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CN109476747A - 结合免疫调节性蛋白和肿瘤抗原的双特异性结合蛋白 - Google Patents

结合免疫调节性蛋白和肿瘤抗原的双特异性结合蛋白 Download PDF

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CN109476747A
CN109476747A CN201780045719.9A CN201780045719A CN109476747A CN 109476747 A CN109476747 A CN 109476747A CN 201780045719 A CN201780045719 A CN 201780045719A CN 109476747 A CN109476747 A CN 109476747A
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CN
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seq
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bispecific binding
scfv
amino acid
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CN201780045719.9A
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赤松谦子
P.卡尔普
C.M.福赛思
P.Y.黄
D.鲍威尔斯
A.F.瓦尔
叶世鸣
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Original Assignee
AbbVie Biotechnology Ltd
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Abstract

本披露提供结合至两种抗原的双特异性蛋白、以及其组合物、用途及制备方法。

Description

结合免疫调节性蛋白和肿瘤抗原的双特异性结合蛋白
1.相关申请的交叉引用
本申请要求在35 U.S.C.§119(e)下于2016年5月27日提出申请的美国临时申请号62/342,393及于2016年10月31日提出申请的申请号62/414,897号的权益，两个申请的全部内容均以引用方式并入本文中。
2.序列表
本申请含有以ASCII格式以电子方式提交的序列表且其全文以引用方式并入本文中。该ASCII复本在2017年5月17日创建，命名为381493-284WO_SL.txt且大小为674,449个字节。
3.技术领域
本申请尤其是关于新颖双特异性结合蛋白、包含这些新蛋白质的组合物、编码这些蛋白质的核酸及其制备及使用方法。
4.背景技术
癌症疗法包含广泛范围的治疗方法，包括手术、辐射及化学疗法。尽管各种方法容许医师广泛选择可用治疗来治疗癌症，但现有治疗剂存在许多缺点，例如缺乏靶向癌细胞超过正常健康细胞的选择性及癌症对治疗产生抗性。
与非靶向疗法(例如辐射治疗)相比，基于靶向治疗剂(其相对于正常细胞优先干扰癌细胞的细胞过程)的最近方法已产生具有较少副作用的化学治疗方案。
癌症免疫疗法、具体而言活化宿主的免疫系统的T细胞以防止癌细胞增殖或杀死癌细胞的药剂的研发已经作为补充现存护理标准的有前景的治疗方法出现。参见，例如，Miller等人Cancer Cell[癌症细胞]，27，439-449(2015)。这些免疫治疗方法包括研发用于调节免疫系统以杀死癌细胞的抗体。例如，抗PD-1阻断抗体派姆单抗(pembrolizumab)及尼沃鲁单抗(nivolumab)已在美国及欧盟批准用于治疗诸如不可切除或转移性黑色素瘤及转移性非小细胞肺癌等疾病。抑制免疫抑制性蛋白(例如CTLA-4)的努力已导致抗CTLA-4抗体(例如曲美目单抗(tremelimumab)及伊匹单抗(ipilimumab))的研发及临床评估。
仍需要替代方法及额外癌症治疗以补充现存的治疗性护理标准。
5.发明内容
本披露提供能特异性结合两种抗原的双特异性结合蛋白。结合蛋白通常包含对应于免疫球蛋白的可变轻链及可变重链区或结构域的可变轻链及可变重链区或结构域。结合蛋白的至少一个抗原结合部分是呈本领域已知的作为scFv的单链形式。在一些实施例中，另一抗原结合部分包含IgG。在其他实施例中，另一抗原结合部分包含scFv。
因此，双特异性结合蛋白可包含两个经由二硫键连接在一起的多肽，其中每一多肽在其各自的N-及C-末端包含第一scFv区及第二scFv区。两个scFv区特异性结合不同抗原。在每一多肽的第一及第二scFv区之间是包含免疫球蛋白的铰链、CH2及CH3结构域的序列。
可替代地，双特异性结合蛋白可包含具有在每一CH3结构域的C-末端连接的scFv区的IgG。在此情形中，IgG的Fab区中的可变重链及轻链特异性结合一种抗原，且C-末端scFv区包含特异性结合第二抗原的不同可变重链及轻链。
如上所述，双特异性结合蛋白可经由两个结构域结合至两种不同抗原，一个在N-末端结合抗原X且另一个在C-末端结合抗原Y。在一些实施例中，双特异性结合蛋白结合免疫调节性蛋白的第一结构域以，例如，活化免疫受体，并结合肿瘤抗原的第二结构域。在一个特定实施例中，双特异性结合蛋白通过经由第一结构域结合激动CD40并经由第二结构域结合肿瘤抗原间皮素。在另一实施例中，双特异性结合蛋白通过经由第一结构域结合激动4-1BB并经由第二结构域结合至间皮素。在这些情形下，双特异性结合蛋白提供肿瘤微环境中的免疫反应的靶特异性活化。肿瘤微环境中的免疫调节性蛋白的该条件活化可避免全身性毒性，潜在地容许免疫抗癌剂的较高给药及较宽应用。
在一个实施例中，双特异性结合蛋白包含两种式(I)的多肽：
X-H-Fc-L-scFvY (I)，
其中
X是scFvX或Fab区，其中X特异性结合第一抗原且scFvY特异性结合第二抗原，
H是铰链区，
Fc包含免疫球蛋白的CH2及CH3区，
scFvX及scFvY各自独立地是单链可变片段，且
L是多肽连接体。
在一些实施例中，两种抗原中的一种是免疫调节性蛋白且另一种是肿瘤抗原。在一些实施例中，在X是Fab区时，则第一抗原是肿瘤抗原，且第二抗原是免疫调节性蛋白。在一些实施例中，在X是Fab区时，则第一抗原是免疫调节性蛋白，且第二抗原是肿瘤抗原。
纳入双特异性结合蛋白中的VH及VL链可源自多种来源，包括预存在的抗体、新近生成的抗体及VH及VL链文库。可纳入双特异性结合蛋白中的VH及VL链的具体示例性实施例以及与参照抗体竞争结合免疫调节性蛋白(例如CD40或4-1BB)及肿瘤抗原(例如间皮素、柄蛋白-4、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、B7-H4或表皮生长因子受体(EGFR))的双特异性结合蛋白的具体示例性实施例提供于具体实施方式部分中。
本文提供包含编码本披露内容的多肽的核苷酸序列的核酸，还提供包含核酸的载体。另外，本文提供经包含编码所披露多肽的核苷酸序列的载体转化的原核及真核宿主细胞、以及经工程化以表达核苷酸序列的真核(例如哺乳动物)宿主细胞。还提供通过培养宿主细胞及回收多肽产生多肽的方法，且进一步论述于下文具体实施方式中。
在另一方面中，本披露提供包括本文所述双特异性结合蛋白的组合物。组合物通常包含一种或多种如本文所述的双特异性结合蛋白和/或其盐、及一种或多种赋形剂、运载体或稀释剂。
双特异性蛋白特异性结合至两种抗原(例如免疫调节性蛋白及肿瘤抗原)，且活化肿瘤微环境内的免疫细胞以实现抗肿瘤活性。因此，本披露提供治疗经诊断患有实体瘤的受试者(例如人类受试者)的方法。方法通常涉及向受试者施用有效提供治疗益处的量的本文所述双特异性结合蛋白。受试者可经诊断患有多种实体瘤中的任一种，这些实体瘤可以是新近诊断的、复发的、或复发且难治的。双特异性结合蛋白通常是以介于约0.005mg/kg至约5mg/kg范围内的剂量以静脉内输注形式施用。双特异性结合蛋白通常是以静脉内输注形式一周两次、一周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每五周一次、每六周一次、每七周一次或每八周一次施用。
双特异性结合蛋白可以单一治疗剂(单一疗法)或辅助或与其他治疗剂(通常但不必，用于治疗实体瘤的那些)一起施用。治疗剂通常经以其批准剂量、施用途径及施用频率来使用，但可以较低剂量使用。
双特异性结合蛋白可经由多种施用途径或方式(包括但不限于，静脉内输注和/或注射、肿瘤内注射及皮下注射)施用。所施用量将取决于施用途径、给药时间表、所治疗癌症的阶段及其他参数，例如患者的年龄及体重，如领域内熟知。预计提供治疗益处的具体示例性给药时间表提供于具体实施方式中。
基于本文提供的数据，预计本文所述双特异性结合蛋白将为经诊断患有实体瘤的受试者提供治疗益处。
6.附图说明
图1A-1B显示本披露内容的双特异性结合蛋白形式的代表图。图1A描绘具有scFv区的本披露内容的双特异性结合蛋白的示例性实施例；图1B描绘具有IgG区及scFv区的本披露内容的双特异性结合蛋白的示例性实施例。
图2A-2B描绘在肿瘤抗原存在下靶向免疫调节性蛋白时不提供条件活化的双特异性结合蛋白的代表图。图2A描绘双重可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig)；图2B描绘交叉双重可变结构域蛋白质(CO-DVD)。
图3A-3G描绘抗CD40抗体可变结构域的示例性氨基酸序列。CDR氨基酸序列以粗体显示。图3A-3C描绘小鼠抗人CD40抗体可变结构域的氨基酸序列：图3A显示muAb1至muAb3；图3B显示muAb4至muAb7；图3C显示muAb8至muAb10。图3D-3G描绘人源化抗人CD40抗体可变结构域的氨基酸序列：图3D显示源自muAb6及muAb8的抗体；图3E显示源自muAb8及muAb9的抗体；图3F显示源自muAb9的抗体；且图3G显示源自muAb9的其他抗体。
图4A-4E描绘抗间皮素抗体可变结构域的示例性氨基酸序列。CDR氨基酸序列以粗体显示。图4A显示HuAb17及HuAM1至HuAM4的序列；图4B显示HuAM5至HuAM9的序列；图4C显示HuAM11至HuAM18的序列；图4D显示HuAM19、HuAM21及HuAM15变体的序列；图4E显示MSLN76923及HuAM15变体的序列。
图5A-5C显示不同癌细胞系中在增加量的CA125存在下抗间皮素抗体HuAM5、HuAM11及HuAM16的结合。图5A描绘OVCAR-3卵巢癌细胞结果；图5B描绘SW1990胰腺癌细胞结果；图5C描绘SN12C肾癌细胞结果。
图6A-6B描绘不同细胞系中具有或无可溶性CA125的抗间皮素抗体HuAM5、HuAM11及HuAM16的不同浓度的结合曲线。图6A描绘表达间皮素的293细胞中的结果；图6B描绘OVCAR-3卵巢癌细胞中的结果。
图7A-7G描绘示例性抗4-1BB抗体可变结构域的氨基酸序列。图7A描绘大鼠TABBY101至TABBY103的序列。图7B描绘大鼠TABBY104至TABBY106的序列。图7C描绘大鼠TABBY107及TABBY108的序列。图7D描绘人源化抗体的序列。图7E描绘额外人源化抗体。图7F描绘小鼠TABBY1.1至TABBY5的序列。图7G描绘小鼠TABBY6至TABBY10的序列。CDR氨基酸序列以粗体显示。
图8A-8H描绘针对CD40及间皮素的示例性双特异性结合蛋白的氨基酸序列。图8A显示LB-1及h24；图8B显示h26及B37；图8C显示B38及B39；图8D显示B40及B41；图8E显示B42及B43；图8F显示B44及B45；图8G显示B46及V6-2；图8H显示V6-5及V6-6。CD40 CDR以粗体显示；间皮素CDR以粗体加下划线显示；恒定区是以斜体加虚下划线显示。
图8I-8M描绘针对4-1BB及间皮素的示例性双特异性结合蛋白的氨基酸序列。图8I显示hu106MSLN-1及hu106MSLN-2；图8J显示hu106MSLN-3及hu1 06MSLN-4；图8K显示hu106MSLN-5及hu106MSLN-6；图8L显示hu107MSLN-1及hu107MSLN-2；图8M显示hu107MSLN-3及hu107MSLN-4。4-1BB CDR以粗体显示；间皮素CDR以粗体加下划线显示；恒定区是以斜体加虚下划线显示。
图9A-9B描绘在间皮素存在下由本披露内容的双特异性结合蛋白的免疫细胞(分别是树突细胞及B细胞)的活化。黑色条描绘与无间皮素的HEK293细胞(“293S”)共培养的免疫细胞的结果；中空条描绘与表达细胞表面人类间皮素的HEK293细胞(“293S huMSLN”)共培养的免疫细胞的结果。图9A显示y-轴上的树突细胞(DC)中的IL-12p70水平；图9B显示y-轴上的B细胞增殖，以计数/分钟(CPM)计。
图10A-10L描绘免疫调节性蛋白CD40或4-1BB及肿瘤抗原柄蛋白-4、EGFR、B7-H4或PSMA的抗体可变结构域或相应双特异性蛋白的氨基酸序列。图10A描绘针对柄蛋白-4、EGFR或PSMA的示例性抗体可变结构域的氨基酸序列。CDR氨基酸序列以粗体显示。
图10B描绘结合CD40及柄蛋白-4的示例性双特异性结合蛋白的氨基酸序列。CD40CDR以粗体显示；柄蛋白-4CDR以粗体加下划线显示；恒定区是以斜体加虚下划线显示。
图10C描绘结合CD40及PSMA的示例性双特异性结合蛋白R89及R90的氨基酸序列。图10D描绘结合CD40及EGFR的示例性双特异性结合蛋白A16及A17的氨基酸序列。CD40 CDR以粗体显示；肿瘤抗原CDR以粗体加下划线显示；恒定区是以斜体加虚下划线显示。
图10E-10G描绘针对B7-H4的示例性鼠类及人源化抗体可变结构域的氨基酸序列。图10E显示小鼠182.19.1、人源化182.19.1及小鼠182.17.1；图10F显示小鼠182.10.21以及182.17.1、182.19.1及182.10.21的人源化型式；图10G显示小鼠181.23.1，以及182.10.21及181.23.1的人源化型式。CDR氨基酸序列以粗体显示。
图10H及10I描绘结合4-1BB及B7-H4的示例性双特异性蛋白的氨基酸序列。图10H显示Hu106B7H4-1及Hu106B7H4-2；图10I显示Hu106B7H4-3及Hu106B7H4-4。4-1BB CDR以粗体显示；B7-H4CDR以粗体加下划线显示。
图10J描绘针对PSMA的示例性抗体可变结构域的氨基酸序列。图10K描绘针对PSMA的抗体可变结构域的额外序列。CDR氨基酸序列以粗体显示。
图10L描绘结合4-1BB及PSMA的示例性双特异性蛋白的氨基酸序列。4-1BB CDR以粗体显示；PSMA CDR以粗体加下划线显示。
图11A-11B描绘各种B细胞共培养物中结合CD40及柄蛋白-4或PSMA的双特异性结合蛋白的效应。图11A描绘与同种型对照、抗CD40抗体huAb6-1或抗柄蛋白-4抗体66.3相比，单独培养的B细胞(上图)、与HEK293细胞共培养的B细胞(中间图)及与表达柄蛋白-4的HEK293细胞的B细胞共培养物(下图)中结合CD40及柄蛋白-4的双特异性蛋白R87的效应。图11B描绘与同种型对照、抗CD40抗体huAb6-1或抗PSMA抗体SAM3.1相比，与4T1细胞一起培养的B细胞(上图)及与表达PSMA的4T1细胞的B细胞共培养物(下图)中结合CD40及PSMA的双特异性蛋白R89的效应。
图12A-12B描绘FACS分析中结合4-1BB及间皮素的双特异性结合蛋白的效应。图12A显示hu106MSLN-1至hu106MSLN-4的效应；且图12B显示hu107MSLN-1至hu107MSLN-4的效应。这些图显示在表达4-1BB的HEK293细胞(上图)或表达间皮素的HEK293细胞(下图)存在下的结合。
图13描绘通过由NF-κB驱动的荧光素酶基因表达量测的结合间皮素的4-1BB双特异性蛋白的激动性活性。上图描绘在Fc交联剂存在下对HEK293细胞中转染的4-1BB的效应；下图描绘无Fc交联剂的效应。
图14A-14B描绘在具有或无细胞表面间皮素的HEK293细胞存在下结合间皮素的4-1BB双特异性蛋白的活性。上图描绘表达间皮素的HEK293细胞中的效应；下图描绘具有模拟转染子的HEK293细胞中的效应。图14A显示hu106MSLN-1至hu1 06MSLN-4的效应；且图14B显示hu107MSLN-1至hu107MSLN-4的效应。
图15A-15C描绘由本披露内容的结合4-1BB及间皮素的双特异性结合蛋白的条件CD8+T细胞活化。图15A显示在表达间皮素的CT26细胞存在下(上图)或在无间皮素的CT26细胞存在下(下图)的CD8+T细胞增殖效应，以计数/分钟(cpm)计；图15B显示在表达间皮素的CT26细胞存在下(上图)或在无间皮素的CT26细胞存在下(下图)自CD8+T细胞的干扰素-γ分泌。图15C显示在表达间皮素的PC3细胞(上图)或PC3细胞(下图)存在下双特异性蛋白施用对自CD8+T细胞的干扰素-γ分泌的效应。
图15D-15E显示结合4-1BB及PSMA的式(I)的双特异性结合蛋白的效应。图15D显示FACS分析中示例性双特异性蛋白的效应，其在表达小鼠PSMA的CT26细胞(上图)或表达小鼠4-1BB的HEK293细胞(下图)存在下显示结合。图15E显示通过在具有或无细胞表面PSMA的CT26细胞存在下示例性双特异性蛋白的NFκB活化量测的激动性活性：上图描绘表达小鼠PSMA的CT26细胞中的效应；下图描绘具有模拟转染子的CT26细胞中的效应。
图16显示表达间皮素的PC3肿瘤细胞与DC及T细胞的共培养物中与同种型对照抗体相比结合CD40及间皮素的式(I)的双特异性结合蛋白的效应。
图17A-17B显示小鼠PC3癌细胞模型中结合CD40及间皮素(“MSLN”)、PSMA或柄蛋白-4的式(I)的双特异性结合蛋白的效应。图17A显示表达间皮素的PC3肿瘤中双特异性结合蛋白h24的效应(上图)及表达PSMA的PC3肿瘤中双特异性结合蛋白R89的效应(下图)。图17B显示表达柄蛋白-4的PC3肿瘤中双特异性结合蛋白R87的效应(上图)及无间皮素表达的PC3肿瘤中双特异性结合蛋白h24的效应(下图)。
图18显示携带表达间皮素的4T1同基因肿瘤(“4T1 MSLN”)的小鼠中抗CD40抗体1C10及双特异性结合蛋白LB-1对肿瘤体积的效应。
图19描绘给药抗CD40抗体1C10、抗间皮素抗体MOR06626或双特异性结合蛋白LB-1对携带表达间皮素的4T1同基因肿瘤的小鼠中肝酶ALT水平(mg/dL)的效应。
图20描绘在给药5mg/kg抗CD40抗体1C10 mIgG1(“1C10”)、小鼠IgG1(“同种型”)及双特异性结合蛋白LB-1(“LB-1”)后细胞因子水平对小鼠中由干扰素-γ(“MIG”)诱导的白介素-6(“IL-6”)、肿瘤坏死因子-α(“TNFa”)、角质细胞化学吸引剂(“KC”)、干扰素γ诱导的蛋白质10(“IP-10”)及单核因子的效应。
图21描绘在具有CT26-PSMA肿瘤的同基因免疫感受态Balb/c小鼠中重复给药抗4-1BB抗体、抗4-1BB抗PSMA结合蛋白或同种型对照对肿瘤体积的效应。总共施用三次具有muIgG1恒定区及T252M突变的抗4-1BB抗体hu106-1(“hu106-1 mIgG1 T252M”)、双特异性结合蛋白Hu106mPSMA-3或Hu106mPSMA-4或同种型对照TIB191 mIgG1。给药是在接种后第18、20及22天实施，如箭头所指示。y-轴显示肿瘤体积(mm3)，x-轴显示接种后天数。
图22A及22B描绘在具有CT26-PSMA肿瘤的同基因免疫感受态Balb/c小鼠中重复给药抗4-1BB抗体、抗4-1BB抗PSMA结合蛋白或同种型对照后个体动物中的肿瘤体积。图22A显示给药TIB191 mIgG1(上图)及抗4-1BB抗体hu106-1 mIgG1 T252M(下图)的动物中的数据。图22B显示给药抗4-1BB抗PSMA结合蛋白Hu106mPSMA-3(上图)及Hu106mPSMA-4(下图)的动物中的数据。给药是在接种后第18、20及22天实施，如箭头所指示。y-轴显示肿瘤体积(mm3)，x-轴显示接种后天数。
