DNA的复制(例如核苷酸类似物)、新病毒蛋白的成熟(例如蛋白酶抑制剂)和病毒出芽和释放。

核苷酸类似物是与核苷酸相似但具有不完整的或异常的脱氧核糖或核糖基团的合成化合物。一旦核苷酸类似物在细胞中，它们被磷酰化，形成与正常核苷酸竞争进入病毒DNA或RNA的三磷酸酯形式。一旦核苷酸类似物的三磷酸酯形式进入生长中的核酸链，它导致与病毒聚合酶的不可逆结合从而造成链终止。核苷酸类似物包括但不限于阿昔洛韦(acyclovir)(用于单纯疱疹病毒和水痘带状疱疹病毒的治疗)、更昔洛韦(gancyclovir)(用于巨细胞病毒的治疗)、碘苷(idoxuridine)、利巴韦林(ribavirin)(用于呼吸道合胞病毒的治疗)、二脱氧肌苷、二脱氧胞苷和齐多夫定(zidovudine)(叠氮胸苷(azidothymidine))。

干扰素是由病毒感染细胞以及免疫细胞分泌的细胞因子。干扰素通过与感染细胞相邻的细胞上的特异性受体相结合而发挥作用，从而导致细胞发生变化以保护其免受病毒感染。α和β-干扰素也诱导感染细胞表面上I类和II类MHC分子的表达，导致更多的抗原呈现以供宿主免疫细胞识别。α和β-干扰素以重组形式提供并用于慢性乙肝和丙肝感染的治疗。以有效进行抗病毒治疗的剂量，干扰素有严重的副作用，诸如发热、不适和体重降低。

多篇美国专利都描述了抗病毒化合物。例如，美国专利7,094,768描述了用于治疗HCV的-羟氨基-或6-烷氧氨基-7-脱氮嘌呤-呋喃核糖衍生物；美国专利7,041,698描述了用于治疗HCV的三肽化合物、组合物及方法；美国专利6,995,174描述了HCV抑制剂；美国专利7,022,736描述了作为病毒抑制剂的二酮酸(Diketoacid)；美国专利6,909,000描述了桥接的双环HCV NS3-NS4A丝氨酸蛋白酶抑制剂；美国专利6,867,185描述了HCV的大环抑制剂；美国专利6,869,964描述了杂环磺胺HCV抑制剂；美国专利6,846,810描述了抗病毒核苷衍生物；以及公开了PCT申请WO 0248157描述了作为HCV NS3蛋白酶抑制剂的咪唑烷酮类及其相关衍生物。

已经有或者正在开发多种药物阻断病毒进入宿主细胞。这些药物包括三环癸胺和金刚乙胺(rimantadine)，它们用于对抗流行感冒；用于治疗鼻病毒、肠道病毒、脑膜炎、结膜炎和脑炎的普来可那立(pleconaril)。

如上所述，核苷或核苷类似物是一类靶向病毒侵入细胞后的病毒组分合成过程的药物。阿昔洛维是有效对抗疱疹病毒感染的核苷类似物。用于治疗HIV的齐多夫定(AZT)也是核苷类似物。拉米夫定(lamivudine)被用于治疗利用逆转录酶作为其复制过程一部分的乙型肝炎。

开发中的其他抗病毒剂包括Rnase H和整合酶的靶标、基于核糖酶的化合物、蛋白酶抑制剂和干扰病毒从宿主细胞的释放的药物，如用于治疗流感的扎那米韦(zanamivir)和奥塞米韦(oseltamivir)。

目前使用的抗病毒剂的例子包括：

拉米夫定(2’，3’-双脱氧-3’-硫代胞苷(thiacytidine)，3TC)，用于HIV和慢性乙型肝炎的治疗，是GlaxoSmithKline以商标Epivir

和Epivir-HBV

上市的逆转录酶抑制剂。其也称为3TC。它是胞苷的类似物。

阿巴卡韦(abacavir)(ABC)是用于治疗HIV和AIDS的核苷类似物逆转录酶抑制剂(NARTI)。其可以商标Ziagen^TM(GlaxoSmithKline)和复方药Trizivir^TM(阿巴卡韦、齐多呋定和拉米夫定)以及Kivexa

/Epzicom^TM(阿巴卡韦和拉米夫定)获得。ABC是鸟苷的类似物(嘌呤)。其靶标是病毒的逆转录酶。

阿昔洛维(INN″)或无环鸟苷(USAN)，化学名羟乙氧甲鸟嘌呤，是一种鸟嘌呤类似物抗病毒剂，用于治疗例如I型单纯疱疹病毒(HSV-I)、II型单纯疱疹病毒种(HSV-2)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、埃-巴二氏病毒(EBV)和细胞巨化病毒(CMV)。它是最常用的抗病毒剂之一，并且是通常以商标Zovirax(GSK)上市。阿昔洛维不同于前述核苷类似物之处在于它仅包含部分核苷结构-糖环被开环结构所替代。Aciclo-GTP是非常强力的病毒DNA聚合酶抑制剂。

三环癸胺(1-氨基金刚烷，以Symmetrel

销售)是用于治疗流感病毒A的抗病毒药。

地达诺新(didanosine)(2’-3’-双脱氧肌苷，ddI)以商标Videx

和Videx EC

销售。它是一种逆转录酶抑制剂，有效对抗HIV，并与其他抗逆转录病毒药物治疗联合使用作为高活性抗逆转录病毒治疗(HAART)的一部分。地达诺新(ddI)是腺苷的核苷类似物，具有连接至糖环的次黄嘌呤。

恩曲他滨(emtricitabine)(FTC)，商标Emtriva(原先的Coviracil)，是一种用于治疗成人HIV感染的核苷逆转录酶抑制剂(NRTI)。恩曲他滨是胞苷类似物。

恩夫韦地(enfuvirtide)(INN)是HIV融合抑制剂，以商标Fuzeon(Roche)上市。

恩替卡韦是用于治疗乙型肝炎感染的口服抗病毒药，以商标Baraclude(BMS)上市。恩替卡韦是抑制病毒复制过程的所有三个步骤的鸟嘌呤类似物。

甘昔洛(ganciclovir)是用于治疗或预防细胞巨化病毒(CMV)感染的抗病毒药。甘昔洛是2’-脱氧鸟苷的合成类似物。

奈韦拉平(nevirapine)，也是商标Viramune

(Boehringer Ingelheim)上市，是用于治疗HIV-I感染和AIDS的非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTI)，其为蛋白酶抑制剂。

奥塞米韦是用于治疗和预防流感病毒A和流感病毒B的抗病毒药。它是作为流感神经氨酸酶的过渡态(transition-state)类似物抑制剂的神经氨酸酶抑制剂，预防从感染的细胞出现新的病毒。奥塞米韦适用于治疗由流感A和B病毒引起的感染，以及对抗犬细小病毒、猫泛白细胞减少症、称为“犬舍咳(kennel cough)”的犬呼吸到综合症和称为“犬流行性感冒(canine flu)”的新疾病(emerging disease)。

利巴韦林(Copegus

；Rebetol

；Ribasphere；VilonaVirazole

，也属于Sandoz，Teva，Warrick)是对众多DNA和RNA病毒都具有活性的抗病毒药。它是一种干扰病毒遗传材料复制的核苷抗代谢药。利巴韦林具有广谱活性，包括重要的对抗流行性感冒、黄热病病毒的活性，并且是许多病毒性出血热丙型肝炎、呼吸道合胞病毒-相关疾病和流行性感冒的药剂。在一实施方式中，利巴韦林与诸如CpGODN或ORN的TLR7、8、9配体一同施用，相对于作为TLR配体的结果产生的IFN-α降低了IL-10的量。

AICA-核糖甙是类似利巴韦林的抗病毒药。在一实施方式中，AICA-核糖甙与诸如CpG ODNs或ORNs的TLR7、8、9配体一同施用，相对于作为TLR配体的结果产生的IFN-α降低了IL-10的量。

金刚乙胺，商标Flumadine

，是用于治疗(以及极少情况用于预防)流感病毒A感染的口服给药的药物。

司他夫定(stavudine)(2’-3’-双脱氢-2’-3’-双脱氧胸苷，d4T，商标Zerit

)是一种对HIV有活性的核苷类似物逆转录酶抑制剂(NARTI)。司他夫定是胸苷类似物。

缬昔洛韦(valaciclovir)(INN)或伐昔洛韦(USAN)用于控制单纯性疱疹和带状疱疹(shingles)的抗病毒药。

阿糖腺苷(vidarabine)是对单纯性疱疹和水痘带状疱疹病毒具有活性的抗病毒药。阿糖腺苷(9-β-D-呋喃核糖腺嘌吟)是腺苷的类似物，其中D-核糖被D-树胶醛醣替代。

扎西他滨(zalcitabine)(2’-3’-双脱氧胞苷，ddC)，也称为双脱氧胞苷，是一种核苷类似物逆转录酶抑制剂(NARTI)，以商标Hivid

销售。扎西他滨是嘧啶类似物。

在本发明的某些方面，在寡核苷酸的合成过程中，可将诸如核苷类似物的抗病毒剂引入免疫刺激性寡核苷酸分子上的一个或多个位置，例如3’或5’末端。这也可以包括在核苷类似物侧引入易受核酸酶作用的位点，使得施用后可进行抗病毒化合物的酶切，使得其抗病毒活性不依赖于所述免疫刺激性寡核苷酸。所述抗病毒剂也可通过其他链接(如3’-3’)或连接子(非核苷酸连接子)连接至免疫刺激性ON。

此外，将不同TLR的配体结合入一个分子可能会导致受体的多聚，这会导致免疫刺激增强，或者与由任一这类配体所产生的免疫刺激特征(profile)不同的特征。

本发明提供了包括连接至抗病毒剂的TLR配体的组合物。本文所用的术语“连接”指通过任意的物理化学相互作用，直接或间接连接在一起的两个或更多个组成部分的任意组合。在一实施方式中，所述键是通过共价键合直接或间接连接到一起的两个或更多个组成部分的组合。因此，在某些实施方式中，本发明的TLR配体可与抗病毒剂一起施用，但与其是物理分离的。然而，在其他实施方式中，可以预期配体-抗病毒剂轭合物。

所述连接子可以连接到寡核苷酸上的任何反应部分上，包括但不限于骨架磷酸基团或糖羟基。例如，它们可以通过磷酸二酯、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯和/或酰胺键引入。可通过现有方法合成不同的分子，并且在固相合成过程中将这些分子在线连接到一起。可选择地，可以在各部分序列合成之后将它们连接在一起。所述连接子本质上可以为非核苷酸。非核苷酸连接子有例如脱碱基残基(dSpacer)、寡聚乙二醇如三乙二醇(间隔基9)或六乙二醇(间隔基18)或烷-二醇如丁二醇。所述间隔子单元优选通过磷酸二酯或硫代磷酸酯键连接。所述连接子单元在分子中可以只出现一次，或者可以引入多次，例如通过磷酸二酯、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯或酰胺键。其它优选的连接子是烷氨基连接子，如C₃、C₆、C₁₂氨基连接子，以及烷硫基连接子如C₃或C₆巯基连接子。所述寡核苷酸还可以通过芳香残基连接，该残基可被烷基或取代烷基进一步取代。寡核苷酸还可以包含双倍体或三倍体单元，这使得可将一种或不同类型的多个配体与寡核苷酸结合。所述寡核苷酸还可以包含由肽修饰试剂或寡核苷酸修饰试剂产生的连接子(www.glenres.com)。此外，它可以包含一种或多种通过肽(酰胺)链接所连接的天然或非天然的氨基酸残基。不同类型的连接子也可以合并成新的连接子。可以通过现有方法合成不同的寡核苷酸，并且在固相合成过程中在线连接到一起。可选择地，可以在各部分序列合成之后将它们连接到一起。

