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CN101267805A - 制造脂质体的系统和方法 - Google Patents

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CN101267805A
CN101267805A CNA2006800343132A CN200680034313A CN101267805A CN 101267805 A CN101267805 A CN 101267805A CN A2006800343132 A CNA2006800343132 A CN A2006800343132A CN 200680034313 A CN200680034313 A CN 200680034313A CN 101267805 A CN101267805 A CN 101267805A
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lipid
liposome
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aqueous solution
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伊恩·麦克拉克伦
劳埃德·B·杰夫斯
爱德华·亚沃尔斯基
基尤·拉姆
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Protiva Biotherapeutics Inc
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Abstract

本发明提供用于生产脂质体的装置和方法。通过在第一储蓄器中提供缓冲溶液，和在第二储蓄器中提供脂质溶液，在混合室中用缓冲溶液连续稀释所述脂质溶液而产生脂质体。将治疗剂，诸如核酸，包含在所述缓冲溶液或所述脂质溶液的一种中。当混合脂质体时，基本上瞬时形成包封治疗产品。然后，将形成的脂质体溶液立即用缓冲溶液稀释，以提高均匀性并且保持小的粒度。

Description

制造脂质体的系统和方法
相关申请的交叉参考
本申请是要求于2005年7月27日递交的题目为“制造脂质体的系统和方法(SYSTEMS AND METHODS FOR MANUFACTURINGLIPOSOMES)”的美国申请号60/703,380的利益的非临时申请，将其通过参考全部结合于此。
发明背景
已经知道许多用于将活性物质施用到细胞中的系统，诸如脂质体、纳米颗粒、聚合物颗粒、免疫-和配体-复合体以及环糊精(参见，抗微生物和抗癌化学治疗中的药物转运(Drug Transport in antimicrobial andanticancer chemotherapy).C.Papadakou编，CRC出版社，1995)。脂质体典型地在实验室中通过声处理、洗涤剂透析、乙醇注射或稀释、French压力挤出(French press extrusion)、醚输注和反相蒸发制备而成。已知具有多个双层的脂质体是多层脂质囊(multilamellar lipid vesicles，MLVs)。由于捕获在层间的流体只在每层膜降解时释放，所以MLVs是延时释放药物的候选。已知具有单一双层的脂质体是单层脂质囊(UV)。UVs可以制成小的(SUVs)或大的(LUVs)。
上述用于脂质体生产的一些方法利用可以导致磷脂原材料和包封的药物变性的苛刻的或极端的条件。另外，这些方法对于大量脂质体的大规模生产不容易缩放(scalable)。此外，通过常规乙醇稀释形成脂质囊涉及将脂质注射或逐滴加入到水性缓冲剂中。这样得到的囊典型地在大小上不均匀，并且含有单层和多层囊的混合物。
将常规脂质体配制成携带包含在水性内部空间(水溶性药物)或参与脂质双层(水不溶性药物)的治疗剂。在血流中具有短半衰期的活性剂特别适合通过脂质体递送。例如，已知许多抗肿瘤药在血流中具有短半衰期，以致它们的肠胃外应用是不可行的。然而，经由血流用于活性剂的部位特异性递送的脂质体的应用受到网状内皮系统(RES)的细胞将脂质体从血液中快速清除的严重限制。
美国专利号5,478,860，其于1995年12月26日授予Wheeler等，并且通过引用结合于此，公开了用于递送疏水性化合物的微乳组合物。这样的组合物具有许多用途。在一个实施方案中，所述疏水性化合物是包含药物的治疗剂。该专利还公开体外和体内递送疏水性化合物到细胞的方法。
Knopov等的PCT公布WO01/05373，其通过引用结合于此，公开了用提供湍流环境(例如，雷诺数＞2000)的静态混合器(static mixer)利用乙醇注射-型方法制备脂质囊的技术。然后，可以在囊形成之后负载治疗剂。
公布的美国申请2004/0142025，其通过引用结合于此，公开了使用顺序的逐步稀释方法形成脂质颗粒的技术。所公开的方法在非湍流的搅拌环境中产生具有低于200nm的大小的脂质颗粒。然而，所公开的方法倾向于产生不太最佳的囊大小和低于最佳的均匀性，特别是对于包封siRNA的脂质体。此外，对于包封的质粒，需要酸性缓冲溶液。
尽管在美国专利号5,478,860，US20040142025和WO 05373中公开的进展，还存在对于用于配制和生产脂质囊，特别是包封治疗剂诸如核酸的脂质囊的改进的方法和装置的需要。本发明实现了这些及其它需要。
发明概述
本发明提供用于制备任选地包含治疗剂的脂质囊的方法和装置。所述治疗剂可以包括，例如，蛋白质、核酸、反义核酸、药物等。本发明可以用于形成包含包封的核酸或小分子药物的脂质囊。在一方面，脂质囊在低压下快速制备，并且方法是完全可以缩放的。在某些优选的实施方案中，所述方法不包括静态混合器或专门的挤出设备。
按照一个实施方案，本发明提供用于生产脂质体的方法。所述方法典型地包括，在第一储蓄器(reservoir)中提供水溶液，所述第一储蓄器与第二储蓄器中的有机脂质溶液流体连通，并且将所述水溶液与所述有机脂质溶液在第一混合区域混合以产生脂质体溶液。有机脂质溶液与所述水溶液混合，以便基本上瞬时产生包封治疗产品的脂质体。而后立即将该脂质体溶液与缓冲溶液混合，以产生稀释的脂质体溶液。可以将所述脂质体溶液引入到缓冲溶液储蓄器中，或者所述脂质体溶液可以与缓冲剂在第二混合区域中混合。
在某些方面，水溶液如缓冲剂，包含治疗产品，以致所述治疗产品被包封在脂质体中。在其它方面，所述有机脂质溶液包含治疗产品。适当的治疗产品包括，但不限于，蛋白质、核酸、反义核酸、核酶、tRNA、snRNA、siRNA(小干扰RNA)、shRNA、ncRNA、预先浓缩的DNA、适体和抗原。在某些优选的方面，所述治疗产品是核酸。
