TW201639583A - 具有免疫賦活活性之含有ＣｐＧ－間隔基－寡核苷酸複合體及其用途 - Google Patents
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Abstract
本發明係提供一種寡去氧核苷酸(oligodeoxynucleotide)，其係包含人類化K型CpG寡去氧核苷酸及聚去氧腺苷酸之寡去氧核苷酸，其中聚去氧腺苷酸係介隔間隔基(spacer)而被配置於該人類化K型CpG寡去氧核苷酸之3’側。又，本發明係提供含有前述寡去氧核苷酸及β-1,3-葡聚糖之複合體。
Description
本發明係關於具有免疫賦活活性之含有寡核苷酸的複合體及其用途、以及用以形成該複合體之寡核苷酸。詳細言之，本發明係關於具有免疫賦活活性之含有CpG寡去氧核苷酸(oligodeoxynucleotide，ODN)及β-葡聚糖(glucan)的複合體及其醫藥用途、以及用以形成該複合體之ODN。
CpG寡去氧核苷酸(CpG ODN)係含有免疫賦活活性(免疫賦活性)之CpG模體(motif)(CpG位置的出現率在基因體中與其他相比為較高的區域)之短的(約20個鹼基對)單股合成之DNA片段，為Toll樣受體(Toll-like receptor)9(TLR9)之強力促效劑(agonist)，將樹突細胞(dendritic cell)(DCs)及B細胞活性化，而使I型干擾素(IFNs)及炎症性細胞介素(cytokine)產生(非專利文獻1及2)，作為包含細胞毒性T淋巴球(CTL)反應之Th1型之體液性及
細胞性免疫反應的輔助而作用(非專利文獻3及4)。因此，CpG ODN被認為是具有抗感染症、癌症、氣喘及花粉症之可能性的免疫治療劑(immunotherapeutic agent)(非專利文獻2及5)。
有骨架序列及免疫賦活特性彼此相異之至少4種型式之CpG ODN(非專利文獻6)。D型(亦稱為A型)CpG ODN典型上含有磷酸二酯(PO)骨架及硫代磷酸酯(phosphorothioate)(PS)Poly(G)尾部(Poly(G)tail)的同時，亦含有1個迴文(palindromic)構造之CpG模體，雖將漿細胞(plasma cell)樣DCs(pDCs)活性化而使大量之IFN-α產生，但無法誘導pDC成熟化或B細胞活性化(非專利文獻7及8)。其他之3種型式之ODN包含PS骨架。K型(亦稱為B型)CpG ODN典型上含有非迴文構造之複數個CpG模體，將B細胞強力地活性化而產生IL-6，使pDCs活性化而成熟化，但幾乎不使IFN-α產生(非專利文獻8及9)。近年來，已開發的C型及P型之CpG ODN各自含有1個及2個迴文構造CpG序列，雙方皆如K型般可使B細胞活性化，如D型般可使pDCs活性化，但與P型CpG ODN比較，C型CpG ODN係較弱地誘導IFN-α產生(非專利文獻10-12)。專利文獻1已記載多數之優異K型CpG ODN。
已顯示D型及P型CpG ODN各自形成所謂胡思町(Hoogsteen)鹼基對及華特生-克里克(Watson-Crick)鹼基對之高次構造，形成被稱為G-四價體(G-tetrads)的平行4股構造的胡思町(Hoogsteen)鹼基對、及於順式迴文構造部位與反式迴文構造部位之間的華特生-克里克
(Watson-Crick)鹼基對，此等對於由pDCs所致的強力IFN-α產生為必要的(非專利文獻12-14)。此種高次構造對於向初期胞內體(endosome)之局部化或藉由TLR9的訊息傳遞上為必要，但此等受到產物之多型性及沉澱的影響，其結果妨礙其臨床應用(非專利文獻15)。因此，僅K型及C型CpG ODN可一般地利用作為人類用之免疫治療劑及疫苗佐劑(非專利文獻16及17)。K型CpG ODN於人類臨床試驗，提高以感染症及癌症作為標的的疫苗之免疫原性(非專利文獻6及16)，為了最適合的佐劑效果，抗原與K型CpG ODN之間的化學性及物理性的連結為必要的。此等之結果顯示4個型式(K、D、P、及C)之CpG ODN有優點及缺點，期待不會凝集且活化B細胞及pDCs兩者的「一體化(all-in-one)」CpG ODN之開發。
來自裂褶菌(Schizophyllum commune)的可溶性β-1,3-葡聚糖之裂褶菌多醣(schizophyllan，SPG)，係作為子宮頸癌患者的放射線療法之賦活藥已於日本被認可歷經30年的醫藥(非專利文獻18)。同樣地，來自香菇(Lentinula edodes)的可溶性β-1,3-葡聚糖之香菇多醣(lenthinan)(LNT)，係於1985年被承認的醫藥，對於無法手術及再發性胃癌患者，以與氟嘧啶系藥劑之併用而被使用(非專利文獻19及20)。已顯示β-1,3-葡聚糖形成聚去氧腺苷酸(polydeoxyadenylic acid(dA))與三重螺旋構造之複合體(非專利文獻21)。
專利文獻2~4已揭示作為包含裂褶菌多醣的β-1,3-葡聚糖與核酸(基因)的水溶性複合體之基因載劑
的用途。此等之文獻已記載藉由形成該複合體，提高基因之反義(antisense)作用及對核酸分解酵素(核酸酶)的耐性作用。
專利文獻5已揭示藉由將具有β-1,3-鍵的多醣類作為載劑(轉染劑)使用，而提高含有CpG序列，且將磷酸二酯鍵取代為硫代磷酸酯(phosphorothioate)鍵或二硫代磷酸酯(phosphorodithioate)鍵的免疫刺激性寡核苷酸之作用。
專利文獻6已記載一種免疫刺激性複合體，其特徵為包含免疫刺激性寡核苷酸、及具有長鏈之β-1,6-糖苷(glucoside)鍵側鏈的β-1,3-葡聚糖。
本發明者們先前呈示與SPG複合體化之使具有磷酸二酯鍵的poly(dA)連結於5’末端的小鼠及人類化CpG ODN會增強細胞介素產生，作為流感疫苗佐劑或Th2細胞關連疾病之預防或治療劑而作用(非專利文獻22及23、以及專利文獻7)。若於K型及D型之各自的CpG之5’末端附加poly(dA)，形成與SPG的複合體，則維持各自K型及D型之特性的同時，其活性被增強。然而，以冀求更有效果且高成本效率的前臨床及臨床開發為目標，達成CpG-SPG複合體的高產率係困難的。近年來，已顯示將具有硫代磷酸酯鍵的poly(dA)與CpG ODN連結時，複合體形成上升至幾乎100%(非專利文獻24)。然而，並未進行為了鑑定最適合的人類化CpG序列、為了將用以獲得4種型式之CpG ODN之「一體化(all-in-one)」活性之因子加以最適化之周密的試驗。
專利文獻8已揭示抗原/CpG寡核苷酸/β-1,3-葡聚糖系之三元複合體之製造方法。
[專利文獻1]US 8,030,285 B2
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本發明所欲解決的課題係提供具有較先前之
CpG-SPG複合體更強活性的免疫賦活劑。
本發明者們專心進行檢討，結果確認含有於3’末端具有聚去氧腺苷酸尾部(poly(dA)tail)的K型CpG ODN之K3(序列識別號2)及SPG的新穎複合體，即K3-SPG，以及含有於3’末端介隔間隔基而具有聚去氧腺苷酸尾部的K3(以下，稱為K3-spacer)及SPG的新穎複合體，即K3-spacer-SPG。此等形成可完全可溶之高次奈米粒子。同樣地，本發明者們亦成功製作含有前述K型CpG ODN及香菇多醣(LNT)的新穎複合體K3-LNT、以及含有K3-spacer及LNT的新穎複合體，即K3-spacer-LNT。K3-SPG、K3-spacer-SPG、K3-LNT、K3-spacer-LNT儘管不具有D型CpG ODN序列，仍兼具K型CpG ODN特有之免疫賦活活性(例如，將B細胞(較佳為人類B細胞)活性化而使IL-6產生的活性)、及D型CpG ODN特有之免疫賦活活性(例如，將漿細胞樣樹突細胞活性化而使IFN-α產生的活性)。再者，K3-LNT、K3-spacer-LNT、K3-spacer-SPG及K3-SPG具有強力的疫苗佐劑活性，與抗原一起作免疫接種時，誘導該抗原特異性的體液性免疫及細胞性免疫兩者，實際上，對RS病毒或流感病毒顯示非常強的感染防禦效果。基於此等之知識見解而進行進一步的檢討，完成了本發明。
即，本發明係如以下所示。
[1]一種寡去氧核苷酸，其係含有人類化K型CpG寡去氧核苷酸及聚去氧腺苷酸的寡去氧核苷酸，其中聚去
氧腺苷酸係介隔間隔基而結合於人類化K型CpG寡去氧核苷酸之3’側。
[2]如[1]記載之寡去氧核苷酸，其中人類化K型CpG寡去氧核苷酸為10個核苷酸以上之長度，包含1或複數個之非甲基化CpG模體。
[3]如[1]或[2]記載之寡去氧核苷酸，其中人類化K型CpG寡去氧核苷酸含有序列TCGA或TCGT。
[4]如[1]至[3]中任一項記載之寡去氧核苷酸，其中人類化K型CpG寡去氧核苷酸包含序列識別號1所表示的核苷酸序列。
[5]如[1]至[4]中任一項記載之寡去氧核苷酸，其中寡去氧核苷酸之磷酸二酯鍵之一部分或全部被硫代磷酸酯鍵取代。
[6]如[5]記載之寡去氧核苷酸，其中寡去氧核苷酸之磷酸二酯鍵的全部被硫代磷酸酯鍵取代。
[7]如[1]至[6]中任一項記載之寡去氧核苷酸，其中聚去氧腺苷酸之長度為20~60個核苷酸長度。
[8]如[1]至[7]中任一項記載之寡去氧核苷酸，其中間隔基為式(A)
(式中，m為2、3、4、5、6、7、8或9，n為1
、2、3、4、5或6，式(3m+2)n為8以上60以下，複數之R1、R2、R3及R4係彼此獨立為氫原子或C1-6烷基，X為氧原子或硫原子)所表示的基、或式(B)
(式中，s為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12，t為1、2、3、4、5或6，(s+3)t為8以上60以下，複數之R5及R6係彼此獨立為氫原子或C1-6烷基，X為氧原子或硫原子)所表示的基。
[9]如[1]至[8]中任一項記載之寡去氧核苷酸，其中間隔基為式(A1)
(式中，m為4、5或6，n為1或2，式(3m+2)n為14以上40以下，複數之R1、R2、R3及R4全部為氫原子，X為硫原子)所表示的基、或式(B1)
(式中，s為8、9、10、11或12，t為1或2，(s+3)t為14以上40以下，複數之R5及R6全部為氫原子，X為硫原子)所表示的基。
[10]如[1]至[9]中任一項記載之寡去氧核苷酸，其中間隔基為下式
之任一者所表示的基或將該基重複2或3次而鍵結的基。
[11]一種複合體，其含有如[1]至[10]中任一項記載之寡去氧核苷酸及β-1,3-葡聚糖。
[12]如[11]記載之複合體，其中β-1,3-葡聚糖為香菇多醣、裂褶菌多醣、硬葡聚糖(scleroglucan)、卡特蘭多
醣(curdlan)、茯苓多醣(pachyman)、灰樹花多醣(grifolan)、或昆布糖(laminaran)。
[13]如[12]記載之複合體，其中β-1,3-葡聚糖為香菇多醣、裂褶菌多醣或硬葡聚糖。
[14]如[11]記載之複合體，其包含下述(i)記載之寡去氧核苷酸、及(ii)記載之β-1,3-葡聚糖，(i)於包含序列識別號1所表示的核苷酸序列的寡去氧核苷酸之3’側介隔間隔基而結合20~60個核苷酸長度的聚去氧腺苷酸，且磷酸二酯鍵之全部經硫代磷酸酯鍵取代的寡去氧核苷酸；(ii)香菇多醣或裂褶菌多醣。
[15]如[11]記載之複合體，其包含「於包含序列識別號1所表示的核苷酸序列的寡去氧核苷酸之3’側，20~60個核苷酸長度之聚去氧腺苷酸介隔包含下式
之任一者所表示的基或將該基重複2或3次而
鍵結的基之間隔基而結合，且磷酸二酯鍵之全部經硫代磷酸酯鍵取代的寡去氧核苷酸」、及「β-1,3-葡聚糖(例如，香菇多醣、裂褶菌多醣)」。
[16]如[15]記載之複合體，其包含「於包含序列識別號1所表示的核苷酸序列的寡去氧核苷酸之3’側，30~50核苷酸長度之聚去氧腺苷酸介隔包含下式
之任一者所表示的基或將該基重複2或3次而鍵結的基之間隔基而結合，且磷酸二酯鍵之全部經硫代磷酸酯鍵取代的寡去氧核苷酸」、及「β-1,3-葡聚糖」。
[17]如[16]記載之複合體，其包含「於包含序列識別號1所表示的核苷酸序列的寡去氧核苷酸之3’側，30~45個核苷酸長度之聚去氧腺苷酸介隔包含下式
之任一者所表示的基或將該基重複2或3次而鍵結的基之間隔基而結合，且磷酸二酯鍵之全部經硫代磷酸酯鍵取代的寡去氧核苷酸」、及「β-1,3-葡聚糖」。
[18]如[17]記載之複合體，其包含「於包含序列識別號1所表示的核苷酸序列的寡去氧核苷酸之3’側，40個核苷酸長度之聚去氧腺苷酸介隔將下式
之任一者所表示的基重複2或3次而鍵結的基之間隔基而結合，且磷酸二酯鍵之全部經硫代磷酸酯鍵取代的寡去氧核苷酸」、及「香菇多醣或裂褶菌多醣」。