在本发明的某些实施方式中，将TLR配体与抗病毒剂连接在一起，使得他们构成同一分子的组成部分。TLR配体可直接或者通过非核苷酸连接子与抗病毒剂连接。如果TLR配体共价结合至所述寡核苷酸而没有中间结构，那么该TLR配体是“直接连接”的。如果它通过连接子连接至寡核苷酸，那么该寡核苷酸称作“间接连接”的。

连接所述寡核苷酸与抗病毒剂的连接子可以包含易受核酸酶作用的位点。本文所用的“易受核酸酶作用的位点”指被称为核酸酶的一类酶中的成员所识别和酶切的DNA或RNA序列。在某些实施方式中，所述易受核酸酶作用的位点被靶细胞中天然存在的核酸酶所识别和酶切。

在某些实施方式中，所述抗病毒剂或连接子结合到所述免疫刺激性寡核苷酸的内部核苷酸上。本文所用的“内部核苷酸”指不在核酸聚合物的最3’或5’末端的核苷酸。因此，“末端核苷酸”指在核酸聚合物的3’或5’末端的核苷酸。在某些实施方式中，所述抗病毒剂或连接子结合至末端核苷酸。本文所用的“3’末端核苷酸”指寡核苷酸聚合物的最3’末端的核苷酸残基。类似地，“5’末端核苷酸”指在寡核苷酸聚合物的最5’末端的核苷酸残基。在某些实施方式中，所述免疫刺激性寡核苷酸可包括内部3’-3’链接or 5’-5’链接。在这种情况下，所述免疫刺激性寡核苷酸分别具有两个5’或3’链接。如果所述抗病毒剂是核苷酸或寡核苷酸，那么所述抗病毒剂也可通过3’-5’，3’-3’或5’-5’链接结合至免疫刺激性寡核苷酸。

在本发明的某些方面，所述TLR配体和抗病毒剂并未连接，而是以微颗粒的形式一同施用。本文所用的“微颗粒”是生物相容的微颗粒，或者适用于植入或给予哺乳动物受体的植入物。在标题为“聚合物基因输送系统”的PCT国际申请PCT/US/03307(公开号WO95/24929)中描述了可根据该方法使用的示例性的生物可蚀性(bioerodible)植入物，本文将其引入作为参考。PCT/US/0307描述了用于在适合的促进剂控制下包含外源基因的生物相容性的，优选可生物降解的聚合基质。所述聚合基质可用于实现外源基因在患者体内的持续释放。

所述聚合基质优选为微颗粒的形式，例如微球(其中所述免疫刺激性寡核苷酸和抗病毒剂或多种抗病毒剂分散到整个固体聚合基质中)或微胶囊(其中所述免疫刺激性寡核苷酸和抗病毒剂或多种抗病毒剂储存在聚合壳的中心)。用于包含所述免疫刺激性寡核苷酸和抗病毒剂或多种抗病毒剂的聚合基质的其他形式包括膜、涂层、凝胶、植入物和斯坦特印模(stents)。选择聚合基质装置的尺寸和组成，以在引入该基质的组织中获得所需的释放动力学。进一步根据待使用的输送方法来选择聚合基质的尺寸，输送方法通常是注射入组织或者通过气雾剂将悬浮液施用入鼻和/或肺动脉瓣区。优选地，当采用气雾剂途径时，将所述聚合基质与核酸、抗病毒剂和/或过敏原包裹在表面活性剂载体中。可将所述聚合基质组合物选择为同时具有有利的降解速率以及由生物粘附性(bioadhesive)材料形成，从而当该基质被施用至受到损伤的鼻和/或肺表面时，进一步提高传递效率。所述基质组合物也可选择为非降解的，而是通过较长时间的扩散来释放。

非生物降解的和可生物降解的聚合基质均可用于将TLR配体和/或抗病毒剂输送至受试对象。优选可生物降解的机制。这类聚合物可以是天然或合成聚合物。根据所需的释放时间段(通常的量级为几小时或年或更长)来选择所述聚合物。通常，最希望的是在几小时到3-12个月的时间段内释放。所述聚合物任意为水凝胶形式，在水中最高可吸收其重量的约90％，并且任意地进一步与多价离子或其他聚合物交联。

特别关注的生物粘附性聚合物包括H.S.Sawhney，CP.Pathak和J.A.Hubell在Macromolecules，(1993)26：581-587中所描述的生物可蚀性水凝胶(本文中引入其教导)、聚透明质酸、酪蛋白、凝胶、明胶蛋白、聚酐、聚丙烯酸、藻朊酸盐、壳聚糖、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁脂)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸基酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸酸异丁酯)和聚(丙烯酸十八烷基酯)。

本文针对患有疾病或病况的受试对象所用的术语“治疗”应当指预防、改善或消除受试对象的所述疾病或病况的至少一种信号或症状。

本文所述的组合物可用于治疗癌症。

患有癌症的受试对象是具有可检测的癌细胞的受试对象。癌症可以是恶性或非恶性癌症。本文所用的“癌症”指干扰机体器官和系统的正常功能作用的不受控制的细胞生长。从其原始位置迁移并且植根于重要器官的癌症最终可以通过使受侵害器官的功能衰退导致受试对象死亡。血癌如白血病能够在竞争中胜过受试对象的正常造血室，由此造成造血衰竭(表现为贫血、血小板减少和嗜中性白血球减少症的形式)而最终导致死亡。

转移是不同于最初的肿瘤位置的癌细胞区，它是因癌细胞从原发性肿瘤扩散至机体的其它部分而产生的。在诊断原发性肿瘤块时，可以监测受试对象的转移灶的存在。通常可以通过单独或联用核磁共振成像(MRI)扫描，计算机X线断层摄影(CT)扫描，血液和血小板计数，肝功能研究，胸透和骨扫描以及特定症状的监测来检测转移灶.

癌症包括但不限于基底细胞癌，胆道癌；膀耽癌；骨癌；脑和中枢神经系统(CNS)癌；乳癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠和直肠癌；结缔组织癌；消化系统癌；子宫内膜癌；食管癌；眼癌；头颈癌：上皮内肿瘤；肾癌；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(例如，小细胞和非小细胞)；淋巴瘤包括霍奇金和非霍奇金淋巴瘤；黑素瘤；骨髓瘤；神经母细胞瘤；口腔癌(例如，唇、舌、口腔和咽部)；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；视网膜神经胶质瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；呼吸系统癌；肉瘤；皮肤癌；胃病；睾丸癌；甲状腺癌；子宫癌；泌尿系统癌以及其它癌、腺癌和肉瘤。

本发明的免疫刺激性组合物也可与抗癌疗法联合施用。抗癌疗法包括癌症用药、放射和外科手术过程。本文所用的“癌症用药”指对受试对象施用以便治疗癌症的药剂。本文所用的“治疗癌症”包括预防癌症的发展、减少癌症的症状和/或抑制已有癌的生长。在其它方面，对具有发展癌症的风险的受试对象施用所述癌症用药，以降低发展癌症的风险。本文描述了用于治疗癌症的各种类型的药物。就本说明书的目的而言，将癌症用药划分为化疗剂，免疫治疗剂，癌症疫苗，激素疗法和生物应答调节剂。

所述化疗剂可选自甲氨蝶呤(methotrexate)、长春新碱(vincristine)、阿霉素(adriamycin)、顺铂(cisplatin)、不含糖的氯乙基亚硝基脲、5-氟尿嘧啶、丝裂霉素(mitomycin C)、博莱霉素(bleomycin)、阿霉素(doxorubicin)、达卡巴嗪(dacarbazine)、紫杉醇(taxol)、泛戈林(fragyline)、葡甲胺GLA、戊柔比星(valrubicin)、卡姆司坦恩(carmustaine)和泼立氟泼散(poliferposan)、MMI270、BAY12-9566、RAS法尼基转移酶抑制剂、法尼基转移酶抑制剂、MMP、MTA/LY231514、LY264618/罗莫特松(Lometexol)、格兰莫雷克(Glamolec)、CI-994、TNP-470、和美新(Hycamtin)/托泊替康(Topotecan)、PKC412、伐司朴达(Valspodar)/PSC833、诺消灵(Novantrone)/米托蒽醌(Mitroxantrone)、美他特(Metaret)/苏拉明(Suramin)、巴马司他(Batimastat)、E7070、BCH-4556、CS-682、9-AC、AG3340、AG3433、英赛尔(Incel)/VX-710、VX-853、ZD0101、ISI641、ODN 698、TA 2516/马迷司他(Marmistat)、BB2516/马迷司他(Marmistat)、CDP 845、D2163、PD183805、DX8951f、LemonalDP 2202、FK 317、毕西巴尼(Picibanil)/OK-432、AD 32/戊柔比星(Valrubicin)、美他特龙(Metastron)/锶衍生物、泰道(Temodal)/替莫唑胺(Temozolomide)、伊瓦瑟(Evacet)/脂质体阿霉素、紫杉醇(Yewtaxan)/紫杉醇(Paclitaxel)、紫杉醇(Taxol)/紫杉醇(Paclitaxel)、Xeload/卡培他滨、氟铁龙(Furtulon)/去氧氟尿苷(Doxifluridine)、环派克斯(Cyclopax)/口服紫杉醇、口服Taxoid、SPU-077/顺铂(Cisplatin)、HMR 1275/弗拉平度(Flavopiridol)、CP-358(774)/EGFR、CP-609(754)/RAS癌基因抑制剂、BMS-182751/口服铂、UFT(替加氟(Tegafur)/尿嘧啶)、尔吉咪唑(Ergamisol)/左旋咪唑、氟尿嘧啶(Eniluracil)/776C85/5FU增强子、开普拓(Campto)/左旋咪唑、坎普特莎(Camptosar)/伊立替康(Irinotecan)、Tumodex/Ralitrexed、乐司他丁(Leustatin)/克拉利宾(Cladribine)、紫杉醇(Paxex)/紫杉醇(Paclitaxel)、多丝尔(Doxil)/脂质体阿霉素、楷莱(Caelyx)/脂质体阿霉素、福达华(Fludara)/氟达拉滨(Fludarabine)、表柔比星(Pharmarubicin)/表阿霉素、DepoCyt、ZD1839、LU79553/Bis-Naphtalimide、LU 103793/多拉司坦(Dolastain)、Caetyx/脂质体阿霉素、健择(Gemzar)/吉西他滨(Gemcitabine)、ZD 0473/Anormed、YM 116、碘种子、CDK4和CDK2抑制剂、PARP抑制剂、D4809/Dexifosamide、Ifes/美司那(Mesnex)/异环磷酰胺(Ifosamide)、卫萌(Vumon)/替尼泊甙(Teniposide)、伯尔定(Paraplatin)/卡铂(Carboplatin)、Plantinol/顺铂(cisplatin)、足叶乙甙(Vepeside)/依托泊苷()、ZD 9331、泰索帝(Taxotere)/多西紫杉醇(Docetaxel)、鸟嘌呤阿糖胞苷药物前体、紫杉类似物、nitrosoureas、烷基化试剂诸如美芬兰(melphelan)和环磷酰胺(cyclophosphamide)、氨鲁米特(Aminoglutethimide)、天冬酰胺酶(Asparaginase)、马利兰(Busulfan)、卡铂(Carboplatin)、苯丁酸氮芥(Chlorombucil)、阿糖胞苷盐酸盐(Cytarabine HCI)、更生霉素(Dactinomycin)、盐酸柔红霉素(Daunorubicin HCl)、雌莫司汀(Estramustine)磷酸钠、足叶乙甙(VP 16-213)、氟尿苷(Floxuridine)、氟尿嘧啶(5-FU的)、氟他胺(Flutamide)、羟基脲(羟基碳酰二胺脲)、异环磷酰胺(Ifosfamide)、干扰素Alfa-2a、Alfa-2b、醋酸亮丙瑞林(LHRH释放因子类似物)、洛莫司汀(Lomustine)(CCNU)、盐酸氮芥(Mechlorethamine HCl)(氮芥子气)、巯基嘌呤、美司那(Mesna)、米托坦(Mitotane)(op′-DDD)、盐酸米托蒽醌(Mitoxantrone)、奥曲肽(Octreotide)、光辉霉素(Plicamycin)、盐酸丙卡巴肼(Procarbazine)、链佐星(Streptozocin)、枸橼酸他莫昔芬(Tamoxifen citrate)、硫代鸟嘌呤、塞替派(Thiotepa)、硫酸长春碱(Vinblastine)、胺苯丫啶(Amsacrine)(m-AMSA)、阿扎胞苷(Azacitidine)、促红细胞生成素(Erthropoietin)、六甲三聚氰胺(HMM)、白细胞介素2、米托胍腙(Mitoguazone)(甲基-GAG；甲基乙二醛双咪腙；MGBG)、喷司他丁(Pentostatin)(2′-脱氧肋间型霉素(2′-deoxycoformycin))、司莫司汀(Semustine)(甲基-CCNU)、替尼泊苷(Teniposide)(VM-26)和硫酸长春地辛(Vindesine)，但并非仅限于此。