在另一个实施方案中，本发明提供用于生产包封治疗产品的脂质体的系统。所述系统典型地包括容纳水溶液的第一储蓄器，和容纳有机脂质溶液的第二储蓄器，其中所述水溶液和有机脂质溶液中的一种包含治疗产品。所述系统还典型地包括泵机构，其设置成将水溶性溶液和有机脂质溶液以基本上相等的流速泵抽到混合区域中，其中所述有机脂质溶液与所述水溶液在混合区域中混合，从而基本上瞬时形成包封治疗产品的脂质体溶液。所述系统还典型地包括收集储蓄器，所述收集储蓄器包含缓冲溶液，与混合区域流体连通，其中所述脂质体溶液基本上在形成后立即引入到收集储蓄器中，由此形成稀释的脂质体溶液。
在又一个实施方案中，本发明提供用于生产包封治疗产品的脂质体的系统。所述系统典型地包括容纳水溶液的第一储蓄器，和容纳有机脂质溶液的第二储蓄器，其中所述水溶液和有机脂质溶液中的一种包含治疗产品。所述系统还典型地包括第一泵机构，其设置成将水溶性溶液和有机脂质溶液以基本上相等的流速泵抽到混合区域中，其中所述有机脂质溶液与所述水溶液在第一混合区域中混合，从而基本上瞬时形成包封治疗产品的脂质体溶液。所述系统还典型地包括容纳缓冲溶液的缓冲剂储蓄器，和第二泵机构，其设置成将所述缓冲溶液以可控的流速泵抽到第二混合区域中，其中所述脂质体溶液基本上在第一混合区域中形成之后立即引入到第二混合区域中，由此在第二混合区域中形成稀释的脂质体溶液。
参考本说明书的其余部分，包括附图和权利要求，将了解本发明的其它特点和优点。本发明的其它特点和优点，以及本发明的各种实施方案的结构和操作，将参考附图在下文详细描述。在附图中，相同的参考数字表示同一或功能相似的元件。
附图简述
图1说明用于制备SNALP的方法的示意图。
图2提供按照本发明的一个实施方案制备脂质体的方法的示意图。
图3a和3b分别显示按照本发明的两个实施方案的装置300和装置302的实施例。
图4是按照本发明的一个实施方案的装置400的代表性示意图的实例。
图5显示按照一个实施方案的T形连接器和相关的流动动力学。发明详述
I.定义
术语“核酸”是指含有至少两个核苷酸的聚合物。“核苷酸”包含糖脱氧核糖(DNA)或核糖(RNA)，碱基，和磷酸基团。核苷酸通过磷酸基团连接在一起(尽管合成的核酸可以使用核苷酸接头而不是磷酸基团制备)。“碱基”包括嘌呤和嘧啶，其进一步包括天然化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、肌苷、和天然类似物，以及嘌呤和嘧啶的合成衍生物，其包括但不限于，放置新的反应基团诸如但不限于胺、醇、硫醇、羧化物和烷基卤化物的修饰。
DNA可以以下列形式：反义、质粒DNA、质粒DNA的部分、预先浓缩的DNA、聚合酶链式反应(PCR)的产物、载体(P1，PAC，BAC，YAC，人工染色体)、表达盒、嵌合序列、染色体DNA、或这些基团的衍生物。RNA可以以下列形式：寡核苷酸RNA、tRNA(转运RNA)、snRNA(小核RNA)、rRNA(核糖体RNA)、mRNA(信使RNA)、反义RNA、siRNA(小干扰RNA)、shRNA(短发夹RNA)、ncRNA(非编码RNA)、适体、核酶、嵌合序列、或这些基团的衍生物。
“反义”是干扰DNA和/或RNA功能的多核苷酸。这可以导致表达的抑制。天然核酸具有磷酸骨架，人工核酸可以包含其它类型的骨架和碱基。这些包括PNAs(肽核酸)、硫代磷酸酯(phosphothioates)、和天然核酸磷酸骨架的其它变体。另外，DNA和RNA可以是单链、双链、三链或四链的。
术语“基因”是指包含产生多肽或前体(例如，单纯疱疹病毒)必需的编码序列的核酸(例如，DNA)序列。多肽可以由全长编码序列或由编码序列的任何部分所编码，只要保留全长或片段的需要的活性或功能特性(例如，酶促活性、配体结合、信号转导、等等)。
当用于本文时，术语“水溶液”是指完全或部分包含水的组合物。
当用于本文时，术语“有机脂质溶液”是指完全或部分包含具有脂质的有机溶剂的组合物。
术语“脂质”是指一组脂肪酸的酯的有机化合物，并且特征是在水中不溶，但是在许多有机溶剂中是可溶的。通常将它们分成至少三类：(1)“简单脂质”其包括脂肪和油以及蜡；(2)“化合物脂质”其包括磷脂和糖脂；(3)“衍生的脂质”诸如类固醇。
术语“两亲性脂质”部分地指任何适合的材料，其中脂质材料的疏水部分定向到疏水相中，而亲水部分定向到水相。两亲性脂质通常是脂质囊的主要成分。亲水性质来自极性或带电基团诸如糖类，磷酸酯合，羧基、硫酸根合、氨基、巯基、硝基、羟基和其它类似基团的存在。疏水性可以通过包含非极性基团而赋予，所述基团包括，但不限于，长链饱和和不饱和脂族烃基团和由一个或多个芳族、脂环族或杂环基团取代的这样的基团。两亲性化合物的实例包括，但不限于，磷脂、氨基脂和鞘脂类。磷脂的代表性实例包括，但不限于，磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱或二亚油酰磷脂酰胆碱。缺乏磷的其它化合物，诸如鞘脂、鞘糖脂家族、二酰基甘油和β-酰氧基酸也在被称为两亲性脂质的组中。另外，上述的两亲性脂质可与其它脂质混和，所述脂质包括甘油三酯类和固醇类。
术语“中性脂质”指在选定的pH值以不带电荷或中性两性离子形式存在的许多脂质种类中的任何一种。在生理pH值下，这样的脂质包括，例如，二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、脑磷脂、胆固醇、脑苷脂和二酰基甘油。
术语“非阳离子脂质”指如上所述的任何中性脂质以及阴离子脂质。有用的非阳离子脂质包括，例如，二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)、和二油酰-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、和1，2-二反油酸基(dielaidoyl)-sn-甘油基-3-磷乙醇胺(反式DOPE)。
术语“阴离子脂质”指在生理pH值下带负电荷的任何脂质。这些脂质包括，但不限于，磷脂酰甘油、心磷脂、二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酸、N-十二烷酰磷脂酰乙醇胺、N-琥珀酰磷脂酰乙醇胺、N-戊二酰磷脂酰乙醇胺，赖氨酰磷脂酰甘油、棕榈酰油酰磷脂酰甘油(POPG)，和其它与中性脂质连接的阴离子修饰基团。