[19]如[11]至[18]中任一項記載之複合體，其為三重螺旋構造狀者。
[20]如[11]至[19]中任一項記載之複合體，其具有將B細胞活性化而使IL-6產生的活性、及將樹突細胞活性化而使IFN-α產生的活性。
[21]一種醫藥組成物，其包含如[1]至[10]中任一項記載之寡去氧核苷酸、或如[11]至[20]中任一項記載之複合體。
[22]如[21]記載之醫藥組成物，其係用於病毒感染症、癌症、過敏性疾病、細胞內寄生性原蟲或細菌感染症之預防或治療。
[23]如[22]記載之醫藥組成物，其係用於病毒感染症之預防或治療。
[24]如[23]記載之醫藥組成物，其中病毒感染症為RS病毒或流感病毒感染症。
[25]一種I型及/或II型干擾素產生誘導劑，其包含如[11]至[20]中任一項記載之複合體。
[26]一種免疫賦活劑，其包含如[1]至[10]中任一項記載之寡去氧核苷酸、或如[11]至[20]中任一項記載之複合體。
[27]如[26]之免疫賦活劑，其為疫苗佐劑。
[28]一種病毒感染症、癌症、過敏性疾病、細胞內寄生性原蟲或細菌感染症之預防或治療劑，其包含如[1]至[10]中任一項記載之寡去氧核苷酸、或如[11]至[20]中任一項記載之複合體。
[29]如[28]記載之預防或治療劑，其中病毒感染症為RS病毒或流感病毒感染症。
[30]如[1]至[10]中任一項記載之寡去氧核苷酸或如[11]至[20]中任一項記載之複合體之用途，其係用於醫藥組成物之製造。
[31]如[30]記載之用途，其中醫藥組成物為病毒感染症、癌症、過敏性疾病、細胞內寄生性原蟲或細菌感染症之預防或治療用之醫藥組成物。
[32]如[31]記載之用途，其中病毒感染症為RS病毒或流感病毒感染症。
[33]一種用於溫血動物中的疾病之治療或預防之方
法，其包含將藥理上有效量之如[1]至[10]中任一項記載之寡去氧核苷酸、或如[11]至[20]中任一項記載之複合體投予至該溫血動物。
[34]如[33]記載之方法，其中疾病為病毒感染症、癌症、過敏性疾病、細胞內寄生性原蟲或細菌感染症。
[35]如[34]記載之方法，其中病毒感染症為RS病毒或流感病毒感染症。
[36]如[33]至[35]中任一項記載之方法，其中溫血動物為人類。
[37]一種誘導溫血動物中的防禦免疫反應之方法，其包含將藥理上有效量之如[1]至[10]中任一項記載之寡去氧核苷酸、或如[11]至[20]中任一項記載之複合體投予至該溫血動物。
[38]如[1]至[10]中任一項記載之寡去氧核苷酸、或如[11]至[20]中任一項記載之複合體，其係用於病毒感染症、癌症、過敏性疾病、細胞內寄生性原蟲或細菌感染症之治療或預防。
[39]如[38]記載之寡去氧核苷酸或複合體，其中病毒感染症為RS病毒或流感病毒感染症。
[40]一種醫藥組成物，其包含：(a)如[1]至[10]中任一項記載之寡去氧核苷酸、或如[11]至[20]中任一項記載之複合體、及(b)抗原。
[41]如[40]記載之組成物，其係用以誘導抗該抗原的免疫反應。
[42]如[41]記載之組成物，其中抗原為來自病原體的抗原。
[43]如[42]記載之組成物，其係病原體之感染症之預防或治療用。
[44]如[43]記載之組成物，其中病原體為病毒。
[45]如[44]記載之組成物，其中病毒為RS病毒或流感病毒。
依據本發明，可提供具有優異免疫賦活活性的寡去氧核苷酸或包含其之複合體。尤其，本發明之複合體兼具K型CpG ODN特有之免疫賦活活性、及D型CpG ODN特有之免疫賦活活性。再者，本發明之複合體具有強力的疫苗佐劑活性，將本發明之複合體與抗原一起作免疫接種時，刺激該抗原特異性的體液性免疫及細胞性免疫兩者，顯示非常強的感染防禦效果。因此，本發明之複合體係有用於作為免疫賦活劑或疫苗佐劑。
[第1圖]人類PBMC中的K3-spacer單獨、K3-spacer-LNT複合體及K3-SPG複合體之pan-IFN-a誘導能力與IL-6誘導能力。K3-spacer-單獨：K3-(S18)-dA40、K3-(S18)2-dA40、K3-(S18)3-dA40。K3-spacer-LNT複合體：K3-(S18)-dA40-LNT#1/#2、K3-(S18)2-dA40-LNT#1/#2、K3-(S18)3-dA40-LNT#1/#2(#1、#2係各自以mG/dA莫耳比為2.5及3.0之條件製作)。K3-SPG複合體：K3-SPG。NC：藉
由未處理之陰性對照組。
[第2圖]接種添加佐劑的RSV F次單元疫苗的小鼠中之血清中RSV F抗原特異性IgG抗體力價。K3-spacer-單獨添加組：F+K3-(S18)-dA40、F+K3-(S18)2-dA40、F+K3-(S18)3-dA40。K3-spacer-LNT複合體添加組：F+K3-(S18)-dA40-LNT、F+K3-(S18)2-dA40-LNT、F+K3-(S18)3-dA40-LNT。K3-SPG複合體添加組：F+K3-SPG。磷酸明礬添加組：F+Alum。RSV F抗原單獨：F。NC：藉由未處理之陰性對照組。
[第3圖]接種添加佐劑的RSV F次單元疫苗的小鼠中之藉由RSV F抗原刺激而特異性誘導的細胞介素誘導能力。K3-spacer-單獨添加組：F+K3-(S18)-dA40、F+K3-(S18)2-dA40、F+K3-(S18)3-dA40。K3-spacer-LNT複合體添加組：F+K3-(S18)-dA40-LNT、F+K3-(S18)2-dA40-LNT、F+K3-(S18)3-dA40-LNT。K3-SPG複合體添加組：F+K3-SPG。磷酸明礬添加組：F+Alum。RSV F抗原單獨：F。NC：藉由未處理之陰性對照組。
[第4圖]人類PBMC中的K3-spacer-LNT複合體及K3-SPG複合體之pan-IFN-a誘導能力與IL-6誘導能力。K3-spacer-LNT複合體：K3-(S18)2-dA30-LNT、K3-(S18)2-dA35-LNT、K3-(S18)2-dA40-LNT、K3-(S12)2-dA40-LNT、K3-(S12)3-dA40-LNT、K3-(C12)2-dA40-LNT、K3-(C12)3-dA40-LNT。K3-SPG複合體：K3-SPG。NC：藉由未處理之陰性對照組。
[第5圖]接種添加佐劑的RSV F次單元疫苗的小鼠
中之血清中RSV F抗原特異性IgG抗體力價。K3-spacer-LNT複合體添加組：F+K3-(S18)2-dA30-LNT、F+K3-(S18)2-dA35-LNT、F+K3-(S18)2-dA40-LNT、F+K3-(S12)2-dA40-LNT、F+K3-(S12)3-dA40-LNT、F+K3-(C12)2-dA40-LNT、F+K3-(C12)3-dA40-LNT。K3-SPG複合體添加組：F+K3-SPG。磷酸明礬添加組：F+Alum。RSV F抗原單獨：F。NC：藉由未處理之陰性對照組。
[第6圖]接種添加佐劑的RSV F次單元疫苗的小鼠中之藉由RSV F抗原刺激而特異性誘導的細胞介素誘導能力。K3-spacer-LNT複合體添加組：F+K3-(S18)2-dA30-LNT、F+K3-(S18)2-dA35-LNT、F+K3-(S18)2-dA40-LNT、F+K3-(S12)2-dA40-LNT、F+K3-(S12)3-dA40-LNT、F+K3-(C12)2-dA40-LNT、F+K3-(C12)3-dA40-LNT。K3-SPG複合體添加組：F+K3-SPG。磷酸明礬添加組：F+Alum。RSV F抗原單獨：F。NC：藉由未處理之陰性對照組。
[第7圖]人類PBMC中的K3-spacer-LNT複合體及K3-SPG複合體之pan-IFN-a誘導能力與IL-6誘導能力。K3-spacer-LNT複合體：K3-(S18)-dA35-LNT、K3-(S18)-dA40-LNT、K3-(S18)2-dA35-LNT、K3-(S18)2-dA40-LNT、K3-(S12)-dA35-LNT、K3-(S12)-dA40-LNT、K3-(S12)2-dA35-LNT、K3-(S12)2-dA40-LNT、K3-(S9)-dA35-LNT、K3-(S9)-dA40-LNT、K3-(S9)2-dA35-LNT、K3-(S9)2-dA40-LNT。K3-SPG複合體：K3-SPG。NC：藉由未處理之陰性對照組。
[第8圖]接種添加佐劑的RSV F次單元疫苗的小鼠
中之血清中RSV F抗原特異性IgG抗體力價。K3-spacer-LNT複合體添加組：F+K3-(S18)-dA35-LNT、F+K3-(S18)-dA40-LNT、F+K3-(S18)2-dA35-LNT、F+K3-(S18)2-dA40-LNT、F+K3-(S12)-dA35-LNT、F+K3-(S12)-dA40-LNT、F+K3-(S12)2-dA35-LNT、F+K3-(S12)2-dA40-LNT、F+K3-(S9)-dA35-LNT、F+K3-(S9)-dA40-LNT、F+K3-(S9)2-dA35-LNT、F+K3-(S9)2-dA40-LNT。磷酸明礬添加組：F+Alum。RSV F抗原單獨：F。NC：藉由未處理之陰性對照組。
[第9圖]接種添加佐劑的RSV F次單元疫苗的小鼠中之藉由RSV F抗原刺激而特異性誘導的細胞介素誘導能力。K3-spacer-LNT複合體添加組：F+K3-(S18)-dA35-LNT、F+K3-(S18)-dA40-LNT、F+K3-(S18)2-dA35-LNT、F+K3-(S18)2-dA40-LNT、F+K3-(S12)-dA35-LNT、F+K3-(S12)-dA40-LNT、F+K3-(S12)2-dA35-LNT、F+K3-(S12)2-dA40-LNT、F+K3-(S9)-dA35-LNT、F+K3-(S9)-dA40-LNT、F+K3-(S9)2-dA35-LNT、F+K3-(S9)2-dA40-LNT。磷酸明礬添加組：F+Alum。RSV F抗原單獨：F。NC：藉由未處理之陰性對照組。
[第10圖]具有間隔基的CpG ODN與LNT或SPG之複合體化之方法。
[第11圖]人類PBMC中的K3-spacer-SPG複合體之pan-IFN-a誘導能力與IL-6誘導能力。K3-spacer-SPG複合體：K3-(S9)-dA40-SPG、K3-(S9)2-dA40-SPG、K3-(S12)-dA40-SPG、K3-(S12)2-dA40-SPG、K3-(S18)-dA40-SPG
、K3-(S18)2-dA40-SPG、K3-(C12)2-dA40-SPG、K3-(C12)3-dA40-SPG。NC：藉由未處理之陰性對照組。
[第12圖]接種添加佐劑的RSV F次單元疫苗的小鼠中之血清中RSV F抗原特異性IgG抗體力價。K3-spacer-SPG複合體添加組：F+K3-(S9)-dA40-SPG、F+K3-(S9)2-dA40-SPG、F+K3-(S12)-dA40-SPG、F+K3-(S12)2-dA40-SPG、F+K3-(S18)-dA40-SPG、F+K3-(S18)2-dA40-SPG、F+K3-(C12)2-dA40-SPG、F+K3-(C12)3-dA40-SPG。RSV F抗原單獨：F。NC：藉由未處理之陰性對照組。
[第13圖]接種添加佐劑的RSV F次單元疫苗的小鼠中之藉由RSV F抗原刺激而特異性誘導的細胞介素誘導能力。K3-spacer-SPG複合體添加組：F+K3-(S9)-dA40-SPG、F+K3-(S9)2-dA40-SPG、F+K3-(S12)-dA40-SPG、F+K3-(S12)2-dA40-SPG、F+K3-(S18)-dA40-SPG、F+K3-(S18)2-dA40-SPG、F+K3-(C12)2-dA40-SPG、F+K3-(C12)3-dA40-SPG。RSV F抗原單獨：F。NC：藉由未處理之陰性對照組。Non-sti：無刺激。
1.寡去氧核苷酸
本發明提供包含K型CpG寡去氧核苷酸及聚去氧腺苷酸(dA)的寡去氧核苷酸(以下，稱為本發明之寡去氧核苷酸)。
於本發明之寡去氧核苷酸包含磷酸二酯鍵經修飾(例如，一部分或全部之磷酸二酯鍵經硫代磷酸酯鍵取代)
者。
本發明之寡去氧核苷酸包含藥學上可容許的鹽。
又，於本說明書，寡去氧核苷酸與ODN係同義。又，「人類化K型CpG寡去氧核苷酸(CpG ODN)」與「人類化K型CpG寡去氧核苷酸(CpG ODN)殘基」係與末尾之用語「殘基」之有無無關而皆為同義，可交換使用。再者，聚去氧腺苷酸與聚去氧腺苷(殘基)係同義。用語「殘基」意指較大分子量之化合物的部分構造，但於本說明書中，「人類化K型CpG寡去氧核苷酸(CpG ODN)」意指獨立的分子、或者較大的分子量之化合物的部分構造，若為本技術領域中具有通常知識者，可由文脈而容易地理解。對於「聚去氧腺苷酸」等之與本發明之寡去氧核苷酸所含的其他部分構造有關的用語亦為相同。