图23A及23B描绘在具有CT26-PSMA肿瘤的同基因免疫感受态Balb/c小鼠中重复给药抗4-1BB抗体、抗4-1BB抗PSMA结合蛋白或同种型对照后的血清细胞因子水平。图23A显示单核细胞趋化蛋白-1(“MCP-1”，上图)及粒细胞-巨噬细胞群落-刺激因子(“GM-CSF”，下图)的血清水平。图23B显示白介素-6(“IL-6”，上图)及角质细胞化学吸引剂(“KC”，下图)的血清水平。y-轴显示血清细胞因子水平(pg/mL)，x-轴显示对照抗体TIB191 mIgG1、抗4-1BB抗体hu106-1 mIgG1 T252M、结合蛋白Hu106mPSMA-3或Hu106mPSMA-4。
图23C描绘在具有CT26-PSMA肿瘤的同基因免疫感受态Balb/c小鼠中重复给药抗4-1BB抗体、抗4-1BB抗PSMA结合蛋白或同种型对照后小鼠肝试样中的CD45+染色。y-轴显示CD45+染色％，x-轴显示对照抗体TIB191 mIgG1、抗4-1BB抗体hu106-1 mIgG1 T252M、结合蛋白Hu106mPSMA-3或Hu106mPSMA-4。
7.具体实施方式
7.1.缩写
在许多实施例中，本文所述双特异性结合蛋白及多核苷酸是借助其各自的多肽或多核苷酸序列进行阐述。除非另有指示，否则多肽序列是以N→C取向提供；多核苷酸序列是以5’→3’取向提供。对于多肽序列而言，使用遗传编码的氨基酸的常规三字母或单字母缩写，如下表1中所述。
某些序列是由指定属于某些类别(例如，脂肪族、疏水等)的氨基酸残基的结构式来定义。如本文所述遗传编码的氨基酸所属的各种类别阐述于下表2中。一些氨基酸可属于一个以上类别。含有硫氢基的半胱氨酸及构象受限的脯氨酸并未分配类别。
7.2.定义
除非本文另有定义，否则结合本披露使用的科学及技术术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
除非另有指示，否则如本文所用结合蛋白氨基酸残基的编号是根据Kabat EU命名法进行。
7.3.双特异性结合蛋白
7.3.1.双特异性形式
为帮助理解，在图1A-1B中图解说明双特异性结合蛋白的两个示例性实施例。参照图1A，一个示例性实施例包含两个经由二硫键(17)连接在一起的多肽。每一多肽包含由各自的多肽连接体(12a或12b)连接在一起的VH区(10a或10b)及各自的VL区(14a或14b)。VH10a、VL14a及连接体12a一起构成单链可变片段(scFv)，在本文中称作scFva。类似地，VH10b、VL 14b及连接体12b构成sCFvb。VL区(14a或14b)融合至铰链区(分别为16a或16b)，该铰链区又融合至Fc区，该Fc区包含融合至CH3结构域(分别为20a或20b)的CH2结构域(分别为18a或18b)。scFva X或sCFvb X区可结合至相同或不同抗原，但在许多实施例中，结合相同抗原。如所阐释，scFva X及scFvb X特异性结合至第一抗原(抗原X)。
图1A中的结合蛋白包含第二scFv、scFvY，其包含经由可变链连接体(分别为26a或26b)连接在一起的第二VL区(24a或24b)(即，VL Y)及第二VH区(分别为28a或28b)(即，VH Y)。VH28a、可变链连接体26a及VL 24a一起构成scFv、scFva Y，其经由连接体22a附接至CH3结构域20a的C-末端。类似地，VH 28b、可变链连接体26b及VL 24b构成通过连接体22b在CH3结构域20b的C-末端附接的scFvb Y。两个部分scFva Y及scFvb Y可结合至相同或不同抗原，但在许多实施例中，结合相同抗原。在一些实施例中，scFva Y及scFvb Y特异性结合第二抗原(抗原Y)。
参照图1B，另一示例性实施例包含在每一CH3结构域20a或20b的C-末端经由连接体22a或22b连接至各自的scFv的IgG。IgG部分包含两个VH(10a或10b)及两个VL(14a或14b)结构域，其各自附接至其相应CH1(30a或30b)及CL(32a或32b)区。如本领域已知，IgG CH1区(30a或30b)附接至相应铰链(分别为16a或16b)，该铰链融合至Fc区，该Fc区包含融合至CH3结构域(20a或20b)的CH2结构域(18a或18b)。在CH3结构域20a或20b的C-末端的每一者处分别是连接体22a或22b，其连接至scFv的VL24a或24b。VL24a或24b随后分别经由连接体26a或26b连接至VH 28a或28b。
构成Fab结构域的CH1区30a及30b及CL区32a及32b可独立地为IgG1、IgG2或IgG4区。CH1区30a及30b可相同或不同，但在许多实施例中相同。类似地，CL区32a及32b可相同或不同，但在许多实施例中相同。
连接其各自的VL及VH区的连接体12a或12b可相同或不同，但在大部分实施例中相同。同样，连接体26a或26b可相同或不同，但在大部分实施例中相同，且可与连接体12a或12b相同。在一些实施例中，连接体12a或12b相同。在一些实施例中，连接体26a或26b相同。可用于连接VH及VL链的连接体的具体序列提供于后一部分中。
如上文图1A中所述，scFva X及scFvb X特异性结合第一抗原(抗原X)。由VH链(10a或10b)(即，VH X)及VL链(分别为14a或14b)(即，VL X)赋予结合特异性以及亲和力。在本披露内容及图1A中描绘的具体实施例的结合蛋白中，包含VH 14a及14b的各自的CDR可相同或不同，如同可为整体VH链。在具体实施例中，VH 14a及14b相同，VL10a及10b相同。
类似地，scFva Y及scFvb Y特异性结合第二抗原(抗原Y)。由VH链(28a或28b)(即，VH Y)及VL链(分别为24a或24b)(即，VL Y)赋予结合特异性以及亲和力。在本披露内容及图1A及1B中描绘的具体实施例的结合蛋白中，包含VH 28a及28b的各自的CDR可相同或不同，如同可为整体VH链。在具体实施例中，VH 28a及28b相同，VL 24a及24b相同。
如本领域已知，每一VH链都具有(以N→C次序)在本文中称作VH CDR编号1、VH CDR编号2及VH CDR编号3的三个互补决定区(“CDR”)，且每一VL链都具有(以N→C次序)在本文中称作VL CDR编号1、VL CDR编号2及VL CDR编号3的三个CDR。可用于结合所关注特异性抗原的具体示例性CDR、VH及VL序列提供于后一部分中。
构成本披露内容的双特异性结合蛋白(例如，式(I)的双特异性结合蛋白)的scFv区包含一起特异性结合抗原的VH及VL区。纳入双特异性结合蛋白中的VH及VL区及CDR可源自多个来源，包括预存在的抗体、新近生成的抗体、VH及VL链文库、CDR文库或合成序列。scFv内的VH及VL链是借助不显著干扰VH及VL区的抗原结合性质的多肽连接体连接。scFv区可具有VH-VL或VL-VH取向(在N→C方向上)，且scFvX与scFvY之间的取向可相同或不同。因此，在N-及C-末端二者包含scFv区的双特异性结合蛋白中，可变链的取向可为VH X-VL X及VL Y-VH Y；VH X-VL X及VH Y-VL Y；VL X-VH X及VL Y-VH Y；或VL X-VH X及VH Y-VL Y。在上文所述及图1A中图解说明的实例中，双特异性结合蛋白包含具有VH X-VL X及VL Y-VH Y的可变链取向的多肽。
在本披露内容的一些实施例中，双特异性结合蛋白展现条件活化，借此其在细胞表面肿瘤抗原存在下提供免疫调节性蛋白的活化，且在不存在细胞表面肿瘤抗原下提供免疫调节性蛋白的降低、最小或无活化。相比之下，图2A-2B中显示的双特异性结合蛋白不提供条件活化。图2A描绘呈双重可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig)形式的一个实施例，其中特异性结合至两种抗原的两个可变区1及2在融合至IgG恒定区之前串联连接。图2B显示交叉双重可变结构域(CO-DVD)形式的双特异性蛋白，其中特异性结合至两种抗原的可变区1及2通过较长连接体区串联连接且还融合至IgG恒定区。
在一些实施例中，本披露内容的双特异性结合蛋白包含连接单链可变片段VH链与VL链的连接体，该连接体在每一情况下独立地具有对应于选自下表中的序列中的一种的序列：
连接单链可变片段VH链与VL链的连接体可经选择以增加本披露内容的双特异性结合蛋白的表达、溶解性、稳定性(例如，如通过较低聚集水平、较低聚集速率、较高熔融温度和/或较长血浆半衰期所量测)和/或效价。
如本领域已知，铰链区16a及16b分别连接可变区14a及14b与CH2结构域18a及18b。可使用IgG1、IgG2、IgG3或IgG4铰链区，以及变体铰链区，如领域内所知。
铰链区变体可用于本披露内容的双特异性结合蛋白以优化某些特征。在阐释性实例中，可引入人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的铰链区内的一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失以降低片段化和/或聚集的水平或速率。这些修饰已由，例如，Cohen，S.L.等人Journalof the American Chemical Society[美国化学学会杂志]，129(22)，6976-6977(2007)阐述。在特定实施例中，本披露内容的双特异性结合蛋白包含变体IgG1、IgG2或IgG4，例如包含氨基酸取代C219S和/或C220S的IgG1或IgG2铰链区。参见美国专利申请号2010/0226925。在另一实施例中，双特异性结合蛋白包括包含氨基酸取代S228P的IgG4铰链区。
如本文所用，“恒定区”包括抗体及同种异型或天然变体的天然恒定区，例如人类IgG1中的D356E及L358M或A431G。参见，例如，Jefferis及Lefranc，MAbs，1(4)：332-338(2009年7月-8月)。轻恒定区可为kappa(κ)轻区或lambda(λ)区。λ轻区可为已知亚型中的任一者，例如λ1、λ2、λ3或λ4。在一些实施例中，与相应野生型序列相比，λ轻区具有C-末端残基截短。参见，例如，Shen等人，MAbs，5(3)：418-431(2013年5月-6月)。在一些实施例中，抗CD40抗体包含卡帕(κ)轻区。
在IgG的片段可结晶(Fc)区中作为标准，CH2结构域18a及18b与其各自的CH3结构域20a及20b融合。可使用IgG1、IgG2或IgG4恒定区的CH3区，以及变体恒定区，如本领域已知，且其可相同或不同，但在许多实施例中相同。
示例性恒定区变体对应于“突变体3”(示于美国专利号5,834,597的图4中)，其中残基234及237(使用EU编号)经丙氨酸取代。突变体3(还称为“M3”)变体可用于多种同种型(例如IgG2)中。
具有S228P的另一示例性恒定区变体(即，其中丝氨酸残基经脯氨酸取代)可用于IgG4。参见Angal，S.等人，Molecular Immunology[分子免疫学]，30，105-108(1993)及Bloom，J.W.等人Protein Science[蛋白质科学]，6：407-514(1997)。
本披露内容的双特异性结合蛋白可为序列经修饰以改变至少一种恒定区介导的生物效应物功能的蛋白质。例如，在一些实施例中，双特异性结合蛋白可经修饰以相对于未经修饰的结合蛋白降低至少一种恒定区介导的生物效应物功能，例如，与Fc受体(FcγR)的结合降低。FcγR结合可通过使FcγR相互作用所需的特定区处的结合蛋白的免疫球蛋白恒定区区段突变来降低(例如，参见Canfield及Morrison，1991，J.Exp.Med.[实验医学杂志]173：1483-1491；及Lund等人，1991，J.Immunol.[免疫学杂志]147：2657-2662)。降低FcγR结合还可降低其他效应物功能，这些效应物功能依赖于FcγR相互作用，例如调理作用、吞噬作用及抗原依赖性细胞毒性(“ADCC”)。
本披露内容的双特异性结合蛋白可包含包括氨基酸取代的经修饰(或变体)CH2结构域或整个Fc结构域，与相应野生型CH2或Fc区的结合相比，其增加与FcγRIIB的结合和/或降低与FcγRIIIA的结合。本披露内容的结合蛋白可为单体或多聚体(例如，二聚体或四聚体)，每一单体单元包含一个或多个CH2或Fc结构域。变体CH2或变体Fc结构域已阐述于，例如，美国专利申请号2014/0377253中。变体CH2或变体Fc结构域通常包括在位置263、位置266、位置273及位置305处的一个或多个取代，其中Fc结构域中残基的编号是如Kabat中的EU索引的编号。在一些实施例中，相对于野生型CH2结构域，双特异性结合蛋白包含一个或多个选自以下的取代：V263L、V266L、V273C、V273E、V273F、V273L、V273M、V273S、V273Y、V305K及V305W。在具体实施例中，相对于人类IgG1的CH2结构域，CH2结构域的一个或多个取代选自V263L、V273E、V273F、V273M、V273S及V273Y。例如，IgG1 CH2结构域的一个或多个取代可为V273E。在另一具体实施例中，本披露内容的双特异性结合蛋白包括包含氨基酸取代V263L的变体IgG1 CH2结构域。
与相应野生型CH2或Fc区的结合相比可增加与FcγRIIB的结合和/或降低与FcγRIIIA的结合的变体CH2或变体Fc结构域的其他实例包括以下中发现的那些：Vonderheide等人，Clin.Cancer Res.[临床癌症研究]，19(5)，1035-1043(2013)，例如S267E或S267E/L328F。
本披露内容的双特异性结合蛋白可包括通过，例如，在参与FcRn相互作用的特定区突变免疫球蛋白恒定区区段增加或减少其对新生Fc受体FcRn的结合亲和力的修饰(例如，参见WO 2005/123780)。在特定实施例中，IgG类的双特异性结合蛋白经突变，以使重链恒定区的氨基酸残基250、314及428中的至少一者在，例如，位置250及428处、或在位置250及314处、或在位置314及428处、或在位置250、314及428处单独或以其任何组合经取代，其中位置250及428的取代为特定组合。对于位置250，取代氨基酸残基可为除苏氨酸外的任何氨基酸残基，包括但不限于丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸。对于位置314，取代氨基酸残基可为除亮氨酸外的任何氨基酸残基，包括但不限于丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸。对于位置428，取代氨基酸残基可为除甲硫氨酸外的任何氨基酸残基，包括但不限于丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸。已知可修饰Fc效应物功能的示例性取代是Fc取代M428L，其可与Fc取代T250Q组合出现。适宜氨基酸取代的其他特定组合鉴别于美国专利号7,217,797的表1中。这些突变增加与FcRn的结合，其保护双特异性结合蛋白免于降解并延长其半衰期。
连接CH3结构域20a及20b与其各自的可变链24a及24b的多肽连接体22a及22b可经选择以将恒定区融合至scFvY，且可相同或不同，但在大部分实施例中相同。连接Fc区中的CH3结构域与包含单链可变片段的可变区的连接体可经选择以增加本披露内容的双特异性结合蛋白的表达、溶解性、稳定性(例如，如通过较低片段化水平、较低片段化速率、较低聚集水平、较低聚集速率、较高熔融温度和/或较长血浆半衰期所量测)和/或效价。连接Fc区与多肽的其他功能部分的连接体披露于，例如，美国专利申请号2014/0044711中。阐释性连接体为领域内，例如，Shan，J.等人Journal of Immunology[免疫学杂志]1999；162：6589-6595中已知。
在一些实施例中，本披露内容的双特异性结合蛋白包含连接Fc区与可变区的连接体，该连接体具有如下序列，所述序列对应于选自下表中的序列中的一种的序列：
序列(N→C) 标识符
VDGASSPVNSSPSVQDI SEQ ID NO：251
VDGASSPVNGSPSVQDI SEQ ID NO：253
GASSPVNVSSPSV SEQ ID NO：254
GGGGSGGGNGTGSGGGGS SEQ ID NO：255
LSAGGHGGLDNDTSAFHL SEQ ID NO：256
SDKTHTSPPSPAPESSGG SEQ ID NO：257
VTTTDFQIQTEMAATMET SEQ ID NO：258
DFLPTTAQPTKKSTLKKR SEQ ID NO：259
TESRSPPAENEVSTPMQA SEQ ID NO：260
GGGGSGGGNGSGSGGGGS SEQ ID NO：261
GGGGSGGGSGGGSGGGGS SEQ ID NO：262
在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含两种式(I)的多肽：
X-H-Fc-L-scFvY (I)，
其中
X是scFvX或Fab区，其中X特异性结合第一抗原且scFvY特异性结合第二抗原，
H是铰链区，
Fc包含免疫球蛋白的CH2及CH3区，
scFvX及scFvY各自独立地是单链可变片段，且
L是多肽连接体。
在一些实施例中，两种抗原中的一种是免疫调节性蛋白且另一种是肿瘤抗原。在一些实施例中，在X是Fab区时，则第一抗原是肿瘤抗原，且第二抗原是免疫调节性蛋白。在其他实施例中，在X是Fab区时，则第一抗原是免疫调节性蛋白，且第二抗原是肿瘤抗原。在一些实施例中，L具有SEQ ID NO：251及253-262中的任一者的氨基酸序列。
在一些实施例中，X是scFvX。在其他实施例中，X是Fab区。
在一些实施例中，scFvX具有式(V)或(VI)的结构：
VH X-LX-VL X- (V)，
VL X-LX-VH X- (VI)，
其中VH X是可变重链，VL X是可变轻链，且LX是多肽连接体。在一些实施例中，LX具有SEQ ID NO：301-306中的任一者的氨基酸序列。
在一些实施例中，scFvY具有式(VII)或(VIII)的结构：
-VL Y-LY-VH Y (VII)，
-VH Y-LY-VL Y (VIII)，
其中VH Y是可变重链，VL Y是可变轻链，且LY是多肽连接体。在一些实施例中，LY具有SEQ ID NO：301-306中的任一者的氨基酸序列。
在一些实施例中，式(I)的双特异性结合蛋白包含两种式(II)的多肽、两种式(III)的多肽或两种式(IV)的多肽，如下文所述。
在实施例中，本文提供式(II)的多肽：
scFvX-H-Fc-L-scFvY (II)，
其中L是多肽连接体，
H是铰链区，
Fc包含免疫球蛋白的CH2及CH3区，
scFvX及scFvY各自独立地是单链可变片段，
scFvX特异性结合第一抗原，
scFvY特异性结合第二抗原，并且
两种抗原中的一种是免疫调节性蛋白且另一种是肿瘤抗原。
在一些实施例中，L具有SEQ ID NO：251及253-262中的任一者的氨基酸序列。
在一些实施例中，scFvX具有式(V)或(VI)的结构：
VH X-LX-VL X- (V)，
VL X-LX-VH X- (VI)，
其中VH X是可变重链，VL X是可变轻链，且LX是多肽连接体。在一些实施例中，LX具有SEQ ID NO：301-306中的任一者的氨基酸序列。
在一些实施例中，scFvY具有式(VII)或(VIII)的结构：
-VL Y-LY-VH Y (VII)，
-VH Y-LY-VL Y (VIII)，
其中VH Y是可变重链，VL Y是可变轻链，且LY是多肽连接体。在一些实施例中，LY具有SEQ ID NO：301-306中的任一者的氨基酸序列。
在另一方面中，提供式(III)的多肽：
Fab-H-Fc-L-scFvY (III)，
其中
L是多肽连接体，
H是铰链区，
Fc包含免疫球蛋白的CH2及CH3区，
Fab是片段抗原结合区，
scFvY是单链可变片段，
Fab特异性结合第一抗原，且
scFvY特异性结合第二抗原。
在一些实施例中，第一抗原是肿瘤抗原且第二抗原是免疫调节性蛋白。在一些实施例中，第一抗原是免疫调节性蛋白且第二抗原是肿瘤抗原。在一些实施例中，L具有SEQID NO：251及253-262中的任一者的氨基酸序列。
在一些实施例中，scFvY具有式(VII)或(VIII)的结构：
-VL Y-LY-VH Y (VII)，
-VH Y-LY-VL Y (VIII)，
其中VH Y是可变重链，VL Y是可变轻链，且LY是多肽连接体。在一些实施例中，LY具有SEQ ID NO：301-306中的任一者的氨基酸序列。
在另一方面中，提供式(IV)的多肽：
VH-CH1-H-Fc-L-scFvY (IV)，
其中
L是多肽连接体，
VH-CH1在与包含VL-CL的肽组合时特异性结合第一抗原，
CH1是CH1恒定结构域，
CL是轻链恒定区域，
VH是可变重链，
VL是可变轻链，
H是铰链区.