免疫治疗剂可以选自3622W94、4B5、ANA Ab、抗-FLK-2、抗-VEGF、ATRAGEN、AVASTIN(贝伐珠单抗；Genentech)、BABS、BEC2、BEXXAR(托西莫单抗；G1axoSmithKline)、C225，CAMPATH(阿仑珠单抗；Genzyme Corp.)、CEACIDE、CMA 676、EMD-72000、ERBITUX(西妥昔单抗；ImClone Systems，Inc.)、Gliomab-H、GNI-250、HERCEPTIN(曲妥珠单抗；Genentech)、IDEC-Y2B8、ImmuRAIT-CEA、ior c5、ior egf.r3、ior t6、LDP-03、LymphoCide、MDX-11、MDX-22、MDX-210、MDX-220、MDX-260、MDX-447、MELIMMUNE-1、MELIMMUNE-2、Monopharm-C、NovoMAb-G2、Oncolym、OV103、Ovarex、Panorex、Pretarget、Quadramet、Ributaxin、RITUXAN(利妥昔单抗；Genentech)、SMART 1D10Ab、SMART ABL 364Ab、SMARTM195、TNT和ZENAPAX(达克珠单抗；Roche)，但不限于此。

本发明还包括治疗细菌感染的方法。“患有感染的受试对象”指患有由传染性微生物表层、局部或全身侵入受试对象导致的病症的受试对象。所述传染性微生物可以是病毒或细菌。

细菌是通过二分分裂来无性繁殖的单细胞生物体。根据细菌的形态学、染色反应、营养和代谢需求、抗原结构、化学成分和遗传同源性对细菌分类和命名。根据细菌的形态学形式，可以把细菌分为3组，即，球状(球菌)、直杆状(杆菌)和曲杆或螺旋杆状(弧菌、弯曲杆菌、螺旋菌和螺旋体)。细菌还更通常根据其染色反应而表征为两类生物体，即革兰氏阳性和革兰氏阴性。革兰氏(Gram)指通常在微生物学实验室中操作的染色方法。革兰氏阳性生物体在染色操作后保留了染色并呈现深紫色。革兰氏阴性生物体不保留染色但吸收复染色并因此呈现粉红色。

感染性细菌包括但不限于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。革兰氏阳性菌包括但不限于(Pasteurella)属、巴斯德菌(Staphulococci)属和链球菌(Streptococcus)属。革兰氏阴性菌包括但不限于大肠杆菌(Escherichiacoli)、假单胞菌(Pseudomonas)属和沙门氏菌(Salmonella)属。感染性细菌的具体例子包括但不限于：幽门螺旋杆菌(Helicobacter pyloris)、伯氏疏螺旋菌(Borrelia burgdorferi)、退伍军人病杆菌(Legionellapneumophilia)、分枝杆菌sps(Mycobacteria sps)(例如，结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、鸟分枝杆菌(M.avium)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、戈登分枝杆菌(M.gordonae))、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、淋球菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes，A组链球菌)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae，B组链球菌)、草绿色组链球菌(Streptococcus，viridans group)、粪链球菌(Streptococcus faecalis)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、厌氧链球菌、(Streptococcus pneumoniae)、致病弯曲杆菌属(Campylobacter sp.)、肠球菌属(Enterococcus sp.)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、棒杆菌属(Corynebacterium sp.)、猪丹毒杆菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、多杀性巴氏杆菌(Pasturella multocida)、拟杆菌属(Bacteroides sp.)、核粒梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、念珠状链杆菌(Streptobacillus moniliformis)、梅毒螺旋体(Treponema pallidum)、极细密螺旋体(Treponema pertenue)、钩端螺旋体(Leptospira)、立克次体(Rickettsia)和以色列氏放线菌(Actinomyces israelli)。

其他医学上相关的微生物在文献中有广泛的描述，例如参见C.G.AThomas，Medical Microbiology，Bailliere Tindall，Great Britain 1983，本文将其全部内容引入作为参考。每一前述列表均为说明性的，而不是限制性的。

本发明方法还可包括抗细菌剂的施用。抗细菌剂杀灭或者抑制细菌，并且包括抗生素以及具有类似功能的其他合成或天然化合物。许多抗生素是作为次级代谢产物由细胞如微生物产生的低分子量分子。一般而言，抗生素干扰对微生物而言是特异的并且不存在于宿主细胞中的一种或多种功能或结构。

可有效杀灭或抑制大范围的细菌的抗细菌抗生素称作广谱抗生素。其它类型的抗病毒抗生素主要对于革兰氏阳性类或革兰氏阴性类细菌有效。这类抗生素称作窄谱抗生素。对于单一生物体或疾病而非其它细菌类型有效的其它抗生素称作限制谱抗生素。

抗细菌剂有时根据其主要作用方式来分类。一般而言，抗细菌剂是细胞壁合成抑制剂，细胞膜抑制剂，蛋白质合成抑制剂，核酸合成或功能抑制剂和竞争性抑制剂。细胞壁合成抑制剂抑制细胞壁合成且一般为细菌肽聚糖合成过程中的步骤。细胞壁合成抑制剂包括β-内酰胺抗生素，天然青霉素，半合成青霉素，氨比西林，克拉维酸，头孢菌素类和杆菌肽。

本发明化合物可单独施用(例如在盐水或缓冲液中)，或者使用本领域公知的任何输送载体施用。所述TLR配体和抗病毒剂可与其他治疗剂如佐剂结合，以更进一步增强免疫应答。所述TLR配体和/或抗病毒剂和/或其他治疗剂可同时或序贯施用。当其他治疗剂同时施用时，它们可以在同一制剂或分离的制剂中施用，但是是在同时施用。当所述其他治疗剂和所述TLR配体和抗病毒剂的施用在时间上是分隔开的时候，所述其他治疗剂彼此之间以及与所述TLR配体和抗病毒剂之间序贯施用。这些化合物施用之间的时间间隔可以为约几分钟或者可以更长。其他治疗剂包括但不限于非核酸的佐剂、细胞因子、抗体、抗原等。

非核酸佐剂是除本文所述的免疫刺激性核酸之外的任何分子或化合物，其可刺激体液和/或细胞的免疫应答。非核酸佐剂包括例如产生长效(depo)作用的佐剂、免疫刺激性佐剂、产生长效作用并刺激免疫系统的佐剂和粘膜佐剂。

本文所用的产生长效作用的佐剂是引起抗原在体内缓慢释放，从而延长免疫细胞对抗原的暴露的佐剂。免疫刺激性佐剂是引起免疫系统的细胞活化的佐剂。“产生长效作用并刺激免疫系统的佐剂”是同时具有上述功能的那些化合物。本文所用的“非核酸粘膜佐剂”是不同于免疫刺激性核酸的佐剂，其与抗原一同施用至粘膜表面时能够诱导受试对象的粘膜免疫应答。这类分子在例如美国专利申请10/888,886(公开号US 2004/0266719)和美国专利6,406,705中进行了描述，本文将其内容引入作为参考。

免疫应答也可通过细胞因子(Bueler&Mulligan，1996；Chow等，1997；Geissler等，1997；Iwasaki等，1997；Kim等，1997)或B-7共刺激性(co-stimulatory)分子(Iwasaki等，1997；Tsuji等，1997)与所述免疫刺激性核酸和抗病毒剂的联合施用或共线性(co-linear)表达来诱导或加强。所述细胞因子可直接与免疫刺激性核酸一同施用，或者可以以编码该细胞因子的核酸载体的形式施用，使得该细胞因子可在体内表达。在一种实施方式中，所述细胞因子以质粒表达载体的形式施用。在这种实施方式中，所述免疫刺激性核酸不包含在同一质粒中。术语“细胞因子”用作各种可溶性蛋白和肽的统称，这类可溶性蛋白和肽在纳摩尔到皮摩尔浓度时充当体液调节剂，并且其在正常或病理状态下调节受试对象细胞和组织的功能活性。这些蛋白质还直接介导细胞之间的相互作用，并且调节细胞外环境中发生的过程。细胞因子的例子包括但不限于IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18粒细胞-巨噬细胞菌落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞菌落刺激因子(GCSF)、干扰素-γ(γ-IFN)、IFN-α、肿瘤坏死因子(TNF)、TGF-β、FLT-3配体和CD40配体。细胞因子在引导T细胞应答中发挥作用。辅助(CD4+)T细胞通过产生对其他免疫系统细胞包括其他T细胞起作用的可溶性因子来协调(orchestrate)哺乳动物的免疫应答。多数成熟的CD4+T辅助细胞表达两种细胞因子特征：Th1或Th2中的一种。在某些实施方式中，优选所述细胞因子为Th1细胞因子。

术语TLR配体和抗病毒剂的“有效量”指实现所需生物作用必需的或足以实现所需生物作用的剂量。例如，用于治疗或预防传染性疾病的免疫刺激性核酸和抗病毒剂的有效量是当任一者单独使用时，预防所述微生物感染必需的量(如果该受试对象未受感染)，或者降低所述感染物(否则其会在没有免疫刺激性核酸或抗病毒剂存在的情况下出现)量所必需的量。与本文提供的教导结合，通过在各种活性化合物和加权因素如功效、相对生物利用度、患者体重、不良副作用的严重性和优选的施用方式中进行选择，可以设计有效的预防或治疗性治疗方案，该方案不会产生明显的毒性而治疗特定受试对象则是完全有效的。用于任何具体应用的有效量会根据各种因素不同而变化，如所治疗的疾病或病况、施用的具体免疫刺激性核酸或抗病毒剂(例如核酸的类型即CpG核酸、免疫刺激性模体的数目或其在核酸中的位置、对所述寡核苷酸骨架的修饰程度、药物的类型)、受试对象的尺寸，或者所治疗疾病或病况的严重性。本领域技术人员可以根据经验确定具体免疫刺激性核酸和/或抗病毒剂和/或其他治疗剂的有效量，而不需要过分的实验。