术语“阳离子脂质”指许多脂质种类中的任何一种，其在选定的pH值，诸如生理pH值下携带净正电荷。这些脂质包括，但不限于，N，N-二油基-N，N-二甲基氯化铵(“DODAC”)；N-(2，3-二油基氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化铵(“DOTMA”)；N，N-二硬脂基-N，N-二甲基溴化铵(“DDAB”)；N-(2，3-二油酰氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化铵(“DOTAP”)；3-(N-(N’，N’-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基)胆固醇(“DC-Chol”)和N-(1，2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N，N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(“DMRIE”)。另外，许多阳离子脂质商业制剂是可用的，其可以用于本发明。这些包括，例如，
Figure A20068003431300111
(商购阳离子脂质体，其包含DOTMA和1，2-二油酰-sn-3-磷乙醇胺(“DOPE”)，来自GIBCO/BRL，Grand Island，纽约，美国)；(商购阳离子脂质体，其包含N-(1-(2，3-二油基氧基)-丙基)-N-(2-(精胺甲酰胺基)乙基)-N，N-二甲基三氟乙酸铵(“DOSPA”)和(“DOPE”)，来自GIBCO/BRL)；和
Figure A20068003431300113
(商购阳离子脂质，其包含在乙醇中的双十八烷基酰氨基甘氨酰羧基精胺(“DOGS”)，来自普洛麦格公司(Promega Corp.)，Madison，威斯康辛，美国)。下述脂质是阳离子的并且在低于生理pH值时具有正电荷：DODAP，DODMA，DMDMA，1，2-二亚油酸基氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(1，2-DiLinoleyloxy-N，N-dimethylaminopropane)(DLinDMA)，1，2-亚油精基氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(1，2-Dilinolenyloxy-N，N-dimethylaminopropane)(DLenDMA)等。
除了阳离子和非阳离子脂质之外，本发明的SNALP可以包括双层稳定组分(BSC)，诸如ATTA-脂质或PEG-脂质，诸如偶联于二烷氧基丙基的PEG(PEG-DAA)，如在例如WO 05/026372中所述，偶联于二酰基甘油的PEG(PEG-DAG)，如在例如美国专利公开号20030077829和2005008689中所述，偶联于磷脂酰乙醇胺(PE)的PEG(PEG-PE)，或缀合于神经酰胺的PEG，或其混合物(参见，美国专利号5,885,613)。在一个优选的实施方案中，所述BSC是抑制SNALP聚集的缀合的脂质。
在某些方面中，所述阳离子脂质典型地构成在所述颗粒中存在的总脂质的约2％-约70％，约5％-约50％，约10％-约45％，约20％-约40％，或约30％-约40％。所述非阳离子脂质典型地构成在所述颗粒中存在的总脂质的约5％-约90％，约10％-约85％，约20％-约80％，约30％-约70％，约40％-约60％，或约48％。PEG-脂质缀合物典型地构成在所述颗粒中存在的总脂质的约0.5％-约20％，约1.5％-约18％，约4％-约15％，约5％-约12％，或约2％。本发明的核酸-脂质颗粒还可以包含胆固醇。如果存在，胆固醇典型地构成在所述颗粒中存在的总脂质的约0％-约10％，约2％-约10％，约10％-约60％，约12％-约58％，约20％-约55％，或约48％。对于本领域的技术人员将容易地是显而易见的是，所述核酸-脂质颗粒的成分的比例可以改变。
在一些实施方案中，在形成的核酸-脂质颗粒中的核酸：脂质的比例(质量/质量比例)将在约0.01-约0.2，约0.03-约0.01，或约0.01-约0.08范围内。起始材料的比例也落在这一范围之内。在另一个实施方案中，所述核酸-脂质颗粒制剂使用约400μg核酸/10mg脂质，或核酸：脂质的比例为约0.01-约0.08或约0.04，其对应1.25mg总脂质/50μg核酸。
“脂质囊”指可用于递送化合物的任何脂质组合物，其包括，但不限于，脂质体，其中水体积被两亲性脂双层所包封；或其中脂质涂覆包含大分子组分的内部，所述大分子组分诸如质粒，具有减小的水性内部；或脂质聚集体或微团，其中被包封的成分包含在相对混乱的脂质混合物中。
当用于本文时，“包封的脂质”可以指为化合物提供完全包封、部分包封或两者的脂质制剂。
当用于本文时，术语“SNALP”指稳定的核酸脂质颗粒。SNALP代表涂覆包含核酸的内部的脂质囊，诸如具有减少的水性内部的质粒。
II.概述
本发明提供用于制备脂质囊的方法和装置。所述方法可以用于制备具有广泛范围的脂质成分的脂质囊，所述广泛范围的脂质成分包括，但不限于，阳离子脂质、阴离子脂质、中性脂质、聚乙二醇(PEG)脂质、亲水性聚合物脂质、促溶脂质和固醇。疏水活性可以结合到含有脂质的有机溶剂(例如，乙醇)中，并且核酸和疏水活性可以添加到水性成分中。在某些方面，本发明的方法可以用于制备微乳，其中脂质单层包绕油基核。在某些方面，所述方法和装置用于制备脂质囊，或脂质体，其中在脂质体形成的同时在脂质体内部包封治疗剂。
III.制备方法
图1是本发明的方法的代表性流程图100的实例。这一流程图只是举例说明，并且不应该限制本发明权利要求的范围。本领域的普通技术人员应该认识到其它变化、改进和备选方案。
在一个方面中，本方法提供脂质溶液110，诸如在良好制备操作(GoodManufacturing Practice(GMP))下合成的临床等级的脂质，其随后增溶在有机溶液120(例如，乙醇)中。类似地，在GMP下制备治疗产品，例如，治疗活性剂，诸如核酸112或其它试剂。然后，将含有缓冲剂(例如，柠檬酸盐)的治疗剂溶液(例如，核酸)115与增溶在低级烷醇中的脂质溶液120混合，以形成脂质体制剂130(在本文还称为“脂质体悬浮液”或“脂质体溶液”)。基本上在脂质体形成的同时将治疗剂捕获在脂质体中。典型地，在负电荷核酸和正电荷阳离子脂质之间的静电相互作用导致包封作用。例如，如果使用可滴定的阳离子脂质，在接近或超过所述阳离子脂质pKa的更高的pH值可以获得低NA包封效率。然而，本领域的技术人员应该意识到，本发明的方法和装置同等适用于在所述囊形成之后脂质体的活性捕获或负载。在某些方面，所述脂质体溶液基本上立即与缓冲溶液140混合，以稀释脂质体溶液(例如，脂质体的悬浮液)。