Fc包含免疫球蛋白的CH2及CH3区，
scFvY是单链可变片段，且
scFvY特异性结合第二抗原。
在一些实施例中，第一抗原是肿瘤抗原且第二抗原是免疫调节性蛋白。在一些实施例中，第一抗原是免疫调节性蛋白且第二抗原是肿瘤抗原。在一些实施例中，L具有SEQID NO：251及253-262中的任一者的氨基酸序列。
在一些实施例中，scFvY具有式(VII)或(VIII)的结构：
-VL Y-LY-VH Y (VII)，
-VH Y-LY-VL Y (VIII)，
其中VH Y是可变重链，VL Y是可变轻链，且LY是多肽连接体。在一些实施例中，LY具有SEQ ID NO：301-306中的任一者的氨基酸序列。
本披露内容的双特异性结合蛋白可包含经遗传工程化和/或以其他方式性质上经修饰的单克隆抗体(包括但不限于，嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体等)的片段或部分。在各个实施例中，结合蛋白包含免疫球蛋白的恒定区的全部或一部分。在一些实施例中，恒定区是选自以下的同种型：IgA(例如，IgA1或IgA2)、IgD、IgE、IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)及IgM。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含一种或多种同种型的一个或多个恒定区。在阐释性实例中，双特异性结合蛋白可包含铰链及IgG1的CH2区及IgG4的CH3区。在具体实施例中，本披露内容的双特异性结合蛋白包含IgG1、IgG2或IgG4恒定区。
本披露内容的双特异性结合蛋白可经衍生化。衍生的结合蛋白通常通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/阻断基团衍生化、蛋白水解裂解、连接至细胞配体或其他蛋白质经修饰。可通过已知技术实施多种化学修饰中的任一者，这些技术包括但不限于衣霉素(tunicamycin)的特定化学裂解、乙酰化、甲酰化、代谢合成等。另外，衍生物可含有一种或多种非天然氨基酸。参见，例如，Wolfson，2006，Chem.Biol.[化学生物学]13(10)：1011-2。
本披露内容的双特异性结合蛋白可具有一个或多个插入一个或多个其CDR区中的氨基酸，例如如Jung及Plückthun，1997，Protein Engineering[蛋白质工程]10：9，959-966；Yazaki等人，2004，Protein Eng.Des Sel.[蛋白质工程设计与选择]17(5)：481-9；及美国专利申请号2007/0280931中所述。
在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含图8A-8H中所示的氨基酸序列。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含SEQ ID NO：401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、419、420及421中的任一者的氨基酸序列。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含SEQ ID NO：401的氨基酸序列。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含SEQ ID NO：402的氨基酸序列。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含SEQ ID NO：403的氨基酸序列。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含SEQ ID NO：404的氨基酸序列。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含SEQ ID NO：405的氨基酸序列。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含SEQ ID NO：406的氨基酸序列。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含SEQ ID NO：407的氨基酸序列。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含SEQ ID NO：408的氨基酸序列。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含SEQ ID NO：409的氨基酸序列。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含SEQ ID NO：410的氨基酸序列。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含SEQ ID NO：411的氨基酸序列。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含SEQ ID NO：412的氨基酸序列。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含SEQ ID NO：419的氨基酸序列。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含SEQ ID NO：420的氨基酸序列。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含SEQ ID NO：421的氨基酸序列。
在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含图8I-8M中所示的氨基酸序列。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含SEQ ID NO：431-440中的任一者的氨基酸序列。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含SEQ ID NO：431的氨基酸序列。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含SEQ ID NO：432的氨基酸序列。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含SEQ IDNO：433的氨基酸序列。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含SEQ ID NO：434的氨基酸序列。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含SEQ ID NO：435的氨基酸序列。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含SEQ ID NO：436的氨基酸序列。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含SEQ ID NO：437的氨基酸序列。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含SEQ IDNO：438的氨基酸序列。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含SEQ ID NO：439的氨基酸序列。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含SEQ ID NO：440的氨基酸序列。
在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含图10B-10D中所示的氨基酸序列。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含SEQ ID NO：413-418中的任一者的氨基酸序列。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含SEQ ID NO：413的氨基酸序列。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含SEQ ID NO：414的氨基酸序列。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含SEQID NO：415的氨基酸序列。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含SEQ ID NO：416的氨基酸序列。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含SEQ ID NO：417的氨基酸序列。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含SEQ ID NO：418的氨基酸序列。
在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含图10H-10I中所示的氨基酸序列。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含SEQ ID NO：441-444中的任一者的氨基酸序列。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含SEQ ID NO：441的氨基酸序列。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含SEQ ID NO：442的氨基酸序列。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含SEQID NO：443的氨基酸序列。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含SEQ ID NO：444的氨基酸序列。
在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含图10L中所示的氨基酸序列。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含SEQ ID NO：445的氨基酸序列。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含SEQ ID NO：446的氨基酸序列。
在双特异性结合蛋白包含Fab区及scFv区时，结合蛋白包含两种多肽，例如式(III)的多肽，其各自包含两个氨基酸序列：由二硫桥共价结合至重链(例如式(IV)的多肽)的轻链(例如包含VL-CL的肽)。在一些实施例中，轻链包含κ轻恒定区。在其他实施例中，轻链包含λ轻恒定区。在某些实施例中，轻链包含SEQ ID NO：371或372的氨基酸序列。在一些实施例中，重链序列包含SEQ ID NO：351-370中的任一者的氨基酸序列。
在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含根据SEQ ID NO：371的轻链及根据SEQID NO：351的重链。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含根据SEQ ID NO：371的轻链及根据SEQ ID NO：352的重链。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含根据SEQ ID NO：371的轻链及根据SEQ ID NO：353的重链。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含根据SEQ IDNO：371的轻链及根据SEQ ID NO：354的重链。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含根据SEQ ID NO：371的轻链及根据SEQ ID NO：355的重链。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含根据SEQ ID NO：371的轻链及根据SEQ ID NO：356的重链。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含根据SEQ ID NO：371的轻链及根据SEQ ID NO：357的重链。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含根据SEQ ID NO：371的轻链及根据SEQ ID NO：358的重链。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含根据SEQ ID NO：371的轻链及根据SEQ ID NO：359的重链。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含根据SEQ ID NO：371的轻链及根据SEQ ID NO：360的重链。
在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含根据SEQ ID NO：372的轻链及根据SEQID NO：361的重链。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含根据SEQ ID NO：372的轻链及根据SEQ ID NO：362的重链。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含根据SEQ ID NO：372的轻链及根据SEQ ID NO：363的重链。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含根据SEQ IDNO：372的轻链及根据SEQ ID NO：364的重链。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含根据SEQ ID NO：372的轻链及根据SEQ ID NO：365的重链。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含根据SEQ ID NO：372的轻链及根据SEQ ID NO：366的重链。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含根据SEQ ID NO：372的轻链及根据SEQ ID NO：367的重链。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含根据SEQ ID NO：372的轻链及根据SEQ ID NO：368的重链。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含根据SEQ ID NO：372的轻链及根据SEQ ID NO：369的重链。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含根据SEQ ID NO：372的轻链及根据SEQ ID NO：370的重链。
双特异性结合蛋白可结合至两种不同抗原。在一些实施例中，需要存在两种抗原以实现期望生物反应，例如生物化学信号的调节(例如，增加或减少)。在这些实施例中，生物反应是在选择生物环境(例如肿瘤微环境)中实现，此时存在两种抗原。在一些实施例中，生物化学信号的调节提供选择性生物效应，例如肿瘤微环境中免疫系统的选择性活化。在一些实施例中，生物化学信号的调节可更大地避免全身性毒性。
本文所述双特异性结合蛋白通常特异性结合至人类抗原。与来自其他物种(例如，来自小鼠或猴，例如食蟹猴)的抗原的交叉反应性结合可提供优点，例如在动物模型中针对生物活性进行测试的能力。可使用该动物模型测试以筛选双特异性结合蛋白以相对于生物活性选择诸如有利的药物动力学等性质。在一些实施例中，双特异性结合蛋白结合至食蟹猴抗原。在一些实施例中，双特异性结合蛋白结合至小鼠抗原。
在一些实施例中，双特异性结合蛋白在活体外分析中与参照抗体竞争结合。参照抗体可结合第一抗原或第二抗原。在一些实施例中，参照抗体是本文所述抗体中的任一者。在一些实施例中，参照抗体是本文所述抗体的人源化或人类型式。
针对竞争的分析包括但不限于放射性材料标记的免疫分析(RIA)、酶联免疫吸附分析(ELISA)、夹心式ELISA、荧光活化细胞分选(FACS)分析及表面等离子共振分析。
在参照抗体与测试结合蛋白(与物种或同种型无关)之间执行抗体竞争分析中，可首先用可检测标记(例如荧光团、生物素或酶(或甚至放射性)标记)标记参照物以使得能够随后鉴别。在此情形中，将表达所关注抗原(即，第一抗原或第二抗原)的细胞与未经标记的测试结合蛋白一起孵育，添加经标记的参照抗体，并量测结合标记的强度。若测试结合蛋白通过结合至重叠表位与经标记的参照抗体竞争，则相对于无测试结合蛋白实施的对照反应，强度将减小。
在此分析的具体实施例，首先测定在分析条件(例如，指定细胞密度)下产生最大结合的80％的经标记的参照抗体的浓度(“conc80％”)，且竞争分析是利用10×conc80％的未经标记的测试结合蛋白及conc80％的经标记的参照抗体实施。
本文所述竞争分析中的结合抑制可表示为抑制常数或Ki，其是根据下式计算：
Ki＝IC50/(1+[参照抗体浓度]/Kd)，
其中IC50是引起参照抗体的结合减少50％的测试结合蛋白的浓度，且Kd是参照抗体的解离常数，即其对所关注抗原的亲和力的量度。与本文披露的结合蛋白竞争的抗体在本文所述分析条件下可具有10pM至1000nM的Ki。
在各个实施例中，若在所用特定分析条件下是最大结合的80％的参照抗体浓度及比参照抗体浓度高10倍的测试结合蛋白浓度下，测试结合蛋白将参照抗体的结合减少至少约20％或更多、例如至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或甚至更多、或介于上述值中的任一者之间的范围内的百分比，则认为其与参照抗体竞争。
用于评价测试结合蛋白是否与如本文所述的参照抗体竞争结合所关注抗原的特定分析及分析条件提供于实例3中。以类似于部分8.3.3.3中针对测定4-1BB配体竞争所述的方法的方式测定抗体竞争。
如上文所论述，本披露内容的双特异性结合蛋白可结合至两种不同抗原，并在一者存在下条件性活化另一者。在一个实施例中，双特异性结合蛋白结合至免疫调节性蛋白(例如以活化免疫受体)及肿瘤抗原。在一个特定实施例中，双特异性结合蛋白在结合至肿瘤抗原间皮素时激动CD40，且在不存在间皮素下展现降低的CD40激动活性。在另一特定实施例中，双特异性结合蛋白在结合至肿瘤抗原间皮素时激动4-1BB，且在不存在间皮素下展现降低的4-1BB激动活性。在另一特定实施例中，双特异性结合蛋白在结合至肿瘤抗原B7-H4时激动4-1BB，且在不存在B7-H4下展现降低的4-1BB激动活性。在这些情形下，双特异性结合蛋白在肿瘤微环境中提供免疫反应的靶特异性条件活化。例如，本文所述双特异性蛋白可用于起始针对肿瘤细胞的免疫反应的靶特异性条件活化以治疗经诊断患有实体瘤的受试者。
用以测定条件活化的分析为本领域已知。在利用结合至免疫调节性蛋白及肿瘤抗原的双特异性蛋白的阐释性实例中，可通过比较具有及无肿瘤抗原的免疫调节性蛋白活性测定条件活化。在这些条件下，通过，例如，在肿瘤抗原存在下与其不存在相比的活化增加测定条件活化。在一些实施例中，在肿瘤抗原存在下与其不存在相比，免疫调节性蛋白活性增加至少约5倍、例如6、7、8、9、10、12、15、18、20、25、30、40、50、70、80、100、200、400、500、700、800或1000倍或更大活性。在一些实施例中，在肿瘤抗原存在下与其不存在相比，免疫调节性蛋白活性增加小于约10000倍、例如5000、2000、1000、800、600、500、300、200或100倍或更低活性。在某些实施例中，分析是部分8.1.2中所述的分析。在其他实施例中，分析是部分8.3.3中所述的分析。
7.3.2.免疫调节性结合蛋白
在一些实施例中，本披露内容的双特异性结合蛋白(例如式(I)的双特异性结合蛋白)选择性结合至选自肿瘤坏死因子受体(TNFR)及CD28家族蛋白的免疫调节性蛋白。TNFR超家族蛋白包括但不限于CD27(S152、Tp55、TNFR超家族成员7)、CD30、CD40(p50、Bp50)、CD95、HVEM(CD270、TNFSF14、TR2、ATAR)、4-1BB(CD137、ILA、TNFR超家族成员9)、TRAILR1(CD120a、DR4、Apo2、CD261、TNFR超家族成员10a)、TRAILR2(DR5、KILLER、TRICK2A、TRICKB、CD262、TNFR超家族成员10b)、TNFR2(CD120b)及TACI(CD267)。CD28受体家族成员包括但不限于CD28、ICOS、PD-1及CTLA-4。在一个特定实施例中，免疫调节性蛋白是CD40。在另一具体实施例中，免疫调节性蛋白是4-1BB。
在阐释性实施例中，在免疫调节性蛋白是CD40且X是scFvX时，式(I)的双特异性结合蛋白包含结合CD40的scFvX及结合肿瘤抗原的scFvY。在某些实施例中，在免疫调节性蛋白是CD40且X是scFvX时，式(I)的双特异性结合蛋白包含结合肿瘤抗原的scFvX及结合CD40的scFvY。在某些实施例中，在免疫调节性蛋白是4-1BB且X是scFvX时，式(I)的双特异性结合蛋白包含结合4-1BB的scFvX及结合肿瘤抗原的scFvY。在某些实施例中，在免疫调节性蛋白是4-1BB且X是scFvX时，式(I)的双特异性结合蛋白包含结合肿瘤抗原的scFvX及结合4-1BB的scFvY。在某些实施例中，在免疫调节性蛋白是CD40且X是Fab时，式(I)的双特异性结合蛋白包含结合肿瘤抗原的Fab及结合CD40的scFvY。
在阐释性实施例中，在免疫调节性蛋白是CD40时，式(II)的多肽包含结合CD40的scFvX及结合肿瘤抗原的scFvY。在某些实施例中，在免疫调节性蛋白是CD40时，式(II)的多肽包含结合肿瘤抗原的scFvX及结合CD40的scFvY。在某些实施例中，在免疫调节性蛋白是4-1BB时，式(II)的多肽包含结合4-1BB的scFvX及结合肿瘤抗原的scFvY。在某些实施例中，在免疫调节性蛋白是4-1BB时，式(II)的多肽包含结合肿瘤抗原的scFvX及结合4-1BB的scFvY。
在阐释性实施例中，在免疫调节性蛋白是CD40时，式(III)的多肽包含结合肿瘤抗原的Fab及结合CD40的scFvY。在某些实施例中，在免疫调节性蛋白是4-1BB时，式(III)的多肽包含结合肿瘤抗原的Fab及结合4-1BB的scFvY。在某些实施例中，在免疫调节性蛋白是4-1BB时，式(III)的多肽包含结合4-1BB的Fab及结合肿瘤抗原的scFvY。
在阐释性实施例中，在免疫调节性蛋白是CD40时，式(IV)的多肽包含VH-CH1(在与包含VL-CL的肽组合时结合肿瘤抗原)及结合CD40的scFvY。在某些实施例中，在免疫调节性蛋白是4-1BB时，式(IV)的多肽包含VH-CH1(在与包含VL-CL的肽组合时结合肿瘤抗原)及结合4-1BB的scFvY。在某些实施例中，在免疫调节性蛋白是4-1BB时，式(IV)的多肽包含VH-CH1(在与包含VL-CL的肽组合时结合4-1BB)及结合肿瘤抗原的scFvY。