CpG寡去氧核苷酸(CpG ODN)係含有免疫賦活性之非甲基化CpG模體的單股DNA，為TLR9之促效劑。於CpG ODN有骨架序列及免疫賦活特性各自相異之K型(亦稱為B型)、D型(亦稱A型)、C型及P型之4種型式(Advanced drug delivery reviews 61,195-204(2009))。本發明之寡去氧核苷酸包含此等中的K型CpG ODN。
K型CpG ODN係具有所謂「典型上含有非迴文構造之複數的非甲基化CpG模體，將B細胞活性化而使IL-6產生，但幾乎不誘導漿細胞樣樹突細胞(pDCs)之IFN-α產生」之構造及機能的特性的CpG ODN。非甲基化CpG模體係指為含有至少1個之胞嘧啶(C)-鳥嘌呤(G)序列的短核苷酸序列，該胞嘧啶-鳥嘌呤序列中的胞嘧啶之
第5位未經甲基化者。又，於以下之說明，CpG只要未特別指明，皆意指非甲基化CpG。因此，本發明之寡去氧核苷酸係藉由包含K型CpG ODN，而具有K型CpG ODN特有之免疫賦活活性(例如，將B細胞(較佳為人類B細胞)活性化而使IL-6產生的活性)。於該技術領域，多數之人類化K型CpG ODN為已知(Journal of immunology 166,2372-2377(2001)；Journal of immunology 164,944-953(2000)；US 8,030,285 B2)。
本發明之寡去氧核苷酸所含的K型CpG ODN較佳為經人類化。「人類化」意指具有對人類TLR9的促效劑活性。因此，包含人類化K型CpG ODN的本發明之寡去氧核苷酸係對人類具有K型CpG ODN特有之免疫賦活活性(例如，將人類B細胞活性化而使IL-6產生的活性)。
適合用於本發明之K型CpG ODN係10個核苷酸以上之長度，包含1個或複數之非甲基化CpG模體。
更適合用於本發明之K型CpG ODN係含有包含1個或複數之CpG模體的非迴文構造。更適合使用的K型CpG ODN係由包含1個或複數之CpG模體的非迴文構造所構成。
人類化K型CpG ODN一般而言，以由TCGA或TCGT所構成的4鹼基之CpG模體為特徵。又，於大多情形，於一個人類化K型CpG ODN中含有2或3個此4鹼基之CpG模體。因此，於較佳態樣，本發明之寡去氧核苷酸所含的K型CpG ODN係包含至少1個，更佳為2個以上，進一步較佳為2或3個之由TCGA或TCGT所構成的4鹼基
之CpG模體。該K型CpG ODN具有2或3個之4鹼基之CpG模體的情形，此等之4鹼基之CpG模體可為相同，亦可相異。惟，只要具有對人類TLR9的促效劑活性，則並未被特別限定。
本發明之寡去氧核苷酸所含的K型CpG ODN更佳為包含序列識別號1所表示的核苷酸序列。
K型CpG ODN之長度只要本發明之寡去氧核苷酸具有免疫賦活活性(例如，將B細胞(較佳為人類B細胞)活性化而使IL-6產生的活性)，則並未被特別限定，但較佳為100個核苷酸長度以下(例如，10-75個核苷酸長度)。K型CpG ODN之長度更佳為50個核苷酸長度以下(例如，10-40個核苷酸長度)。K型CpG ODN之長度更佳為30個核苷酸長度以下(例如，10-25個核苷酸長度)。K型CpG ODN之長度最佳為12-25個核苷酸長度。
聚去氧腺苷酸(dA)之長度只要為對於與β-1,3-葡聚糖(較佳為香菇多醣、或裂褶菌多醣)鏈一起形成三重螺旋構造之充分長度，則並未特別被限定，但由形成安定的三重螺旋構造的觀點，通常為20個核苷酸長度以上，較佳為40個核苷酸長度以上，更佳為60個核苷酸長度以上。聚去氧腺苷酸(poly dA)由於越長則越可與β-1,3-葡聚糖形成安定的三重螺旋構造，故理論上並無上限，但過長時，成為於寡去氧核苷酸之合成時之長度產生偏差的原因，故通常為100個核苷酸長度以下，較佳為80個以下。另一方面，除了前述安定的三重螺旋構造之形成外，由使與每單位量之β-1,3-葡聚糖結合的本發明之
寡去氧核苷酸量增加、且寡去氧核苷酸之合成時之長度之偏差的回避、複合化效率之觀點，聚去氧腺苷酸之長度較佳為20~60個核苷酸長度(具體而言，20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60個核苷酸長度)，更佳為30~50個核苷酸長度(30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50個核苷酸長度)，最佳為30~45個核苷酸長度(30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45個核苷酸長度)。尤其，30個核苷酸長度以上之情形，顯示良好的複合化效率。本發明之寡去氧核苷酸係藉由含有聚去氧腺苷酸，而具有與雙股之裂褶菌多醣鏈一起形成三重螺旋構造的活性。又，亦有將聚去氧腺苷酸標示為「聚(dA)」或「poly(dA)」的情形。
於1分子之本發明之寡去氧核苷酸，可含有複數個之K型CpG ODN及/或聚去氧腺苷酸，但較佳為K型CpG ODN及聚去氧腺苷酸各含有1個，最佳為由K型CpG ODN及聚去氧腺苷酸各1個所構成。
本發明之寡去氧核苷酸係以聚去氧腺苷酸被配置於K型CpG ODN之3’側為特徵。藉由此配置，本發明之複合體(詳細如下述)除了具有K型CpG ODN特有之免疫賦活活性之外，亦具有D型CpG ODN特有之免疫賦活活性。
於本發明之寡去氧核苷酸，K型CpG ODN與聚去氧腺苷酸係藉由間隔基而連結。於本發明，間隔基意指8~60個之原子連結為直線狀的基，於本發明作為間隔基使用的原子只要為可直鏈狀連結的原子則並未特別限定，例如，可列舉碳原子、氮原子、氧原子、矽原子、磷原子、硫原子，較佳為碳原子、氧原子、磷原子。於形成本發明所使用的間隔基之直鏈的原子亦可結合有氫原子、氧原子、硫原子、羥基、C1-6烷基等之取代基，該取代基較佳為氫原子、硫原子、羥基或甲基，更佳為氫原子、硫原子或羥基。本發明所使用的間隔基更佳為式(A)
(式中，m為2、3、4、5、6、7、8或9(較佳為4、5或6)，n為1、2、3、4、5或6(較佳為1或2)，式(3m+2)n為8以上60以下(較佳為14以上40以下)，複數之R1、R2、R3及R4係彼此獨立為氫原子或C1-6烷基(較佳為全部皆為氫原子)，X為氧原子或硫原子(較佳為硫原子))所表示的基、或式(B)
(式中，s為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12(較佳為8、9、10、11或12)，t為1、2、3、4、5或6(較佳為1或2)，(s+3)t為8以上60以下(較佳為14以上40以下)，複數之R5及R6係彼此獨立為氫原子或C1-6烷基(較佳為全部皆為氫原子)，X為氧原子或硫原子(較佳為硫原子))所表示的基，進一步更佳為下式
之任一者所表示的基或將該基重複2或3次(較佳為2次)而鍵結的基。此處，重複2次而鍵結的基係例如下式
所表示的基。
本發明所使用的間隔基例如可使用對應的亞醯胺(amidite)來製造。就對應式(A)所表示的間隔基的亞醯胺而言，可列舉例如PEG亞醯胺(可使用市售品、或按照日本特開2002-176987號公報記載之方法來製造)。對應式(B)所表示的間隔基的亞醯胺可例如將於兩末端具有羥基的烷二醇，按照國際公開公報WO99/19474記載之方法而變換成亞醯胺而獲得。
本發明之寡去氧核苷酸可按照例如Nucleic Acids in Chemistry and Biology,3.Chemical synthesis(1990)ed.G.Michael Blackburn and Michael J.Gait.Oxford University Press記載之方法來製造，具體而言，於dA30、dA35、dA40等之聚去氧腺苷酸之5'位上，使對應上述間隔基的亞醯胺耦合n次，之後，藉由使對應K型CpG寡去氧核苷酸的部分耦合而加以製造。
於最佳態樣，本發明之寡去氧核苷酸包含K型CpG ODN(具體而言，例如，包含序列識別號1所表示的核苷酸序列的寡去氧核苷酸)、間隔基及聚去氧腺苷酸，K型CpG ODN位於該寡去氧核苷酸之5’末端，聚去氧腺
苷酸位於3’末端，使K型CpG ODN與聚去氧腺苷酸介隔間隔基而連結。具體而言，係於包含序列識別號1所表示的核苷酸序列所構成的寡去氧核苷酸之3’末端，20~60個核苷酸長度(更佳為30~50個核苷酸長度(30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個核苷酸長度)，最佳為30~45個核苷酸長度(30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45個核苷酸長度))之聚去氧腺苷酸介隔間隔基而結合的寡去氧核苷酸。例如，以下之表所列舉的寡去氧核苷酸。
將上述表所列舉的寡去氧核苷酸之核苷酸序列(去除間隔基部分)各自示於序列識別號2~17。
本發明之寡去氧核苷酸之全長(間隔基以外之部分之核苷酸長度的合計)通常為30~200個核苷酸長度，較佳為35~100個核苷酸長度，更佳為40~80個核苷酸長度(具體而言，40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、
60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80個核苷酸長度)，更佳為50~70個核苷酸長度(具體而言，50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70個核苷酸長度)，最佳為50~65個核苷酸長度(具體而言，50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64或65個核苷酸長度)。
本發明之寡去氧核苷酸可被適當修飾成對活體內分解(例如，利用核酸外切酶或核酸內切酶的分解)有抵抗性。較佳為該改變包含硫代磷酸酯修飾或二硫代磷酸酯修飾。即，本發明之寡去氧核苷酸中之磷酸二酯鍵的一部分或全部經硫代磷酸酯鍵或二硫代磷酸酯鍵取代。
較佳為本發明之寡去氧核苷酸包含磷酸二酯鍵之修飾，更佳為磷酸二酯鍵之修飾為硫代磷酸酯鍵(即，如WO 95/26204所記載，非交聯氧原子中的1個被取代為硫原子)。即，本發明之寡去氧核苷酸中之磷酸二酯鍵之一部分或全部經硫代磷酸酯鍵取代。
本發明之寡去氧核苷酸較佳為於K型CpG ODN，包含利用硫代磷酸酯鍵或二硫代磷酸酯鍵的修飾，更佳為該K型CpG ODN之磷酸二酯鍵的全部被取代為硫代磷酸酯鍵。又，本發明之寡去氧核苷酸較佳為於聚去氧腺苷酸，包含硫代磷酸酯鍵、或二硫代磷酸酯鍵，更佳為該聚去氧腺苷酸之磷酸二酯鍵的全部被取代為硫
代磷酸酯鍵。更佳為本發明之包含人類化K型CpG寡去氧核苷酸及聚去氧腺苷酸的寡去氧核苷酸之磷酸二酯鍵的全部被取代為硫代磷酸酯鍵。最佳為本發明之寡去氧核苷酸係於人類化K型CpG寡去氧核苷酸(例如，序列識別號1)之3’末端，將20~60個核苷酸長度(更佳為30~50個核苷酸長度(30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個核苷酸長度)，最佳為30~45個核苷酸長度(30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45個核苷酸長度))之聚去氧腺苷酸，介隔間隔基而結合的寡去氧核苷酸，該寡去氧核苷酸所含的全部之磷酸二酯鍵係被取代為硫代磷酸酯鍵。藉由硫代磷酸酯鍵，於本發明之寡去氧核苷酸，不僅可期待增強抗分解的抵抗性，且可期待免疫賦活活性(例如，將B細胞活性化而使IL-6產生的活性)之增強、及CpG-β-1,3-葡聚糖複合體之高產率。又，本說明書中的硫代磷酸酯鍵係與硫代磷酸酯骨架同義，磷酸二酯鍵係與磷酸骨架同義。
本發明之寡去氧核苷酸包含上述寡去氧核苷酸的所有藥學上可容許的鹽類、酯、或此種酯之鹽類。
就本發明之寡去氧核苷酸之藥學上可容許的鹽類而言，較佳可列舉如鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽之鹼金屬鹽；如鈣鹽、鎂鹽之鹼土類金屬鹽；鋁鹽、鐵鹽、鋅鹽、銅鹽、鎳鹽、鈷鹽等之金屬鹽；如銨鹽之無機鹽；如t-辛基胺鹽、二苄基胺鹽、味啉鹽、葡萄糖胺鹽、苯基甘胺酸烷基酯鹽、乙二胺鹽、N-甲基還原葡糖胺鹽、胍鹽