按照本发明的方法和系统，向搅拌环境诸如在搅拌室中连续引入脂质和缓冲溶液的作用引起用所述缓冲剂溶液对所述脂质溶液的连续稀释，由此基本上在搅拌的同时产生脂质体。立即稀释脂质体悬浮液，例如，将脂质体悬浮液与缓冲液混合，帮助防止脂质体粒度增加，这是如果允许所述脂质体悬浮液静置延长的时间阶段，例如数分钟或数小时的典型的情形。此外，立即稀释还提高脂质体的均匀性，特别是在siRNA是所包封的治疗剂的情形中。当用于本文时，短语“用缓冲溶液连续稀释脂质溶液”(及变化)一般意指所述脂质溶液在水合过程中充分快速地稀释，具有充分的力完成囊的产生。
在本发明的方法中，所述有机脂质溶液典型地包含有机溶剂，诸如低级烷醇。如上文提及，在一个方面中，将所述脂质体立即用缓冲剂(例如，柠檬酸盐)稀释140，以增加核酸(例如，质粒)捕获并保持粒度。所述稀释可以通过将脂质体溶液立即引入到控制量的缓冲溶液中的方式进行，或者通过将脂质体溶液与控制流速的缓冲剂在第二混合区域中混合而进行。在样品浓缩160之前，通过使用例如阴离子交换柱体150而去除游离的治疗剂(例如，核酸)。此外，通过使用超滤步骤170去除烷醇，浓缩所述样品(例如，浓缩至约0.9mg/mL质粒DNA)，去除烷醇，并且将缓冲剂用置换缓冲剂(例如，用盐水缓冲剂)180取代。其后，将所述样品过滤190并且装入管瓶195。现在将使用如在图1中列出的步骤在下文中更详细地讨论本方法。
1.脂质增溶(solubilization)和治疗剂溶解(dissolution)
在一个实施方案中，按照本发明的方法生产的脂质体囊包括稳定的核酸脂质颗粒(即，SNALP)制剂。本领域的技术人员应该理解，下述描述只是举例说明的目的。本发明的方法适用于广泛范围的脂质囊类型和大小。这些脂质囊包括，但不限于，已知为单层脂质囊的单一双层脂质囊，其可以制成小的(SUVs)或大的(LUVs)，以及多层脂质囊(MLVs)。其它囊包括，微团、脂质-核酸颗粒、病毒体等。本领域的技术人员应该了解本发明的方法和装置适用的其它脂质囊。
按照本方法和装置制备的脂质体的优选大小为直径在约50-200nm之间。在某些方面，脂质体制剂具有这样的大小分布，其中平均大小(例如，直径)是约70nm至约200nm，并且更典型地平均大小为约100nm或更小。
在某些方面，本发明的脂质体制剂(例如，SNALP制剂)包含4种脂质成分：磷脂；胆固醇；PEG-脂质；和阳离子脂质。在一个方面中，所述磷脂是DSPC，所述PEG-脂质是PEG-S-DSG，并且所述阳离子脂质是DODMA。在一个方面中，摩尔组成是约20∶45∶10∶25的DSPC∶Chol∶PEG-DSG∶DODMA。在另一个方面，所述SNALP制剂是20∶48∶2∶30的DSPC∶胆固醇∶PEG-C-DMA∶DlinDMA。在某些实施方案中，脂质增溶在其中的有机溶剂的浓度为约45％v/v-约100％v/v。在某些方面，所述有机溶剂是低级烷醇。适合的低级烷醇包括，但不限于，甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、它们的异构体以及它们的组合。在一个实施方案中，所述溶剂是乙醇，其体积约为50-90％v/v。在一个方面中，脂质占约1mL/g-约5mL/g的体积。
例如，在适当的温度使用高架搅拌器，将脂质增溶120。在一个方面中，溶液的总脂质浓度为约15.1(例如，对于SNALP制剂约11.6)mg/mL(20mM)。在某些方面，治疗剂(例如，核酸)包含在水溶液中(例如，缓冲剂)并且稀释至终浓度。在一个方面中，例如，所述终浓度为在柠檬酸盐缓冲液中约0.9mg/mL，pH约4-6。在这种情形中，质粒溶液的体积与烷醇-脂质溶液的体积相同。应该理解，当使用本发明的直接稀释方法时，缓冲溶液不必是酸性的，例如，缓冲溶液的pH值可以是7.0或更高。在一个实施方案中，使用高架混合器在套层不锈钢容器中进行治疗剂(例如，核酸)溶液的制备。样品不需要加热进行制备，尽管在某些情形中，它是在与脂质囊形成之前的脂质溶液相同的温度。
在一个实施方案中，治疗剂包含在脂质溶液中。在某些方面，在脂质溶液中的治疗剂是亲脂性的。适当的亲脂性试剂包括紫杉醇(taxol)，紫杉醇衍生物，其包括，例如，protax III和紫杉醇(paclitaxol)，亲脂性苯并卟啉，维替泊芬膦甲酸的脂质前药，1-O-十八烷基-sn-甘油-3-膦酰基甲酸酯(ODG-PFA)，二油酰[3H]碘代脱氧尿嘧啶([3H]IDU-Ol2)，脂质衍生的HIV蛋白酶抑制肽，诸如iBOC-[L-Phe]-[D-β-Nal]-Pip-[α-(OH)-Leu]-Val(7194)和其它脂质衍生的药物或前药。
2.脂质体形成
在已经制备溶液如脂质溶液120和水性治疗剂(例如，核酸)溶液115之后，将它们混合在一起130，例如，使用蠕动泵混合器或无脉动齿轮泵进行。在一个方面中，将所述溶液以基本上相等的流速泵入混合环境中，尽管也可以使用不相等的流速。在某些方面，所述混合环境包括“T”-型连接器或混合室。在这种情形中，优选地，流体管道，并且因此流体流动在“T”-连接器内的狭窄孔内汇合，作为相对彼此以大约180°的相对流动。可以使用具有更狭窄的相对引入角度的其它混合室或连接器，诸如例如在27°和90°之间和在90°和180°之间。当溶液流在混合环境中汇合并且混合时，脂质囊基本上瞬时形成。当包含溶解的脂质的有机溶液和水溶液(例如，缓冲剂)同时并且连续地混合时形成脂质囊。有利地并且意外地，通过混合所述水溶液和有机脂质溶液，所述有机脂质溶液经历连续的、顺序的逐步稀释，从而基本上同时产生脂质体溶液(脂质体的悬浮液)。泵机构可以设置成将相等或不同流速的脂质和水溶液提供到混合环境中，这在高烷醇环境中产生脂质囊。
有利地，并且意外地，如这里教导的用于混合脂质溶液和水溶液的方法和装置在基本上与脂质体形成同时提供治疗剂在所形成的脂质体中的包封，包封效率达到约90％。如果需要，在这里讨论的其它处理步骤可以用于进一步改进包封效率和浓度。
在一个实施方案中，在将溶解在有机溶剂(例如，乙醇)中的脂质通过与水溶液(例如，缓冲剂)混合以逐步方式稀释时形成脂质囊。这种受控的逐步稀释通过将水性和脂质流在孔如T-连接器中混合，并且随后立即稀释在缓冲溶液中而实现。如果需要，得到的脂质，溶剂和溶质浓度可以在囊形成过程中保持不变。在一个方面中，形成具有小于约150nm，例如，约100nm或更小的平均直径的脂质囊，其有利地不需要通过高能处理诸如膜挤出、声处理或微流态化而进一步减小尺寸。