对于一些用途而言，期望具有对免疫调节性蛋白具有亲和力的双特异性结合蛋白。对于某些用途(例如治疗用途)而言，期望至少约3000nM的亲和力(例如KD)。对于期望特定亲和力的应用而言，双特异性结合蛋白以至少约3000nM或甚至更高，例如至少约2000nM、1000nM、900nM、800nM、700nM、600nM、500nM、400nM、300nM、250nM、200nM、150nM、100nM、90nM、80nM、70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、15nM、10nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM或更大的亲和力特异性结合免疫调节性蛋白。在一些实施例中，针对免疫调节性蛋白的KD是在由上述值中的任两者界定的范围内，例如约1至约5000nM，例如10至3000、50至3000、100至2000、1至1000、20至2000、30至3000、或约100至3000nM。
在一些实施例中，双特异性结合蛋白在活体外分析中与参照抗体竞争结合表达CD40的细胞上的人CD40(SEQ ID NO：271)。参照抗体可为本文所述或本领域已知抗CD40抗体中的任一者。在一些实施例中，参照抗体是表1-4中提供的抗体。在具体实施例中，参照抗体是选自抗体AD163.9.3(“muAb1”)；抗体AD166.4.4(“muAb2”)；抗体AD175.14.11(“muAb3”)；抗体AD163.10.7(“muAb4”)；抗体AD165.1.2(“muAb5”)；抗体AD163.162.1(“muAb6”)；抗体AD163.27.12(“muAb7”)；抗体AD163.7.2(“muAb8”)；抗体AD164.14.6(“muAb9”)；及抗体AD164.76.2(“muAb10”)。在一些实施例中，参照抗体是表1-4中提供的抗体的人源化型式。在一些实施例中，参照抗体是muAb1、muAb1、muAb2、muAb3、muAb4、muAb5、muAb6、muAb7、muAb8、muAb9或muAb10的人源化型式。在具体实施例中，参照抗体是具有根据SEQ ID NO：310或311的重链及根据SEQ ID NO：320轻链的huAb9-5。在另一具体实施例中，参照抗体是具有根据SEQ ID NO：312或313的重链及根据SEQ ID NO：320的轻链的huAb9-5V273E。在另一具体实施例中，参照抗体是具有根据SEQ ID NO：314或315的重链及根据SEQID NO：320的轻链的huAb9-5V273Y。在另一具体实施例中，参照抗体是具有根据SEQ ID NO：312或313的重链及根据SEQ ID NO：321的轻链的huAb9 A2I。在另一具体实施例中，参照抗体是具有根据SEQ ID NO：312或313的重链及根据SEQ ID NO：322的轻链的huAb9 A2V。
在一些实施例中，本披露内容的双特异性结合蛋白包括包含选自以下序列的VH序列的免疫调节性蛋白结合区(CDR序列以粗体表示)：
且相应VL序列的氨基酸序列是选自以下序列(CDR序列以粗体表示)：
在一些实施例中，本披露内容的双特异性结合蛋白(例如式(I)的蛋白质)适于施用于人类。在具体实施例中，双特异性结合蛋白包含人源化免疫调节性蛋白结合结构域。在另一具体实施例中，双特异性结合蛋白包括包含选自以下序列的VH序列的免疫调节性蛋白结合区(CDR序列以粗体表示)：
且相应VL的氨基酸序列是选自以下序列(CDR序列以粗体表示)：
在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有含有以下CDR的氨基酸序列的CD40结合结构域：
在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：10的VH及根据SEQID NO：41的VL的CD40结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQID NO：11的VH及根据SEQ ID NO：41的VL的CD40结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：12的VH及根据SEQ ID NO：41的VL的CD40结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：13的VH及根据SEQ ID NO：42的VL的CD40结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：14的VH及根据SEQ ID NO：42的VL的CD40结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：15的VH及根据SEQ ID NO：42的VL的CD40结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：16的VH及根据SEQ ID NO：43的VL的CD40结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：17的VH及根据SEQ IDNO：43的VL的CD40结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ IDNO：18的VH及根据SEQ ID NO：43的VL的CD40结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：16的VH及根据SEQ ID NO：44的VL的CD40结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：17的VH及根据SEQ ID NO：44的VL的CD40结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：17的VH及根据SEQ ID NO：49的VL的CD40结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：17的VH及根据SEQ ID NO：50的VL的CD40结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：17的VH及根据SEQ ID NO：51的VL的CD40结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：18的VH及根据SEQ IDNO：44的VL的CD40结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ IDNO：22的VH及根据SEQ ID NO：48的VL的CD40结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：22的VH及根据SEQ ID NO：49的VL的CD40结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：23的VH及根据SEQ ID NO：48的VL的CD40结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：23的VH及根据SEQ ID NO：49的VL的CD40结合结构域。
在一些实施例中，双特异性结合蛋白在活体外分析中与参照抗体竞争结合表达4-1BB的细胞上的人类4-1BB(SEQ ID NO：273)。参照抗体可为本文所述或本领域已知的抗4-1BB抗体中的任一者。在具体实施例中，参照抗体是选自抗体TABBY101(“TABBY101”)、抗体TABBY102(“TABBY102”)、抗体TABBY103(“TABBY103”)、抗体TABBY104(“TABBY104”)、抗体TABBY105(“TABBY105”)、抗体TABBY106(“TABBY106”)、抗体TABBY107(“TABBY107”)、抗体TABBY108(“TABBY108”)、抗体TABBY1.1(“TABBY1.1”)、抗体TABBY3(“TABBY3”)、抗体TABBY5(“TABBY5”)、抗体TABBY6(“TABBY6”)、抗体TABBY9(“TABBY9”)及抗体TABBY10(“TABBY10”)。在一个实施例中，参照抗体是TABBY106。在另一实施例中，参照抗体是TABBY107。在一些实施例中，参照抗体是TABBY106、TABBY107或TABBY108的人源化型式。在具体实施例中，参照抗体是具有根据SEQ ID NO：330或331的重链及根据SEQ ID NO：334的轻链的hu106-1-hIgG1。在另一具体实施例中，参照抗体是具有根据SEQ ID NO：332或333的重链及根据SEQID NO：335的轻链的hu107-1-hIgG1。
在一些实施例中，本披露内容的双特异性结合蛋白包括包含选自以下序列的VH序列的免疫调节性结合区(CDR序列以粗体表示)：
且相应VL序列的氨基酸序列是选自以下序列(CDR序列以粗体表示)：
在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEO ID NO：61的VH及根据SEQID NO：81的VL的4-1BB结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQID NO：62的VH及根据SEQ ID NO：82的VL的4-1BB结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：63的VH及根据SEQ ID NO：83的VL的4-1BB结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：64的VH及根据SEQ ID NO：84的VL的4-1BB结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：65的VH及根据SEQ ID NO：85的VL的4-1BB结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：66的VH及根据SEQ ID NO：86的VL的4-1BB结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：67的VH及根据SEQ ID NO：87的VL的4-1BB结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：68的VH及根据SEQID NO：88的VL的4-1BB结合结构域。
在一些实施例中，本披露内容的双特异性结合蛋白包括包含选自以下序列的VH序列的免疫调节性结合区(CDR序列以粗体表示)：
且相应VL序列的氨基酸序列是选自以下序列(CDR序列以粗体表示)：
在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：73的VH及根据SEQID NO：96的VL的4-1BB结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQID NO：74的VH及根据SEQ ID NO：97的VL的4-1BB结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：75的VH及根据SEQ ID NO：98的VL的4-1BB结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：76的VH及根据SEQ ID NO：99的VL的4-1BB结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：77的VH及根据SEQ ID NO：100的VL的4-1BB结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：78的VH及根据SEQ ID NO：101的VL的4-1BB结合结构域。
在一些实施例中，本披露内容的双特异性结合蛋白(例如式(I)的蛋白质)适于施用于人类。在具体实施例中，双特异性结合蛋白包含人源化免疫调节性蛋白结合结构域。在某些实施例中，本披露内容的双特异性结合蛋白包括包含选自以下序列的VH序列的免疫调节性结合区(CDR序列以粗体表示)：
且相应VL序列的氨基酸序列是选自以下序列(CDR序列以粗体表示)：
在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有含有以下CDR的氨基酸序列的4-1BB结合结构域：
在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：69-72中的任一者的VH及根据SEQ ID NO：89-95中的任一者的VL的4-1BB结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：69的VH及根据SEQ ID NO：89的VL的4-1BB结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：69的VH及根据SEQ ID NO：90的VL的4-1BB结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：70的VH及根据SEQ ID NO：90的VL的4-1BB结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：69的VH及根据SEQ ID NO：91的VL的4-1BB结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：69的VH及根据SEQ ID NO：92的VL的4-1BB结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：69的VH及根据SEQID NO：93的VL的4-1BB结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQID NO：70的VH及根据SEQ ID NO：89的VL的4-1BB结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：70的VH及根据SEQ ID NO：91的VL的4-1BB结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：70的VH及根据SEQ ID NO：92的VL的4-1BB结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：70的VH及根据SEQ ID NO：93的VL的4-1BB结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：71的VH及根据SEQ ID NO：94的VL的4-1BB结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：71的VH及根据SEQ ID NO：95的VL的4-1BB结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：72的VH及根据SEQID NO：94的VL的4-1BB结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQID NO：72的VH及根据SEQ ID NO：95的VL的4-1BB结合结构域。
本文部分7.3.2中所述的免疫调节性结合区中的VH或VL序列的某些突变将由普通技术人员理解为提供在本披露内容范畴内的双特异性结合蛋白。突变可包括自如本文披露的VH或VL序列的氨基酸取代、添加或缺失，同时对于免疫调节性蛋白保留显著活性。因此，在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含与部分7.3.2中所示的VH序列中的任一者具有至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VH序列。双特异性结合蛋白可包含与部分7.3.2中所示的VH序列中的任一者相比具有高达8个、高达7个、高达6个、高达5个、高达4个、高达3个、或高达2个突变的VH序列。在一些实施例中，双特异性结合蛋白可包含与部分7.3.2中所示的VH序列中的任一者相比具有5个或更少、4个或更少、3个或更少、或2个或更少突变的VH序列。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含与部分7.3.2中所示的VL序列中的任一者相比具有至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的VL序列。双特异性结合蛋白可包含与部分7.3.2中所示的VL序列中的任一者相比具有高达8个、高达7个、高达6个、高达5个、高达4个、高达3个、或高达2个突变的VL序列。在一些实施例中，双特异性结合蛋白可包含与部分7.3.2中所示的VL序列中的任一者相比具有5个或更少、4个或更少、3个或更少、或2个或更少突变的VL序列。
7.3.3.肿瘤抗原结合蛋白
在另一方面中，本披露内容的双特异性结合蛋白选择性结合至肿瘤抗原。细胞表面肿瘤抗原是在实体瘤(包括本文所述实体瘤中的任一者)的细胞膜上表达。适当肿瘤抗原包括CSF1R、Ly86、MS4A7、CD74、CCR5、COL7A1、LOX、LRRC15、SERPINE1、TGFBR1、VEGF-A、VEGFR、ANGPTL4、EGLN、IFI6、KISS1R、PDK1、CADM1、COL6A3、KRT33A、LUM、WNT5A、MMP14、CDCP1、PDGFRA、ADGRE1、MHC-类别II、HLA-DR、TCRαβ、TCRγδ、PD-1、PD-L1、CTLA-4、MUC1、MUC16、CA15-3、CA19-9、CA-195、CA-549、细胞自溶酶-D、CEACAM5、CEACAM6、ERBB2、EGFR、ENO2、ALPP、PLP1、DLL3、SLC34A2、PTK7、B7-H3、LIV-1、STEAP1、TACSTD2、GPNMB、5T4、CD142、TIM1、CDH3、LGR5、LYPD3、TGDF1、B7-H4、间皮素、柄蛋白-4及PSMA。在具体实施例中，肿瘤抗原是选自间皮素、B7-H4、柄蛋白-4、PSMA、PD-L1、EGFR及VEGFR。在某些实施例中，肿瘤抗原是选自间皮素、B7-H4、柄蛋白-4、PSMA及EGFR。
对于一些用途而言，期望具有对肿瘤抗原具有高亲和力的双特异性结合蛋白。对于某些用途(例如治疗用途)而言，期望至少约100nM的亲和力(例如KD)。对于需要特异亲和力的应用，双特异性结合蛋白以至少约100nM或甚至更高(例如至少约90nM、80nM、70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、15nM、10nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.1nM、0.01nM或更大)的亲和力特异性结合肿瘤抗体。在一些实施例中，针对肿瘤抗原的KD是在由上述值中的任两者界定的范围内，例如约0.1至约100nM、例如1至100、0.1至50、2至90、或约0.1至80nM。
在具体实施例中，本披露内容的双特异性结合蛋白对CD40具有亲和力且激动CD40，且对间皮素具有高亲和力。在另一具体实施例中，本披露内容的双特异性结合蛋白对CD40具有亲和力且激动CD40，且对前列腺特异性膜抗原(PSMA)具有高亲和力。在又一具体实施例中，本披露内容的双特异性结合蛋白对CD40具有亲和力且激动CD40，且对表皮生长因子受体(EGFR)具有高亲和力。在额外具体实施例中，本披露内容的双特异性结合蛋白对CD40具有亲和力且激动CD40且对柄蛋白-4具有高亲和力。在另一实施例中，本文披露的双特异性结合蛋白对4-1BB具有亲和力且激动4-1BB，且对间皮素具有高亲和力。在另一实施例中，本文披露的双特异性结合蛋白对4-1BB具有亲和力且激动4-1BB，且对B7-H4具有高亲和力。在另一实施例中，本文披露的双特异性结合蛋白对4-1BB具有亲和力且激动4-1BB，且对PSMA具有高亲和力。
结合免疫调节性蛋白及肿瘤抗原的结合蛋白的亲和力可使用领域内熟知或本文所述的技术(例如像ELISA、等温滴定量热法(ITC)、表面等离子共振或荧光偏振分析)来测定。
在具体实施例中，本披露内容的双特异性结合蛋白结合至CD40及间皮素。在另一具体实施例中，本披露内容的双特异性结合蛋白结合至CD40及前列腺特异性膜抗原(PSMA)。在又一具体实施例中，本披露内容的双特异性结合蛋白结合至CD40及表皮生长因子受体(EGFR)。在额外具体实施例中，本披露内容的双特异性结合蛋白结合至CD40及柄蛋白-4。在另一具体实施例中，双特异性结合蛋白结合至4-1BB及间皮素。在另一具体实施例中，双特异性结合蛋白结合至4-1BB及B7-H4。在又一具体实施例中，双特异性结合蛋白结合至4-1BB及PSMA。
在阐释性实施例中，在免疫调节性蛋白是CD40且X是scFvX时，式(I)的双特异性结合蛋白包含结合CD40的scFvX及结合间皮素的scFvY。在某些实施例中，在免疫调节性蛋白是CD40且X是scFvX时，式(I)的双特异性结合蛋白包含结合间皮素的scFvX及结合CD40的scFvY。在某些实施例中，在免疫调节性蛋白是CD40且X是Fab时，式(I)的双特异性结合蛋白包含结合间皮素的Fab及结合CD40的scFvY。
在阐释性实施例中，在免疫调节性蛋白是CD40时，式(II)的多肽包含结合CD40的scFvX及结合间皮素的scFvY。在某些实施例中，在免疫调节性蛋白是CD40时，式(II)的多肽包含结合间皮素的scFvX及结合CD40的scFvY。
在阐释性实施例中，在免疫调节性蛋白是CD40时，式(III)的多肽包含结合间皮素的Fab及结合CD40的scFvY。
在阐释性实施例中，在免疫调节性蛋白是CD40时，式(IV)的多肽包含VH-CH1(在与包含VL-CL的肽组合时结合间皮素)及结合CD40的scFvY。
在一些实施例中，双特异性结合蛋白在活体外分析中与参照抗体竞争结合表达间皮素的细胞上的人类间皮素。参照抗体可为本文所述或本领域已知的抗间皮素抗体中的任一者。在一些实施例中，参照抗体是表2-1中提供的抗体。在具体实施例中，参照抗体是选自抗体HuAb17(“HuAb17”)；抗体HuAM1(“HuAM1”)；抗体HuAM2(“HuAM2”)；抗体HuAM3(“HuAM3”)；抗体HuAM4(“HuAM4”)；抗体HuAM5(“HuAM5”)；抗体HuAM6(“HuAM6”)；抗体HuAM7(“HuAM7”)；抗体HuAM8(“HuAM8”)；抗体HuAM9(“HuAM9”)；抗体HuAM11(“HuAM11”)；抗体HuAM12(“HuAM12”)；抗体HuAM13(“HuAM13”)；抗体HuAM14(“HuAM14”)；抗体HuAM15(“HuAM15”)；抗体HuAM17(“HuAM17”)；抗体HuAM18(“HuAM18”)；抗体HuAM19(“HuAM19”)；及抗体HuAM21(“HuAM21”)。在具体实施例中，参照抗体是HuAM15。