在本发明的某些实施方式中，所述TLR配体和抗病毒剂以有效治疗或预防传染性疾病的协同剂量施用。协同剂量是产生高于单一的所述免疫刺激性核酸或所述抗病毒剂的单独作用的总和的生理应答的剂量。例如，在本发明的某些实施方式中，所述生理作用是减少受病毒感染的细胞的量。协同剂量是产生大于由单一的所述免疫刺激性核酸或所述抗病毒剂减少的受感染细胞的总和的受感染细胞减少量的剂量。在其他实施方式中，所述生理结果是减少体内的微生物量。在这种情况下，协同剂量是产生大于由单一的所述免疫刺激性核酸或所述抗病毒剂产生的减少量的总和的减少量的剂量。在其他实施方式中，所述生理结果是与感染相关的生理参数的降低，例如真菌损害或其他症状。例如，尿路感染的诊断是基于尿中细菌的存在和数量，当在中流、清洁排出尿样中检测到超过10⁵菌落/毫升的微生物。该数目降低至10³且优选至低于10²细菌菌落/毫升表明感染被根除了。

本文所述化合物的受试对象剂量通常为约0.1μg到10,000mg，更优选为约1μg/天到8000mg，并且更优选为约10μg到100μg。根据受试对象体重来表示，通常的剂量为约0.1μg到20mg/kg/天，更优选约1-10mg/kg/天，且最优选约1-5mg/kg/天。

在某些情况下，采用低于治疗(sub-therapeutic)剂量的TLR配体和抗病毒剂。当这两类药物一起使用时，它们可以以低于治疗剂量施用，并且仍然产生所需的治疗作用，本文所用的“低于治疗剂量”指低于在受试对象中产生治疗结果的剂量的剂量。因此，抗病毒剂的低于治疗剂量是在没有免疫刺激核酸的情况下在受试对象内无法产生所需治疗结果的剂量。抗病毒剂的治疗剂量在用于治疗传染性疾病的药物领域中是公知的。这些剂量广泛地记载在诸如Remington’s Pharmaceutical Sciences，18th ed.，1990的文献中；以及被医疗职业用作治疗传染性疾病的指南的许多其他医学文献中。免疫刺激性寡核苷酸的治疗剂量在本领域中已经有记载，并且以上已经具体描述了用于确定受试对象中的治疗剂量的方法。

在本发明的其它实施方式中，所述TLR配体和抗病毒剂以常规时间表(schedule)施用。本文所用的“常规时间表”指预先确定的指定的时间段。所述常规时间表可包括长度相同或不同的多个时间段，只要该时间表是预先确定的。例如，所述常规时间表可包括按照每日、每两天、每三天、每四天、每五天、每六天、每周、每月或其间的任意固定的天数或周数、每两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、十二个月等等进行组合物施用。可选择地，预先确定的常规时间表可包括按第一周里每日、随后几个月里每月、以及之后每三个月进行组合物的施用。所述常规时间表涵盖了任何具体的组合，只要是预先确定了涉及在某日施用的适当的时间表。

对于本文所述的任意化合物，可根据动物模型初步确定治疗有效剂量。也可根据在人类中做了测试(开始了人临床试验)的CpG寡核苷酸，以及公知显示类似药理学活性的化合物如其他佐剂(如LT和用于疫苗接种目的的其他抗原)的人类数据来确定治疗有效剂量。对于肠胃外施用可能需要更高的剂量。可根据所施用化合物的相对生物利用度和效力来调整施用的剂量。根据本文所述的方法和本领域公知的其他方法来调整获得最大效力的剂量完全属于本领域技术人员的能力范围。

本发明制剂以可药用溶液施用，该溶液可常规地包含可药用浓度的盐、缓冲剂、防腐剂、相容载体、佐剂，以及任意包含的其他治疗成分。

对于治疗中的使用，可通过将组合物输送至所需表面如粘膜、全身的任何方式来将有效量的TLR配体和抗病毒组合物给予受试对象。给予本发明的药物组合物可通过本领域技术人员公知的任何手段来实现。优选的施用途径包括但不限于经口、肠胃外、肌内、鼻内、舌下、气管内、吸入、经眼、阴道和直肠。

对于口服施用，可通过将活性化合物与本领域中已知的可药用载体相混合从而容易地配制化合物(即CpG免疫刺激性寡聚核苷酸、抗原和其它治疗剂)。这些载体使本发明的化合物能被配制为片剂、丸剂、糖衣丸剂、胶囊剂、液体剂、凝胶剂、糖浆剂、浆剂、悬浮剂等以便被治疗的受试对象口服消化。可以以固体赋形剂，选择性地研磨所得混合物并加工所述颗粒混合物，需要时加入合适的辅剂之后得到片剂或糖衣丸剂芯从而获得口服用药物制剂。合适的赋形剂具体为，诸如糖之类的填料，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇；纤维素制剂，诸如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。需要时可以加入崩解剂，诸如交联聚乙烯基吡咯烷酮、琼脂或褐藻酸或其盐(诸如海藻酸钠)。选择性地，口服制剂也可配制在盐中水或用于中和内部酸环境的缓冲液(如EDTA)中或者无需任何载体而施用。

还具体设想的是上述一种或多种成分的口服剂型。所述一种或多种成分可经化学修饰从而使得衍生物的口服输送有效。通常，所设想的化学修饰是将至少一部分连接在所述成分分子本体上，其中所述部分能够(a)抑制蛋白质水解；和(b)从胃或肠摄入到血液中。还希望的是一种或多种成分的整体稳定性的增加和体内循环时间的增加。这些部分的例子包括：聚乙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和聚脯氨酸。见Abuchowski和Davis，1981，″Soluble Polymer-Enzyme Adducts″In：Enzymes as Drugs，Hocenberg和Roberts，eds.，Wiley-Interscience，New York，NY，pp.367-383；Newmark，等，1982，J.Appl.Biochem.4：185-189。其它可使用的聚合物是聚-1，3-二氧戊环和聚-1，3，6-tioxocane。如上所述，优选为药物使用的是聚乙二醇部分。

对于所述成分(或衍生物)，释放位置可以是胃、小肠(十二指肠、空肠或回肠)，或大肠。本领域技术人员有可供使用的不在胃中溶解，却在十二指肠或肠道其它位置释放材料的制剂。优选为，所述释放或者通过寡聚核苷酸(或衍生物)的保护或通过在胃环境之外例如在肠中释放生物活性材料从而避免胃环境的不利影响。

为了确保充分的胃部耐受，在对至少pH 5.0的环境而言不可渗透的包衣是必需的。用作肠溶性包衣的更常用的惰性成分的例子是醋酸纤维素偏苯三酸酯(CAT)、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯(HPMCP)、HPMCP 50、HPMCP 55、聚醋酸乙烯酯邻苯二甲酸酯(PVAP)、EudragitL30D、Aquateric、邻苯二甲酸醋酸纤维素(CAP)、Eudragit L、EudragitS和虫胶。这些包衣可以混合膜形式使用。

包衣或包衣混合物可也用在片剂上，而这并非旨在保护免受胃的影响。这可包括糖制包衣或使片剂易于吞咽的包衣。胶囊可由硬壳(诸如明胶)构成以输送干燥治疗剂即粉末；对于液体形式，可使用软明胶。胶囊剂的壳材料可以是厚淀粉或其它可食用纸。对于丸剂、锭剂、模制片剂或片剂粉末，可以使用湿式结块技术。

治疗剂可以以粒径约1mm的颗粒或微球形式包含在制剂中作为微细的复合颗粒。用于胶囊施用的材料的制剂也可以是粉末、略微压缩的栓剂或者甚至片剂。所述治疗剂可通过压缩制备。

着色剂和调味剂也均可加入。例如，寡聚核苷酸(或衍生物)可经配制(诸如通过脂质体或微球体包封)，然后进一步包装在可食用产品诸如含有着色剂和调味剂的冰冻饮料之中。

可用惰性材料稀释或增加治疗剂的体积。这些稀释剂可包括碳水化合物，具体为甘露醇、α-乳糖、无水乳糖、纤维素、蔗糖、改性葡聚糖和淀粉。某些无机盐也可用作填料，包括三磷酸钙、碳酸镁和氯化钠。一些商售稀释剂是Fast-Flo、Emdex、STA-Rx 1500、Emcompress和Avicell。

可包括崩解剂使治疗剂制剂为固体剂型。用作崩解剂的材料包括但不限于淀粉，包括基于淀粉的商业崩解剂，羧甲基淀粉钠(Explotab)。乙醇酸淀粉钠、安伯来特(Amberlite)、羧甲基纤维素钠、超直链淀粉(ultramylopectin)、褐藻酸钠、明胶、橘皮、酸式羧甲基纤维素、天然海绵和膨润土均可使用。崩解剂的另一形式是不溶性阳离子交换树脂。粉末树胶也可用作崩解剂和粘合剂并且这些可包括粉末树胶诸如琼脂、刺梧桐树胶或黄芪胶。褐藻酸及其钠盐也可用作崩解剂。

粘结剂可用来将治疗剂保持在一起以形成硬质片剂，并且包括来自天然产物的材料，例如阿拉伯胶、黄蓍胶、淀粉和明胶。其他材料包括甲基纤维(MC)、乙基纤维素(EC)和羧甲基纤维素(CMC)。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和羟丙基甲基纤维素(HPMC)均可用在醇溶液中以使治疗剂成粒。

在所述治疗剂的制剂中可包括抗摩擦剂，以防止制剂过程中的粘连。在所述治疗剂与模具壁之间可使用润滑剂作为中间层，这些润滑剂包括但不限于：硬脂酸(包括其镁盐和钙盐)、聚四氟乙烯(PTFE)、液体石蜡、植物油和蜡类。也可使用可溶性的润滑剂，例如十二烷基硫酸钠和十二烷基硫酸镁、各种分子量的聚乙二醇，Carbowax 4000和6000。

也可加入滑动剂以在配制过程中改善药物的流动性质并有助于在压缩时的重新分配。所述滑动剂可包括淀粉、滑石、热解硅石和含水硅铝酸盐。

为有助于治疗剂溶解在水性环境中，可加入表面活性剂作为润湿剂。表面活性剂可包括阴离子去垢剂诸如十二烷基硫酸钠、二辛基硫代琥珀酸钠和二辛基磺酸钠。阳离子去垢剂也可以使用，包括氯化苯扎溴铵或苄索氯铵。可包含在制剂之中作为表面活性剂的潜在非离子去垢剂的列表有聚桂醇400、硬脂酸聚烃氧(40)酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50和60、甘油单硬脂酸酯、聚山梨酸酯40、60、65和80、蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素和羧甲基纤维素。这些表面活性剂或者单独地或者作为具有不同比例的混合物存在于所述寡聚核苷酸或衍生物的制剂中。

可口服使用的药物制剂包括由明胶制得的压入式(push-fit)胶囊，以及由明胶和塑化剂诸如甘油或山梨糖醇制得的软密封胶囊。所述压入式(push-fit)胶囊可含有与填料诸如乳糖、粘合剂诸如淀粉和/或润滑剂诸如滑石或硬脂酸镁和可选地稳定剂相混合的活性成分。在软胶囊中，活性化合物可溶解或悬浮在合适的液体诸如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇中。此外，可加入稳定剂。也可以使用用于口服施用的微球体。这些微球体已经在本领域中很好地得以定义。用于口服施用的所有制剂应当为适于如此施用的剂量。