、二乙基胺鹽、三乙基胺鹽、二環己基胺鹽、N,N’-二苄基乙二胺鹽、氯普鲁卡因鹽、普鲁卡因鹽、二乙醇胺鹽、N-苄基-苯乙基胺鹽、哌鹽、四甲基銨鹽、參(羥甲基)胺基甲烷鹽之有機鹽等之胺鹽；如氫氟酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽之鹵素原子化氫酸鹽；硝酸鹽、過氯酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等之無機酸鹽；如甲烷磺酸鹽、三氟甲烷磺酸鹽、乙烷磺酸鹽之低級烷磺酸鹽；如苯磺酸鹽、p-甲苯磺酸鹽之芳基磺酸鹽；乙酸鹽、蘋果酸鹽、反丁烯二酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、草酸鹽、順丁烯二酸鹽等之有機酸鹽；及如甘胺酸鹽、離胺酸鹽、精胺酸鹽、鳥胺酸鹽、麩胺酸鹽、天冬胺酸鹽之胺基酸鹽。就更佳的鹽而言，可列舉如鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽之鹼金屬鹽；及如t-辛基胺鹽、二苄基胺鹽、味啉鹽、葡萄糖胺鹽、苯基甘胺酸烷基酯鹽、乙二胺鹽、N-甲基還原葡糖胺鹽、胍鹽、二乙基胺鹽、三乙基胺鹽、二環己基胺鹽、N,N’-二苄基乙二胺鹽、氯普鲁卡因鹽、普鲁卡因鹽、二乙醇胺鹽、N-苄基-苯乙基胺鹽、哌鹽、四甲基銨鹽、參(羥甲基)胺基甲烷鹽之有機鹽等之胺鹽。就進一步較佳的鹽而言，可列舉鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽、三乙基胺鹽及參(羥甲基)胺基甲烷鹽。
本發明之寡去氧核苷酸亦可呈水合物存在，如上述之水合物亦包含於本發明。
本發明之寡去氧核苷酸可為單股、雙股、3股之任一形態，但較佳為單股。
於本發明之寡去氧核苷酸，有存在基於分子
內之不對稱中心的光學異構物的情形。只要未特別指明，於本發明之寡去氧核苷酸，此等之異構物及此等之異構物之任意比率的混合物皆為包含於本發明者。
本發明之寡去氧核苷酸較佳為經單離。「單離」意指實施去除作為目的的成分以外之因子的操作，而脫離天然存在的狀態。「經單離的寡去氧核苷酸」之純度(作為目的的寡去氧核苷酸重量佔評價對象物之總重量之百分率)通常為70%以上，較佳為80%以上，更佳為90%以上，進一步更佳為99%以上。
本發明之寡去氧核苷酸由於具有優異的免疫賦活活性(例如，將B細胞(較佳為人類B細胞)活性化而使IL-6產生的活性)，故有用於作為免疫賦活劑等。再者，本發明之寡去氧核苷酸由於具有與雙股之β-1,3-葡聚糖(較佳為香菇多醣、裂褶菌多醣、或硬葡聚糖)一起形成三重螺旋構造的性質，故有用於下述之本發明之複合體的調製。
2.複合體
本發明提供含有上述本發明之寡去氧核苷酸及β-1,3-葡聚糖的複合體(以下，稱為本發明之複合體)。
上述之本發明之寡去氧核苷酸因含有K型CpG ODN，而其單獨發揮K型CpG ODN特有之免疫賦活活性(例如，將B細胞(較佳為人類B細胞)活性化而使IL-6產生的活性)，缺乏D型CpG ODN特有之免疫賦活活性(例如，將漿細胞樣樹突細胞活性化而使IFN-α產生的活性)。然而，令人驚訝地，藉由與β-1,3-葡聚糖(較佳為香菇
多醣或裂褶菌多醣)形成複合體，不需要D型CpG ODN之序列而獲得D型CpG ODN特有之免疫賦活活性(例如，將漿細胞樣樹突細胞活性化而使IFN-α產生的活性)。即，本發明之複合體具有K型CpG ODN特有之免疫賦活活性(例如，將B細胞(較佳為人類B細胞)活性化而使IL-6產生的活性)、及D型CpG ODN特有之免疫賦活活性(例如，將漿細胞樣樹突細胞(較佳為人類漿細胞樣樹突細胞)活性化而使IFN-α產生的活性)兩者。
就本發明所使用的β-1,3-葡聚糖而言，可列舉香菇多醣、裂褶菌多醣、硬葡聚糖、卡特蘭多醣、茯苓多醣、灰樹花多醣、昆布糖等。β-1,3-葡聚糖較佳為如香菇多醣、裂褶菌多醣或硬葡聚糖之含有大量1,6-葡萄哌喃糖苷(glucopyranoside)分枝(側鏈率33~40%)的β-1,3-葡聚糖，更佳為香菇多醣或裂褶菌多醣，最佳為香菇多醣。
香菇多醣(LNT)係來自香菇之周知的β-1,3-1,6-葡聚糖，分子式為(C6H10O5)n，分子量為約30~70萬。幾乎不溶於水、甲醇、乙醇(95)、或丙酮，但溶解於屬極性有機溶媒的DMSO或氫氧化鈉水溶液。
香菇多醣具有活性化巨噬細胞、殺手T細胞、自然殺手細胞及抗體依存性巨噬細胞媒介性細胞毒殺作用(ADMC)活性之增強作用(Hamuro,J.,et al.：Immunology,39,551-559,1980、Hamuro,J.,et al.：Int.J.Immunopharmacol.,2,171,1980、Herlyn,D.,et al.：Gann,76,37-42,1985)。於動物實驗，被認為對於同系
腫瘤(syngeneic tumor)及自體腫瘤(autologous tumor)藉由與化學療劑之併用投予，有腫瘤增殖抑制作用以及延命效果。又，即使藉由香菇多醣之單獨投予亦被認為有腫瘤增殖抑制作用以及延命效果。於臨床試驗對於無法手術或再發胃癌患者，藉由與替加氟(tegafur)經口投予之併用，被認為有生存期間的延長(醫藥品調查表(Pharmaceutical Interview Form)「香菇多醣靜注用1mg「味之素」」)，而於日本被認可。由香菇多醣之單獨投予所致的效果於目前並未被確認。
裂褶菌多醣(SPG)係來自裂褶菌之周知的可溶性β-葡聚糖。SPG包含β-(1→3)-D-葡聚糖之主鏈、及每各3個之葡萄糖有1個之β-(1→6)-D-葡萄糖苷基(glucosyl)側鏈(Tabata,K.,Ito,W.,Kojima,T.,Kawabata,S.and Misaki A.,「Carbohydr.Res.」,1981,89,1,p.121-135)。SPG作為對婦科癌之免疫增強法的肌肉內注射製劑臨床藥有20年以上之使用實績(清水，陳，荷見，增淵，「Biotherapy」,1990,4,p.1390、長谷川，「Oncology and Chemotherapy」,1992,8,p.225)，於活體內之安全性已被確認(Theresa,M.McIntire and David,A.Brant,「J,Am.Chem.Soc.」,1998,120,p.6909)。
於本說明書，「複合體」意指複數之分子藉由靜電結合、凡得瓦鍵、氫鍵、疏水性相互作用等之非共價鍵或共價鍵而組合，藉此獲得的產物。
本發明之複合體可形成藥學上可容許的鹽，就如此鹽類而言，較佳可列舉如鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽之鹼
金屬鹽；如鈣鹽、鎂鹽之鹼土類金屬鹽；鋁鹽、鐵鹽、鋅鹽、銅鹽、鎳鹽、鈷鹽等之金屬鹽；如銨鹽之無機鹽；如t-辛基胺鹽、二苄基胺鹽、味啉鹽、葡萄糖胺鹽、苯基甘胺酸烷基酯鹽、乙二胺鹽、N-甲基還原葡糖胺鹽、胍鹽、二乙基胺鹽、三乙基胺鹽、二環己基胺鹽、N,N’-二苄基乙二胺鹽、氯普鲁卡因鹽、普鲁卡因鹽、二乙醇胺鹽、N-苄基-苯乙基胺鹽、哌鹽、四甲基銨鹽、參(羥甲基)胺基甲烷鹽之有機鹽等之胺鹽；如氫氟酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽之鹵素原子化氫酸鹽；硝酸鹽、過氯酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等之無機酸鹽；如甲烷磺酸鹽、三氟甲烷磺酸鹽、乙烷磺酸鹽之低級烷磺酸鹽；如苯磺酸鹽、p-甲苯磺酸鹽之芳基磺酸鹽；乙酸鹽、蘋果酸鹽、反丁烯二酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、草酸鹽、順丁烯二酸鹽等之有機酸鹽；及如甘胺酸鹽、離胺酸鹽、精胺酸鹽、鳥胺酸鹽、麩胺酸鹽、天冬胺酸鹽之胺基酸鹽。就更佳的鹽而言，可列舉如鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽之鹼金屬鹽；及如t-辛基胺鹽、二苄基胺鹽、味啉鹽、葡萄糖胺鹽、苯基甘胺酸烷基酯鹽、乙二胺鹽、N-甲基還原葡糖胺鹽、胍鹽、二乙基胺鹽、三乙基胺鹽、二環己基胺鹽、N,N’-二苄基乙二胺鹽、氯普鲁卡因鹽、普鲁卡因鹽、二乙醇胺鹽、N-苄基-苯乙基胺鹽、哌鹽、四甲基銨鹽、參(羥甲基)胺基甲烷鹽之有機鹽等之胺鹽。作為進一步更佳的鹽而言，可列舉鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽、三乙基胺鹽及參(羥甲基)胺基甲烷鹽。
本發明之複合體係較佳為三重螺旋構造狀。
於較佳態樣，形成該三重螺旋構造的三股之鏈中，雙股為β-1,3-葡聚糖鏈，單股為上述本發明之寡去氧核苷酸中之聚去氧腺苷酸之鏈。又，該複合體亦可於一部份包含未形成三重螺旋構造的部分。
本發明之複合體中的寡去氧核苷酸與β-1,3-葡聚糖之組成比係因應寡去氧核苷酸中之聚去氧腺苷酸的鏈長、及β-1,3-葡聚糖之長度等而可加以變化。例如，於β-1,3-葡聚糖鏈與聚去氧腺苷酸之鏈之長度為同等的情形，將雙股之β-1,3-葡聚糖鏈、與單股之本發明之寡去氧核苷酸組合，可形成三重螺旋構造。一般而言，由於相對於β-1,3-葡聚糖鏈，聚去氧腺苷酸之鏈長較短，故對於雙股之β-1,3-葡聚糖鏈，複數之本發明之寡去氧核苷酸藉由聚去氧腺苷酸而組合，可形成三重螺旋構造(參照第10圖)。
本發明之複合體係含有人類化K型CpG ODN及β-1,3-葡聚糖(例如，香菇多醣、裂褶菌多醣、硬葡聚糖、卡特蘭多醣、茯苓多醣、灰樹花多醣、昆布糖)的複合體，較佳為由人類化K型CpG ODN及β-1,3-葡聚糖(例如，香菇多醣、裂褶菌多醣、硬葡聚糖)所構成的複合體。更佳為包含「於包含序列識別號1所表示的核苷酸序列的寡去氧核苷酸之3’側，20~60個核苷酸長度(具體而言，20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60個核苷酸長度)之聚去氧腺苷酸介
隔包含下式
之任一者所表示的基或將該基重複2或3次而鍵結的基之間隔基而結合，且磷酸二酯鍵之全部經硫代磷酸酯鍵取代的寡去氧核苷酸」、及「β-1,3-葡聚糖(例如，香菇多醣、裂褶菌多醣)」之複合體(例如，K3-spacer-dA20~60-LNT、K3-spacer-dA20~60-SPG)，更佳為包含「於包含序列識別號1所表示的核苷酸序列的寡去氧核苷酸之3’側，30~50個核苷酸長度(具體而言，30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個核苷酸長度)之聚去氧腺苷酸介隔包含下式
之任一者所表示的基或將該基重複2或3次而鍵結的基之間隔基而結合，且磷酸二酯鍵之全部經硫代磷酸酯鍵取代的寡去氧核苷酸」、及「β-1,3-葡聚糖(例如，香菇多醣、裂褶菌多醣)」之複合體(例如，K3-spacer-dA30~50-LNT、K3-spacer-dA30~50-SPG)，進一步更佳為包含「於包含序列識別號1所表示的核苷酸序列的寡去氧核苷酸之3’側，30~45個核苷酸長度(具體而言，30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45個核苷酸長度)之聚去氧腺苷酸介隔包含下式
之任一者所表示的基或將該基重複2或3次而鍵結的基之間隔基而結合，且磷酸二酯鍵之全部經硫代磷酸酯鍵取代的寡去氧核苷酸」、及「β-1,3-葡聚糖(例
如，香菇多醣、裂褶菌多醣)」之複合體(K3-spacer-dA30~45-LNT、K3-spacer-dA30~45-SPG)，最佳為包含「於包含序列識別號1所表示的核苷酸序列的寡去氧核苷酸之3’側，40個核苷酸長度之聚去氧腺苷酸介隔將下式
之任一者所表示的基重複2或3次而鍵結的基之間隔基而結合，且磷酸二酯鍵之全部經硫代磷酸酯鍵取代的寡去氧核苷酸」、及「香菇多醣或裂褶菌多醣」之複合體(K3-(S18)2-dA40-LNT、K3-(S18)2-dA40-SPG、K3-(S12)2-dA40-LNT、K3-(S12)2-dA40-SPG)。
本發明之複合體之調製可與非專利文獻21~24、或日本特開2008-100919號公報記載的條件同樣地進行。即，將本來以天然之三重螺旋構造存在的β-1,3-葡聚糖溶解於非質子性有機極性溶媒(二甲基亞碸(DMSO)、乙腈、丙酮等)或鹼水溶液(氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨、氫氧化鈣等)而解開成單股。將如此獲得的單股之β-1,3-葡聚糖之溶液與本發明之寡去氧核苷酸之溶液(水溶液、中性附近之pH之緩衝水溶液、或酸性之緩衝水溶液，較佳為水溶液或中性附近之pH之緩衝水溶液)混合，因應必要而再次將pH調整為中性附近後，保持適當時間。例如，於5℃保存一夜。其結果，藉由雙股之β-1,3-葡聚糖