本发明方法的一个实施方案显示在图2中。在一个方面中，使用本发明的方法，通过没有梯度的两阶段逐步稀释而制备囊。例如，在第一逐步稀释中，在高烷醇(例如，乙醇)环境(例如，约20％-约55％v/v的乙醇)中形成囊。然后，可以通过以逐步方式将烷醇(例如，乙醇)浓度降低到小于或等于约25％v/v，诸如约17％v/v-约25％v/v而稳定这些囊。在某些方面中，治疗剂存在于水溶液中，或在脂质溶液中，治疗剂在脂质体形成的同时被包封。
如在图2中所示，在一个实施方案中，脂质最初溶解在约40％-约100％v/v，更典型地约65％-约90％v/v，并且最典型地约80％-约90％v/v的烷醇环境中(A)。接着，通过与水溶液混合而逐步稀释所述脂质溶液，这导致在约20.0-55％的烷醇(例如，乙醇)浓度中形成囊(B)。通过混合水溶液和有机脂质溶液，所述有机脂质溶液进行连续、顺序的逐步稀释，从而产生脂质体。此外，可以通过将囊另外逐步稀释到低于或等于约25％，优选地约19-25％的烷醇浓度而进一步稳定脂质囊诸如SNALP(一种脂质-颗粒)(C)。在某些方面，所述另外的顺序稀释(C)基本上在脂质体形成后立即进行。例如，在脂质体溶液形成和稀释(C)之间经过小于1分钟是有利的，更有利地是小于10秒，并且甚至更有利地是小于1秒或2秒。
在某些方面，对于两种顺序稀释(A→B和B→C)，得到的乙醇、脂质和溶质浓度在接收容器中都保持不变。与通过在更低的乙醇浓度稀释而形成的囊相比较，在初始混合步骤之后的这些更高的乙醇浓度，脂质单体重排成双层以更有序的方式进行。不受任何具体理论的限制，据信这些更高的乙醇浓度促进核酸与阳离子脂质在双层中的缔合。在一个方面中，核酸包封发生在高于22％的烷醇(例如，乙醇)浓度范围内。
在一个方面中，脂质囊以约60-约400mL/分钟的速率形成。在混合步骤130后，脂质浓度为约1-12mg/mL，并且治疗剂(例如，核酸)浓度为约0.05-0.23mg/mL。在某些优选的方面中，脂质浓度为约1.25mM 0.72mg/mL并且治疗剂(例如，核酸)浓度为约0.06mg/mL，从而提供约为12的脂质：核酸比例。缓冲剂浓度为约1-3mM，并且烷醇浓度为约45％v/v-约90％v/v。在优选的方面中，缓冲剂浓度为约3mM，并且烷醇浓度为约45％v/v-约60％v/v。
3.脂质体稀释
返回图1，在囊形成步骤130后，通过在去除游离核酸之前立即稀释140脂质囊悬浮液(脂质体溶液)，而提高治疗剂(例如，核酸)包封程度，并且保持粒度，并且甚至减小粒度。例如，在稀释步骤140之前，如果治疗剂捕获在约50-60％，在稀释步骤140之后，它可以增加到约80-90％。在步骤140中，通过与水溶液诸如缓冲剂混合(例如，1∶1，20mM柠檬酸盐缓冲液，300mM NaCl，pH 6.0)，脂质体制剂稀释到约10％-约40％，优选约20％的烷醇。然后，任选地允许稀释的样品在室温下温育。
4.去除游离的治疗剂
在立即稀释140之后，约70-80％或更多的治疗剂(例如，核酸)被捕获在脂质囊(例如，SNALP)内，并且游离的治疗剂可以从制剂去除150。在某些方面，使用阴离子交换层析。有利地，使用阴离子交换树脂导致高动力学的核酸去除能力，能够单独使用，可以预先灭菌和验证，并且是完全可缩放的。另外，所述方法导致游离治疗剂(例如，核酸，诸如大约总质粒的25％)的去除。样品体积在层析后没有改变，并且治疗剂(例如，核酸)和脂质浓度分别为约0.04-0.05和0.7mg/mL。在这一点上，可以关于包封的治疗剂检测样品。
5.样品浓缩
在某些情形中，例如，使用超滤160(例如，切向流透析)，将脂质体溶液任选地浓缩约5-50倍，优选地10-20倍。在一个实施方案中，将样品转移到超滤系统的给料储蓄器中，并且去除缓冲剂。可以使用各种方法诸如通过超滤去除所述缓冲剂。在一个方面中，使用装满聚砜中空纤维，例如具有约0.5mm-约1.0mm的内径和30,000标称截留分子量(NMWC)的聚砜中空纤维的柱体，去除缓冲剂。还可以使用具有约1,000MWCO-约750,000MWCO的中空纤维。将脂质体保留在所述中空纤维内并且再循环，而溶剂和小分子通过流经中空纤维的孔而从所述制剂去除。在这一步骤中，滤液称为穿透溶液。当完成浓缩步骤时，治疗剂(例如，核酸)和脂质浓度分别可以增加到约2和60mg/mL。在一个实施方案中，烷醇浓度保持不变，但是烷醇：脂质的比例减小约50倍。
6.烷醇去除
在一个实施方案中，将浓缩的制剂对约5-20个体积的，优选约10个体积的水溶液(例如，缓冲剂)(例如，pH 4.0的柠檬酸盐缓冲剂(25mM柠檬酸盐，100mM NaCl))进行渗滤，以去除烷醇170。还可以使用中性缓冲剂或糖基缓冲剂。在完成步骤170的烷醇浓度小于约1％。脂质和治疗剂(例如，核酸)浓度保持不变，并且治疗剂捕获的水平也保持恒定。
7.缓冲剂置换
在已经去除烷醇之后，然后通过对另一种缓冲剂(例如，对10个体积的盐水，含有10mM Hepes或磷酸盐的150mM NaCl，pH 7.4)渗滤而置换水溶液180。可以使用任何种类的缓冲剂，例如，中性的、糖基的等。典型地，脂质与治疗剂(例如，核酸)的浓度比例保持不变，并且核酸捕获的水平大约恒定。在某些情形中，通过用约为浓缩样品10％体积的缓冲剂漂洗柱体可以提高样品收率。在某些方面，然后将这种漂洗物添加到浓缩样品中。
8.无菌过滤
在某些优选的实施方案中，可以任选地进行脂质浓度约12-120mg/mL的样品的无菌过滤190。在某些方面，在低于约40psi的压力下进行过滤，使用囊式滤器(capsule filter)和具有加热套层的加压分配容器。稍微加热样品可以改善过滤的容易度。
9.无菌填充
使用与常规脂质体配制方法相似的方法进行无菌填充步骤195。本发明的方法导致在最终产物中约50-60％的输入治疗剂(例如，核酸)。在某些方面，最终产物的治疗剂与脂质的比例为约0.01-0.2。
IV.治疗剂
本发明的脂基药物制剂和组合物用于全身或局部递送治疗剂或生物活性剂，并且还用于诊断检测中。下述讨论一般指脂质体；然而，相同的讨论完全适用于本发明其余的药物递送系统，这对于本领域的技术人员是显而易见的。
如上文所讨论，治疗剂优选地在囊形成过程中结合到脂质囊内。在一个实施方案中，疏水活性与脂质一起结合到有机溶剂中，而核酸和亲水治疗剂可以添加到水性成分中。在某些情形中，所述治疗剂包括下列各项的一种：蛋白质、核酸、反义核酸、核酶、tRNA、snRNA、siRNA、shRNA、ncRNA、预先浓缩的DNA、适体、抗原及它们的组合。在优选的方面，所述治疗剂是核酸。所述核酸可以编码蛋白质，诸如例如，单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)、胞嘧啶脱氨酶、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶、p53、嘌呤核苷磷酸化酶、羧酸酯酶、脱氧胞苷激酶、硝基还原酶、胸苷磷酸化酶、或细胞色素P450 2B1。