在一些实施例中，本披露内容的双特异性结合蛋白(例如式(I)的蛋白质)适于施用于人类。在具体实施例中，双特异性结合蛋白包含人类肿瘤抗原结合结构域。在另一具体实施例中，双特异性结合蛋白包括包含选自以下序列的VH序列的肿瘤抗原结合区(CDR序列以粗体表示)：
且相应VL序列的氨基酸序列是选自以下序列(CDR序列以粗体表示)：
在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有含有以下CDR的氨基酸序列的间皮素结合结构域：
在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：107的VH及根据SEQID NO：136的VL的间皮素结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：108的VH及根据SEQ ID NO：137的VL的间皮素结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：109的VH及根据SEQ ID NO：137的VL的间皮素结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：110的VH及根据SEQ IDNO：137的VL的间皮素结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQID NO：111的VH及根据SEQ ID NO：137的VL的间皮素结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：112的VH及根据SEQ ID NO：137的VL的间皮素结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：113的VH及根据SEQ IDNO：137的VL的间皮素结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQID NO：114的VH及根据SEQ ID NO：137的VL的间皮素结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：115的VH及根据SEQ ID NO：138的VL的间皮素结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：116的VH及根据SEQ IDNO：137的VL的间皮素结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQID NO：117的VH及根据SEQ ID NO：139的VL的间皮素结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：118的VH及根据SEQ ID NO：137的VL的间皮素结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：119的VH及根据SEQ IDNO：139的VL的间皮素结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQID NO：117的VH及根据SEQ ID NO：137的VL的间皮素结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：120的VH及根据SEQ ID NO：137的VL的间皮素结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：119的VH及根据SEQ IDNO：137的VL的间皮素结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQID NO：120的VH及根据SEQ ID NO：141的VL的间皮素结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：121的VH及根据SEQ ID NO：137的VL的间皮素结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：122的VH及根据SEQ IDNO：137的VL的间皮素结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQID NO：123的VH及根据SEQ ID NO：140的VL的间皮素结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：124的VH及根据SEQ ID NO：137的VL的间皮素结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：129的VH及根据SEQ IDNO：143的VL的间皮素结合结构域。
在一些实施例中，双特异性结合蛋白在活体外分析中与参照抗体竞争结合表达柄蛋白-4的细胞上的人类柄蛋白-4。参照抗体可为本文所述或本领域已知的抗柄蛋白-4抗体中的任一者。
在一些实施例中，本披露内容的双特异性结合蛋白包含柄蛋白-4结合区，其包含以下的VH序列(CDR序列以粗体表示)：
及以下的VL序列(CDR序列以粗体表示)：
在一些实施例中，双特异性结合蛋白在活体外分析中与参照抗体竞争结合表达表皮生长因子受体(EGFR)的细胞上的人类表皮生长因子受体。参照抗体可为本文所述或本领域已知的抗EGFR抗体中的任一者。
在一些实施例中，本披露内容的双特异性结合蛋白包含EGFR结合区，其包以下的VH序列(CDR序列以粗体表示)：
及以下的VL序列(CDR序列以粗体表示)：
在一些实施例中，双特异性结合蛋白在活体外分析中与参照抗体竞争结合表达前列腺特异性膜抗原(PSMA)的细胞上的人类前列腺特异性膜抗原。参照抗体可为本文所述或本领域已知的抗PSMA抗体中的任一者。在一些实施例中，参照抗体是如本文所述的抗PSMA抗体的人源化型式，例如，具有图10A、10J及10K中所示的VH及VL序列的抗体。
在一些实施例中，本披露内容的双特异性结合蛋白包括包含选自以下序列的VH序列的PSMA结合区(CDR序列以粗体表示)：
且相应VL序列的氨基酸序列是选自以下序列(CDR序列以粗体表示)：
在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：191的VH及根据SEQID NO：201的VL的PSMA结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQID NO：192的VH及根据SEQ ID NO：202的VL的PSMA结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：193的VH及根据SEQ ID NO：203的VL的PSMA结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：194的VH及根据SEQ ID NO：204的VL的PSMA结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：195的VH及根据SEQ ID NO：205的VL的PSMA结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：196的VH及根据SEQ ID NO：206的VL的PSMA结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：197的VH及根据SEQ ID NO：207的VL的PSMA结合结构域。
在一些实施例中，双特异性结合蛋白在活体外分析中与参照抗体竞争结合表达B7-H4的细胞上的B7-H4。参照抗体可为本文所述或本领域已知的抗B7-H4抗体中的任一者。在一些实施例中，参照抗体是如本文所述的抗B7-H4抗体的人源化型式，例如，具有图10E-10G中所示的VH及VL序列的抗体。
在一些实施例中，本披露内容的双特异性结合蛋白包括包含选自以下序列的VH序列的B7-H4结合区(CDR序列以粗体表示)：
且相应VL序列的氨基酸序列是选自以下序列(CDR序列以粗体表示)：
在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：211的VH及根据SEQID NO：221的VL的B7-H4结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQID NO：212的VH及根据SEQ ID NO：222的VL的B7-H4结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：216的VH及根据SEQ ID NO：225的VL的B7-H4结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：218的VH及根据SEQ ID NO：228的VL的B7-H4结合结构域。
在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：213、214、215、217或219的VH及根据SEQ ID NO：223、224、226、227、229、或230的VL的B7-H4结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：213的VH及根据SEQ ID NO：223的VL的B7-H4结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：214的VH及根据SEQ ID NO：224的VL的B7-H4结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：215的VH及根据SEQ ID NO：223的VL的B7-H4结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：217的VH及根据SEQ ID NO：226的VL的B7-H4结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：217的VH及根据SEQ ID NO：227的VL的B7-H4结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：219的VH及根据SEQ ID NO：229的VL的B7-H4结合结构域。在一些实施例中，双特异性结合蛋白具有包含根据SEQ ID NO：219的VH及根据SEQ ID NO：230的VL的B7-H4结合结构域。
本文部分7.3.3中所述的肿瘤抗原结合区中的VH或VL序列的某些突变将由普通技术人员理解为提供在本披露内容范畴内的双特异性结合蛋白。突变可包括自如本文披露的VH或VL序列的氨基酸取代、添加或缺失，同时对于肿瘤抗原保留显著活性。因此，在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含与部分7.3.3中所示的VH序列中的任一者具有至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VH序列。双特异性结合蛋白可包含与部分7.3.3中所示的VH序列中的任一者相比具有高达8个、高达7个、高达6个、高达5个、高达4个、高达3个、或高达2个突变的VH序列。在一些实施例中，双特异性结合蛋白可包含与部分7.3.3中所示的VH序列中的任一者相比具有5个或更少、4个或更少、3个或更少、或2个或更少突变的VH序列。在一些实施例中，双特异性结合蛋白包含与部分7.3.3中所示的VL序列中的任一者相比具有至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的VL序列。双特异性结合蛋白可包含与部分7.3.3中所示的VL序列中的任一者相比具有高达8个、高达7个、高达6个、高达5个、高达4个、高达3个、或高达2个突变的VL序列。在一些实施例中，双特异性结合蛋白可包含与部分7.3.3中所示的VL序列中的任一者相比具有5个或更少、4个或更少、3个或更少、或2个或更少突变的VL序列。
双特异性结合蛋白的额外翻译后修饰可包括糖基化。常见二分枝复合物可由具有两个N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、三个甘露糖及两个GlcNAc残基(其β-1，2连接至α-6甘露糖及α-3甘露糖以形成两个天线)的核结构组成。一个或多个岩藻糖(Fuc)、半乳糖(Gal)、高甘露糖聚糖Man-5或Man-9、等分GlcNAc及唾液酸(包括N-乙酰基神经氨酸(NANA)或N-羟乙酰基神经氨酸(NGNA)残基)可附接至核。N-连接糖型可包括G0(具有核心二分枝糖基化结构的蛋白质)、G0F(岩藻糖基化G0)、G0F GlcNAc、G1(具有含有一个半乳糖残基的核心糖基化结构的蛋白质)、G1F(岩藻糖基化G1)、G2(具有含有两个半乳糖残基的核心糖基化结构的蛋白质)和/或G2F(岩藻糖基化G2)。
7.4.核酸及表达系统
本披露涵盖编码双特异性结合蛋白、其多肽片段或组分的免疫球蛋白轻链及重链基因的核酸分子、包含这些核酸的载体及能够产生本披露的双特异性结合蛋白的宿主细胞。
本披露内容的双特异性结合蛋白可通过在宿主细胞中重组表达免疫球蛋白轻链及重链基因来制备。为了重组表达结合蛋白，用一个或多个携带编码结合蛋白的免疫球蛋白轻链和/或重链的DNA片段的重组表达载体转染宿主细胞，使得在宿主细胞中表达轻链和/或重链并任选地分泌至培养宿主细胞的培养基中，可自该培养基回收结合蛋白。使用标准重组DNA方法来获得结合蛋白重链和/或轻链基因，将这些基因纳入重组表达载体中并将这些载体引入宿主细胞中，例如阐述于以下文献中者的那些：Molecular Cloning；ALaboratory Manual[分子克隆：实验室手册]，第2版(Sambrook、Fritsch及Maniatis(编辑)，冷泉港实验室(Cold Spring Harbor)，纽约，1989)、Current Protocols inMolecular Biology[当前分子生物学方案](Ausubel，F.M.等人编辑，格林出版联合公司(Greene Publishing Associates)，1989)及美国专利号4,816,397。
为了生成编码这些双特异性结合蛋白的核酸，首先获得编码轻链及重链可变区的DNA片段。这些DNA可通过使用，例如，聚合酶链反应(PCR)扩增及修饰编码轻链及重链可变序列的种系DNA或cDNA来获得。人类重链及轻链可变区基因的种系DNA序列为本领域已知(例如，参见“VBASE”人类种系序列数据库；还参见Kabat，E.A.等人，1991，Sequences ofProteins of Immunological Interest[免疫学感兴趣的蛋白质的序列]，第5版，美国卫生及公共服务部(U.S.Department of Health and Human Services)，NIH出版号91-3242；Tomlinson等人，1992，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]22T：116-198；及Cox等人，1994，Eur.J.Immunol.[欧洲免疫学杂志]24：827-836；每一者的内容均以引用方式并入本文中)。
在获得编码双特异性结合蛋白相关的VH及VL区段的DNA片段后，可进一步通过标准重组DNA技术处理这些DNA片段以，例如，将可变区基因转化成全长结合蛋白链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些处理中，编码VL或VH的DNA片段可操作连接至编码另一蛋白质(例如结合蛋白恒定区或挠性连接体)的另一DNA片段。如此背景中所用的术语“可操作连接”意指连结两个DNA片段，从而由两个DNA片段编码的氨基酸序列保留于框内。
可通过将编码VH的DNA可操作连接至编码重链恒定区(CH1、CH2、CH3及任选地CH4)的另一DNA分子来将编码VH区的分离DNA转化成全长重链基因。人类重链恒定区基因的序列为领域内所已知(例如参见Kabat，E.A.等人，1991，Sequences of Proteins ofImmunological Interest[免疫学感兴趣的蛋白质的序列]，第5版，美国卫生及公共服务部，NIH出版号91-3242)，且涵盖这些区的DNA片段可通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但在某些实施例中是IgG1、IgG2或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因，可将编码VH的DNA可操作连接至仅编码重链CH1恒定区的另一DNA分子。
可通过将编码VL的DNA可操作连接至编码轻链恒定区CL的另一DNA分子来将编码VL区的分离DNA转化成全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人类轻链恒定区基因的序列为本领域已知(例如参见Kabat，E.A.等人，1991，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest[免疫学感兴趣的蛋白质的序列]，第5版，美国卫生及公共服务部，NIH出版号91-3242)，且涵盖这些区的DNA片段可通过标准PCR扩增获得。轻链恒定区可为κ或λ恒定区，但在某些实施例中是κ恒定区。为产生scFv基因，将编码VH及VL的DNA片段可操作连接至另一编码挠性连接体(例如编码氨基酸序列(Gly4～Ser)3(SEQ ID NO：301))的片段，从而VH及VL序列可表达为邻接单链蛋白，其中VL区及VH区由挠性连接体连结(例如参见Bird等人，1988，Science[科学]242：423-426；Huston等人，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]85：5879-5883；McCafferty等人，1990，Nature[自然]348：552-554)。
为表达本披露内容的双特异性结合蛋白，将如上文所述获得的编码部分或全长轻链及重链的DNA插入表达载体中，使得基因可操作连接至转录及翻译控制序列。在此背景中，术语“可操作连接”意指使结合蛋白基因接合至载体中以便该载体内的转录及翻译控制序列发挥其调控结合蛋白基因的转录及翻译的预期功能。所选表达载体及表达控制序列应与所用表达宿主细胞相容。可将结合蛋白轻链基因(若存在)及结合蛋白重链基因插入分开载体中，或更通常地，将两种基因插入相同表达载体中。
通过标准方法将双特异性结合蛋白基因插入表达载体中(例如，将结合蛋白基因片段上的互补限制位点与载体接合，或若不存在限制位点，则利用钝端接合)。在插入双特异性结合蛋白相关轻链或重链序列之前，表达载体可已经携带结合蛋白恒定区序列。例如，一种将双特异性结合蛋白相关VH及VL序列转化成全长结合蛋白基因的方式是将其插入已经分别编码重链恒定及轻链恒定区的表达载体中，使得VH区段可操作连接至载体内的CH区段且VL区段可操作连接至载体内的CL区段。另外或可替代地，重组表达载体可编码促进宿主细胞分泌结合蛋白链的信号肽。可将结合蛋白链基因克隆至载体中，以使信号肽在框内连接至结合蛋白链基因的氨基末端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白的信号肽)。
除结合蛋白链基因外，本披露内容的重组表达载体携带控制宿主细胞中的结合蛋白链基因的表达的调节序列。术语“调控序列”意在包括控制结合蛋白链基因的转录或翻译的启动子、增强子及其他表达控制元件(例如聚腺苷酸化信号)。这些调节序列阐述于，例如，Goeddel，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology[基因表达技术：酶学方法]185，学术出版社(Academic Press)，圣地亚哥(San Diego)，加利福尼亚州(CA)，1990中。普通技术人员应了解，表达载体的设计(包括调节序列的选择)可取决于诸如以下等因素：待转化的宿主细胞的选择、期望蛋白质的表达水平等。适于哺乳动物宿主细胞表达的调节序列包括引导哺乳动物细胞中的高水平蛋白质表达的病毒元件，例如源自巨细胞病毒(CMV)(例如CMV启动子/增强子)、猿猴病毒40(SV40)(例如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))及多瘤的启动子和/或增强子。关于病毒调节元件及其序列的进一步说明，参见，例如，Stinski的美国专利号5,168,062、Bell等人的美国专利号4,510,245及Schaffner等人的美国专利号4,968,615。
除双特异性结合蛋白链基因及调控序列外，本披露内容的重组表达载体可携带其他序列，例如调控宿主细胞中的载体复制的序列(例如复制源)及可选标记物基因。该可选标记物基因促进已引入该载体的宿主细胞的选择(例如参见美国专利号4,399,216、4,634,665及5,179,017，全部都授予Axel等人)。例如，通常可选标记物基因赋予已引入该载体的宿主细胞对药物(例如G418、潮霉素(hygromycin)或胺甲蝶呤(methotrexate))的抗性。适宜可选标记物基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于经胺甲蝶呤选择/扩增的DHFR-宿主细胞)及neo基因(用于G418选择)。为表达轻链及重链，通过标准技术将编码重链及轻链的一种或多种表达载体转染至宿主细胞中。术语“转染”的各种形式意在涵盖多种多样的常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞中的技术，例如电穿孔、脂转染、磷酸钙沈淀、DEAE-葡聚糖转染及诸如此类。
可在原核或真核宿主细胞中表达本披露内容的双特异性结合蛋白。在某些实施例中，结合蛋白的表达是在真核细胞(例如，哺乳动物宿主细胞)中实施，以最佳分泌经适当折叠的免疫活性结合蛋白。用于表达本披露内容的重组结合蛋白的示例性哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)(包括DHFR-CHO细胞，阐述于Urlaub及Chasin，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]77：4216-4220中，其与DHFR可选标记物一起使用，例如，如Kaufman及Sharp，1982，Mol.Biol.[分子生物学]159：601-621中所述)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞及SP2细胞。当将编码结合蛋白基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞中时，通过将宿主细胞培养一段时间来产生双特异性结合蛋白，该段时间足以使双特异性结合蛋白在宿主细胞中表达或使结合蛋白分泌至宿主细胞生长的培养基中。可使用标准蛋白质纯化方法自培养基回收结合蛋白。还可使用宿主细胞来产生完整结合蛋白的部分，例如Fab片段或scFv分子。应理解，上述程序的变化形式在本披露的范畴内。例如，可期望用编码本披露内容的双特异性结合蛋白的轻链或重链(但并非二者)的DNA转染宿主细胞。