就口腔施用而言，所述组合物可以采用以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。

为了通过吸入进行施用，根据本发明使用的化合物可以利用合适的推进剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体，以来自加压包装或喷雾器的气溶胶喷雾形式便捷地输送。在加压气溶胶的情况下，通过提供输送特定量的阀门确定单位剂量。在吸入器或吹药器中使用的例如明胶的胶囊和药筒可以配制为含有化合物和合适的粉末基质诸如乳糖或淀粉的粉末混合物。

本文还设想了所述寡核苷酸(或其衍生物)的肺部输送。在吸入时所述寡核苷酸(或衍生物)被输送至哺乳动物的肺部，并且穿透肺粘膜上皮进入血流。吸入分子的其他报道者包括Adjei等，1990，PharmaceuticalResearch，7：565-569；Adjei等，1990，International Journal ofPharmaceutics，63：135-144(醋酸亮丙瑞林)；Braquet等，1989，Journal ofCardiovascular Pharmacology，13(suppl.5)：143-146(内皮素-1)；Hubbard等，1989，Annals of Internal Medicine，Vol.Ill，pp.206-212(al-抗胰蛋白酶)；Smith等，1989，J.Clin.Invest.84：1145-1146(a-1-蛋白酶)；Oswein等，1990，″Aerosolization of Proteins″，Proceedings ofSymposium on Respiratory Drug Delivery II，Keystone，Colorado，March，(重组人生长激素)；Debs等，1988，J.Immunol.140：3482-3488(干扰素-g和肿瘤坏死因子α)以及Platz等的美国专利5,284,656(粒细胞集落刺激因子)。在1995年9月19日授权给Wong等人的美国专利5,451,569中记载了用于获得全身效果的药物肺部输送的方法和组合物。

在本发明的实践中设想使用的是大量设计用于治疗剂产品肺部输送的机械装置，包括但不限于吹药器、配量吸入器和粉末吸入器，所有这些对本领域技术人员都是熟悉的。适用于本发明的实践的商业装置的一些具体例子是Ultravent吹药器，由Mallinckrodt，Inc.，圣路易斯，密苏里州制造；Acorn II吹药器，由Marquest Medical Products，Englewood，科罗拉多州制造；Ventolin配量吸入器，由Glaxo Inc.，Research TrianglePark，北卡罗来纳州制造；和Spinhaler粉末吸入器，由Fisons Corp.，Bedford，马萨诸塞州制造。

所有这类装置均需要使用适合于寡核苷酸(或衍生物)分配的制剂。通常，每种制剂专门针对所用类型的设备，并且除可用于治疗的常规稀释剂、佐剂和/或载体外，还可以包括使用适合的推进材料。同样，设想了使用脂质体、微囊或微球体、内含复合物或其他类型的载体。根据化学修饰的类型或者所用装置的类型，化学修饰的寡核苷酸也可制成不同的制剂。

适用于喷雾器(喷射雾化器或超声喷雾器)的制剂通常包括以约0.1-25mg生物活性寡核苷酸/mL溶液的浓度将寡核苷酸(或衍生物)溶解在水中。所述制剂还可包括缓冲剂和简单糖(例如用于寡核苷酸稳定化和渗透压的调节)。所述喷雾器制剂还可包含表面活性剂，以减少或防止在气雾剂形成中由溶液雾化引起的表面诱导的寡核苷酸聚集。

与配量吸入器一起使用的制剂通常包括精细分散的粉末，其含有在表面活性剂的协助下悬浮在推进剂中的寡聚核苷酸(或衍生物)。所述推进剂可以是任何能为此目的采用的传统材料，诸如含氯氟烃、含氯氟碳氢化合物、含氟碳氢化合物或碳氢化合物，包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙烷和1，1，1，2-四氟乙烷或其组合。合适的表面活性剂包括山梨聚糖三油酸酯和大豆卵磷脂。油酸也可用作表面活性剂。

从粉末吸入器装置中分发而出的制剂将包括含有寡聚核苷酸(或衍生物)的细碎粉末并还可以含有能有助于粉末从装置中分散而出的量例如占制剂50重量％至90重量％的疏松剂诸如乳糖、山梨糖醇、蔗糖或甘露醇。所述寡聚核苷酸(或衍生物)应当最有利地制备为颗粒形式，平均粒径小于10mm(或微米)，最优选为0.5至5mm，以便于最有效地输送至肺末梢。

也设想了本发明的药物组合物的鼻腔输送。鼻腔输送使得在施用治疗剂产品至鼻部之后本发明的药物组合物直接进入血液，而无需将产品堆积到肺部。鼻腔输送的制剂包括含有葡聚糖或环葡聚糖的那些制剂。

针对鼻腔施用，有用的装置是其上连接有配量喷雾器的小硬质瓶。在一个实施方式中，通过将本发明的药物组合物吸入到具有确定体积的小室中从而输送配定剂量，所述小室具有小孔，小孔的大小使得通过小室中的液体被压缩时形成喷雾从而使气溶胶制剂气雾化。小室被压缩从而施用本发明的药物组合物。在具体实施方式中，小室为活塞式设置。这些装置可通过商业途径获得。

另外一种方式，可使用塑料挤压瓶，其具有小孔或开口，小孔或开口的大小使得通过挤压形成喷雾从而使气溶胶制剂气雾化。开口通常位于瓶子的顶部，顶部通常逐渐变细以适合放入鼻腔从而有效地施用气溶胶制剂。优选为，为了施用测定剂量的药物，鼻腔吸入器将提供配量的气溶胶制剂。

当需要全身输送所述化合物时，所述化合物可配制用来通过注射进行肠胃外施用，例如通过快速浓注或者持续的灌注(infusion)。可以将注射用制剂制成单位剂型，例如添加了防腐剂的安瓿或多剂量容器形式。这些组合物可以采取诸如在油或水性载体中的悬浮液、溶液或乳剂的形式，并且可以包含配制助剂如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。

用于肠胃外施用的药物制剂包括水溶性形式的活性化合物的水溶液。另外，可以将活性化合物的悬浮液制成适合的油注射悬浮液。适合的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油如芝麻油，或合成脂肪酸酯类如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体。水性注射悬浮液可以包含能提高该悬浮液粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选地，该悬浮液还可包含适合的稳定剂或能提高化合物溶解度的试剂，以便制备高浓缩的溶液。

另外一种方式，活性化合物可以为粉末形式，以供在使用前用合适的载体例如无菌无热源水重新配制。

所述化合物也可配制在直肠或阴道组合物中如栓剂或滞留灌肠剂，例如包含常规栓剂基材如可可脂或者其他的甘油酯。

除之前描述的制剂之外，所述化合物还可以调制为长效制剂。这样的长期作用制剂可用稳定的聚合性或疏水性材料(在可接受的油中的乳液)或离子交换树脂，或微溶衍生物例如微溶盐进行配制。

所述药物组合物还可以包括适合的固体或凝胶相载体或者赋形剂。这类载体或赋形剂的实例包括但不限于：碳酸钙、磷酸钙、各种糖类、淀粉、纤维素衍生物、明胶和聚合物如聚乙二醇类。

适合的液体或固体药物剂型为：例如吸入用含水或盐水溶液、微囊化的、内螺旋化的、包覆在极小的金颗粒上的、包含在脂质体中的、雾化的、气溶胶、用于植入皮肤的颗粒或者干燥到锋利的物体上以划入皮肤中。所述药物组合物还包括颗粒剂、粉剂、片剂、包衣片剂、(微)胶囊剂、栓剂、糖浆剂、乳剂、悬浮液剂、霜剂、滴剂或者活性化合物长期释放的制剂，在该制剂中通常如上所述使用赋形剂和添加剂和/或助剂，如崩解剂、粘结剂、包衣剂、溶胀剂、润滑剂、调味剂、甜味剂或增溶剂。所述药物组合物适用于各种药物输送系统。对于药物输送方法的简单综述，参见Langer，Science 249：1527-1533，1990，本文将该文献引入作为参考。

所述组合物可以其本身(纯的)或者以可药用盐形式施用。当用于药物中时，所述盐应为可药用，但非可药用盐也可以便利性地用于制备其可药用盐。这类盐包括但不限于由下列酸制备的那些盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、对-甲苯磺酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸，萘-2-磺酸和苯磺酸。此外，这类盐可以制备成羧酸基团的碱金属或碱土金属盐，如钠，钾或钙盐。

适合的缓冲剂包括：乙酸和盐(1-2％w/v)；柠檬酸和盐(1-3％w/v)；硼酸和盐(0.5-2.5％w/v)；以及磷酸和盐((0.8-2％w/v)。适合的防腐剂包括苯扎氯铵(0.003-0.03％w/v)；氯代丁醇(0.3-0.9％w/v)；对羟基苯甲酸类(0.01-0.25％w/v)和硫柳汞(0.004-0.02％w/v)。

本发明的药物组合物包含任选包含在可药用载体中的有效量的组合物。术语可药用载体指适合于对人或其它脊推动物施用的一种或多种相容性固体或液体填充剂、稀释剂或包埋物质。术语载体指天然或合成的有机或无机成分，其与活性成分合并以方便施用。所述药物组合物各成分彼此之间，以及与本发明化合物之间，能够以特定方式混合，使得不存在明显损害所需药物功效的相互作用。

在其他方面，本发明涉及用于治疗传染性疾病的试剂盒。本发明的一种试剂盒包括容纳免疫刺激性核酸的容器和容纳抗病毒剂的容器，以及所述免疫刺激性核酸和抗病毒剂施用时间的说明书。优选地，所述免疫刺激性核酸供全身施用，据此提供所述说明书。在一种重要的实施方式中，容纳所述免疫刺激性核酸的容器是缓释载体，其在本文中的含义与其现有技术中的含义相同，即任何缓慢释放所述免疫刺激性核酸的装置。

除了使用所述TLR配体和抗病毒剂来预防人的感染外，所述组合物还适用于治疗非人脊椎动物。群居以及杂居(如在动物园中)的非人脊椎动物、农场和研究用动物也可作为本发明方法的受试对象。动物园的动物，诸如包括例如狮、虎、豹、猎豹和美洲狮的猫科动物；大象、长颈鹿、熊、鹿、狼、牦牛、非人灵长类、海豹、海豚和鲸鱼；以及研究用动物如小鼠、大鼠、仓鼠和沙鼠都是本发明方法的潜在受试对象。

诸如母鸡、小鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑和雉鸡的鸟类是许多类型的传染病的首要目标。在出生后不久，孵化的小鸟就暴露于致病微生物。虽然，这些小鸟最初借助从母体继承的抗体保护来对抗病原体，但是这种保护只是暂时的，并且所述小鸟自身不成熟的免疫系统必须开始保护它对抗病原体。通常希望在幼年鸟类最易生病的时候预防它们的感染。还希望预防年老的鸟类的感染，特别是当这些鸟类属于群居的时候，这会导致疾病的迅速扩散。因此，希望对鸟类给予所述免疫刺激性寡核苷酸和抗病毒剂以预防传染性疾病。