鏈與該寡去氧核苷酸中之聚去氧腺苷酸鏈形成三重螺旋構造，而形成本發明之複合體。藉由對生成的複合體進行利用尺寸排除層析(size exclusion chromatography)之純化、超過濾、透析等，可去除未形成複合體之寡去氧核苷酸。又，藉由對生成的複合體進行利用陰離子交換層析的純化，可去除未形成複合體之β-1,3-葡聚糖。藉由上述之方法，可將複合體適當地純化。
本發明之複合體之形成可藉由測定例如利用CD(圓偏光二色性(circular dichroism))光譜的構型變化、利用尺寸排除層析的UV吸收位移、膠體電泳、微晶片電泳、毛細管電泳動而加以確認，但未限於此等。
本發明之寡去氧核苷酸與β-1,3-葡聚糖之混合比可考慮聚去氧腺苷酸鏈之長度等而適宜設定，但通常莫耳比(β-1,3-葡聚糖(LNT等)/ODN)為0.02~2.0，較佳為0.1~0.5。於其他態樣，莫耳比(β-1,3-葡聚糖(LNT等)/ODN)例如為0.005~1.0，較佳為0.020~0.25。
於另外的局面，本發明之寡去氧核苷酸與β-1,3-葡聚糖之混合比可考慮聚去氧腺苷酸鏈之長度等而適宜設定，例如，可依聚去氧腺苷酸鏈之腺苷數(dA)與β-1,3-葡聚糖之主鏈葡萄糖數(mG)之比率來設定。通常，mG/dA比為2.0~10，較佳為2.0~6.0，更佳為2.0~4.0，進一步更佳為2.0~3.0。
關於本發明之複合體之調製方法，以CpG-spacer-ODN與LNT複合體為例加以說明。使LNT溶解於0.05~2N，較佳為0.1~1.5N之鹼水溶液(例如，0.25N
氫氧化鈉水溶液)，於1℃~40℃放置10小時~4日(例如，於室溫放置一晚)，而調製單股之LNT水溶液(例如，50mg/ml之LNT水溶液)。將前述LNT水溶液與另外調製的CpG-spacer-ODN水溶液(例如，100μM之CpG水溶液)以莫耳比(LNT/ODN)0.005~1.0加以混合，接著，於前述LNT、CpG-spacer-ODN混合液中添加酸性之緩衝水溶液(例如，NaH2PO4)而中和，於1~40℃維持6小時~4日(例如，於4℃一晚)，藉此使複合體化完成。又，為了前述複合化，亦可將LNT水溶液於最後添加混合。複合體之形成可例如，使用尺寸排除層析，將CpG-spacer-ODN之向高分子量側的位移，藉由監測240~280nm(例如，260nm)的吸收而確認。
於一態樣，本發明之複合體係呈竿狀之粒子之形態。粒子徑係與作為材料所使用的β-1,3-葡聚糖(例如，裂褶菌多醣)天然呈三重螺旋構造形成的粒子之徑為同等，通常平均粒子徑為10-100nm，較佳為20-50nm。該粒子徑可將複合體溶解或分散於水中，使用Malvern Instruments Zeta Sizer，於80℃之條件下藉由動態光散射法而測量。
本發明之複合體較佳為經單離。「經單離的複合體」之純度(作為目的的複合體重量佔評價對象物之總重量的百分率)通常為70%以上，較佳為80%以上，更佳為90%以上，進一步更佳為99%以上。
本發明之複合體因具有優異的免疫賦活活性，尤其具有K型CpG ODN特有之免疫賦活活性(例如，將
B細胞(較佳為人類B細胞)活性化而使IL-6產生的活性)、及D型CpG ODN特有之免疫賦活活性(例如，將漿細胞樣樹突細胞(較佳為人類漿細胞樣樹突細胞)活性化而使IFN-α產生的活性)兩者，故有用於作為免疫賦活劑等。例如，本發明之含有寡去氧核苷酸(例如，序列識別號2~17)與LNT的複合體(例如，K3-spacer-LNT)及本發明之含有寡去氧核苷酸(例如，序列識別號2~17)與SPG的複合體(例如，K3-spacer-SPG)具有炎症反應誘導能力(pan-IFN-a、IL-6等)、病毒接種個體中之血清中抗原特異性IgG抗體力價(總IgG、IgG2c等)之增強作用、病毒接種個體中之抗原特異性細胞介素產生能力(IFN-γ、IL2等)、抗病毒的感染防禦效果。針對K3-spacer-LNT，於病毒接種個體亦具有Th2型細胞介素(IL-13等)之產生增強能力。因此，有用於作為新穎疫苗佐劑候選物。
3.醫藥組成物
本發明係提供含有上述本發明之寡去氧核苷酸或上述本發明之複合體之醫藥組成物。本發明之醫藥組成物可藉由按照通常手段將上述本發明之寡去氧核苷酸或上述本發明之複合體加以製劑化而獲得。本發明之醫藥組成物包含本發明之寡去氧核苷酸或複合體及藥理學上可容許的載劑。又，本醫藥組成物亦可進一步含有抗原。此種醫藥組成物係作為適合經口或非經口投予的劑型被提供。
作為非經口投予用之組成物，例如，可使用於注射劑、栓劑等，注射劑可包含靜脈注射劑、皮下注
射劑、皮內注射劑、肌肉注射劑、點滴注射劑等之劑型。此種注射劑可按照周知方法來調製。就注射劑之調製方法而言，例如，可藉由將上述本發明之寡去氧核苷酸或複合體溶解或懸浮於通常用於注射劑的無菌水性溶媒而調製。就注射用之水性溶媒而言，例如，可使用蒸餾水；生理食鹽水；磷酸緩衝液、碳酸緩衝液、Tris緩衝液、乙酸緩衝液等之緩衝液等。此種水性溶媒之pH可列舉5~10，較佳為6~8。調製的注射液以被填充於適當安瓿中為較佳。
又，本發明之寡去氧核苷酸或複合體之懸浮液亦可藉由加以真空乾燥、冷凍乾燥等之處理而調製本發明之寡去氧核苷酸或複合體之粉末製劑。藉由將本發明之寡去氧核苷酸或複合體以粉末狀態保存，使用時將該粉末以注射用之水性溶媒加以分散，可供給於使用。
醫藥組成物中之本發明之寡去氧核苷酸或複合體之含量通常為醫藥組成物全體之約0.1~100重量%，較佳為約1~99重量%，進一步較佳為約10~90重量%左右。
本發明之醫藥組成物可單獨含有本發明之寡去氧核苷酸或複合體作為有效成分，亦可將本發明之寡去氧核苷酸或複合體與其他有效成分組合而含有。
4.醫藥用途
本發明之寡去氧核苷酸及複合體具有優異的免疫賦活活性，故本發明之寡去氧核苷酸、複合體及醫藥組成物可使用作為免疫賦活劑。藉由將本發明之寡去氧核苷
酸、複合體或醫藥組成物投予至哺乳動物(人類等之靈長類、小鼠等之嚙齒類等)，可誘發該哺乳動物中的免疫反應。尤其，本發明之複合體具有D型CpG ODN之活性特性，刺激末梢血液單核球，而使I型干擾素(Pan-IFN-α、IFN-α2等)及II型干擾素(IFN-γ)兩者大量地產生，故有用於作為I型干擾素產生誘導劑、II型干擾素產生誘導劑、I型及II型干擾素產生誘導劑。因誘導I型及II型干擾素兩者之產生，本發明之複合體及含有其之醫藥組成物係有用於I型及II型干擾素之任一者或兩者為有效的疾病之預防或治療。就I型干擾素有效的疾病而言，可列舉病毒感染症(例如，C型肝炎病毒(HCV)、疱疹病毒、乳突瘤病毒(papilloma virus)、RS病毒、流感病毒等)、癌症等。就II型干擾素為有效的疾病而言，可列舉過敏性疾病、細胞內寄生性之原蟲(利什曼原蟲(leishmania)等)或細菌(李斯特菌(Listeria)、結核菌等)等之感染症等。對包含RS病毒或流感病毒的急性病毒感染症，I型干擾素及II型干擾素同時提高與病毒排除有關的免疫反應，故本發明之複合體及含有其之醫藥組成物可期待對急性病毒感染症的有效性。
又，本發明之寡去氧核苷酸及複合體，尤其是本發明之複合體，具有強力的疫苗佐劑活性，將本發明之寡去氧核苷酸及複合體與抗原一起投予至哺乳動物時，可強力地誘導抗該抗原的免疫反應。因此，本發明亦提供一種包含「(a)本發明之寡去氧核苷酸、或本發明之複合體」、及「(b)抗原」之用以誘導抗該抗原的免疫
反應之組成物。尤其，本發明之複合體強力地誘導抗抗原之體液性免疫反應(抗原特異性抗體產生)及細胞性免疫反應(抗原特異性CTL誘導)之兩者。因此，本發明之寡去氧核苷酸、複合體、及醫藥組成物，尤其是本發明之複合體及含有其之醫藥組成物，有用於作為疫苗佐劑。
於本說明書，佐劑意指促進免疫反應的輔助劑，與抗原一起被投予至活體時，非特異性地使抗此抗原的免疫反應增強的物質。
就抗原而言，只要對於投予對象之哺乳動物(人類等之靈長類、小鼠等之嚙齒類等)而言具有抗原性，抗體或細胞毒性T淋巴球(CTL、CD8+T細胞)可作為抗原而辨識，則並未被特別限定，可使用成為抗原的所有物質(蛋白質、胜肽、核酸、脂質、糖質、以及前述物質之修飾體(例如，導入一個或複數之胺基酸的刪除、取代、及/或添加等(以下，變異等)的修飾體等)。就抗原而言，亦可使用來自原蟲、真菌、細菌、病毒等之病原體的抗原、與癌症或特定之疾病有關的抗原。
於本說明書，「抗原A來自病原體X」意指抗原A係作為構成因子被含於該病原體X中。例如，抗原A為多胜肽的情形，意指其多胜肽之胺基酸序列存在於病原體X之基因體所編碼的蛋白質之胺基酸序列中。
就來自病原體之抗原而言，可列舉病原體本身或其一部分、不活化或減毒化的病原體本身或其一部分、或彼等之導入變異等的修飾體。
使用來自病原體之抗原作為抗原時，誘發抗
該抗原的免疫反應，而構築將含該抗原的病原體免疫學性地排除至活體外的機制。因此，含有(a)「本發明之寡去氧核苷酸、或本發明之複合體」、及(b)「來自病原體之抗原」之用以誘導抗該抗原的免疫反應用之組成物係有用於起因於該病原體的疾病(例如，病原體之感染症)之預防或治療。
本發明之複合體強力地誘導抗抗原的體液性免疫反應(抗原特異性抗體產生)以及細胞性免疫反應(抗原特異性CTL誘導)兩者。因此，來自已知藉由細胞毒性T淋巴球所辨識的細胞內感染性之病原體(病毒、原蟲、真菌、細菌等)之抗原、或與癌化細胞有關連的抗原(例如，腫瘤抗原)等適合被使用作為抗原。
就細胞內感染性病毒而言，並未被特別限定，但可列舉RS病毒、流感病毒、副流感病毒、C型肝炎病毒(HCV)、A型肝炎病毒(HAV)、B型肝炎病毒(HBV)、伊波拉病毒(Ebola virus)、巨細胞病毒(cytomegalovirus)、腺病毒、小兒麻痺病毒(poliovirus)、日本腦炎病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、德國麻疹病毒(rubella virus)、狂犬病病毒、黄熱病毒、水痘帶狀疱疹病毒(varicella-zoster virus)、漢他病毒(hantavirus)、登革熱病毒(dengue virus)、諾羅病毒(Norovirus)、輪狀病毒(rotavirus)、小病毒(parvovirus)、冠狀病毒(coronavirus)、犬瘟熱病毒(distemper virus)、成人T細胞白血病病毒(HTLV-1)、人類免疫不全病毒(HIV)、疱疹病毒、乳突瘤病毒等。就細胞內感染性細菌而言，可列舉黴漿菌等。
就細胞內感染性原蟲而言，可列舉瘧疾原蟲、住血吸蟲等。細胞內感染性病原體較佳為病毒(具體而言，RS病毒、或流感病毒等)。
就與癌化的細胞有關連的抗原而言，可列舉於癌化細胞特異性表現的蛋白質、糖鏈、胜肽、以及前述物質之變異體(刪除、取代、及/或添加)或其修飾體等。
本發明之複合體因強力誘導I型及II型干擾素兩者，而於一態樣，可選擇I型干擾素及II型干擾素兩者為有效之引起急性病毒感染症的病毒(例如，RS病毒、流感病毒)作為病毒。
例如，藉由將含有(a)「本發明之寡去氧核苷酸、或本發明之複合體」、及(b)「來自病原體或癌症的抗原」之誘導抗該抗原的免疫反應用之組成物，對該病原體感染症或癌症之患者、有罹患該病原體感染症或癌症的可能性之人類進行投予，而使接受該投予的對象中之細胞毒性T淋巴球(CTL)抗原特異性地活化，誘導該抗原特異性的抗體產生，即藉由誘導溫血動物(較佳為人類)之防禦免疫反應，可預防‧治療該感染症或癌症。即，該組成物有用於作為上述感染症、癌症等之疾病之預防或治療用之疫苗。
又，本發明之複合體因可強力地誘導抗抗原的體液性免疫反應(抗原特異性抗體產生)及細胞性免疫反應(抗原特異性CTL誘導)兩者，故亦可使用病原體或癌細胞之表面抗原及內部抗原中任一者作為抗原，亦可冀望將表面抗原與內部抗原混合而使用。
含有(a)「本發明之寡去氧核苷酸、或本發明之複合體」、及(b)「抗原」之誘導抗該抗原的免疫反應用之組成物可按照上述本發明之醫藥組成物來調製。
包含本說明書中列舉的專利及專利申請說明書之全部刊物所記載的內容係藉由在本說明書之引用，其全部與被明示的相同程度被併入本說明書中。
以下，藉由實施例以進一步詳細地說明本發明，但本發明完全未受限於此等實施例。
[實施例1-3及參考例1]
<實施例之K3-spacer及參考例K3-dA40之合成>
實施例之K3-spacer及參考例K3-dA40係示於表2，以如以下的方法合成。