还可使用重组DNA技术以移除编码轻链及重链中的一种或二者的DNA的一些或全部，其并非结合至免疫调节性蛋白和/或肿瘤抗原所必需。自这些经截短DNA分子表达的分子还由本披露内容的结合蛋白涵盖。
对于本披露内容的双特异性结合蛋白的重组表达，可用本披露内容的两个表达载体共转染宿主细胞，第一载体编码重链衍生的多肽且第二载体编码轻链衍生的多肽。两个载体可含有相同可选标记物，或其可各自含有单独可选标记物。可替代地，可使用编码重链及轻链两种多肽的单一载体。
一旦核酸编码双特异性结合蛋白的一个或多个部分，即可向编码序列中引入其他改变或突变以，例如，生成编码具有不同CDR序列的结合蛋白、对Fc受体具有降低亲和力的结合蛋白或不同亚类的结合蛋白的核酸。
本披露内容的双特异性结合蛋白还可通过化学合成(例如，通过Solid PhasePeptide Synthesis[固相肽合成]，第2版，1984皮尔斯化学公司(The Pierce ChemicalCo.)，罗克福德(Rockford)，伊利诺伊州(Ill)中所述的方法)来产生。还可使用无细胞平台生成变体结合蛋白(例如，参见Chu等人，Biochemia[生物化学]第2期，2001(罗氏分子生物公司(Roche Molecular Biologicals))及Murray等人，2013，Current Opinion inChemical Biology，[化学生物学新见]17：420-426。
7.5.双特异性结合蛋白的纯化
一旦通过重组表达产生本披露内容的多肽，即可通过本领域已知纯化蛋白的任何方法对其进行纯化，例如通过层析(例如，离子交换、亲和力，具体而言在蛋白质A或蛋白质G选择后针对抗原通过亲和力，及尺寸管柱层析)、离心、差异溶解性，或通过任何其他标准技术用于纯化蛋白质或其技术的任一组合。此外，本披露的多肽或其片段可融合至本文所述或现有领域已知促进纯化的异源多肽序列。可将多肽纯化为单体或二聚体，例如包含两种多肽的双特异性结合蛋白。例如，可通过包含澄清、蛋白质A层析及病毒灭活的一些步骤纯化多肽。
一旦分离，即可(若期望)通过以下方法纯化双特异性结合蛋白：例如高效液相层析(例如，参见Fisher，LaboratoryTechniques In Biochemistry And Molecular Biology[生物化学与分子生物学实验室技术](Work及Burdon编辑，Elsevier，1980))、尺寸排除层析、疏水相互作用层析(例如，利用脂肪族交联琼脂糖介质，例如Butyl Sepharose高效层析(GE医疗生命科学公司(GE Healthcare Life Sciences)))、羟磷灰石层析(例如，使用CaPure-HA(东曹生命科学公司(Tosoh Bioscience LLC))或CHT陶瓷羟磷灰石I型(伯乐实验室(Bio-Rad Laboratories，Inc.))载体)或凝胶过滤层析(例如，使用SuperdexTM 75管柱(Pharmacia Biotech AB公司，乌普萨拉(Uppsala)，瑞典))。可使用本领域已知的多种层析技术(例如，流过或结合-与-洗脱模式、梯度洗脱)以纯化双特异性结合蛋白的制剂。在具体实施例中，通过羟磷灰石层析纯化结合CD40及间皮素的双特异性结合蛋白，其中将pH维持于6.7±0.1下。
还可经由一或多次过滤纯化本披露内容的双特异性结合蛋白，例如包含活性碳过滤、膜过滤(例如，经由多孔亲水聚合物(例如聚醚砜)的无菌过滤、Q膜过滤或S膜过滤)。例如，活性碳过滤使用活性碳内的大表面积或孔径以自流动流吸附杂质。Q膜过滤使用在表面上具有四级铵离子的阴离子交换膜以保留高负电荷物质。相比之下，S膜过滤使用具有硫酸根离子的阳离子交换膜以保留高正电荷杂质。
可使用标准最终精整技术(例如纳米过滤及渗滤、或任何最终精整技术的系列中的任一组合)进行额外纯化以得到纯化双特异性结合蛋白。
7.6.药物组合物
本文所述双特异性结合蛋白可呈包含蛋白质及一种或多种运载体、赋形剂和/或稀释剂的组合物形式。组合物可经配制用于特定用途，例如用于兽医用途或人类中的药物用途。组合物的形式(例如，干燥粉末、液体配制品等)及所用赋形剂稀释剂和/或运载体将取决于结合蛋白的预期用途且对于治疗用途而言，取决于施用模式。
对于治疗用途而言，组合物可以包括药学上可接受的运载体的无菌药物组合物的部分供应。此组合物可呈任一适宜形式(取决于将其施用于受试者(例如人类受试者，即患者)的期望方法而定)。药物组合物可通过各种途径(例如经口、经皮、皮下、鼻内、静脉内、肌内、肿瘤内、鞘内、外敷或局部)施用于受试者。在任一给定情形下施用的最适宜途径将取决于特定双特异性结合蛋白、受试者、及疾病的性质及严重水平及受试者的身体状况。通常，药物组合物将经静脉内或皮下施用。
药物组合物可以每剂量含有预定量的本文所述双特异性结合蛋白的单位剂型便捷地提供。单位剂量中包括的结合蛋白的量将取决于所治疗疾病以及领域内所熟知的其他因素。单位剂量可呈含有一定量的结合蛋白的适于单一施用的冻干干燥粉末形式或呈液体形式。干燥粉末单位剂型可包装于具有注射器、适宜量的稀释剂和/或可用于施用的其他组分的套组中。呈液体形式的单位剂量可便捷地以预填充有一定量的结合蛋白的适于单一施用的注射器形式供应。
药物组合物还可以含有一定量的双特异性结合蛋白的适于多次施用的大块形式供应。
药物组合物可通过将具有期望纯度的双特异性结合蛋白与可选的领域内通常采用的药学上可接受的运载体、赋形剂或稳定剂(其在本文中都称作“运载体”，即缓冲剂、稳定剂、防腐剂、等渗剂、非离子型去污剂、抗氧化剂及其他各种添加剂)混合制备为冻干配制品或水溶液以供储存。参见Remington’s Pharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学]，第16版(Osol编辑，1980)。这些添加剂在所采用剂量及浓度下必须对接受者无毒。
7.7.使用方法
7.7.1.治疗益处
如先前所论述，对于多种实体瘤而言，一种或多种肿瘤抗原在肿瘤细胞表面上表达，但在非癌细胞表面上不表达或最小表达。本文提供的数据显示，激动免疫调节性蛋白并结合细胞表面肿瘤抗原的本文所述双特异性结合蛋白在活体内发挥针对这些实体瘤的强效抗肿瘤活性。因此，可以治疗方式使用双特异性结合蛋白和/或包含双特异性结合蛋白的药物组合物以治疗实体瘤。
通常，这些方法涉及向患有实体瘤的人类患者施用有效量的激动免疫调节性蛋白并结合细胞表面肿瘤抗原的双特异性结合蛋白以提供治疗益处。可经结合蛋白治疗的实体瘤包括但不限于肾上腺癌、膀胱癌、骨癌、脑癌(例如，神经胶质瘤)、乳癌、子宫颈癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食管癌、眼癌、胃癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌，例如非鳞状非小细胞肺癌、肺腺癌、间皮瘤)、淋巴瘤(例如，B细胞淋巴瘤)、黑色素瘤(例如，晚期恶性黑色素瘤)、口腔癌、卵巢癌(例如，铂抗性卵巢癌、输卵管癌、原发性腹膜癌)、胰腺癌、阴茎癌、前列腺癌、皮肤癌、睪丸癌、甲状腺癌、子宫癌及阴道癌。在一些实施例中，实体瘤是选自脑癌、乳癌、胃癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌及前列腺癌。癌症可包括表达肿瘤抗原的肿瘤细胞、包括不表达肿瘤抗原的肿瘤细胞的癌症、或包括肿瘤细胞的癌症，其中的一些表达肿瘤抗原且其中的一些不表达肿瘤抗原。在一些实施例中，实体瘤是在已知提供临床益处的标准疗法(例如，基于铂的疗法)后进展或患者不可以其他方式经标准疗法治疗(例如，患者对标准疗法中的活性成分过敏)的晚期实体瘤。在某些实施例中，使用结合间皮素的双特异性蛋白以治疗在已知提供临床益处的标准疗法后进展或在不可以其他方式经标准疗法治疗的患者中的间皮素阳性晚期实体瘤。在某些实施例中，使用结合间皮素的双特异性蛋白以治疗肺腺癌、间皮瘤、胰腺癌或卵巢癌。在某些实施例中，使用结合间皮素的双特异性蛋白以治疗非鳞状非小细胞肺癌、间皮瘤、胰腺癌或卵巢癌。在某些实施例中，使用结合间皮素的双特异性蛋白以治疗在已知提供临床益处的标准疗法后进展或在不可以其他方式经标准疗法治疗的患者中的具有局部晚期或转移性疾病的卵巢癌。在某些实施例中，使用结合间皮素的双特异性蛋白以治疗在已知提供临床益处的标准疗法后进展或在不可以其他方式经标准疗法治疗的患者中的具有局部晚期或转移性疾病的非小细胞肺癌。在某些实施例中，使用结合间皮素的双特异性蛋白以治疗具有晚期或转移疾病的非鳞状非小细胞肺癌，其在接受基于铂的疗法(或对于分别含有EGFR活化或TK活化突变或ALK重排的肿瘤，表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂、酪氨酸激酶(TK)抑制剂或退行性淋巴瘤激酶(ALK)抑制剂)后进展。在某些实施例中，使用结合间皮素的双特异性蛋白以治疗具有局部晚期或转移性疾病的非鳞状非小细胞肺癌，其在接受免疫疗法(例如作为单一药剂的抗PD-1或抗PD-L1拮抗剂单克隆抗体、与化学疗法的组合、或与抗CTLA-4拮抗剂抗体的组合)后进展。在某些实施例中，使用结合EGFR的双特异性蛋白以治疗结肠直肠癌、头颈癌、非小细胞肺癌或神经胶母细胞瘤。在某些实施例中，使用结合PSMA的双特异性蛋白以治疗前列腺癌。在某些实施例中，使用结合B7-H4的双特异性蛋白以治疗乳癌或卵巢癌。
癌症可经新近诊断且未经治疗，或可是抗性、复发、难治性、或复发及难治性、或转移形式的实体瘤。小鼠异种移植物模型(图17A-17B)中以及鼠类同基因肿瘤模型(图18)中的活体内数据显示，双特异性结合蛋白展现显著抗肿瘤效应。另外，图19及20中的生物化学生物标记显示与已知鼠类抗体1C10的相同剂量相比，在施用双特异性结合蛋白后肝毒性降低且细胞因子释放减少。
如上文所论述，本文披露的双特异性结合蛋白活化免疫反应。因此，可自治疗排除具有经改变免疫系统的患者。在一些实施例中，在满足以下准则中的一个或多个后排除患者：(1)在过去2年内有活性或先前记载的自体免疫疾病(包括但不限于发炎性肠病、乳糜泻、韦格纳症候群(Wegener syndrome))。(不排除患有儿童期特异性或气喘、白斑病、脱发、桥本氏症候群(Hashimoto syndrome)、葛雷夫斯氏病(Grave′s disease)或无需全身治疗的牛皮癣(在过去2年内)的受试者)；(2)原发性免疫缺失、骨髓移植、慢性淋巴球性白血病、实体器官移植或结核症的先前临床诊断的病史；(3)凝血病变或血小板病症的病史；(4)针对人类免疫缺失病毒(HIV)的确认的阳性测试结果、或患有慢性或活性B或C型肝炎的受试者。(具有B或C型肝炎的病史且已记载在抗病毒疗法后治愈的受试者可入选)；(5)在接受免疫疗法(包括但不限于针对CTLA-4、PD-L1或PD-1的药剂)时先前等级≥3的免疫介导的神经毒性或肺炎，或在接受免疫疗法时在3个月内未消退或无症状的任何其他先前等级≥3的免疫介导的不良事件；(6)在双特异性结合蛋白的第一剂量之前的28天内接受活的、减毒疫苗。
本披露内容的双特异性结合蛋白可单独施用(单一疗法)或辅助其他抗癌症疗法和/或靶向或非靶向抗癌剂或与其一起施用。在作为双特异性结合蛋白单一疗法施用时，可使用一种或多种双特异性结合蛋白。不管作为单一疗法或辅助其他疗法或药剂或与其一起施用，施用一定量的双特异性结合蛋白使得整体治疗方案提供治疗益处。
治疗益处意指使用双特异性结合蛋白以治疗患者的癌症引起与无疗法(若适当时)或已知护理标准相比任何显示的临床益处。临床益处可通过普通技术人员已知的任何方法来评价。在一个实施例中，临床益处是基于客观反应率(ORR)(使用RECIST型式1.1测定)、反应的持续时间(DOR)、无进展存活(PFS)和/或整体存活(OS)来评价。在一些实施例中，完全反应指示治疗益处。在一些实施例中，部分反应指示治疗益处。在一些实施例中，稳定的疾病指示治疗益处。在一些实施例中，整体存活增加指示治疗益处。在一些实施例中，治疗益处可在于疾病进展时间改良和/或症状或生活质量改良。在其他实施例中，治疗益处可不转化成疾病控制的时段增加，而是转化成症状负荷显著减少，从而产生改良的生活质量。如普通技术人员将明了，可使用单独双特异性结合蛋白(单一疗法)或辅助其他抗癌症疗法和/或靶向或非靶向抗癌剂或与其一起观察治疗益处。
通常，使用经设计以量测对癌症的新治疗的反应的标准临床测试评价治疗益处。为评价本文所述双特异性结合蛋白的治疗益处，可使用以下测试中的一种或组合：(1)实体瘤中的反应评估准则(RECIST)型式1.1，(2)免疫相关的RECIST(irRECIST)，(3)美国东岸癌症临床研究合作组织(Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG)体能状态，(4)免疫相关的反应准则(irRC)，(5)可通过评价肿瘤抗原评估的疾病，(6)验证的患者报告结果量表，和/或(7)针对整体存活及无进展存活的Kaplan-Meier估计。
肿瘤负荷的变化的评价是癌症治疗的临床评估的重要特征。肿瘤收缩(客观反应)及发生疾病进展的时间是癌症临床试验中的重要终点。标准化反应准则(称作RECIST(实体瘤中的反应评估准则))于2000年公开。更新(RECIST 1.1)于2009年发布。RECIST准则通常用于客观反应是主要研究终点的临床试验、以及进行稳定疾病、肿瘤进展或至进展分析的时间的评价(因为这些结果量度是基于解剖学肿瘤负荷及其在实验过程内的变化的评价)的实验中。表3提供用以测定对研究药物(例如本文所述双特异性结合蛋白)的客观肿瘤反应的反应准则的定义。
可用于测定本文所述双特异性结合蛋白的治疗益处的次要结果量度包括客观反应率(ORR)、无进展存活(PFS)、整体存活(OS)、整体反应的持续时间(DOR)及反应深度(DpR)。ORR定义为实现完全反应(CR)或部分反应(PR)的参与者的比例。PFS定义为自双特异性结合蛋白的第一剂量日期至疾病进展或死亡(以先发生者为准)的时间。OS定义为自诊断日期或疾病(例如癌症)的治疗开始且经诊断患有该疾病的患者仍存活的时间长度。DOR定义为自参与者的初始CR或PR的时间至疾病进展的时间。DpR定义为与基线肿瘤负荷相比在最大反应点观察到的肿瘤收缩的百分比。ORR及PFS二者的临床终点可基于上述RECIST 1.1准则来测定。
可用于对经历免疫疗法治疗的癌症患者具有特异性的临床评估的其他准则包括标准化免疫相关的RECIST(irRECIST)准则。参见，例如，Nishino，M.等人，Eur.J.Radiol.[欧洲放射学杂志]，84(7)，第1259-1268页(2015年7月)。这些指南改良上述RECIST 1.1准则，同时考虑潜在免疫调节性效应。表4提供用于测定对免疫调节性药物(例如本文所述双特异性结合蛋白)的客观肿瘤反应的反应准则的定义。
使用表5中所示的体能状态的ECOG量表以阐述患者的功能水平(就其自身护理的能力、日常活动及身体能力而言)。量表是由美国东岸癌症临床研究合作组织(ECOG)(现为ECOG-ACRIN癌症研究组的部分)研发且于1982年公开。
可用于完全特征及测定对免疫治疗剂(例如基于抗体的癌症疗法)的反应的另一组准则是免疫相关的反应准则(irRC)，其于2009年经研发用于量测实体瘤并于2013年更新。参见，例如，Wolchok等人，Clin.Cancer Res.[临床癌症研究]2009；15(23)：7412-7420及Nishino等人，Clin.Cancer Res.[临床癌症研究]2013；19(14)：3936-3943。更新的irRC准则通常用于评价免疫治疗剂(例如本文所述双特异性结合蛋白)对肿瘤负荷的效应，且根据表6定义反应。
自使用本文所述双特异性结合蛋白作为单一疗法或辅助其他疗法或药剂或与其一起施用以治疗实体瘤产生的一个示例性治疗益处是完全反应。自使用本文所述双特异性结合蛋白作为单一疗法或辅助其他疗法或药剂或与其一起施用以治疗实体瘤产生的另一示例性治疗益处是部分反应。
验证的患者报告结果量表还可用于表示由每一患者经由特定报告系统提供的反应。并不集中于疾病，这些结果量表涉及在管控慢性病况的同时保留功能。验证的患者报告结果量表的一个非限制性实例是来自美国国立卫生研究院的(患者报告结果量测信息系统)。例如，成人癌症患者的身体功能仪器可评估上肢(例如，灵巧性)、下肢(例如，步行或移动)及中央区(例如，颈、背移动性)的功能的自我报告能力，且包括日常活动，例如跑步任务。
Kaplan-Meier曲线(Kaplan及Meier，J.Am.Stat.Assoc.[美国统计学会杂志]1958；53(282)：457-481)还可用于估计与护理标准相比经历双特异性结合蛋白疗法的癌症患者的整体存活及无进展存活。
7.7.2.辅助疗法
双特异性结合蛋白可辅助具有抗癌性质的其他药剂或治疗或与其一起使用。在辅助使用时，双特异性结合蛋白及一种或多种其他药剂可在单一组合药物配制品中配制在一起，或可利用单一协调给药方案或利用不同给药方案分开配制及施用。辅助双特异性结合蛋白或与其一起施用的药剂通常对双特异性结合蛋白具有互补活性，使得结合蛋白及其他药剂不会不利地影响彼此。
可辅助双特异性结合蛋白或与其一起施用的药剂包括但不限于烷基化剂、血管生成抑制剂、抗体、抗代谢物、抗有丝分裂物、抗增殖物、抗病毒剂、极光(aurora)激酶抑制剂、细胞凋亡促进剂(例如Bcl-2家族抑制剂)、死亡受体途径活化剂、Bcr-Abl激酶抑制剂、BiTE(双特异性T细胞衔接体(Engager))抗体、抗体药物结合物、生物反应改良剂、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂、细胞周期抑制剂、环氧合酶-2抑制剂、DVD、白血病病毒致癌基因同源物(ErbB2)受体抑制剂、生长因子抑制剂、热休克蛋白(HSP)-90抑制剂、组蛋白去乙酰酶(HDAC)抑制剂、激素疗法、免疫剂、细胞凋亡蛋白抑制剂(IAP)的抑制剂、嵌入抗生素、激酶抑制剂、驱动蛋白抑制剂、Jak2抑制剂、哺乳动物雷帕霉素(rapamycin)靶标(mTor)抑制剂、微RNA、促分裂原活化的细胞外信号调控激酶抑制剂、非类固醇消炎药(NSAID)、聚ADP(二磷酸腺苷)-核糖聚合酶(PARP)抑制剂、铂化学治疗剂、布鲁顿氏酪氨酸激酶(Bruton’styrosine kinase，BTK)抑制剂(例如，依鲁替尼(ibrutinib)、阿卡拉替尼(acalabrutinib))、polo样激酶(Plk)抑制剂、磷酸肌醇-3激酶(PI3K)抑制剂、蛋白体抑制剂、嘌呤类似物、嘧啶类似物、受体酪氨酸激酶抑制剂、类视色素/三角肌植物生物碱、小抑制核糖核酸(siRNA)、拓朴异构酶抑制剂、泛素连接酶抑制剂以及这些药剂中的一个或多个的组合。
免疫剂的实例包括但不限于干扰素、免疫检查点抑制剂及其他免疫增强剂。干扰素包括干扰素α、干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素β、干扰素γ-1a、(干扰素γ-1b)或干扰素γ-n1、其组合及诸如此类。免疫检查点抑制剂包括靶向PD-1(例如，派姆单抗及尼沃鲁单抗)、PD-L1(例如，德瓦鲁单抗(durvalumab)、阿替珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、MEDI4736、MSB0010718C及MPDL3280A)及CTLA4(细胞毒性淋巴球抗原4；例如伊匹单抗、曲美目单抗)的抗体。免疫增强剂包括活化T细胞的抗OX40激动剂抗体。
双特异性结合蛋白还可用于增强放射疗法的效能。放射疗法的实例包括外线束放射疗法、内放射疗法(即，近接治疗)及全身性放射疗法。
7.8.剂量及施用方案
所施用双特异性结合蛋白的量将取决于各种因素，包括但不限于所治疗实体瘤的特定类型、所治疗实体瘤的阶段、施用模式、施用频率、期望治疗益处及其他参数，例如患者的年龄、体重及其他特征等。针对特定施用模式及频率有效提供治疗益处的剂量的测定在本领域普通技术人员的能力内。
最初可自活体内动物模型或临床试验估计有效提供治疗益处的剂量。适于多种多样疾病的动物模型为本领域已知。
本文披露的双特异性结合蛋白可通过适于待治疗的病况的任何途径来施用。双特异性结合蛋白通常将非经肠，即输注、皮下、肌内、静脉内(IV)、真皮内、鞘内、浓注、肿瘤内注射或硬膜外施用((Shire等人，2004，J.Pharm.Sciences[药物科学杂志]93(6)：1390-1402))。在一个实施例中，双特异性结合蛋白是以冻干粉末形式提供于小瓶中。在施用之前，用无菌注射用水(SWFI)或其他适宜介质重构冻干粉末以提供含有双特异性结合蛋白的溶液。将所得重构溶液进一步用盐水或其他适宜介质稀释并经由IV输注施用，每7天两次、每7天一次、每14天一次、每21天一次、每28天一次、每35天一次、每42天一次、每49天一次或每56天一次。在一些实施例中，对于第一周期而言，输注在90分钟内发生。在一些实施例中，随后输注是在60分钟内。
在一些实施例中，激动CD40的抗间皮素双特异性结合蛋白包含两种多肽，其各自包含SEQ ID NO：401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、419、420及421中的任一者的氨基酸序列。
在另一示例性实施例中，激动CD40的抗间皮素双特异性结合蛋白是以0.005mg/kg、0.01mg/kg、0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.06mg/kg、0.08mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.8mg/kg、1.0mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg、2.0mg/kg、2.2mg/kg、2.4mg/kg、2.6mg/kg、2.8mg/kg、3.0mg/kg、3.2mg/kg、3.4mg/kg、3.6mg/kg、3.8mg/kg、4.0mg/kg、4.4mg/kg、4.8mg/kg或5.0mg/kg每28天一次施用。
在又一示例性实施例中，激动CD40的抗间皮素双特异性结合蛋白是以0.005mg/kg、0.01mg/kg、0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.06mg/kg、0.08mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.8mg/kg、1.0mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg、2.0mg/kg、2.2mg/kg、2.4mg/kg、2.6mg/kg、2.8mg/kg、3.0mg/kg、3.2mg/kg、3.4mg/kg、3.6mg/kg、3.8mg/kg、4.0mg/kg、4.4mg/kg、4.8mg/kg或5.0mg/kg每21天一次施用。
在又一示例性实施例中，激动CD40的抗间皮素双特异性结合蛋白是以0.005mg/kg、0.01mg/kg、0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.06mg/kg、0.08mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.8mg/kg、1.0mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg、2.0mg/kg、2.2mg/kg、2.4mg/kg、2.6mg/kg、2.8mg/kg、3.0mg/kg、3.2mg/kg、3.4mg/kg、3.6mg/kg、3.8mg/kg、4.0mg/kg、4.4mg/kg、4.8mg/kg或5.0mg/kg每14天一次施用。