小鸡中的常见感染的例子是小鸡传染性贫血病毒(CIAV)。CIAV首次是1979年在日本，在马立克氏病疫苗接种中断的研究过程中分离出来的(Yuasa等，1979，Avian Dis.23：366-385)。自那时起，在所有主要家禽饲养国家的商业家禽中均检测到CIAV(van Bulow等，1991，pp.690-699，Diseases of Poultry，9th edition，Iowa State University Press)。

CIAV感染在年幼易受感染的小鸡中导致临床疾病，表现为贫血、出血和免疫抑制。CIAV-感染的小鸡的胸腺萎缩和骨髓萎缩以及相关伤害也是CIAV感染的特征。在胸腺以及偶尔在腔上囊中的淋巴细胞枯竭导致免疫抑制，以及对于次生病毒、细菌或真菌感染的易感性升高，这会使疾病进程更加复杂。在感染马立克氏病病毒(MDV)、传染性囊病病毒、网状内皮细胞增生病病毒、腺病毒或呼肠孤病毒中的一种或多种之后，所述免疫抑制可能会导致恶化的疾病。已经报道，MDV发病机理会被CIAV强化(DeBoer等，1989，p.28 In Proceedings of the 38thWestern Poultry Diseases Conference，Tempe，Ariz.)。此外，已经报道CIAV会恶化传染性囊病的症候(Rosenberger等，1989，Avian Dis.33：707-713)。由于CAA，小鸡会发展出对实验诱导的疾病的年龄抗性。这种情况在2周龄时基本完成，但是更高龄的鸟类任然易受感染(Yuasa，N.等，1979supra；Yuasa，N.等，Arian Diseases 24，202-209，1980)。然而，如果小鸡用CAA和免疫抑制药剂(IBDV，MDV等)进行双重感染，对所述疾病的年龄抗性会延迟(Yuasa，N.等，1979and 1980supra；Bulowvon V.等，J.Veterinary Medicine 33，93-116，1986)。可能会加强疾病传播的CIAV的特征包括对环境灭活和某些常用消毒剂的高耐受性。疾病爆发期间10-30％的感染鸟类死亡这一事实清楚表明了CIAV感染对家禽工业的经济影响。

牛和牲畜同样易受感染。影响这些动物的疾病可导致严重的经济损失，特别是在牛中。本发明方法可用于防护牲畜的感染，例如奶牛、马、猪、绵羊和山羊。

奶牛会受牛病毒的影响。牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是小的包膜阳性链RNA病毒，并且与猪瘟病毒(HOCV)和羊边境病病毒(BDV)一起被划归瘟病毒属。虽然，瘟病毒之前划归披膜病毒科，一些研究者建议将它们与黄热病病毒和丙型肝炎病毒(HCV)属一起重新划归属黄病毒科(Francki，等，1991)。

根据细胞培养实验，可将BVDV(一种重要的牛病原体)区分为致细胞病变的(CP)和非致细胞病变的(NCP)生物类型(biotype)。虽然两种生物类型均可在牛中发现，但是NCP生物类型传播更广。如果怀孕的牛被NCP菌株感染，那么该牛会生出永久感染并且特别免疫耐受的牛犊，其在整个一生中都会散播病毒。永久感染的牛会患上粘膜病，随后可从该动物中分离出全部两种生物类型。临床表明可包括流产、畸形生长和呼吸作用问题、粘膜病和轻微腹泻。此外，已经报道了与牛群流行病相关的严重的血小板减少可能会导致动物的死亡，并且与这种疾病相关的菌株似乎比常规的BVDVs致病性更强。

马疱疹病毒(EHV)包括一族抗原不同的生物试剂，其引起马的多种感染从临床症状不显的到致命的疾病。这些包括马疱疹病毒-1(EHV-1)，一种在马中普遍存在的病原体。EHV-1与流产、呼吸道疾病和中枢神经系统病症的流行病相关。幼年马上呼吸道的初次感染导致持续8-10天的发热疾病。经过免疫的母马也可能通过呼吸道再次感染而没有明显患病，从而经常在没有警示的情况下发生流产。神经综合症与呼吸道疾病或流产相关，并且会影响任何年龄的任一性别的动物，导致不协调、虚弱和继发的瘫痪(Telford，E.A.R.等，Virology 189，304-316，1992)。其他EHVs包括EHV-2或马细胞巨化病毒、EHV-3、马媾疹病毒和EHV-4(以前划归EHV-1亚型2)。

绵羊和山羊会被多种危险的微生物感染，包括梅迪-维斯那病。

诸如猴、猿猴和猕猴的灵长类会被猴免疫缺陷病毒所感染。已经报道了灭活的细胞-病毒和不含细胞的全猴免疫缺陷疫苗能对猕猴提供保护(Stott等，(1990)Lancet 36：1538-1541；Desrosiers等，PNAS USA(1989)86：6353-6357；Murphey-Corb等，(1989)Science 246：1293-1297；and Carlson等，(1990)AIDS Res.Human Retroviruses 6：1239-1246)。已经报道了重组HIV gpl20疫苗能为黑猩猩提供保护(Berman等，(1990)Nature 345：622-625)。

无论是家养的还是野生的猫科动物均易被各种微生物所感染。例如，猫传染性腹膜炎是在家养和野生猫科动物如狮、豹、猎豹和美洲虎中均会出现的疾病。当需要预防这种或其他类型的病原生物对猫科动物的感染，本发明方法可用于预防或治疗猫科动物的感染。

家猫可以被多种逆转录病毒感染，包括但不限于猫白血病毒(FeLV)、猫肉瘤病毒(FeSV)、内源C型致肿瘤RNA病毒(RD-114)和猫合胞体-形成病毒(FeSFV)。其中，FeLV是最重要的病原体，引起多种症状，包括淋巴网状内皮细胞瘤和骨髓瘤、贫血、免疫介导的病症和类似于人获得性免疫缺损综合症(AIDS)的免疫缺陷综合症。最近，更特别地将一种称为FeLV-AIDS的特别的复制-缺陷FeLV突变体与免疫抑制性质关联起来。

猫T-淋巴细胞慢病毒(也称为猫免疫缺陷)的发现首先报道于Pedersen等，(1987)Science 235：790-793中。FIV的特征报道于Yamamoto等，(1988)Leukemia，December Supplement 2：204S-215S；Yamamoto等，(1988)Am.J.Vet.Res.49：1246-1258；和Ackley等，(1990)J.Virol.64：5652-5655中。FIV的克隆和序列分析报道于Olmsted等，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2448-2452和86：4355-4360中。

猫传染性腹膜炎(FIP)是在家养和野生猫科动物中反复无常地发生的一种散发病。虽然FIP主要是家猫的疾病，其已经在狮、美洲狮、豹、猎豹和美洲虎中发现。已知会患FIP的小型野生猫科动物包括猞猁和狞獾、沙猫和雪豹。在家猫中，该疾病主要出现在幼年动物中，尽管所有年龄的猫科动物都易受感染。峰值发生率主要发生在6到12个月龄。从5到13年龄会观察到发生率的降低，随后在14到15年龄的猫中发生率上升。

本发明还包括同时筛查包含抗病毒剂和免疫刺激性寡核苷酸的分子的免疫刺激活性以及抗病毒活性的方法。这可通过使用从病毒感染的患者分离出的免疫细胞(例如通过检测细胞因子生成和病毒滴定量)，或者体外抗病毒测试系统(例如HCV复制子)与体内免疫刺激测试系统(例如承担TLR9/IFN-α信号传导途径的细胞系)的组合，或者模拟病毒感染的体外病毒测试系统(例如用于HCV的牛病毒性腹泻病毒感染的PBMC)来进行。此外，由于许多病毒借助它们的蛋白质抗病毒作用来靶向(例如TLR-介导的信号传导)，可使用天然包含所关注的TLR信号传导途径和所述抗病毒剂或者由它们转染的细胞体系来筛查抗病毒剂和免疫刺激性寡核苷酸的组合作用。

本发明的筛查方法适用于鉴定免疫刺激性寡核苷酸与抗病毒治疗的有效的抗病毒组合物。一种筛查方法采用从病毒感染患者分离的免疫细胞，随后用本发明组合物对所述细胞进行处理。可通过检测细胞因子生成和病毒滴定量来评估该组合物的效力。这种检测可使用体外抗病毒测试系统如HCV复制子(需要参照物)和体内免疫刺激测试系统如承担TLR9/IFN-α信号传导途径的细胞系来进行。可使用的另一体外病毒测试系统是模拟病毒感染的系统，例如感染牛病毒性腹泻病毒的PBMC作为HCV的模型。此外，由于许多病毒靶向体内的抗病毒过程(如TLR-介导的信号传导)，可使用天然包含所关注的TLR信号传导途径和所述抗病毒组合物或者由它们转染的细胞体系来筛查抗病毒剂和免疫刺激性寡核苷酸的组合作用。例如，在一种这类组合中，所述抗病毒剂是NS3/4蛋白酶，且所述免疫刺激性寡核苷酸是CpG寡核苷酸。

实施例

方法

寡核苷酸和试剂

所有的ODN和ORN均购自Biospring(Frankfurt，德国)或由ColeyPharmaceutical GmbH(Langenfeld，德国)提供，鉴定和纯度由ColeyPharmaceutical GmbH来控制，并且具有由Limulus测定无法检测到的内毒素水平(＜0.1EU/ml)(BioWhittaker，Verviers，比利时)。将ODN悬浮于无菌、无内毒素的Tris-EDTA(Sigma，Deisenhofen，德国)中，ORN悬浮在无菌、不含DNAse和RNAse的dH₂O(Life Technologies，Eggenstein，德国)中，并且在无菌条件下储存和操作，以防止微生物和内毒素污染。使用不合内毒素的Tris-EDTA或不含DNAse和RNAse的dH₂O进行所有的稀释。包括8-氧代-rG和氯喹的核苷得自Sigma或ChemGenes(Wilmington，MA，USA)，并且溶解在DMSO、NaOH或H₂O中。

细胞纯化

来自健康人类捐献者的外周血血沉棕黄层制剂从杜塞尔多夫大学(德国)血库获得，并且通过在Ficoll-Hypaque(Sigma)上离心来纯化PBMC。将细胞在潮湿的孵育器中于37℃在RPMI 1640培养基中培养，该培养基中补充了5％(v/v)加热灭活的人AB血清(Bio Whittaker)或10％(v/v)加热灭活的FCS、2mM L-谷酰胺、100U/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素(均来自Sigma)。

细胞因子检测

将PBMC以5×10⁶细胞/ml的浓度悬浮，并且加入到96孔圆底平板中(250μl/孔)。将PBMC用不同的ODN、ORN或核苷浓度孵育，并且在所示时间点采集培养物上清液(SN)。如果不即刻使用，那么将SN储存在-20C下直到需要为止。对于抑制实验，用所示的TLR配体浓度和加入的核苷或ORN来刺激细胞。在某些实验中，在细胞培养开始1小时后加入另一经修饰的ORN。

使用市售的用于IL-12p40(来自BD Biosciences，Heidelberg，德国)、IFN-γ和TNF-α(来自Diaclone，Besancon，法国)的ELISA试剂盒，或者使用用市售抗体(PBL，New Brunswick，NJ，美国)开发的用于IFN-α的内部ELISA来评估SN中的细胞因子量。

对于众多的细胞因子和趋化因子组合的分析，采用来自Bio-Rad(Munich，Germany)的luminex系统和来自Biosource(Solingen，Germany)的多重试剂盒来进行多重分析。