表2中，左端表示5’末端，右端表示3’末端。X部分(亦稱為間隔基部分)係選自S18、S12、S9或C12，n表示其重複的數目。n=1的情形，亦有未特別記載的情形。屬具有間隔基及dA40的K3(亦標記為K3-spacer)，且將作為間隔基之S18重複2次者(或含2個S18單元者)，係標記為K3-(S18)2-dA40。
As、Cs、Gs、Ts、A、S18、S12、S9及C12係以下列之構造表示。
本寡去氧核苷酸係使用屬通常方法的固相亞磷醯胺法(Nucleic Acids in Chemistry and Biology,3.Chemical synthesis(1990)ed.G.Michael Blackburn and Michael J.Gait.Oxford University Press)來合成。於合成S18之部分之際，使用Spacer 18(DMT-六-乙氧基-二醇亞磷醯胺(DMT-Hexa-ethoxy-glycol phosphor
amidite)、ChemGene、目錄編號：CLP-9765)，於合成S12之部分之際，使用Spacer 12(DMT-四乙氧基-二醇亞磷醯胺(DMT-Tetraethoxy-glycol phosphoramidite)、ChemGene、目錄編號：CLP-1368)，於合成S9之部分之際，使用Spacer 9(DMT-三乙氧基-二醇亞磷醯胺(DMT-Triethoxy-glycol phosphoramidite)、ChemGene、目錄編號：CLP-1113)，於合成C12之部分之際，使用Carbon 12(DMT-十二烷-二醇亞磷醯胺(DMT-Dodecane-Diol phosphoramidite)、ChemGene、目錄編號：CLP-1114)。
表3呈示表2記載之K3-spacer之分子量(計算值)、利用質量分析的測定值、及以下列條件藉由逆相HPLC分析的情形之保持時間(管柱：Waters-、X-Bridge C18 2.5μm、4.6 x 75mm，A溶液：100mM六氟異丙醇、8mM三乙基胺，B溶液：甲醇、B%：5%→30%(20分鐘，線性梯度)；60℃；1ml/分鐘；260nm)。
[參考例2]
<K3-dA40與SPG之複合體(K3-SPG複合體)之調製>
[其1]
將7.22mg之K3-dA40溶解於水(3.7mL)中。將SPG(三井製糖)15mg溶解於0.25N NaOH(1mL)。將1mL之330mM NaH2PO4添加至DNA溶液，接著將SPG溶液加到DNA/NaH2PO4溶液中，藉由於4℃靜置一晚而完成複合體化。莫耳比(MSPG/MDNA)係固定於0.27。複合體之形成係藉由微晶片電泳裝置(SHIMADZU：MultiNA)來確認。
[其2]
將SPG(三井製糖)以成為15mg/mL的方式，溶解於0.25N NaOH，於室溫放置一晚。K3-dA40係以成為100μM的方式，溶解於注射用水。將SPG 8.12mg與K3-dA40 4.17mg混合，接著，添加與SPG相同體積(541.4μl)之330mM NaH2PO4，藉由於4℃靜置一晚而完成複合體化。複合體之形成係使用尺寸排除層析，將K3-dA40之向高分子量側的位移，藉由監測260nm中的吸收而確認。相對於K3-dA40之保持時間為30.35分鐘，K3-SPG複合體之保持時間為21.99分鐘。又，因其波峰位移為100%，故K3-SPG複合體之形成被確認(系統：Agilent 1100series，管柱：Asahipak GS-520 HQ(Shodex)-GS-320 HQ(Shodex)，流速：0.5mL/分鐘，緩衝液：100mM磷酸鹽緩衝液、pH7.4，溫度：40℃)。
[實施例4]
<K3-spacer與LNT之複合體(K3-spacer-LNT複合體)
之調製>
將香菇多醣(LNT：味之素股份有限公司，批次編號：2D8X1)以成為50mg/mL的方式，溶解於0.25N NaOH，於室溫放置一晚。K3-spacer係以成為100μM的方式，溶解於注射用水。將LNT水溶液與K3-spacer水溶液以表4所示比率混合，接著，添加與所添加的LNT相同體積之330mM NaH2PO4，藉由於4℃一晚靜置而完成複合體化(以後，標記為K3-spacer-LNT)。複合體之形成係使用尺寸排除層析，將K3-spacer之向高分子量側的位移，藉由監測260nm中的吸收而確認。
分析條件A
系統：Agilent 1100series，管柱：Asahipak GF7M-HQ(Shodex)二管連結，流速：0.8mL/分鐘，緩衝液：10mM EDTA PBS、pH7.4，溫度：40℃
分析條件B
系統：Agilent 1100series，管柱：Asahipak GS-520 HQ(Shodex)-GS-320 HQ(Shodex)，流速：0.5mL/分鐘，緩衝液：100mM磷酸鹽緩衝液、pH7.4，溫度：40℃
分析條件C
系統：Agilent 1100series，管柱：Asahipak GS-520 HQ(Shodex)-GS-320 HQ(Shodex)，流速：0.5mL/分鐘，緩衝液：20%乙腈、80mM磷酸鹽緩衝液、pH7.4，溫度：40℃
將上述之分析條件中的各種K3-spacer、及各種K3-spacer-LNT複合體之保持時間、K3-spacer-LNT複
合體之含量(%)示於表5。全部皆確認到K3-spacer之波峰位移，故K3-spacer-LNT複合體之形成被證明。
[實施例5]
<K3-spacer與SPG之複合體(K3-spacer-SPG複合體)之調製>
將裂褶菌多醣(SPG：三井製糖股份有限公司)以成為15mg/mL的方式溶解於0.25N NaOH，於室溫放置一晚。K3-spacer係以成為100μM的方式，溶解於注射用水。將SPG水溶液與K3-spacer水溶液以表6所示比率加以混合，接著添加與所添加的SPG相同體積之330mM NaH2PO4，藉由於4℃靜置一晚而完成複合體化(以後，標記為K3-spacer-SPG)。複合體之形成係使用尺寸排除層析，藉由偵測260nm中的吸收而確認K3-spacer之向高分子量側的位移。
分析條件B
系統：Agilent 1100series，管柱：Asahipak GS-520 HQ(Shodex)-GS-320 HQ(Shodex)，流速：0.5mL/分鐘，緩衝液：100mM磷酸鹽緩衝液、pH7.4，溫度：40℃
分析條件C
系統：Agilent 1100series，管柱：Asahipak GS-520 HQ(Shodex)-GS-320 HQ(Shodex)，流速：0.5mL/分鐘，緩衝液：20%乙腈、80mM磷酸鹽緩衝液、pH7.4，溫度：40℃
將上述之分析條件中的各種K3-spacer、及各種K3-spacer-SPG複合體之保持時間、K3-spacer-SPG複合體之含量(%)示於表7。全部皆以90%以上之比率，確認K3-spacer之波峰位移，故K3-spacer-SPG複合體之形成被證明。
[試驗例1]
(1)方法
<動物>
C57BL/6J小鼠係購自日本CLEA。全部之動物實驗係按照醫藥基盤研究所及大阪大學動物施設之機關準則來實施。
<人類PBMCs之調製及刺激(第1、4、7圖)>
將冷凍人類PBMCs(Lonza公司，Cat# CC-2702、Lot# 0000396517)融解，以complete RPMI(添加10% FCS、青黴素、及鏈黴素的RPMI 1640)調製為1 x 107個/ml之細胞密度。以100μL/孔接種於U底96孔細胞培養盤，以各疫苗佐劑刺激24小時。刺激後，將培養上清液中之pan-IFN-α(Mabtech)及IL-6(R&D)藉由細胞介素ELISA定量。對第1圖中的K3-spacer-LNT附加的# 1或# 2各自指以mG/dA莫耳比為2.5或3.0之條件所製作的佐劑複合體。
<抗RSV F疫苗抗原之抗體力價測定(第2、5、8圖)>
於7週齡之C57BL/6小鼠之尾根部，每一隻以2週間隔接種2次RSV F抗原0.5μg與各種佐劑10μg(於核酸佐劑，核酸用量為10μg)之混合製劑。自最終免疫1週後進行末梢血液之回收及血清之調製，作為評價試料。血清中之結合於RSV F疫苗抗原的總IgG及IgG亞型係使用ELISA法來測定。
<RSV F疫苗抗原特異性T細胞細胞介素產生
能力(第3、6、9圖)>
於7週齡之C57BL/6小鼠之尾根部，每一隻以2週間隔接種2次RSV F抗原0.5μg與各種佐劑10μg。自最終免疫1週後回收脾臓，調製脾臓細胞。將接種於96孔培養盤的脾臓細胞，各自以RSV F抗原之第I型MHC拘束性抗原決定位胜肽(MHC class I-restricted epitope peptide)、第II型MHC拘束性抗原決定位胜肽(MHC class II-restricted epitope peptide)、疫苗抗原蛋白質來刺激，培養24小時或48小時。RSV F抗原特異性細胞介素產生能力係將培養上清液作為試料，使用細胞介素ELISA法來評價。於本檢討評價屬Th1型細胞介素的IFN-g、自活性化T細胞所產生的IL-2、屬Th2型細胞介素的IL-5及IL-13之4種細胞介素。
(2)結果
<使用人類PBMCs的K3-spacer-LNT及K3-SPG複合體之炎症反應誘導能力>
針對K3-spacer單獨(K3-(S18)-dA40、K3-(S18)2-dA40、K3-(S18)3-dA40)、及K3-spacer-LNT複合體(K3-(S18)-dA40-LNT#1/#2、K3-(S18)2-dA40-LNT#1/#2、K3-(S18)3-dA40-LNT#1/#2)，檢討人類PBMC中的炎症反應誘導能力。將結果示於第1圖。相對於在K3-spacer單獨刺激中pan-IFN-a產生為檢測極限程度，暗示K3-spacer-LNT複合體具有高pan-IFN-a誘導能力。又，由K3-spacer-LNT複合體所致的pan-IFN-a誘導能力與K3-SPG複合體相比為較高的結果。再者，暗示由K3-spacer-LNT複合體所致
的pan-IFN-a誘導能力並未依存於spacer之長度。另一方面，於IL-6誘導活性，觀察到K3-spacer單獨、K3-spacer-LNT複合體及K3-SPG複合體為同等的。
<接種添加K3-spacer-LNT及K3-SPG複合體之RSV F次單元疫苗的小鼠中之血清中RSV F抗原特異性IgG抗體力價>
將K3-(S18)-dA40、K3-(S18)2-dA40、K3-(S18)3-dA40之K3-spacer單獨、K3-spacer-LNT複合體(K3-(S18)-dA40-LNT、K3-(S18)2-dA40-LNT、K3-(S18)3-dA40-LNT)、及K3-SPG之抗體產生增強活性，藉由測量經RSV F次單元疫苗免疫的小鼠血清中抗體力價來評價。將結果示於第2圖。RSV F抗原特異性的總IgG誘導與RSV F抗原單獨接種組(F)相比，藉由添加佐劑而被增強，暗示K3-spacer單獨(F+K3-(S18)-dA40、F+K3-(S18)2-dA40、F+K3-(S18)3-dA40)、K3-spacer-LNT複合體(F+K3-(S18)2-dA40-LNT及F+K3-(S18)3-dA40-LNT)及K3-SPG複合體(F+K3-dA40-SPG)與磷酸明礬(F+Alum)之輔助效果為同等的可能性。接種屬Th2型佐劑的磷酸明礬(F+Alum)的小鼠組中，觀察到IgG1亞型誘導能力與RSV F抗原單獨接種組(F)相比為較高的，於K3-spacer-LNT複合體亦觀察到與磷酸明礬同等之IgG1誘導能力。另一方面，關於IgG2c亞型抗體，於接種K3-spacer單獨、K3-spacer-LNT複合體、K3-SPG複合體的免疫組，與磷酸明礬相比顯示高度增強的活性。由以上之結果，暗示包含(S18)、(S18)2、(S18)3間隔基的K3-spacer-LNT複合體顯示與K3-SPG複合體同
樣之Th1型佐劑活性，另一方面，亦具有與磷酸明礬同樣之Th2型之免疫增強活性。
<接種添加K3-spacer-LNT及K3-SPG複合體之RSV F次單元疫苗的小鼠中之RSV F抗原特異性細胞介素產生能力>