在又一示例性实施例中，激动CD40的抗间皮素双特异性结合蛋白是以0.005mg/kg、0.01mg/kg、0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.06mg/kg、0.08mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.8mg/kg、1.0mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg、2.0mg/kg、2.2mg/kg、2.4mg/kg、2.6mg/kg、2.8mg/kg、3.0mg/kg、3.2mg/kg、3.4mg/kg、3.6mg/kg、3.8mg/kg、4.0mg/kg、4.4mg/kg、4.8mg/kg或5.0mg/kg每7天一次施用。
在辅助其他药剂(例如其他化学治疗剂)或与其一起施用时，双特异性结合蛋白可以与其他药剂相同的时间表或以不同时间表施用。在以相同时间表施用时，双特异性结合蛋白可在另一药剂之前、之后或同时施用。在双特异性结合蛋白是辅助护理标准或与其一起施用的一些实施例中，可在开始标准疗法之前、例如在开始标准照护疗法之前一天、几天、一周、几周、一个月或甚至几个月起始双特异性结合蛋白。
在一个示例性实施例中，双特异性结合蛋白用于辅助尼沃鲁单抗以治疗非小细胞肺癌。在一些实施例中，双特异性结合蛋白结合CD40及间皮素。在具体实施例中，双特异性结合蛋白是SEQ ID NO：401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、419、420及421中的任一者，例如包含具有选自所列举SEQ ID NO的相同氨基酸序列的两种多肽的双特异性结合蛋白。双特异性结合蛋白是经由IV输注以0.005mg/kg、0.01mg/kg、0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.06mg/kg、0.08mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.8mg/kg、1.0mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg、2.0mg/kg、2.2mg/kg、2.4mg/kg、2.6mg/kg、2.8mg/kg、3.0mg/kg、3.2mg/kg、3.4mg/kg、3.6mg/kg、3.8mg/kg、4.0mg/kg、4.4mg/kg、4.8mg/kg或5.0mg/kg每14天一次施用。尼沃鲁单抗是通过静脉内输注以3mg/kg的剂量在60分钟内每两周一次施用。继续辅助双特异性结合蛋白/尼沃鲁单抗疗法直至疾病进展或患者不再耐受。
在另一示例性实施例中，使用双特异性结合蛋白以辅助尼沃鲁单抗以治疗非小细胞肺癌。在一些实施例中，双特异性结合蛋白结合CD40及间皮素。在具体实施例中，双特异性结合蛋白是SEQ ID NO：401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、419、420及421中的任一者，例如包含具有选自所列举SEQ ID NO的相同氨基酸序列的两种多肽的双特异性结合蛋白。双特异性结合蛋白是经由IV输注以0.005mg/kg、0.01mg/kg、0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.06mg/kg、0.08mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.8mg/kg、1.0mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg、2.0mg/kg、2.2mg/kg、2.4mg/kg、2.6mg/kg、2.8mg/kg、3.0mg/kg、3.2mg/kg、3.4mg/kg、3.6mg/kg、3.8mg/kg、4.0mg/kg、4.4mg/kg、4.8mg/kg或5.0mg/kg每21天一次施用。尼沃鲁单抗是通过静脉内输注以3mg/kg的剂量在60分钟内每两周一次施用。继续辅助双特异性结合蛋白/尼沃鲁单抗疗法直至疾病进展或患者不再耐受。
在另一示例性实施例中，使用双特异性结合蛋白以辅助尼沃鲁单抗以治疗非小细胞肺癌。在一些实施例中，双特异性结合蛋白结合CD40及间皮素。在具体实施例中，双特异性结合蛋白是SEQ ID NO：401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、419、420及421中的任一者，例如包含具有选自所列举SEQ ID NO的相同氨基酸序列的两种多肽的双特异性结合蛋白。双特异性结合蛋白是经由IV输注以0.005mg/kg、0.01mg/kg、0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.06mg/kg、0.08mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.8mg/kg、1.0mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg、2.0mg/kg、2.2mg/kg、2.4mg/kg、2.6mg/kg、2.8mg/kg、3.0mg/kg、3.2mg/kg、3.4mg/kg、3.6mg/kg、3.8mg/kg、4.0mg/kg、4.4mg/kg、4.8mg/kg或5.0mg/kg每28天一次施用。尼沃鲁单抗是通过静脉内输注以3mg/kg的剂量在60分钟内每两周一次施用。继续辅助双特异性结合蛋白/尼沃鲁单抗疗法直至疾病进展或患者不再耐受。
在另一示例性实施例中，使用双特异性结合蛋白以辅助派姆单抗以治疗非小细胞肺癌。在一些实施例中，双特异性结合蛋白结合CD40及间皮素。在具体实施例中，双特异性结合蛋白是SEQ ID NO：401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、419、420及421中的任一者，例如包含具有选自所列举SEQ ID NO的相同氨基酸序列的两种多肽的双特异性结合蛋白。双特异性结合蛋白是经由IV输注以0.005mg/kg、0.01mg/kg、0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.06mg/kg、0.08mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.8mg/kg、1.0mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg、2.0mg/kg、2.2mg/kg、2.4mg/kg、2.6mg/kg、2.8mg/kg、3.0mg/kg、3.2mg/kg、3.4mg/kg、3.6mg/kg、3.8mg/kg、4.0mg/kg、4.4mg/kg、4.8mg/kg或5.0mg/kg每14天一次施用。派姆单抗是通过静脉内输注以2mg/kg的剂量在30分钟内每三周一次施用。继续辅助双特异性结合蛋白/派姆单抗疗法直至疾病进展或患者不再耐受。
在另一示例性实施例中，使用双特异性结合蛋白以辅助派姆单抗以治疗非小细胞肺癌。在一些实施例中，双特异性结合蛋白结合CD40及间皮素。在具体实施例中，双特异性结合蛋白是SEQ ID NO：401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、419、420及421中的任一者，例如包含具有选自所列举SEQ ID NO的相同氨基酸序列的两种多肽的双特异性结合蛋白。双特异性结合蛋白是经由IV输注以0.005mg/kg、0.01mg/kg、0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.06mg/kg、0.08mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.8mg/kg、1.0mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg、2.0mg/kg、2.2mg/kg、2.4mg/kg、2.6mg/kg、2.8mg/kg、3.0mg/kg、3.2mg/kg、3.4mg/kg、3.6mg/kg、3.8mg/kg、4.0mg/kg、4.4mg/kg、4.8mg/kg或5.0mg/kg每21天一次施用。派姆单抗是通过静脉内输注以2mg/kg的剂量在30分钟内每三周一次施用。继续辅助双特异性结合蛋白/派姆单抗疗法直至疾病进展或患者不再耐受。
在另一示例性实施例中，使用双特异性结合蛋白以辅助派姆单抗以治疗非小细胞肺癌。在一些实施例中，双特异性结合蛋白结合CD40及间皮素。在具体实施例中，双特异性结合蛋白是SEQ ID NO：401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、419、420及421中的任一者，例如包含具有选自所列举SEQ ID NO的相同氨基酸序列的两种多肽的双特异性结合蛋白。双特异性结合蛋白是经由IV输注以0.005mg/kg、0.01mg/kg、0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.06mg/kg、0.08mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.8mg/kg、1.0mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg、2.0mg/kg、2.2mg/kg、2.4mg/kg、2.6mg/kg、2.8mg/kg、3.0mg/kg、3.2mg/kg、3.4mg/kg、3.6mg/kg、3.8mg/kg、4.0mg/kg、4.4mg/kg、4.8mg/kg或5.0mg/kg每28天一次施用。派姆单抗是通过静脉内输注以2mg/kg的剂量在30分钟内每三周一次施用。继续辅助双特异性结合蛋白/派姆单抗疗法直至疾病进展或患者不再耐受。
如由普通技术人员应了解，上述各种药剂的建议剂量可能需要经调节以优化患者反应及最大化治疗益处。
8.实例
强调本文所述双特异性结合蛋白的示例性实施例的某些特征及性质的以下实例提供用于阐释性目的，但不进行限制。
实例1-抗CD40抗体的生成及表征
8.1.1.小鼠抗人CD40杂交瘤的生成
用过表达人CD40的小鼠3T12细胞对Balb/C小鼠或SJL小鼠进行腹膜内免疫生成单克隆抗体。收获脾，并将脾细胞与多发性骨髓瘤细胞系NS0融合。使用氨蝶呤选择杂交瘤。筛选并亚克隆表达具有激动性活性的抗CD40抗体的所选杂交瘤以分离个别克隆。
8.1.2.CD40分析
为筛选具有激动性活性的抗体，研发一组功能分析，包括NF-κB通路刺激、单核细胞活化、DC活化及人CD40配体(SEQ ID NO：272)(CD40L)竞争。在这些分析中，包括抗人CD40G28-5(小鼠IgG1)(Biolegend)作为阳性对照及同种型匹配小鼠抗体(muIgG1)作为阴性对照。
8.1.2.1.HEK-BlueTM CD40 NF-κB报导基因分析
将稳定表达人CD40及NF-κB报导基因的HEK-BlueTM 293 CD40细胞系(InVivogen)维持于补充有30μg/mL杀稻瘟菌素(Blasticidin)及100μg/mL吉欧霉素(Zeocin)的DMEM、10％热灭活胎牛血清(FBS)中。HEK-BlueTM CD40细胞表面上CD40的活化触发导致活化NF-κB及随后分泌胚胎碱性磷酸酶(SEAP)的信号传导级联。将含有激动性抗CD40的杂交瘤上清液与2.5×105/mL HEK-BlueTM CD40细胞一起孵育会刺激产生SEAP，其可通过比色酶分析来量测。因此，SEAP的水平对应于杂交瘤上清液中抗CD40的活性。
8.1.2.2.单核细胞活化分析
使用单核细胞细胞系THP1-XBlue细胞(InVivogen)实施单核细胞活性分析。此细胞系稳定表达NF-κB及AP-1可诱导型SEAP报导基因且将其维持于具有10％热灭活FBS及200μg/mL吉欧霉素的RPMI 1640中。在该分析中，首先将5×105/mL THP1-XBlue细胞用40ng/mLIFNγ初免24小时，且随后与测试试样再一起孵育24小时。通过酶分析监测激动性抗CD40诱导的SEAP活性。筛选结果及示例性活性概述于表1-1中。
8.1.2.3.一级DC IL-12p70产生分析
还针对活化单核细胞源树突细胞(moDC)的能力筛选抗CD40克隆。通过IL-12p70产生监测活化。简言之，将来自健康人类供体的经相等体积的PBS稀释的全血添加至釉料下含有Ficoll-Paque Plus(15mL)的Leucosep(Greiner Bio One)管中。随后将血液以1,000g离心15分钟而无制动。收集PBMC并用PBS洗涤一次，于室温下以1,300rpm离心5分钟，并用RPMI1640洗涤一次。将细胞再悬浮于培养基(RPMI1640+10％热灭活FBS)中。随后利用StemCell的富集套组自PBMC分离单核细胞并于37℃、5％CO2下在补充有10ng/mL GM-CSF及20ng/mLIL-4的StemSep无血清培养基中培养6天。在第3天向培养物中添加新鲜GM-CSF及IL-4以帮助维持DC分化。6天培养后，使单核细胞源不成熟DC经受FACS分析以验证不成熟DC表型：Lin-、CD80/CD86+、HLA-DR+、CD11c+。将不成熟moDC用IFNγ初免并在补充有GM-CSF及IL-4的StemSep无血清培养基中用含有抗CD40的试样刺激48小时。收获培养上清液并通过市售ELISA套组分析IL-12p70产生。筛选结果及代表性活性概述于表1-1中。
1单核细胞活化是于OD655下记录的自THP1-XBlue细胞释放的SEAP活性
8.1.3.鼠类抗CD40抗体的可变区测序及人源化
使用标准PCR技术分别自杂交瘤AD163.9.3、AD166.4.4、AD175.14.11、AD163.10.7、AD165.1.2、AD163.162.1、AD163.27.12、AD163.7.2、AD 164.14.6及AD164.76.3克隆编码十种单克隆抗体(表1-2)的重链及轻链可变区的cDNA序列，并使用标准DNA测序技术对其进行测序。全氨基酸序列示于图3A-3C中。
抗体V区的人源化是如Queen，C.等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]，1989；86：10029-10033)概述来实施，且所得抗体的序列概述于表1-3中。CDR的典型结构是根据Huang等人(Methods[方法]，2005；36：35-42)来测定。鉴别具有相同或大部分类似的CDR典型结构的人类可变种系序列，且选择适当人类VH、VL及J区段序列以为抗CD40可变区提供框架。在计算机模型表明与CDR显著接触的框架位置，用鼠类抗CD40V区的氨基酸取代初始人类框架氨基酸(回复突变)。全氨基酸序列示于图3D-3G中。
根据上述方法人源化抗CD40克隆AD163.162.1。AD163.162.1的人源化型式是huAb6-1、huAb6-2及huAb6-3。抗体huAb6-1具有含有框架回复突变M48I、V67A、I69L及A71V的VH(SEQ ID NO：10)。抗体huAb6-2具有含有框架回复突变M48I及A71V的VH(SEQ ID NO：11)。抗体huAb6-3具有含有框架回复突变M48I及A71V、以及VH CDR种系化变化N60A、K64Q及D65G的VH(SEQ ID NO：12)以改良与人类种系序列的同一性。抗体huAb6-1、huAb6-2及huAb6-3具有含有框架回复突变A43S、L46R、L47W及F71Y的VL(SEQ ID NO：41)。
抗CD40克隆163.7.2的人源化型式是huAb8-1、huAb8-2及huAb8-3(图3D、3E)。抗体huAb8-1具有含有框架回复突变M48I、V67A、I69L、A71V、K73R、Y91F及R94S的VH(SEQ ID NO：13)。抗体huAb8-2具有含有框架回复突变M48I、V67A、I69L、A71V、K73R、Y91F及R94S以及VHCDR C59S突变的VH(SEQ ID NO：14)。抗体huAb8-3具有含有框架回复突变M48I、A71V及R94S的VH(SEQ ID NO：15)。抗体huAb8-1、huAb8-2及huAb8-3都具有含有框架回复突变A43S及Y87F的VL(SEQ ID NO：42)。
抗CD40克隆AD164.14.6经人源化以提供huAb9-1、huAb9-2、huAb9-3、huAb9-4、huAb9-5及huAb9-6。抗体huAb9-1及huAb9-4展示具有框架回复突变I48M、V67I及V71R的VH(SEQ ID NO：16)。抗体huAb9-2及huAb9-5具有含有框架回复突变I48M及V71R的VH(SEQ IDNO：17)。抗体huAb9-3及huAb9-6具有含有框架回复突变I48M及V71R以及额外两个CDR种系变化T30S及N65S的VH(SEQ ID NO：18)以改良与人类种系序列的同一性。抗体huAb9-1、huAb9-2及huAb9-3具有含有框架回复突变I2A、Y36F及Y87F的VL(SEQ ID NO：43)。抗体huAb9-4、huAb9-5及huAb9-6具有含有框架回复突变I2A的VL(SEQ ID NO：44)。
通过恢复VL的框架回复突变I2A进一步修饰克隆AD164.14.6以移除轻链的第二位置处发现的信号肽裂解位点。分别含有框架突变A2I及A2V的抗体huAb9 A2I(SEQ ID NO：50)及huAb9 A2V(SEQ ID NO：51)防止形成不期望裂解产物。
利用人类IgG1重链恒定区及κ轻链恒定区生成本实例中的人源化抗体。可在人类IgG1重链的蛋白质表达后通过翻译后处理部分裂解C-末端赖氨酸。因此，huAb9-5具有根据SEQ ID NO：310或311的重链及根据SEQ ID NO：320的轻链。还利用重链恒定区中分别对应于根据SEQ ID NO：312或313及SEQ ID NO：314或315的重链的V273E及V273Y氨基酸突变及根据SEQ ID NO：320的轻链产生抗体huAb9-5。利用人类IgG1 V273E重链恒定区生成抗体huAb9 A2I及huAb9 A2V。因此，huAb9 A2I具有根据SEQ ID NO：312或313的重链及根据SEQID NO：321的轻链。类似地，huAb9 A2V具有根据SEQ ID NO：312或313的重链及根据SEQ IDNO：322的轻链。
8.1.4.人源化抗体的NF-κB活化、CD40结合动力学、物种交叉反应性及表位类别
在HEK-BlueTM 293 CD40 NFκB报导基因细胞中评估由本发明的人源化抗CD40抗体的NF-κB活化。活化表示为OD655下量测的SEAP(分泌的胚胎碱性磷酸酶)报导基因活性。所量测最大OD655及半数最大活化浓度(EC50)概述于表1-4中。
通过表面等离子共振及FACS分析二者分析本发明的人源化抗CD40抗体的结合亲和力。
通过表面等离子共振分析利用Biacore T200仪器分析CD40结合动力学(表1-5)。简言之，将山羊抗小鼠Fc抗体(Pierce)或山羊抗人Fc(Pierce)固定于CM5传感器芯片上，之后将抗CD40抗体捕获于测试表面上。随后，注射人CD40(Creative BioMart)或食蟹猴(cyno)CD40(Creative BioMart)的细胞外结构域的可溶性形式，且量测结合及解离。
表面等离子共振数据指示人源化huAb8-1及huAb9-5抗体保留分别与其亲本克隆AD163.7.2或克隆AD164.14.6的结合亲和力类似的结合亲和力(KD)，且显示与人类及食蟹猴CD40的类似结合(表1-5)。
*数字是指指数标志，例如3.0E-09＝3.0×10-9。
还针对经人类或食蟹猴CD40稳定转染的HEK293细胞以及源自食蟹猴或人类PBMC的B细胞上与细胞表面CD40的结合评估人源化抗CD40抗体。将人源化抗CD40抗体与HEK293转染子一起在冰上孵育15分钟，且利用荧光偶联的抗人二级抗体(JacksonImmunoResearch公司)检测结合。细胞的FACS分析确认人源化抗体结合至人类及食蟹猴CD40稳定细胞系。在利用小鼠或狗CD40实施的实验中未观察到结合。
还针对抗CD40抗体结合至一级人类及食蟹猴CD40表达细胞的能力对其进行评价。将自人类或食蟹猴血液分离的PBMC与结合至荧光染料CF640R的抗CD40抗体一起孵育。在FACS分析后，通过FlowJo(FlowJo，LLC)软件分析数据。这些结果显示，人源化抗体结合至源自人类及食蟹猴PBMC二者的一级CD40阳性细胞。
通过量测抗CD40及CD40复合物与板结合的人CD40L(SEQ ID NO：272)的结合的ELISA分析确认本发明的人源化抗体的表位分类。将增加量的人源化抗CD40抗体或人类IgG1对照抗体与1μg/mLCD40-huFc融合蛋白一起孵育，并添加至经CD40L涂布的板。将来自未经涂布板的信号定义为背景。人源化抗体huAb8-3及huAb8-1阻断CD40及CD40L的相互作用；且huAb6-1及huAb6-2显示对CD40-CD40L相互作用的最小影响。huAb9-5及huAb9-6的数据表明抗体增强CD40与CD40L结合。
8.1.5.通过修饰抗CD40抗体的Fc区增强FcγRIIB结合
经由修饰Fc区以增强FcγRIIB结合来实现CD40的较大激动性活性(Li及Ravetch，Science[科学]，2011；333：1030-1034；及White等人，J.Immunol[免疫学杂志]，2011；187：1754-1763)。向人源化抗CD40抗体中引入人类IgG1恒定区中位置273的两个突变V273E及V273Y。通过FACS分析及通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)监测Fc突变对与Fcγ受体的结合的影响。
将增加量的抗CD40人类IgG1抗体及其Fc变体与稳定表达不同人类Fcγ受体(包括具有F或V多型性的FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32A)、FcγRIIB(CD32B)及FcγRIIIA)的CHO细胞一起孵育。利用荧光结合的抗人F(ab’)2特异性二级抗体(Jackson ImmunoResearch公司)检测结合。突变V273E或V273Y降低与FcγRIIIA的结合，同时维持或增强FcγRIIB结合。
使用标准方案量测人源化抗CD40抗体的Fc变体的ADCC(Law等人，2005，CancerRes.[癌症研究]65：8331-8)。突变V273E或V273Y降低CD40表达细胞上由人类IgG1 Fc介导的ADCC活性。
8.1.6.具有Fc修饰的抗人CD40的活体外激动性活性
针对抗CD40Fc变体刺激B细胞增殖、由DC的IL-12p70产生及同种异体DC及T细胞混合培养物中IFNγ产生的能力评估抗CD40Fc变体的激动性活性。
8.1.6.1.B细胞增殖