在某些方面，治疗剂结合在有机脂质成分中。在某些情形中，所述治疗剂是亲脂性的。适当的亲脂性试剂包括紫杉醇(taxol)，紫杉醇衍生物，其包括，例如，protax III和紫杉醇(Paclitaxol)，亲脂性苯并卟啉，维替泊芬膦甲酸的脂质前药，1-O-十八烷基-sn-甘油-3-膦酰基甲酸酯(ODG-PFA)，二油酰[3H]碘代脱氧尿嘧啶([3H]IDU-Ol2)，脂质衍生的HIV蛋白酶抑制肽，诸如iBOC-[L-Phe]-[D-β-Nal]-Pip-[α-(OH)-Leu]-Val(7194)和其它脂质衍生的药物或前药。
在另一个实施方案中，本发明的脂质囊可以在囊形成之后负载一种或多种治疗剂。在某些方面，使用本发明施用的所述治疗剂可以是为待治疗的疾病选择的适当疗法的多种药物的任何药物。通常所述药物是抗肿瘤剂，诸如长春新碱，多柔比星，米托蒽醌，喜树碱，顺铂，博来霉素，环磷酰胺，甲氨蝶呤，链脲霉素(streptozotocin)，等。特别优选的抗肿瘤药物包括，例如，放线菌素D，长春新碱，长春碱，半胱氨酸阿拉伯糖苷，蒽环霉素，烷基药剂(alkylative agents)，铂化合物，抗代谢物，和核苷类似物，诸如甲氨蝶呤和嘌呤与嘧啶类似物。还可以理想地通过本方法将抗感染药剂递送到特定组织。本发明的组合物还可以用于其它药物的选择性递送，所述其它药物包括但不限于局部麻醉剂，例如，地布卡因和氯丙嗪；β-肾上腺素阻断剂，例如，普萘洛尔，噻吗洛尔和拉贝洛尔；抗高血压药物，例如，可乐定和肼屈嗪；抗抑郁药，例如，丙米嗪，阿米替林和多塞平(doxepim)；抗惊厥药(anti-conversants)，例如，苯妥英；抗组胺药，例如，苯海拉明，氯苯那敏和异丙嗪；抗生素/抗细菌药，例如，庆大霉素(gentamycin)，环丙沙星和头孢西丁；抗真菌药，例如，咪康唑，特康唑，益康唑，异康唑，布他康唑(butaconazole)，克霉唑，伊曲康唑，制霉菌素，萘替芬和两性霉素B；抗寄生物药，激素，激素拮抗剂，免疫调节剂，神经递质拮抗剂，抗青光眼药，维生素，麻醉品，和显象剂。
V.装置
在一个实施方案中，本发明提供用于实施本发明方法的系统和装置。图3a和3b分别显示按照本发明的两个实施方案的装置300和装置302的实例。这些图表只是举例说明，并且不应该限制本文权利要求的范围。本领域的普通技术人员应该认识到其它的变化、改进和备选方案。
如所示，装置300和装置302分别包括两个储蓄器，一个水溶液储蓄器305和一个有机溶液储蓄器310，分别用于容纳水溶液和有机溶液。在某些方面，在低压(例如，＜10psi)快速制备脂质囊制剂，并且本发明的装置和方法是完全可缩放的(scaleable)(例如，0.5mL-5000L)。在1-L规模，以约0.4-0.8L/分钟形成脂质囊。在某些优选的方面，所述装置不使用静态混合器也不使用专门的挤出设备。
在一个实施方案中，混合室320包括T-连接器，其具有任选的软管倒钩，其中流体管道324和326以约180°相互影响。还可以改变混合的角度，并且可以在约90°-约180°或者甚至27°-约90°的角度形成小于约100nm的脂质囊。在某些方面，使用基本上相等的流体管道流速制备充分限定和可再现平均直径的脂质囊。在其它方面，在一些情形中，通过改变流体管道的流速而制备充分限定的和可再现的平均直径的脂质囊，例如，以确保充分的混合。在某些方面中，流速之间的方差小于50％，更典型地小于约25％，并且甚至更典型地小于约5％。
图5显示按照一个实施方案的T-连接器和相关的流动动力学。在实施例部分(下文)更详细地显示和讨论流速的实例。与现有系统比较，本发明在低得多的(和基本上相等的)流速提供非湍流和提高的剪切速率。例如，在约500/s-约3300/s的剪切速率在约0.075-约0.4L/min的流速(两个流动管道)的混合环境中，本发明有利地提供非湍流(Nre＜2000)。对于混合室的管下游计算这些值；难以预测在T-连接器的混合点发生什么。可能产生湍流，但是只是在混合室中的混合点产生。
例如，使用蠕动泵315，容积式泵，无脉动齿轮泵，通过给脂质-乙醇和缓冲剂容器305、310加压，或者通过组合两种或多种这些和/或其它泵机构，可以驱动所述两种流体成分的混合。在一个方面中，使用配有505L泵顶的Watson-Marlow 505Di/L泵；硅氧烷管道(例如，铂处理的，3.2mm内径(ID)，2.4mm壁厚；从Watson Marlow获得，货号913A032024)可以用于进入聚丙烯或不锈钢T-连接器中的流体管道(例如，具有1/8”内径(ID))。典型地，脂质囊在室温下形成，但是按照本发明脂质囊可以在升高的温度形成。与其它现有方法不同，对于缓冲剂组成没有一般要求。事实上，本发明的方法和装置可以通过将烷醇中的脂质与水混合而配制脂质囊。在某些方面，本发明的方法和装置形成直径小于约100nm的脂质囊。
当制备包含核酸的脂质囊(诸如SNALP)时，核酸与阳离子脂质和反荷离子的比例可以最优化。对于精制制剂，在混合和乙醇去除步骤后优选70-95％的核酸(“NA”)包封。通过立即稀释这一初始SNALP制剂，有利地提高NA包封的水平。令人惊讶地，当在混合环境中混合溶液(治疗剂在一种溶液成分中)时，本发明的方法和装置提供达到约90％的包封效率。在图3a和3b中显示两种备选的稀释方案，例如，直接稀释。
在图3a中所示的实施方案中，将在混合区域320中形成的脂质体溶液立即并且直接引入到收集容器360中，收集容器360中含有控制量的稀释缓冲剂。在优选的方面，容器360包括设置成搅拌容器360的内容物以促进稀释的一个或多个元件。在一个方面中，在容器360中存在的稀释缓冲剂的量基本上等于向其中引入的脂质体溶液的体积。例如，当45％乙醇中的脂质体溶液引入到含有相等体积的乙醇的容器360中时，将有利地在22.5％的乙醇中产生更小的颗粒。
在图3b中所示的实施方案中，将含有稀释缓冲剂的第三储蓄器345流动性地偶联到第二混合区域340。在该实施方案中，将在混合区域320中形成的脂质体溶液立即并且直接与在第二混合区域340的稀释缓冲剂混合。在某些方面，混合区域340包括排列的T-连接器，以致脂质体溶液和稀释缓冲剂流动作为反向180°的流动而汇合，然而，可以使用提供更狭窄角度例如，27°-约180°的连接器。泵机构330将缓冲剂的可控流动递送至混合区域340。在一个方面中，控制提供到混合区域340的稀释缓冲剂的流速，使之基本上等于从混合区域320引入到其中的脂质体溶液的流速。本实施方案有利地允许更多地控制与所述脂质体溶液在第二混合区域340混合的稀释缓冲剂流动，并且因此还更多地控制在整个第二混合过程的缓冲剂中脂质体溶液的浓度。这种稀释缓冲剂流速的控制有利地允许在减小的浓度形成小的粒度。参见，例如，下面的实施例部分。