实施例1观察到将8-修饰的鸟苷连接至免疫刺激性核酸的协同作用

用8-氧代-rG(C-8取代的鸟苷)修饰的ORN(SEQ ID NO：1-4)和未修饰的ORN(SEQ ID NO：8)来刺激人PBMC(n＝3)。收集上清液，并检测细胞因子IFN-α(图1a)、IL-12p40(图1b)和TNF-α(图1c)。数据表明，相比未修饰的ORN SEQ ID NO：10，在序列中增加8-氧代-rG增强了IFN-α和IL-12诱导活性。

实施例28-修饰的G在RNA序列中的位置可增强活性

用所示的在ORN的不同位置具有单一8-氧代-rG的ORN(SEQ IDNO：1-4)和8-溴-dA修饰的阴性对照(SEQ ID NO：8)来刺激人PBMC(n＝3)。收集上清液并检测IFN-α。数据显示8-氧代-rG包含在5’位(SEQ ID NO：1和3)，而不是在3’位(SEQ ID NO：2和4)时，会产生增强的细胞因子诱导(图2)。

实施例3在ORN 5’末端的不同的8-修饰的脱氧-和核糖核苷酸增强免疫刺激活性

采用所示的在ORN的5’末端具有单一8-氧代-rG/Dg(SEQ IDNO：1，5)、8-溴-dG(SEQ ID NO：7)或7-硫代-8-氧代-鸟苷(immunosine)(艾沙托立宾)(SEQ ID NO：6)(具有5’-5’链接)的ORN来刺激人PBMC(n＝3)，并检测IFN-α。数据显示，相比未修饰的ORN(SEQ ID NO：8和11)，在5’位加入8-修饰的G(无论是脱氧-还是核糖核苷酸)会产生增强的细胞因子诱导(图3)。对8-溴-rG得到类似的数据(数据未示出)。此外，甚至8-修饰的dA或rA的链接(数据未示出)也会导致细胞因子诱导的增强，尽管幅度较小。

实施例4利巴韦林与免疫刺激性CpG ODN组合导致IL-10相对IFN-α诱导活性降低

通过用CpG ODN(SEQ ID NO：15)刺激人PBMC，并与剂量不断提高的利巴韦林一同培养，可观察到利巴韦林对CpG-诱导的IL-10诱导的抑制作用。重要的是，对于IFN-α没有观察到利巴韦林的抑制作用。特别是在丧失利巴韦林剂量时观察到这种现象。

表1通过向含有1μM SEQ ID NO：13的培养物中加入利巴韦林而计算所得的IC50

	IC50IFN-α	IC50IL-10	IC50IL-6
	IC50IFN-α	IC50IL-10	IC50IL-6	利巴韦林	1000μM	58μM	320μM

该观察结果对于利巴韦林在治疗指示中的应用具有重要意义。IL-10是一种调节细胞因子，其经常抵消治疗干预作用(如对于TLR配体或IFN-α治疗)。抑制IL-10的能力对于药物组合非常有用，因为它使得IFN和其他细胞因子能产生更强的应答，从而提高治疗剂组合的效力。因此，利巴韦林的这种作用可导致用上述药剂与利巴韦林的组合进行治疗的患者体内的细胞因子环境改变，产生更强的、不受抑制的细胞因子或TLR配体的作用。

表2：核酸序列

Seq ID No	序列
Seq ID No	序列	1	rOrUrUrOrUrOrU
2	rGrUrUrOrUrGrU	1	rOrUrUrOrUrOrU
2	rGrUrUrOrUrGrU	3	rOrUrUrGrUrGrU
4	rGrUrUrGrUrOrU	3	rOrUrUrGrUrGrU
4	rGrUrUrGrUrOrU	5	OrUrUrGrUrGrU
6	iIMrUrUrGrUrGrU	5	OrUrUrGrUrGrU
6	iIMrUrUrGrUrGrU	7	BGrUrUrGrUrGrU
8	rGrUrUrGrUrGrU	7	BGrUrUrGrUrGrU
8	rGrUrUrGrUrGrU	9	rGrCrCrArCrCrGrArGrCrCrGrArArGrGrCrArC*rC
10	BArUrUrGrUrGrU	9	rGrCrCrArCrCrGrArGrCrCrGrArArGrGrCrArC*rC
10	BArUrUrGrUrGrU	11	rCrCrGrUrCrUrGrUrUrGrUrGrUrGrArCrU*rC
12	rUrUrGrUrUrGrUrUrGrUrUrGrUrUrGrUrUrGrU*rU	11	rCrCrGrUrCrUrGrUrUrGrUrGrUrGrArCrU*rC
12	rUrUrGrUrUrGrUrUrGrUrUrGrUrUrGrUrUrGrU*rU	13	TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCC*G
14	TCCATGACGTTCCTGATGC	13	TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCC*G

实施例5利巴韦林在体外和体内对免疫刺激性CpG ODN介导的T细胞细胞因子生成的作用

用10mg/kg腹膜内施用(IP)利巴韦林(RBV)的初始实验显示RBV在体内无效果，并且体外IFN-γCD3-诱导的生成甚至可能稍有降低。然而，在RBV存在下体外抗-CD3刺激显示出增强的IFN-γ生成，但仅在非常低浓度的RBV(1-5μM)情况下。我们用低剂量的RBV在体内(0.5mg/kg IP)进行了重复实验。

用SEQ ID NO.14(100微克SC)、RBV(0.5mg/kgIP)或者SEQ IDNO.14和RBV对小鼠进行注射。在第0天或第5天体内给予RBV，且在第0天给予CpG。在第6天从腹股沟淋巴结中分离样本，并且在1-16μM RBV存在下保持在抗-CD3涂覆板上的介质中。在第8天进行ELISA分析以检测IFN-γ。

正如所预期的，体内CpG ODN增强了体外T细胞IFN-γ生成(图4B)。在没有CpG ODN的条件下观察到RBV对IFN-γ生成的小幅作用(图4A)。然而，当CpG ODN也被注入时，RBV对IFN-γ生成的作用大幅加强。观察到RBV对CD3-介导的IFN-γ生成的体外作用独立于之前的ODN/RBV处理。结果如图5所示。类似于上述数据，低浓度的RBV体外提高的IFN-γ水平独立于之前的体内处理(图5A)。与CpGODN组合的作用如图5B所示。使用骨髓(BM)来源的树突细胞(DCs)进行了类似的实验。将保持在GM-CSF中的BM-来源的DC用SEQ IDNO.14、RBV(1μM、5μM、10μM、100μM或120μM)处理，或用SEQID NO.14和RBV处理。在第4、24和72小时时测试样本的细胞因子、IL-10(图6)、IL-12p40(图7A)、IL-12p70(图7B)和TNF(数据未示出)。在120μM没有观察到单独RBV的作用。SEQ ID NO.14诱导IL-12、IL-10和TNF。RBV降低IL-10和TNF，但是提高IL-12(仅在72h时)。如图6所示，RBV降低了SEQ ID NO.14-诱导的IL-10。RBV降低了SEQ ID NO.14-诱导的IL-12p40，并增强IL-12p70(小幅的)。

实施例6利巴韦林和CpG ODN在小鼠癌症模型中的体内作用

用SEQ ID NO.14和RBV对C26 SC小鼠模型进行处理(在第7、14和21天100毫克ODN intra/peri肿瘤，且同一天进行0.5mg/kg RBVIP)。数据如图8所示。对于单独CpG ODN的30-40天，该合并治疗产生了更长的小鼠存活期。如图8所示，虽然根据对数级分析，CpG ODN加RBV相对于单独的CpG ODN治疗并没有产生统计学显著性，但是有明确的改善存活率的趋势。

等效方案

以上撰写的说明书被认为足以使本领域技术人员实施本发明。本发明的范围并不限于所提供的实施例，因为这些实施例旨在作为对本发明一个方面的单一解释，而其它功能上等效的实施方案也属于本发明的范围。除了本文所示和所述的那些外，本领域技术人员根据上面的描述可以显而易见地得出本发明的各种变型，这种变型应当落入所附的权利要求的范围内。本发明的优点和目标不必被本发明的每一种实施方式所覆盖。

序列表

<110>科勒制药集团股份有限公司

科勒制药有限责任公司

科勒制药集团有限公司-加拿大

<120>TLR配体和抗病毒剂的组合物

<130>C1037.70066WO00

<140>未转让

<141>2007-09-27

<150>US 60/847,408

<151>2006-09-27

<160>14

<170>Patentln version 3.4

<210>1

<211>7

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡聚核苷酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>其中n是8-氧-rG

<220>

<221>misc_feature

<222>(4)..(4)

<223>其中n是8-氧-rG

<220>

<221>misc_feature

<222>(6)..(6)

<223>其中n是8-氧-rG

<400>1

nuununu 7

<210>2

<211>7

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡聚核苷酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(4)..(4)

<223>其中n是8-氧-rG

<400>2

guunugu 7

<210>3

<211>7

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡聚核苷酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>其中n是8-氧-rG

<400>3

nuugugu 7

<210>4

<211>7

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡聚核苷酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(6)..(6)

<223>其中n是8-氧-rG

<400>4

guugunu 7

<210>5

<211>7

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡聚核苷酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>其中n是8-氧-dG

<400>5

nuugugu 7

<210>6

<211>7

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡聚核苷酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>其中n是5′至5′连接的7-硫代-8-氧代-尿苷

<400>6

nuugugu 7

<210>7

<211>8

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡聚核苷酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>其中n是8-溴-dG

<400>7

nguugugu 8

<210>8

<211>8

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡聚核苷酸

<400>8

gauugugu 8

<210>9

<211>20

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡聚核苷酸

<400>9

gccaccgagc cgaaggcacc 20

<210>10

<211>7

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡聚核苷酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>其中n是8-溴-dA

<400>10

nuugugu 7

<210>11

<211>18

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡聚核苷酸

<400>11

ccgucuguug ugugacuc 18

<210>12

<211>20

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡聚核苷酸

<400>12

uuguuguugu uguuguuguu 20

<210>13

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡聚核苷酸

<400>13

tcgtcgtttt cggcgcgcgc eg 22

<210>14

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡聚核苷酸

<400>14

tecatgaegt tectgatge 19

Claims

1.一种包括免疫刺激性寡核苷酸和抗病毒剂的组合物，其中所述抗病毒剂不是C-8取代的鸟苷或者咪唑并喹啉，并且其中所述抗病毒剂连接至所述免疫刺激性寡核苷酸。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述免疫刺激性寡核苷酸直接连接至所述抗病毒剂。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述免疫刺激性寡核苷酸间接连接至所述抗病毒剂。