將K3-spacer單獨(K3-(S18)-dA40、K3-(S18)2-dA40、K3-(S18)3-dA40)、K3-spacer-LNT複合體(K3-(S18)-dA40-LNT、K3-(S18)2-dA40-LNT、K3-(S18)3-dA40-LNT)、及K3-SPG複合體之RSV F抗原特異性細胞介素產生誘導能力，藉由測量自經RSV F次單元疫苗免疫的小鼠脾臓細胞因應抗原刺激所產生的細胞介素而評價。將結果示於第3圖。RSV F抗原特異性的IFN-g產生誘導與IL-2產生誘導之增強效果與K3-spacer單獨相比，於K3-spacer-LNT複合體(F+K3-(S18)-dA40-LNT、F+K3-(S18)2-dA40-LNT、F+K3-(S18)3-dA40-LNT)中較高，暗示K3-LNT複合體與K3-SPG複合體(F+K3-dA40-SPG)之活性為同等的可能性。於屬Th2型佐劑的磷酸明礬佐劑接種組(F+Alum)，IFN-g產生係於任一者之刺激皆為檢測極限以下。另一方面，IL-13產生增強效果係於屬Th2型佐劑的磷酸明礬接種組中觀察到高的，於屬Th1型佐劑的K3-SPG接種組則為低的結果。有趣的是，於K3-spacer-LNT複合體(F+K3-(S18)-dA40-LNT、F+K3-(S18)2-dA40-LNT、F+K3-(S18)3-dA40-LNT)，與同屬Th1型佐劑的K3-SPG複合體接種組(F+K3-dA40-SPG)相比，顯示高的IL-13產生增強效果，與屬Th2型佐劑的磷酸明礬接種組同等。由此，暗示
K3-spacer-LNT複合體除了具有K3-SPG複合體所具有的高Th1反應增強效果之外，亦具有Th2反應增強能力。
<使用人類PBMCs的K3-spacer-LNT及K3-SPG複合體之炎症反應誘導能力>
針對K3-spacer-LNT複合體(K3-(S18)2-dA30-LNT、K3-(S18)2-dA35-LNT、K3-(S18)2-dA40-LNT、K3-(S12)2-dA40-LNT、K3-(S12)3-dA40-LNT、K3-(C12)2-dA40-LNT、K3-(C12)3-dA40-LNT)及K3-SPG複合體，檢討人類PBMC中的炎症反應誘導能力。將結果示於第4圖。暗示K3-(S18)2-dA30-LNT、K3-(S18)2-dA35-LNT、K3-(S18)2-dA40-LNT、K3-(S12)2-dA40-LNT、K3-(S12)3-dA40-LNT之K3-spacer-LNT複合體與K3-SPG複合體相比，具有高pan-IFN-a誘導能力。另一方面，於K3-(C12)2-dA40-LNT及K3-(C12)3-dA40-LNT之K3-spacer-LNT複合體，pan-IFN-a誘導能力為檢測極限以下。關於IL-6產生量，於除了K3-(C12)2-dA40-LNT及K3-(C12)3-dA40-LNT之外的K3-spacer-LNT複合體，觀察到與K3-SPG複合體同等之誘導活性。
<接種添加K3-spacer-LNT及K3-SPG複合體之RSV F次單元疫苗的小鼠中之血清中RSV F抗原特異性IgG抗體力價>
將K3-spacer-LNT複合體(K3-(S18)2-dA30-LNT、K3-(S18)2-dA35-LNT、K3-(S18)2-dA40-LNT、K3-(S12)2-dA40-LNT、K3-(S12)3-dA40-LNT、K3-(C12)2-dA40-LNT、K3-(C12)3-dA40-LNT)及K3-SPG複合體之抗體產生增
強活性，藉由測量經RSV F次單元疫苗免疫的小鼠血清中抗體力價而評價。將結果示於第5圖。RSV F抗原特異性的總IgG誘導與RSV F抗原單獨接種組(F)相比，藉由添加佐劑而被增強，暗示K3-spacer-LNT複合體(F+K3-(S18)2-dA30-LNT、F+K3-(S18)2-dA35-LNT、F+K3-(S18)2-dA40-LNT、F+K3-(S12)2-dA40-LNT、F+K3-(S12)3-dA40-LNT、F+K3-(C12)2-dA40-LNT、F+K3-(C12)3-dA40-LNT)及K3-SPG複合體(F+K3-SPG)與磷酸明礬(F+Alum)之輔助效果為同等的可能性。於接種屬Th2型佐劑的磷酸明礬(F+Alum)的小鼠組，觀察到IgG1亞型誘導能力與RSV F抗原單獨接種組(F)相比為較高，於K3-spacer-LNT複合體亦觀察到與磷酸明礬同等以上之IgG1誘導能力。另一方面，於IgG2c亞型抗體，接種K3-spacer-LNT複合體及K3-SPG的免疫組顯示與磷酸明礬相比為較高的結果。由以上之結果，暗示K3-(S18)2-dA30-LNT、K3-(S18)2-dA35-LNT、K3-(S18)2-dA40-LNT、K3-(S12)2-dA40-LNT、K3-(S12)3-dA40-LNT、K3-(C12)2-dA40-LNT及K3-(C12)3-dA40-LNT之K3-spacer-LNT複合體具有同等之抗體增強活性的可能性。
<接種添加K3-spacer-LNT及K3-SPG複合體之RSV F次單元疫苗的小鼠中之RSV F抗原特異性細胞介素產生能力>
將K3-LNT複合體(K3-(S18)2-dA30-LNT、K3-(S18)2-dA35-LNT、K3-(S18)2-dA40-LNT、K3-(S12)2-dA40-LNT、K3-(S12)3-dA40-LNT、K3-(C12)2-dA40-LNT、K3-(C1
2)3-dA40-LNT)及K3-SPG複合體之RSV F抗原特異性細胞介素產生誘導能力，藉由測量自經RSV F次單元疫苗免疫的小鼠脾臓細胞因應抗原刺激所產生的細胞介素來評價。將結果示於第6圖。RSV F抗原特異性的IFN-g產生誘導與IL-2產生誘導之增強效果係與抗原單獨投予組(F)相比，於K3-spacer-LNT複合體(F+K3-(S18)2-dA30-LNT、F+K3-(S18)2-dA35-LNT、F+K3-(S18)2-dA40-LNT、F+K3-(S12)2-dA40-LNT、F+K3-(S12)3-dA40-LNT、F+K3-(C12)2-dA40-LNT、F+K3-(C12)3-dA40-LNT)及K3-SPG複合體(F+K3-dA40-SPG)為高的結果。於屬Th2型佐劑的磷酸明礬佐劑投予組(F+Alum)，IFN-g產生係於任一者之刺激皆為檢測極限以下。另一方面，IL-13產生增強效果與抗原單獨投予組相比，於屬Th2型佐劑的磷酸明礬接種組觀察到高的，於屬Th1型佐劑的K3-SPG接種組則為低的結果。關於K3-spacer-LNT複合體，與同屬Th1型佐劑的K3-SPG接種組(F+K3-dA40-SPG)相比顯示高IL-13產生增強效果，與屬Th2型佐劑的磷酸明礬接種組同等。由此，暗示K3-(S18)2-dA30-LNT、K3-(S18)2-dA35-LNT、K3-(S18)2-dA40-LNT、K3-(S12)2-dA40-LNT、K3-(S12)3-dA40-LNT、K3-(C12)2-dA40-LNT、K3-(C12)3-dA40-LNT之K3-spacer-LNT複合體具有同等之Th1及Th2細胞介素產生增強活性。
<使用人類PBMCs的K3-spacer-LNT及K3-SPG複合體之炎症反應誘導能力之檢討>
針對K3-spacer-LNT複合體(K3-(S18)-dA35-LNT、
K3-(S18)-dA40-LNT、K3-(S18)2-dA35-LNT、K3-(S18)2-dA40-LNT、K3-(S12)-dA35-LNT、K3-(S12)-dA40-LNT、K3-(S12)2-dA35-LNT、K3-(S12)2-dA40-LNT、K3-(S9)-dA35-LNT、K3-(S9)-dA40-LNT、K3-(S9)2-dA35-LNT、K3-(S9)2-dA40-LNT)及K3-SPG複合體，檢討人類PBMC中的炎症反應誘導能力。將結果示於第7圖。於全部之K3-spacer-LNT複合體，與K3-SPG複合體相比，暗示具有高pan-IFN-a誘導能力。另一方面，IL-6產生量係於K3-spacer-LNT複合體及K3-SPG複合體觀察到同等之誘導活性。
<接種添加K3-spacer-LNT複合體之RSV F次單元疫苗的小鼠中之血清中RSV F抗原特異性IgG抗體力價>
將K3-spacer-LNT複合體(K3-(S18)-dA35-LNT、K3-(S18)-dA40-LNT、K3-(S18)2-dA35-LNT、K3-(S18)2-dA40-LNT、K3-(S12)-dA35-LNT、K3-(S12)-dA40-LNT、K3-(S12)2-dA35-LNT、K3-(S12)2-dA40-LNT、K3-(S9)-dA35-LNT、K3-(S9)-dA40-LNT、K3-(S9)2-dA35-LNT、K3-(S9)2-dA40-LNT)之抗體產生增強活性，藉由測量經RSV F次單元疫苗免疫的小鼠血清中抗體力價來評價。將結果示於第8圖。RSV F抗原特異性的總IgG誘導與RSV F抗原單獨接種組(F)相比，藉由添加佐劑而被增強，暗示K3-spacer-LNT複合體(F+K3-(S18)-dA35-LNT、F+K3-(S18)-dA40-LNT、F+K3-(S18)2-dA35-LNT、F+K3-(S18)2-dA40-LNT、F+K3-(S12)-dA35-LNT、F+K3-(S12)-dA40-LNT
、F+K3-(S12)2-dA35-LNT、F+K3-(S12)2-dA40-LNT、F+K3-(S9)-dA35-LNT、F+K3-(S9)-dA40-LNT、F+K3-(S9)2-dA35-LNT、F+K3-(S9)2-dA40-LNT)與磷酸明礬(F+Alum)之佐劑效果為同等的可能性。接種屬Th2型佐劑的磷酸明礬(F+Alum)的小鼠組中，觀察到IgG1亞型誘導能力與RSV F抗原單獨接種組(F)相比為較高的，於spacer長度最長的K3-(S18)2-dA35-LNT、K3-(S18)2-dA40-LNT複合體投予組(F+K3-(S18)2-dA35-LNT、F+K3-(S18)2-dA40-LNT)，亦觀察到與磷酸明礬同等之IgG1誘導能力。另一方面，於IgG2c亞型抗體，接種全K3-spacer-LNT複合體的免疫組與磷酸明礬相比顯示高的結果。由以上之結果，暗示K3-(S18)-dA35-LNT、K3-(S18)-dA40-LNT、K3-(S18)2-dA35-LNT、K3-(S18)2-dA40-LNT、K3-(S12)-dA35-LNT、K3-(S12)-dA40-LNT、K3-(S12)2-dA35-LNT、K3-(S12)2-dA40-LNT、K3-(S9)-dA35-LNT、K3-(S9)-dA40-LNT、K3-(S9)2-dA35-LNT、K3-(S9)2-dA40-LNT之K3-spacer-LNT複合體具有同等之Th1增強活性，其中尤以K3-(S18)2-dA35-LNT及K3-(S18)2-dA40-LNT具有高的Th2增強活性。
<接種添加K3-spacer-LNT複合體之RSV F次單元疫苗的小鼠中之RSV F抗原特異性細胞介素產生能力>
將K3-spacer-LNT複合體(K3-(S18)-dA35-LNT、K3-(S18)-dA40-LNT、K3-(S18)2-dA35-LNT、K3-(S18)2-dA40-LNT、K3-(S12)-dA35-LNT、K3-(S12)-dA40-LNT、K3-
(S12)2-dA35-LNT、K3-(S12)2-dA40-LNT、K3-(S9)-dA35-LNT、K3-(S9)-dA40-LNT、K3-(S9)2-dA35-LNT、K3-(S9)2-dA40-LNT)之RSV F抗原特異性細胞介素產生誘導能力，藉由測量自經RSV F次單元疫苗免疫的小鼠脾臓細胞因應抗原刺激所產生的細胞介素來評價。將結果示於第9圖。RSV F抗原特異性的IFN-g產生誘導與IL-2產生誘導之增強效果與抗原單獨投予組(F)相比，於K3-spacer-LNT複合體(F+K3-(S18)-dA35-LNT、F+K3-(S18)-dA40-LNT、F+K3-(S18)2-dA35-LNT、F+K3-(S18)2-dA40-LNT、F+K3-(S12)-dA35-LNT、F+K3-(S12)-dA40-LNT、F+K3-(S12)2-dA35-LNT、F+K3-(S12)2-dA40-LNT、F+K3-(S9)-dA35-LNT、F+K3-(S9)-dA40-LNT、F+K3-(S9)2-dA35-LNT、F+K3-(S9)2-dA40-LNT)為高的結果。於屬Th2型佐劑的磷酸明礬佐劑投予組(F+Alum)，IFN-g產生係於任一種之刺激皆為檢測極限以下。另一方面，IL-5及IL-13產生增強效果與抗原單獨投予組(F)相比，於屬Th2型佐劑的磷酸明礬接種組觀察到較高的。於K3-spacer-LNT複合體，K3-(S18)2-dA40-LNT投予組(F+K3-(S18)2-dA40-LNT)顯示高的IL-5及IL-13產生增強效果。由以上之結果，暗示K3-spacer-LNT複合體具有與K3-SPG複合體同等之自然免疫活性化能力及Th1增強活性，其中於K3-(S18)2-dA40-LNT，亦具有高的Th2增強活性。