在某些方面中，本发明的脂质体生成装置300和302进一步包括用于控制储蓄器305和310的温度的温度控制机构(未显示)。典型地，来自第一储蓄器305和第二储蓄器310的流体在分开的孔同时流入混合室320。装置302进一步包括用于脂质体收集的第二混合室340下游的收集储蓄器350。此外，在某些方面，装置300和302进一步包括储蓄器305和310之一或两者上游的存储容器。此外，储蓄器305和310之一或两者可以包括装有高架混合器的套层不锈钢容器。
在另一个实施方案中，本发明提供具有超滤系统的装置，用于实施本发明的方法。图4是按照本发明的一个实施方案的装置400的代表性示意图的实例。这一示意图只是举例说明，并不应该限制本文权利要求的范围。本领域的普通技术人员应该认识到其它的变化、改进和备选方案。
在某些方面，装置400包括多个储蓄器，并且装有超滤系统。水溶液储蓄器440和有机溶液储蓄器430每一个分别具有上游制剂囊(未显示)。
如在图4中所示，收集容器450与流动超滤系统流体连通。在某些方面，超滤用来浓缩SNALP样品，然后通过缓冲剂置换而将乙醇从制剂中去除。应该理解，当进行按照图3a的方法时，收集容器450可与包含需要量的稀释缓冲剂。类似地，当进行按照图3b的过程时，容器450可以作用为图3b的收集容器350(在图4中未显示的第二泵)。
在一个操作实施方案中，将稀释的SNALP转移到超滤系统的给料储蓄器中。通过去除缓冲剂和乙醇，例如，通过使用用拥有约0.5mm-约1.0mm内径和约1,000-约750,000截留分子量(MWCO)的聚砜中空纤维填充的错流柱体，而进行浓缩。SNALP保持在所述中空纤维内并且再循环，而乙醇和缓冲剂成分通过流经这些中空纤维的孔而从所述制剂去除。这种滤液称为穿透溶液，并且被丢弃。当SNALP浓缩到需要的质粒浓度时，SNALP悬浮在其中的缓冲剂可以通过超滤去除，并且被等体积的最终缓冲剂置换。超滤可以用其它方法诸如常规透析代替。
VI.实施例
实施例1-现有方法与直接稀释方法的比较
SNALP由2摩尔％PEG-C-DMA，30％DlinDMA，20摩尔％DSPC和48摩尔％Chol”组成。
WATSON MARLOW泵-505Di/L型：
→核酸：未修饰的siRNA(在0.9％NaCl中复原)(0.225mg/ml siRNA)
→混合体积：10mL核酸+10mL脂质-乙醇溶液(5mL脂质)
→1.6mm T形连接器，3.2mm管道，每个通道40cm管长
→流速：200mL/分钟
条件：
1.将核酸与脂质混合，然后在温育延迟后使用泵稀释SNALP(现有方法)。
2.将核酸与脂质混合，然后使用移液器添加缓冲剂而稀释SNALP。
3.将核酸和脂质直接混合到含有稀释缓冲剂的瓶中(图3a，不搅动)。
4.将核酸和脂质直接混合在搅动的稀释缓冲剂中(图3a)。
结果：
  参数   1   2   3   4
  包封(％)   78.5   82.6   79.7   79.9
  囊大小(nm)   103.0(0.09)   91.0(0.07)   80.1(0.13)   82.3(0.13)
与用现有方法诸如在公布的美国申请2004/0142025中公开的方法制备的SNALP相比较，直接稀释方法(图3a)以类似的包封效率产生显著更小的SNALP颗粒。
实施例2-使用变化的方法参数比较本发明的方法。
形成4×浓缩的SNALP
SNALP2显示在图3a中的方法
SNALP3显示在图3b中的方法
 条件   siRNA溶液   脂质溶液   稀释缓冲剂   流速(ml/min)   包封(％)   具有聚合(poly)的大小(nm)
 SNALP2   0.225mg/mlpH 5   5mM90％EtOH   20mM柠檬酸盐和300mM NaCl，pH 6   200   81.8   82.9(0.15)
 SNALP2   0.225mg/mlpH 5   5mM90％EtOH   20mM柠檬酸盐和300mM NaCl，pH 6   400   82.1   75.2(0.11)
 4×浓缩的SNALP2   0.9mg/mlpH 5   20mM90％EtOH   20mM柠檬酸盐和300mM NaCl，pH 6   200   80.8   104.0(0.14)
 4×浓缩的SNALP2   0.9mg/mlpH 5   20mM90％EtOH   20mM柠檬酸盐和300mM NaCl，pH 6   400   80.9   112.4(0.21)
 4×浓缩的修饰的SNALP2   0.9mg/mlpH 4   20mM100％EtOH   20mM PBS，pH 7   200   81.3   100.7(0.14)
 4×浓缩的修饰的SNALP2   0.9mg/mlpH 4   20mM100％EtOH   20mM PBS，pH 7   400   81.1   98.9(0.21)
形成4×浓缩的SNALP
直接稀释(图3a)相对管道中的稀释(图3b)
Figure A20068003431300261
*在稀释之前关于初始囊形成的速率的流速值，对于管道中的稀释方法以600mL/min递送的稀释缓冲剂，以在得到的SNALP样品中获得20％的EtOH。
总结：
1.当泵流速增加时，可以在更高的初始脂质和siRNA浓度(4×)制备SNALP，并且对所述siRNA溶液、脂质溶液和稀释缓冲剂进行修饰。这些SNALP具有良好的包封效率和粒度。
2.使用管道中的稀释方法(SNALP3-图3b)，可以进一步控制这些SNALP的粒度，给出在尺寸上类似于以四分之一的初始脂质和siRNA浓度制备的SNALP2(图3a)的颗粒。
VII.结论
使用本发明的系统和方法可以生产的脂质颗粒的其它特点、优点和实例可以在美国临时专利申请系列号[60/](代理人记录号020801-002810US)中找到，所述美国临时专利申请系列号[60/](代理人记录号020801-002810US)题目为“Apoliprotein B的siRNA沉默(siRNA SilencingofApoliprotein B)”，与本申请同时于2005年7月27日提交，其内容通过引用结合于此。本文讨论的所有专利、专利申请和其它参考文献都通过引用结合于此。