4.根据权利要求2所述的组合物，其中所述免疫刺激性寡核苷酸和所述抗病毒剂是同一分子的组成部分。

5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述抗病毒剂是一种或多种核苷酸类似物。

6.根据权利要求2所述的组合物，在所述免疫刺激性寡核苷酸和抗病毒剂之间还包括易受核酸酶作用的位点。

7.根据权利要求2所述的组合物，其中所述免疫刺激性寡核苷酸包含至少一个3’-3’键。

8.根据权利要求2所述的组合物，其中所述免疫刺激性寡核苷酸包含至少一个5’-5’键。

9.根据权利要求1所述的组合物，还包括可药用载体。

10.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物是无菌的。

11.根据权利要求1所述的组合物，其中所述抗病毒剂是洛索立宾。

12.根据权利要求1所述的组合物，其中所述抗病毒剂是艾沙托立宾。

13.根据权利要求1所述的组合物，其中所述免疫刺激性寡核苷酸包括嵌合骨架。

14.根据权利要求1所述的组合物，其中所述抗病毒剂是利巴韦林。

15.根据权利要求1所述的组合物，其中所述抗病毒剂是瓦洛皮他宾。

16.根据权利要求1所述的组合物，其中所述抗病毒剂是BILN2061。

17.根据权利要求1所述的组合物，其中所述抗病毒剂是VX-950。

18.根据权利要求1所述的组合物，其中所述免疫刺激性寡核苷酸是RNA寡核苷酸。

19.根据权利要求1所述的组合物，其中所述免疫刺激性寡核苷酸是DNA寡核苷酸。

20.根据权利要求19所述的组合物，其中所述DNA寡核苷酸是A-类、B-类、C-类、P-类、T-类或E-类寡核苷酸。

21.根据权利要求19所述的组合物，其中所述DNA寡核苷酸包括至少一个未甲基化的CpG二核苷酸。

22.根据权利要求21所述的组合物，其中所述至少一个未甲基化的CpG二核苷酸包括磷酸二酯或类磷酸二酯核苷酸间键，并且所述寡核苷酸包括至少一个稳定化的核苷酸间键。

23.根据权利要求19所述的组合物，其中所述DNA寡核苷酸包括至少三个未甲基化的CpG二核苷酸。

24.根据权利要求27所述的组合物，其中所述至少三个未甲基化的CpG二核苷酸包括磷酸二酯或磷酸二酯类核苷酸间键，并且所述寡核苷酸包括至少一个稳定化的核苷酸间键。

25.根据权利要求1所述的组合物，其中所述抗病毒剂连接至内部核苷酸。

26.根据权利要求1所述的组合物，其中所述抗病毒剂连接至末端核苷酸。

27.根据权利要求30所述的组合物，其中所述末端核苷酸是3’末端核苷酸。

28.根据权利要求30所述的组合物，其中所述末端核苷酸是5’末端核苷酸。

29.根据权利要求1所述的组合物，还包括与所述免疫刺激性寡核苷酸一起配制的第二抗病毒剂。

30.根据权利要求29所述的组合物，其中所述第二抗病毒剂连接至所述免疫刺激性寡核苷酸。

31.根据权利要求29所述的组合物，其中所述组合物包括容纳所述免疫刺激性寡核苷酸和所述抗病毒剂的微粒。

32.根据权利要求29所述的组合物，其中所述组合物包括容纳所述免疫刺激性RNA寡核苷酸和所述抗病毒剂的脂质体。

33.根据权利要求20所述的组合物，其中所述DNA寡核苷酸不是含脱碱基的寡核苷酸。

34.根据权利要求19所述的组合物，其中所述DNA寡核苷酸不是衔接寡核苷酸。

35.一种包括免疫刺激性RNA寡核苷酸和抗病毒剂的组合物，其中所述抗病毒剂与所述免疫刺激性RNA寡核苷酸相关联。

36.根据权利要求35所述的组合物，其中所述免疫刺激性RNA寡核苷酸连接至所述抗病毒剂。

37.根据权利要求36所述的组合物，其中所述免疫刺激性RNA寡核苷酸直接连接至所述抗病毒剂。

38.根据权利要求37所述的组合物，其中所述免疫刺激性RNA寡核苷酸间接连接至所述抗病毒剂。

39.根据权利要求36所述的组合物，其中所述免疫刺激性RNA寡核苷酸和所述抗病毒剂是同一分子的组成部分。

40.根据权利要求35所述的组合物，其中所述免疫刺激性RNA寡核苷酸不连接至所述抗病毒剂。

41.根据权利要求40所述的组合物，其中所述组合物包括容纳所述免疫刺激性RNA寡核苷酸和所述抗病毒剂的微粒。

42.根据权利要求40所述的组合物，其中所述组合物包括容纳所述免疫刺激性RNA寡核苷酸和所述抗病毒剂的脂质体。

43.根据权利要求35所述的组合物，其中所述抗病毒剂是一种或多种核苷酸类似物。

44.根据权利要求36所述的组合物，在所述免疫刺激性RNA寡核苷酸与所述抗病毒剂之间还包括易受核酸酶作用的位点。

45.根据权利要求35所述的组合物，还包括可药用载体。

46.根据权利要求35所述的组合物，其中所述组合物是无菌的。

47.根据权利要求35所述的组合物，其中所述抗病毒剂是C8-取代的鸟苷。

48.根据权利要求47所述的组合物，其中所述C8-取代的鸟苷结合在所述RNA寡核苷酸内。

49.根据权利要求48所述的组合物，其中所述C8-取代的鸟苷位于所述RNA寡核苷酸的5’末端。

50.根据权利要求48所述的组合物，其中所述C8-取代的鸟苷位于所述RNA寡核苷酸5’末端的3’侧相距一个、二个或三个核苷处’。

51.一种治疗病毒性疾病的方法，所述方法包括向需要这种治疗的受试对象施用有效治疗所述病毒性疾病的量的权利要求1-34或35-50中任一项所述的组合物。

52.根据权利要求51所述的方法，其中所述病毒性疾病是人免疫缺陷病毒(HIV)。

53.根据权利要求51所述的方法，其中所述病毒性疾病是丙型肝炎病毒(HCV)。

54.根据权利要求51所述的方法，其中所述病毒性疾病是乙型肝炎病毒(HBV)。

55.根据权利要求51所述的方法，其中所述组合物经肠胃外施用。

56.根据权利要求51所述的方法，其中所述受试对象对非CpG治疗无响应。

57.根据权利要求51所述的方法，其中所述受试对象对采用所述抗病毒剂的治疗无响应。

58.一种包括能表达抑制性病毒蛋白和TLR的细胞，以及载体的组合物。

59.根据权利要求58所述的组合物，其中所述细胞被TLR报道子构建体所转染。

60.根据权利要求59所述的组合物，其中所述TLR是TLR7、TLR8或TLR9。

61.根据权利要求58所述的组合物，其中所述细胞被抑制性病毒蛋白表达构建体所转染。

62.根据权利要求61所述的组合物，其中所述抑制性病毒蛋白是NS3/4蛋白酶。

63.根据权利要求58所述的组合物，其中所述细胞是来自病毒感染患者的免疫细胞。

64.根据权利要求58所述的组合物，其中所述抑制性病毒蛋白由所述细胞内源性地表达。

65.根据权利要求58所述的组合物，其中所述载体是缓冲剂。

66.一种鉴定免疫刺激性抗病毒组合物的方法，所述方法包括使权利要求59所述的细胞与测试化合物接触，并检测细胞因子产生和抗病毒报道子的读数，其中细胞因子产生的提高和抗病毒报道子的读数的提高表明所述测试化合物是免疫刺激性的抗病毒组合物。

67.一种鉴定免疫刺激性抗病毒组合物的方法，所述方法包括使权利要求63所述的细胞与测试化合物接触，并检测Th1响应、类Th-1响应或前炎症细胞因子产生，其中Th1响应、Th-1-类响应或前炎症细胞因子产生的提高表明所述测试化合物是免疫刺激性抗病毒组合物。

68.一种鉴定免疫刺激性抗病毒组合物的方法，所述方法包括从病毒感染的患者分离免疫细胞，使该细胞与测试化合物接触，并检测细胞因子产生和病毒滴定量，其中Th1细胞因子产生的提高和病毒滴定量的降低表明所述测试化合物是免疫刺激性抗病毒组合物。

69.一种筛查具有抗病毒活性的包含抗病毒剂和免疫刺激性寡核苷酸的分子的方法，所述方法包括从病毒感染的患者分离免疫细胞，使该细胞与所述分子接触并检测病毒滴定量，其中病毒滴定量的降低表明所述分子具有抗病毒活性。

70.根据权利要求68或69所述的方法，其中所述外周血单核细胞包括树突细胞。

71.根据权利要求70所述的方法，其中所述树突细胞包括浆细胞样树突细胞。

72.根据权利要求68或69所述的方法，其中所述接触在体外进行。

73.根据权利要求68或69所述的方法，其中所述外周血单核细胞是经过培养的。

74.一种包括连接至抗病毒剂的TLR7/8/9配体的组合物。

75.根据权利要求74所述的组合物，其中所述TLR7/8/9配体是免疫刺激性寡核苷酸。

76.根据权利要求74所述的组合物，其中所述TLR7/8/9配体直接连接至所述抗病毒剂。

77.根据权利要求74所述的组合物，其中所述TLR7/8/9配体间接连接至所述抗病毒剂。

78.根据权利要求76所述的组合物，其中所述TLR7/8/9配体和所述抗病毒剂是同一分子的组成部分。

79.根据权利要求74所述的组合物，其中所述抗病毒剂是一种或多种核苷酸类似物。

80.根据权利要求76所述的组合物，其中在所述TLR7/8/9配体和所述抗病毒剂之间还包括易受核酸酶作用的位点。

81.一种治疗癌症的方法，所述方法包括向患有癌症的受试对象施用有效治疗所述癌症的量的免疫刺激性寡核苷酸与抗病毒剂的组合物。

82.根据权利要求81所述的方法，其中所述抗病毒剂连接至所述免疫刺激性寡核苷酸。

83.根据权利要求81所述的方法，其中所述抗病毒剂是利巴韦林。

84.根据权利要求81所述的方法，其中所述免疫刺激性寡核苷酸是RNA寡核苷酸。

85.根据权利要求81所述的方法，其中所述免疫刺激性寡核苷酸是DNA寡核苷酸。

86.根据权利要求85所述的方法，其中所述DNA寡核苷酸是A-类、B-类、C-类、P-类、T-类或E类寡核苷酸。

87.根据权利要求85所述的方法，其中所述DNA寡核苷酸包括至少一个未甲基化的CpG二核苷酸。

88.根据权利要求81所述的方法，其中所述寡核苷酸还包括C-8取代的鸟苷。

89.一种治疗细菌感染的方法，所述方法包括向患有细菌感染的受试对象施用有效治疗所述细菌感染的量的免疫刺激性寡核苷酸与抗病毒剂的组合物。

90.根据权利要求891所述的方法，其中所述抗病毒剂连接至所述免疫刺激性寡核苷酸。

91.根据权利要求89所述的方法，其中所述抗病毒剂是利巴韦林。

92.根据权利要求89所述的方法，其中所述免疫刺激性寡核苷酸是RNA寡核苷酸。

93.根据权利要求89所述的方法，其中所述免疫刺激性寡核苷酸是DNA寡核苷酸。

94.根据权利要求93所述的方法，其中所述DNA寡核苷酸是A-类、B-类、C-类、P-类、T-类或E类寡核苷酸。

95.根据权利要求93所述的方法，其中所述DNA寡核苷酸包括至少一个未甲基化的CpG二核苷酸。

96.、根据权利要求89所述的方法，其中所述寡核苷酸还包括C-8取代的鸟苷。

97.根据权利要求1-50中任一项所述的组合物，还包括可药用载体。

98.根据权利要求1-50中任一项所述的组合物，其用于治疗癌症，或者病毒或细菌感染。

99.权利要求1-50中任一项所述的组合物的用途，其与抗原结合用于制造用于对受试对象进行免疫接种的药物。

100.权利要求1-50中任一项所述的组合物的用途，其用于制造用于治疗受试对象的癌症的药物。

101.权利要求1-50中任一项所述的组合物的用途，其用于制造用于治疗受试对象的病毒感染的药物。

102.权利要求1-50中任一项所述的组合物的用途，其用于制造用于治疗受试对象的细菌感染的药物。