[試驗例2]
與試驗例1同樣地進行下列評價。
<使用人類PBMCs的K3-spacer-SPG複合體之炎症反
應誘導能力之檢討>
針對K3-spacer-SPG複合體(K3-(S9)-dA40-SPG、K3-(S9)2-dA40-SPG、K3-(S12)-dA40-SPG、K3-(S12)2-dA40-SPG、K3-(S18)-dA40-SPG、K3-(S18)2-dA40-SPG、K3-(C12)2-dA40-SPG、K3-(C12)3-dA40-SPG)，檢討人類PBMC中的炎症反應誘導能力。將結果示於第11圖。於K3-(S9)-dA40-SPG、K3-(S9)2-dA40-SPG、K3-(S12)-dA40-SPG、K3-(S12)2-dA40-SPG、K3-(S18)-dA40-SPG、K3-(S18)2-dA40-SPG複合體，暗示具有pan-IFN-a、IL-6誘導能力。另一方面，於K3-(C12)2-dA40-SPG、K3-(C12)3-dA40-SPG複合體，pan-IFN-a、IL-6之誘導活性為檢測極限程度。
<接種添加K3-spacer-SPG複合體之RSV F次單元疫苗的小鼠中之血清中RSV F抗原特異性IgG抗體力價>
將K3-spacer-SPG複合體(K3-(S9)-dA40-SPG、K3-(S9)2-dA40-SPG、K3-(S12)-dA40-SPG、K3-(S12)2-dA40-SPG、K3-(S18)-dA40-SPG、K3-(S18)2-dA40-SPG、K3-(C12)2-dA40-SPG、K3-(C12)3-dA40-SPG)之抗體產生增強活性，藉由測量經RSV F次單元疫苗免疫的小鼠血清中抗體力價而評價。將結果示於第12圖。清楚可知與RSV F抗原單獨接種組(F)相比，RSV F抗原特異性的抗體誘導於K3-spacer-SPG複合體投予組(F+K3-(S9)-dA40-SPG、F+K3-(S9)2-dA40-SPG、F+K3-(S12)-dA40-SPG、F+K3-(S12)2-dA40-SPG、F+K3-(S18)-dA40-SPG、F+K3-(S18)
2-dA40-SPG、F+K3-(C12)2-dA40-SPG、F+K3-(C12)3-dA40-SPG)中被增強。
<接種添加K3-spacer-SPG複合體之RSV F次單元疫苗的小鼠中之RSV F抗原特異性細胞介素產生能力>
將K3-spacer-SPG複合體(K3-(S9)-dA40-SPG、K3-(S9)2-dA40-SPG、K3-(S12)-dA40-SPG、K3-(S12)2-dA40-SPG、K3-(S18)-dA40-SPG、K3-(S18)2-dA40-SPG、K3-(C12)2-dA40-SPG、K3-(C12)3-dA40-SPG)之RSV F抗原特異性細胞介素產生誘導能力，藉由測量自經RSV F次單元疫苗免疫的小鼠脾臓細胞因應抗原刺激所產生的細胞介素而評價。將結果示於第13圖。RSV F抗原特異性的IFN-g產生誘導與IL-2產生誘導之增強效果，與抗原單獨投予組(F)相比，於K3-spacer-SPG複合體(F+K3-(S9)-dA40-SPG、F+K3-(S9)2-dA40-SPG、F+K3-(S12)-dA40-SPG、F+K3-(S12)2-dA40-SPG、F+K3-(S18)-dA40-SPG、F+K3-(S18)2-dA40-SPG、F+K3-(C12)2-dA40-SPG、F+K3-(C12)3-dA40-SPG)為高的結果。另一方面，IL-5與抗原單獨投予組(F)相比，為同等以下之誘導程度，但IL-13產生增強效果與抗原單獨投予組(F)相比，於K3-spacer-SPG複合體(F+K3-(S9)-dA40-SPG、F+K3-(S9)2-dA40-SPG、F+K3-(S12)-dA40-SPG、F+K3-(S12)2-dA40-SPG、F+K3-(S18)-dA40-SPG、F+K3-(S18)2-dA40-SPG、F+K3-(C12)2-dA40-SPG、F+K3-(C12)3-dA40-SPG)成為高的結果(第13圖)。
依據本發明，提供具有優異免疫賦活活性的寡去氧核苷酸及含有其之複合體。尤其，本發明之複合體兼具K型CpG ODN特有之免疫賦活活性、及D型CpG ODN特有之免疫賦活活性。此外，K3-spacer-SPG及K3-spacer-LNT具有強力的疫苗佐劑活性，將K3-spacer-SPG或K3-spacer-LNT與抗原一起作免疫接種時，刺激該抗原特異性的體液性免疫及細胞性免疫兩者。因此，作為免疫賦活劑或疫苗佐劑，本發明之複合體於醫藥領域為有用的。
本申請案係以在日本申請的日本特願2015-057861(申請日：2015年3月20日)為基礎，其內容完全被包含於本說明書。
<110> 國立研究開發法人醫療基盤．健康．營養研究所(NATIONAL INSTITUTES OF BIOMEDICAL INNOVATION,HEALTH AND NUTRITION)第一三共股份有限公司
<120> 具有免疫賦活活性之含有CpG-間隔基-寡核苷酸複合體及其用途
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Claims (45)
- 一種寡去氧核苷酸(oligodeoxynucleotide)，其係包含人類化K型CpG寡去氧核苷酸及聚去氧腺苷酸之寡去氧核苷酸，其中聚去氧腺苷酸係介隔間隔基(spacer)而結合於人類化K型CpG寡去氧核苷酸之3’側。
- 如請求項1之寡去氧核苷酸，其中人類化K型CpG寡去氧核苷酸為10個核苷酸以上之長度，包含1或複數個之非甲基化CpG模體(motif)。
- 如請求項1或2之寡去氧核苷酸，其中人類化K型CpG寡去氧核苷酸包含序列TCGA或TCGT。
- 如請求項1至3中任一項之寡去氧核苷酸，其中人類化K型CpG寡去氧核苷酸包含序列識別號1所表示的核苷酸序列。
- 如請求項1至4中任一項之寡去氧核苷酸，其中寡去氧核苷酸之磷酸二酯鍵之一部分或全部經硫代磷酸酯鍵取代。
- 如請求項5之寡去氧核苷酸，其中寡去氧核苷酸之磷酸二酯鍵之全部經硫代磷酸酯鍵取代。
- 如請求項1至6中任一項之寡去氧核苷酸，其中聚去氧腺苷酸之長度為20~60個核苷酸長度。
- 如請求項1至7中任一項之寡去氧核苷酸，其中間隔基為式(A)所表示的基、或式(B)所表示的基，
- 如請求項1至8中任一項之寡去氧核苷酸，其中間隔基為式(A1)所表示的基、或式(B1)所表示的基，
- 如請求項1至9中任一項之寡去氧核苷酸，其中間隔基為下式中任一者所表示的基或將該基重複2或3次而鍵結的基，
- 一種複合體，其含有如請求項1至10中任一項之寡去氧核苷酸及β-1,3-葡聚糖。
- 如請求項11之複合體，其中β-1,3-葡聚糖為香菇多醣(lenthinan)、裂褶菌多醣(schizophyllan)、硬葡聚糖(scleroglucan)、卡特蘭多醣(curdlan)、茯苓多醣 (pachyman)、灰樹花多醣(grifolan)、或昆布糖(laminaran)。
- 如請求項12之複合體，其中β-1,3-葡聚糖為香菇多醣、裂褶菌多醣或硬葡聚糖。
- 如請求項11之複合體，其包含下述(i)記載之寡去氧核苷酸、及(ii)記載之β-1,3-葡聚糖：(i)於包含序列識別號1所表示的核苷酸序列的寡去氧核苷酸之3’側介隔間隔基而結合20~60個核苷酸長度之聚去氧腺苷酸，且磷酸二酯鍵之全部經硫代磷酸酯鍵取代的寡去氧核苷酸；(ii)香菇多醣或裂褶菌多醣。
- 如請求項11之複合體，其包含寡去氧核苷酸、及β-1,3-葡聚糖，其中寡去氧核苷酸係於包含序列識別號1所表示的核苷酸序列的寡去氧核苷酸之3’側介隔間隔基而結合20~60個核苷酸長度之聚去氧腺苷酸，且磷酸二酯鍵之全部經硫代磷酸酯鍵取代的寡去氧核苷酸，該間隔基包含下式中任一者所表示的基或將該基重複2或3次而鍵結的基，
- 如請求項15之複合體，其包含寡去氧核苷酸、及β-1,3-葡聚糖，其中寡去氧核苷酸係於包含序列識別號1所表示的核苷酸序列的寡去氧核苷酸之3’側介隔間隔基而結合30~50個核苷酸長度之聚去氧腺苷酸，且磷酸二酯鍵之全部經硫代磷酸酯鍵取代的寡去氧核苷酸，該間隔基包含下式中任一者所表示的基或將該基重複2或3次而鍵結的基，
- 如請求項16之複合體，其包含寡去氧核苷酸、及β-1,3-葡聚糖，其中寡去氧核苷酸係於包含序列識別號1所表 示的核苷酸序列的寡去氧核苷酸之3’側介隔間隔基而結合30~45個核苷酸長度之聚去氧腺苷酸，且磷酸二酯鍵之全部經硫代磷酸酯鍵取代的寡去氧核苷酸，該間隔基包含下式中任一者所表示的基或將該基重複2或3次而鍵結的基，
- 如請求項17之複合體，其包含寡去氧核苷酸、及香菇多醣或裂褶菌多醣，其中寡去氧核苷酸係於包含序列識別號1所表示的核苷酸序列的寡去氧核苷酸之3’側介隔間隔基而結合40個核苷酸長度之聚去氧腺苷酸，且磷酸二酯鍵之全部經硫代磷酸酯鍵取代的寡去氧核苷酸，該間隔基包含將下式中任一者所表示的基重複2或3次而鍵結的基，
- 如請求項11至18中任一項之複合體，其係三重螺旋構造狀者。
- 如請求項11至19中任一項之複合體，其具有將B細胞活性化而使IL-6產生的活性、及將樹突細胞(dendritic cell)活性化而使IFN-α產生的活性。
- 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至10中任一項之寡去氧核苷酸、或如請求項11至20中任一項之複合體。
- 如請求項21之醫藥組成物，其係用於病毒感染症、癌症、過敏性疾病、細胞內寄生性原蟲或細菌感染症之預防或治療。
- 如請求項22之醫藥組成物，其係用於病毒感染症之預防或治療。
- 如請求項23之醫藥組成物，其中病毒感染症為RS病毒或流感病毒感染症。
- 一種I型及/或II型干擾素產生誘導劑，其包含如請求項11至20中任一項之複合體。
- 一種免疫賦活劑，其包含如請求項1至10中任一項之寡去氧核苷酸、或如請求項11至20中任一項之複合體。
- 如請求項26之免疫賦活劑，其為疫苗佐劑。
- 一種病毒感染症、癌症、過敏性疾病、細胞內寄生性原蟲或細菌感染症之預防或治療劑，其包含如請求項1至10中任一項之寡去氧核苷酸、或如請求項11至20中任一項之複合體。
- 如請求項28之預防或治療劑，其中病毒感染症為RS病毒或流感病毒感染症。
- 一種如請求項1至10中任一項之寡去氧核苷酸或如請求項11至20中任一項之複合體之用途，其係用於醫藥組成物之製造。
- 如請求項30之用途，其中醫藥組成物為病毒感染症、 癌症、過敏性疾病、細胞內寄生性原蟲或細菌感染症之預防或治療用之醫藥組成物。
- 如請求項31之用途，其中病毒感染症為RS病毒或流感病毒感染症。
- 一種用於溫血動物中疾病的治療或預防之方法，其包含將如請求項1至10中任一項之寡去氧核苷酸、或如請求項11至20中任一項之複合體之藥理的有效量投予該溫血動物。
- 如請求項33之方法，其中疾病為病毒感染症、癌症、過敏性疾病、細胞內寄生性原蟲或細菌感染症。
- 如請求項34之方法，其中病毒感染症為RS病毒或流感病毒感染症。
- 如請求項33至35中任一項之方法，其中溫血動物為人類。
- 一種誘導溫血動物中的防禦免疫反應之方法，其包含將如請求項1至10中任一項之寡去氧核苷酸、或如請求項11至20中任一項之複合體之藥理的有效量投予至該溫血動物。
- 如請求項1至10中任一項之寡去氧核苷酸、或如請求項11至20中任一項記載之複合體，其係使用於病毒感染症、癌症、過敏性疾病、細胞內寄生性原蟲或細菌感染症之治療或預防。
- 如請求項38之寡去氧核苷酸或複合體，其中病毒感染症為RS病毒或流感病毒感染症。
- 一種醫藥組成物，其包含(a)如請求項1至10中任一項 之寡去氧核苷酸、或如請求項11至20中任一項之複合體、及(b)抗原。
- 如請求項40之組成物，其係用於誘導抗該抗原的免疫反應。
- 如請求項41之組成物，其中抗原為來自病原體之抗原。
- 如請求項42之組成物，其係病原體之感染症之預防或治療用。
- 如請求項43之組成物，其中病原體為病毒。
- 如請求項44之組成物，其中病毒為RS病毒或流感病毒。
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