尽管本发明已经通过实施例并且关于具体的实施方案进行了描述，但是应该理解，本发明不限于所公开的实施方案。相反，意欲涵盖对于本领域的技术人员显而易见的各种改进和类似的安排。因此，后附的权利要求的范围应该符合最广泛的解释，从而包括所有这样的改进和类似的安排。

Claims (30)

1.生产包封治疗产品的脂质体的方法，所述方法包括：
在第一储蓄器中提供水溶液；
在第二储蓄器中提供有机脂质溶液，其中所述水溶液和所述有机脂质溶液的一种包含治疗产品；
将所述水溶液和所述有机脂质溶液在第一混合区域混合，以产生脂质体溶液，其中所述有机脂质溶液与所述水溶液混合，以便基本上瞬时产生包封所述治疗产品的脂质体；并且然后立即
将所述脂质体溶液与缓冲溶液混合，以产生稀释的脂质体溶液。
2.权利要求1的方法，其中将所述脂质体溶液与所述缓冲溶液混合包括将所述脂质体溶液引入到含有所述缓冲溶液的第三储蓄器中。
3.权利要求2的方法，其中所述第三储蓄器包含基本上等于或大于向其中引入的脂质体溶液的量的一定量的缓冲溶液。
4.权利要求2的方法，其中搅拌所述第三储蓄器。
5.权利要求1的方法，其中将所述脂质体溶液与所述缓冲溶液混合包括在第二混合区域中混合。
6.权利要求5的方法，其中所述第一混合区域包括第一T-连接器，其中将所述水溶液和所述有机脂质溶液作为相对彼此基本上180°的相对流动引入到第一T-连接器中，其中第二混合区域包括第二T-连接器，并且其中将所述脂质体溶液和所述缓冲溶液作为相对彼此基本上180°的相对流动引入到所述第二T-连接器中。
7.权利要求1的方法，其中所述第一混合区域包括第一T-连接器，并且其中将所述水溶液和所述有机脂质溶液作为相对彼此基本上180°的相对流动引入到所述T-连接器中。
8.权利要求1的方法，其中所述脂质体溶液具有约20％v/v至约55％v/v的有机溶剂浓度。
9.权利要求8的方法，其中所述稀释的脂质体溶液具有小于约25％v/v的有机溶剂浓度。
10.权利要求1的方法，其中所述脂质体直径小于约100nm。
11.权利要求1的方法，其中所述治疗产品选自由下列各项组成的组：蛋白质、质粒、适体、核酸、反义核酸、核酶、tRNA、snRNA、siRNA、shRNA、ncRNA、预先浓缩的DNA和抗原。
12.权利要求1的方法，其中所述治疗产品是核酸。
13.权利要求12的方法，其中所述核酸编码选自由下列各项组成的组的蛋白质：单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)、胞嘧啶脱氨酶、黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶、p53、嘌呤核苷磷酸化酶、羧酸酯酶、脱氧胞苷激酶、硝基还原酶、胸苷磷酸化酶、或细胞色素P450 2B1。
14.权利要求1的方法，其中所述治疗产品是亲脂性的。
15.权利要求14的方法，其中所述亲脂性产品选自由protax III、紫杉醇(Paclitaxol)、紫杉醇(taxol)、紫杉醇衍生物和脂质衍生的前药组成的组。
16.用于生产包封治疗产品的脂质体的系统，所述系统包括：
容纳水溶液的第一储蓄器；
容纳有机脂质溶液的第二储蓄器，其中所述水溶液和所述有机脂质溶液中的一种包含治疗产品；和
泵机构，将所述泵机构设置成将所述水溶液和所述有机脂质溶液以基本上相等的流速泵抽到混合区域中，其中所述有机脂质溶液与所述水溶液在混合区域中混合，以基本上瞬时形成包封治疗产品的脂质体溶液；和
收集储蓄器，所述收集储蓄器包括缓冲溶液，与所述混合区域流体连通，其中将所述脂质体溶液在形成后基本上立即引入到收集储蓄器中，由此形成稀释的脂质体溶液。
17.权利要求16的系统，其中所述混合区域包括T-连接器，并且其中将所述水溶液和所述有机脂质溶液作为相对彼此基本上180°的相对流动引入到所述T-连接器中。
18.权利要求16的系统，其中所述收集储蓄器含有基本上等于或大于向其中引入的脂质体溶液的量的一定量的缓冲溶液。
19.权利要求16的系统，其中搅拌所述第三储蓄器。
20.用于生产包封治疗产品的脂质体的系统，所述系统包括：
容纳水溶液的第一储蓄器；
容纳有机脂质溶液溶液的第二储蓄器，其中所述水溶液和所述有机脂质溶液中的一种包含治疗产品；和
第一泵机构，将其设置成将所述水溶液和所述有机脂质溶液以基本上相等的流速泵抽到第一混合区域中，其中所述有机脂质溶液与所述水溶液在第一混合区域混合，以基本上瞬时形成包封治疗产品的脂质体溶液；
容纳缓冲溶液的缓冲储蓄器；和
第二泵机构，将其设置成将所述缓冲溶液以控制的流速泵抽到第二混合区域中，其中在第一混合区域中形成以后，所述脂质体溶液基本上立即引入到第二混合区域，由此在所述第二混合区域形成稀释的脂质体溶液。
21.权利要求20的装置，其中所述第一混合区域包括第一T-连接器，其中将所述水溶液和所述有机脂质溶液作为相对彼此基本上180°的相对流动引入到第一T-连接器中，其中所述第二混合区域包括第二T-连接器，并且其中将所述脂质体溶液和所述缓冲溶液作为相对彼此基本上180°的相对流动引入到所述第二T-连接器中。
22.权利要求20的系统，其中控制所述缓冲溶液的流速基本上等同于或大于进入所述第二T-连接器的脂质体溶液的流速。
23.权利要求16或20的系统，其中所述脂质体溶液具有约20％v/v-约55％v/v的有机溶剂浓度。
24.权利要求23的系统，其中所述稀释的脂质体溶液具有小于约25％v/v的有机溶剂浓度。
25.权利要求16或20的系统，其中所述脂质体直径小于约100nm。
26.权利要求16或20的系统，其中所述治疗产品选自由下列各项组成的组：蛋白质、质粒、适体、核酸、反义核酸、核酶、tRNA、snRNA、siRNA、shRNA、ncRNA、预先浓缩的DNA和抗原。
27.权利要求16或20的系统，其中所述治疗产品是核酸。
28.权利要求27的系统，其中所述核酸编码选自由下列各项组成的组的蛋白质：单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)、胞嘧啶脱氨酶、黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶、p53、嘌呤核苷磷酸化酶、羧酸酯酶、脱氧胞苷激酶、硝基还原酶、胸苷磷酸化酶、或细胞色素P4502B1。
29.权利要求16或20的系统，其中所述治疗产品是亲脂性的。
30.权利要求29的系统，其中所述亲脂性产品选自由protax III、紫杉醇(Paclitaxol)、紫杉醇(taxol)、紫杉醇衍生物和脂质衍生的前药组成的细。
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