通过B细胞富集套组(StemCell Technologies)经由负向选择富集人类B细胞。将纯化B细胞以5×105/mL、200μL/孔在AIM-V无血清培养基(GIBCO)中接种至96孔板中。添加连续稀释的抗CD40抗体并与B细胞一起培养6天。在培养的最后16小时中，向培养物的每一孔中添加1μCi的H3TdR并通过H3TdR纳入测定B细胞增殖。通过闪烁计数器以计数/分钟(CPM)形式记录与H3TdR纳入相关的放射性。与相应人类IgG1野生型抗体相比，抗CD40人类IgG1 Fc变体V273E及V273Y显示增强的B细胞活化。
8.1.6.2.DC IL-12p70产生
首先自人类PBMC纯化的单核细胞衍生不成熟DC并用IL-4及GM-CSF处理。在用IFNγ初免后由抗CD40抗体诱导DC成熟及IL-12p70产生。抗CD40抗体huAb6-1、huAb8-1及huAb9-5的野生型人类IgG1型式在刺激DC以产生IL-12p70中显示强效活性。V273E或V273YFc突变型式维持或增强其对DC活化的功效。
8.1.6.3.同种异体DC及T细胞共培养物
将使用上述方法源自单核细胞的树突细胞(5×103)与1×105个自不同供体纯化的T细胞混合。向DC及T细胞共培养物中添加不同量的具有野生型人类IgG1恒定区或Fc变体的抗CD40抗体huAb6-1、huAb8-1、huAb9-5。在4天孵育后，收集上清液并通过ELISA量测IFNγ。
抗CD40抗体huAb6-1、huAb8-1及huAb9-5增加自体DC及T细胞共培养物中的IFNγ产生。IFNγ的产生代表T细胞活化及潜在T细胞介导的细胞毒性。HuAb9-5及huAb8-1在刺激T细胞方面比huAb6-1更强效。
8.1.7.抗人CD40抗体的活体内抗肿瘤活性
针对具有野生型人类IgG1及Fc变体的人源化抗CD40抗体huAb6-1、huAb8-1及huAb9-5抑制具有前列腺癌异种移植物PC3的NSG小鼠中肿瘤生长的能力对这些抗体进行评价。
向NSG小鼠皮下接种PC3细胞(1×106)、纯化T细胞(5×105)及自体DC(1×105)的混合物。在接种后立即腹膜内注射2mg/kg的抗CD40抗体或对照抗体的单一剂量。每隔一天利用测径器量测肿瘤体积。抗CD40抗体(包括huAb6-1、huAb8-1、huAb9-5及相应V273E或V273YFc变体)抑制PC3肿瘤生长。
实例2-抗间皮素抗体的生成及表征
8.2.1.完全人类抗人间皮素抗体的生成
经由活体外RNA展示技术(Hseh，C-M.，Kutskova，Y.A.及Memmott，J.E.，美国专利申请号US 2010/0105569)及随后亲和力成熟以得到抗间皮素抗体HuAb17来生成完全人类抗间皮素抗体。
序列比对显示间皮素抗体HuAb17与人类种系VH1-46/JH4及IGLV3-1/Jk2共有最高同一性。为改良HuAb17对间皮素的亲和力，自IgBLAST数据库中还与种系VH1-46及IGLV3-1共有高同一性的其他人类抗体序列鉴别超突变CDR残基。随后通过PCR利用具有低简并性的引物在这些超突变CDR位置使相应HuAb17 CDR残基经受限制的诱变以在适于表面展示的scFv形式中产生三个抗体文库。第一文库含有VH CDR编号1及VH CDR编号2(Kabat编号)中残基30、31、33、34、50、53、56及58的突变；第二文库为VH CDR编号3中残基95至100d；且第三文库为三个VL CDR中残基27、30、31、33、52、53及93至96。对于HuAb17进一步突变以使其对齐从而更接近人类种系框架序列，在VH位置D27Y及V55G引入二元简并性。此外，以下位置是种系：位置13、37、74、76、82a、84、91及94的VH；及位置20及100的VL。展示HuAb17文库且通过磁力、随后荧光活化细胞分选针对低浓度的生物素化间皮素进行选择。亲本HuAb17及其亲和力成熟变体列举于表2-1中。每一克隆的重链或轻链可变区的氨基酸序列示于图4A-4E中。
8.2.2.完全人类抗间皮素抗体的间皮素结合动力学及物种交叉反应性
通过表面等离子共振使用上述方法针对与人类食蟹猴间皮素的结合亲和力量测完全人类抗间皮素抗体。人类抗间皮素亲本抗体HuAb17的结合动力学及其针对人类及食蟹猴间皮素的亲和力成熟变体概述于表2-2中。
*数字是指指数标志，例如3.0E-09＝3.0×10-9。
8.2.3.在CA125存在下亲和力成熟人类抗间皮素的活体外结合
间皮素在一些实体瘤(包括间皮瘤、卵巢癌及胰腺癌)上高度表达，且经常与另一肿瘤抗原CA125(MUC16)共表达。已报导，间皮素可与CA125相互作用以介导细胞黏附(RumpA.等人，J.Biol.Biochem.[生物化学杂志]2004，279：9190-9198)。为确定本文所述抗间皮素抗体是否可在富集CA125的肿瘤微环境中结合至间皮素，在具有或无内源性CA125表达的肿瘤细胞系上量测抗间皮素亲和力成熟变体的结合。
通过FACS在卵巢癌细胞系OVCAR3、胰腺癌细胞系SW1990及肾癌细胞系SN12C上量测抗间皮素亲和力成熟变体的结合。OVCAR3及SW1990二者均表达CA125，但未检测到SN12C细胞上的CA125表达。SN12C及OVCAR3上的最大结合及半数最大结合的浓度概述于表2-3中，其显示具有含CA125表达(CA125+)或无表达(CA125-)的内源性间皮素表达的间皮素阳性肿瘤细胞系上的人类抗间皮素亲和力成熟抗体的结合动力学。
为量测可溶性CA125对抗间皮素抗体结合的影响，向与增加量的可溶性CA125一起预孵育的癌细胞中添加亚最佳浓度(0.5μg/mL)的抗体。利用荧光结合的山羊-抗人二级抗体检测在CA125存在下抗体的间皮素结合。如图5A-5C中所描绘，代表性抗间皮素亲和力成熟变体显示在增加量的可溶性CA125存在下与不同肿瘤细胞系的结合一致。稳定表达间皮素的OVCAR3细胞以及HEK293细胞上的抗间皮素亲和力成熟变体的结合曲线在可溶性CA125存在下还不显著变化(图6A-6B)。
实例3-抗4-1BB抗体的生成及表征
8.3.1.经由大鼠及小鼠杂交瘤技术的抗4-1BB抗体
根据本领域已知的方法对大鼠及小鼠进行免疫(E.Harlow，D.Lane.Antibody：ALaboratory Manual[抗体：实验室手册]，(冷泉港实验室出版社，纽约冷泉港，1998))。使用重组小鼠4-1BB-ECD-人类Fc融合或小鼠4-1BB-ECD-his蛋白作为免疫原。使用表达人类及小鼠4-1BB的人类细胞以测定抗血清效价及筛选抗原特异性抗体。在Gerbu MM佐剂(Cooper-Casey Corporation)存在下用含有10μg蛋白质/动物/注射的剂量在踝关节中对Sprague-Dawley大鼠进行免疫用于初次及加强免疫。为增加对计数物质4-1BB的免疫反应，利用人类及小鼠4-1BB-ECD-his蛋白的混合物进一步加强动物用于最终加强。
8.3.2.杂交瘤融合及筛选
培养鼠类骨髓瘤细胞系NS0的细胞以恰好在融合之前达到对数期阶段。自每一小鼠移出腘及鼠蹊淋巴结并以无菌方式制备单一细胞悬浮液。根据本领域已知的方法使淋巴球与骨髓瘤细胞融合(E.Harlow，D.Lane.Antibody：A Laboratory Manual[抗体：实验室手册]，(冷泉港实验室出版社，纽约冷泉港，1998)；Kohler G.及Milstein C.，Nature[自然]，256：495-497(1975)；BTX Harvard Apparatus公司(美国马萨诸塞州霍利斯顿(Holliston，MA，US)ECM 2001技术手册)。将融合杂交细胞分配至DMEM/10％FBS/HAT培养基中的96孔板中。使存活杂交瘤克隆的上清液经受使用表达重组人类4-1BB或小鼠4-1BB的人类细胞系的基于细胞的筛选。
使命中物(hit)扩增并通过FACS使用表达人类4-1BB、食蟹猴4-1BB及小鼠4-1BB的人类细胞系及山羊抗大鼠IgG-PE(Jackson Immunochemicals公司)或山羊抗小鼠IgG-PE(Jackson Immunochemicals公司)确认结合特异性用于检测。使用MoFlo(Beckman公司)通过将每孔的单一细胞沉淀至96孔细胞培养板中以确保细胞系的克隆性(clonality)来亚克隆命中物的选择。通过FACS使用表达人类4-1BB蛋白质、食蟹猴4-1BB或小鼠4-1BB的人类细胞系针对特异性筛选所得克隆。使用大鼠单克隆同种型套组(Serotec)或小鼠同种型套组(Roche)测定每一单克隆抗体的同种型。纯化产生所关注抗体的杂交瘤克隆并通过表面等离子共振、功效(NFκB报导基因分析)及配体竞争(ELISA)针对亲和力进一步表征。针对TABBY10的示例性鼠类抗体TABBY1.1或针对TABBY108的大鼠抗体TABBY101的VH及VL区的氨基酸序列示于图7A-7C及7F-7G中。
8.3.3.4-1BB分析
8.3.3.1.4-1BB NF-κB报导基因
使用Lipofectamine 2000(英杰公司，美国纽约格兰德岛(Invitrogen，GrandIsland，NY，USA))利用表达人类、食蟹猴或小鼠4-1BB蛋白质的质体转染先前经pLenti-NFκB-荧光素酶载体转导的HEK293细胞。报导基因细胞表面上4-1BB的活化触发信号传导级联，从而导致活化NF-κB及随后表达荧光素酶。将细胞解冻，以5×105个细胞/mL再悬浮，并以50μL/孔(25，000个细胞/孔)直接平铺于96孔形式白色/透明底部板(Thermo Fisher)中。以30、10、3.33、1.11、0.37或0.12μg/mL以50μL/孔一式两份地添加剂量滴定的纯化抗体制剂。交联剂以120、40、13.33、4.44、1.48或0.49μg/mL或培养基以50μL/孔一式两份地添加。使用以下试剂作为交联剂：山羊抗小鼠IgG Fc(Jackson Immunochemicals公司)、山羊抗人IgGFc(Jackson Immunochemicals公司)或山羊抗大鼠IgG Fc(Jackson Immunochemicals公司)。向对照孔中添加重组人类(艾伯维公司(Abbvie)，6μg/mL)或小鼠4-1BB配体(R&D，6μg/mL)、TNFα(R&D，60ng/mL)或生长培养基用于细胞系的每一者中的最大及最小荧光素酶活性。将分析板于37℃下孵育过夜并通过75μL/孔的BriteLite底物(Perkin Elmer)的相对发光(RLU)量测荧光素酶活性。如下将数据绘制为配体活性％的图：
相对活性％＝((试样的RLU-培养基的RLU)/(配体的RLU-培养基的RLU))×100。
8.3.3.2.4-1BB FACS结合
为测定测试抗体的物种特异性及相对结合亲和力，生成细胞系以在膜上外源表达4-1BB。用表达人类、食蟹猴或小鼠4-1BB蛋白质的质体转染HEK293细胞。利用MoFlo分选器(Beckman)分选稳定、高表达群体并将其维持于含有500μg/mL G418的DMEM、10％胎牛血清中。对于分析，将细胞用胰蛋白酶解离，以5×106个细胞/mL再悬浮并以50μL/孔(250，000个细胞/孔)转移至500μL聚丙烯板(Nunc)。以20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312、0.156、0.078、0.039、0.0195、0.00976μg/mL(50μL/孔，单态)向分析板的适当孔中添加测试抗体并于室温下孵育20分钟。将细胞用250μL/PBS(Hyclone)/孔洗涤两次。以原液的1∶250稀释物、50μL/孔添加PE标记的检测抗体，并于室温下孵育20分钟。使用以下检测抗体：山羊抗大鼠IgG-PE(Southern Biotech)、山羊抗小鼠IgG-PE(Southern Biotech)或山羊抗人IgG-PE(Southern Biotech)。将细胞洗涤一次并用含有1％甲醛的PBS固定。在FACSCalibur(Becton Dickinson)上针对荧光对板进行分析。
8.3.3.3.4-1BB配体竞争
为评估抗4-1BB抗体与4-1BB配体(4-1BBL)竞争结合的能力，进行ELISA分析。于室温下将Immunlon 4板(Dynatec)用碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(Pierce)中的0.5μg/mL的特异性山羊抗人IgG Fc(Jackson Immunochemicals)涂布过夜。洗涤板并以0.2μg/mL添加小鼠(R&D系统)或人类4-1BB-Fc(R&D细胞)蛋白质并于室温下孵育1小时。洗涤板并如下一式两份地添加测试抗体：10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.156、0.078、0.039、0.0195、0.00976或0μg/mL，并于室温下孵育1小时。随后自孔移出溶液。向各自的孔中添加人类4-1BBL(SEQID NO：274)(R&D系统，0.02μg/mL)或小鼠4-1BBL(R&D系统，0.04μg/mL)并于室温下孵育1小时。洗涤板并以0.05μg/mL添加生物素化抗人4-1BBL(R&D系统)或生物素化抗小鼠4-1BBL(R&D系统)试剂以检测分析板中4-1BBL的存在。洗涤板并利用抗生物素蛋白-HRP(JacksonImmunochemicals公司)以1：5000稀释检测复合物，于室温下孵育30分钟。洗涤板并向每一孔中添加100μL/孔的TMB底物(BioFx)。在5分钟孵育后，以50μL/孔添加TMB停止缓冲液(BioFx)。于650nM下在Spectramax(Molecular Devices)上对板进行读数。如下将数据绘制为最大(4-1BBL)结合％的图：
最大结合％＝(试样的OD650)/(0μg/mL抗体下的OD650)×100。
8.3.3.4.利用交联剂的CD8+T细胞分析
通过Ficoll-paque离心自血沉棕黄层纯化人类PBMC且随后使用CD8+T细胞负向选择套组(StemCell Technologies)自PBMC纯化CD8+T细胞。将CD8+T细胞再悬浮于AIM-V培养基中。还在此培养基中制备抗体。将96孔平底板用100μL0.5μg/mL PBS中的OKT3在孵育器中涂布2hr，且将板用AIM-V洗涤两次。向板中添加50μLCD8+T细胞(2×105)/孔，以及50μL 4-1BB抗体(30μg/mL或期望浓度梯度)及50μL山羊抗人IgG、Fcγ特异性抗体(120μg/mL或所用4-1BB抗体的量的4倍)。将板孵育72hr，其后取50μL上清液用于通过Luminex进行细胞因子分析。向板中每孔添加50μLAIM-V/0.5μCi3H并将混合物孵育6hr以量测胸苷纳入(增殖)。
可替代地，利用CHOK1-FcγR转染子或PC3-MSLN作为交联剂，在实验之前当天将经辐照细胞(2×104/孔)放置于完全培养基中的96-孔板中。在AIM-V培养基中制备CD8+T细胞及抗体梯度。用100μLCD8+T细胞(2×105/孔)及100μL含有1μg/mL OKT3的4-1BB抗体代替孔中的培养基。孵育板，并如上文实施用于细胞因子释放及增殖的分析。
8.3.4.大鼠抗4-1BB抗体的结合数据
生成针对4-1BB的示例性抗体，且相应VH及VL序列的氨基酸序列示于图7A-7C中。
大鼠抗体TABBY101至TABBY108都展现与鼠类4-1BB的结合，如通过表面等离子共振(Biacore)所显示，如表3-1中所示。
另外，鼠类抗体TABBY1.1至TABBY10展现通过Biacore的与人类4-1BB的结合，如表3-2中所示。
通过表面等离子共振分析以如实例1中所述的类似方式测定针对内源性人类4-1BB的示例性抗体的结合以及其各自的EC50。表3-3显示4-1BB抗体TABBY106-rIgG1及TABBY107-rIgG1(即，具有大鼠IgG1恒定区及分别具有λ及κ轻链)展现与文献4-1BB抗体3H3及1D8不同的结合特性。与3H3及1D8相反，本发明披露的抗体显示与人类4-1BB的结合。此外，4-1BB抗体TABBY106-rIgG1及TABBY107-rIgG1结合至鼠类4-1BB。
*值是指指数标志，例如3.0E-09＝3.0×10-9。
另外，与文献4-1BB抗体3H3及1D8相反，示例性4-1BB鼠类抗体TABBY106-rIgG1及TABBY107-rIgG1还结合至食蟹猴4-1BB。结果概述于表3-4中。
*值是指指数标志，例如3.0E-09＝3.0×10-9。
根据上述Biacore分析测试大鼠抗体TABBY101至TABBY108与针对人类4-1BB的人类4-1BB配体的竞争性结合。这些抗体都不与人类4-1BB配体竞争结合至人类4-1BB。
实例4-结合CD40及间皮素的双特异性结合蛋白的设计及活体外评估
8.4.1.原理及分子设计
靶向抗CD40结合蛋白的肿瘤在结合至肿瘤细胞膜上的肿瘤抗原后应理想地活化CD40。肿瘤抗原结合可提供交联用于活化CD40多聚化及起始下游信号传导。在不存在肿瘤抗原时，该结合蛋白应展现最小CD40激动性活性。在结合细胞表面肿瘤抗原后，结合蛋白将增加CD40激动剂活性。为此，测试不同双特异性结合蛋白形式。
一种形式是双重可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig)(图2A)，其含有两个由连接体连接的串联可变(V)结构域、之后是常规抗体的恒定区。为构建CD40/肿瘤抗原DVD-Ig，将针对肿瘤抗原的V-结构域放置于分子的氨基(N)-末端的外部结构域中，同时将针对CD40的V-结构域放置于内部结构域中。DVD-Ig中的重(VH)链及轻(VL)链上的两个V-结构域是由GS连接体(即，对于VH为GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：346)且对于VL为GGSGGGGSG(SEQ ID NO：347))、或长(L)或短(S)连接体连接，其是基于抗体中天然存在的铰链区设计(Wu，C等人，NatureBiotechnology[自然生物技术]，25：1290-1297(2007))。先前已阐述连接体(例如，于Jakob等人，mAbs，5(3)：358-363(2013)中)。重链长连接体具有氨基酸序列ASTKGPSVFPLAP(SEQID NO：342)，且短连接体具有序列ASTKGP(SEQ ID NO：343)。对于轻链而言，长连接体具有氨基酸序列TVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO：344)，且短连接体具有序列TVAAP(SEQ ID NO：345)。因此，DVD蛋白质可经阐述具有可变重链及可变轻链的连接体组合，例如，“LS”包含可变重“长”链连接体及可变轻“短”链连接体。
因此，在含有具有改编自huAb8-1或huAb9-5的VH及VL的抗CD40结构域及具有改编自抗MSLN抗体HuAM15的VH及VL的抗MSLN结构域的人类IgG2或人类IgG1V273E恒定区上生成一组各自具有不同连接体组合的DVD结合蛋白DVD-LL、DVD-LS、DVD-SL、DVD-SS、DVD-GS。
还根据PCT公开(WO 2013/101972，关于CO-DVD的论述)构建根据图2B的结构的CO-DVD双特异性蛋白。
测试的第三双特异性形式是图1A中所示的式(I)的双特异性结合蛋白。在此形式中，抗体可变结构域是由单链Fv(scFv)(抗原结合结构域，其中VH及VL结构域是由挠性连接体连接)表示。一个scFv位于分子的N-末端且之后是铰链、IgG恒定区的CH2区及CH3区。第二scFv放置于C-末端，且连接体(SEQ ID NO：251)连接CH3区及scFv。针对CD40及肿瘤抗原的scFv放置于N-或C-末端。
利用CD40scFv在人类IgG2、人类IgG1V273E或V273Y恒定区的氨基(N-)或羧基(C-)末端生成式(I)的双特异性结合蛋白(表4-1)。表4-1中的结合蛋白的氨基酸序列示于图8A-8G中。
8.4.2.CD40双特异性结合蛋白的间皮素-依赖性活性的评估
具有条件活化的分子经设计以在间皮素存在下具有选择性活性，在其不存在下具有较低或最小活性。出于此实例的目的，与在不存在间皮素下相比，在间皮素存在下的活性应展现功效以及大小增强至少5倍。
为鉴别具有间皮素依赖性条件活性的分子，首先测试呈不同形式的双特异性结合蛋白与CD40及MSLN靶标的结合。随后，评价CD40/间皮素双特异性结合蛋白在与表达间皮素的HEK293细胞或无间皮素表达的亲本293细胞共培养时活化B细胞及树突细胞的能力。如上文所述，通过B细胞增殖监测B细胞活化，并通过IL-12p70产生监测DC活化。另外，还通过B细胞以及DC上的流式细胞术监测细胞表面活化标记物(例如CD23、CD83及CD86)。在这些实验中，使用抗CD40抗体作为阳性对照，且使用同种型匹配的hIgG作为阴性对照。
首先测试如上文所论述构建的DVD-Ig双特异性蛋白DVD-LL、DVD-LS、DVD-SL、DVD-SS及DVD-GS与CD40或MSLN的结合，且在结合分析中显示结合亲和力。在间皮素阳性细胞存在或不存在下测试DVD-Ig分子的活体外免疫细胞活化。DVD-Ig蛋白都不显示间皮素依赖性B细胞或树突细胞活化。在间皮素存在下，这些分子具有极小至无活性。
利用如上文所论述对CD40及间皮素具有特异性的可变结构域构建示例性CO-DVD双特异性蛋白，但其不展现显著抗间皮素结合。
阐述于表4-1中的若干式(I)的双特异性结合蛋白显示与CD40及MSLN二者的结合(表4-2)，且评估其展现DC及B细胞的MSLN依赖性CD40活化的能力。式(I)的双特异性蛋白刺激自与无间皮素的HEK293细胞共培养的DC的极小至无IL-12p70释放，而相同蛋白质刺激自与表达间皮素的HEK293细胞的DC共培养物的显著IL-12p70释放(图9A)。类似地，在B细胞与HEK293亲本细胞共培养时，式(I)的双特异性结合蛋白在刺激B细胞增殖中展现最小活性，如由阴性对照人类IgG所测量。与抗CD40抗体huAb8-1或huAb9-5相比，在与表达间皮素的HEK293细胞共培养时，式(I)蛋白质刺激B细胞的显著增殖(图9B)。
活体外免疫细胞中式(I)的示例性双特异性结合蛋白B40(SEQ ID NO：406)的活化增强的概述示于表4-3中。在结合至细胞表面MSLN后，B40诱导B细胞活化(如通过活化标记物(CD23及CD86)的诱导所量测)及B细胞增殖，且诱导单核细胞源树突细胞(moDC)活化，如通过白介素(IL)-12p70及CD83表达所量测。在不存在MSLN下，与激动性抗CD40抗体huAb9A2I相比，B40在诱导B细胞活化中显著较不强效且对moDC无可检测的效应。如具有，例如，CD86分析读出的B细胞分析中可见，双特异性结合蛋白B40显示EC50自在不存在间皮素下(“-MSLN”)的B细胞(间皮素EC50＝1.4nM)至与表达细胞表面间皮素(“+MSLN”)的HEK293细胞共培养的B细胞(间皮素EC50＝0.035nM)减小。类似地，在具有分析读出的单核细胞源树突细胞(“moDC”)中，间皮素EC50自在不存在间皮素下不可检测(即，无量测活性)变为在表达间皮素的HEK293细胞存在下亚纳摩尔功效[EC50＝0.15nM(CD83)及EC50＝0.44nM(IL-12p70)]。
构建并评估式(I)的其他示例性双特异性结合蛋白。蛋白质的可变结构域结构于表4-4中给出。示例性蛋白质V6-2(SEQ ID NO：419)、V6-5(SEQ ID NO：420)及V6-6(SEQ IDNO：421)具有如图8G-8H中所示的全长氨基酸序列。另外，构成蛋白质V6-3、V6-7、V6-11及V6-14的两种多肽中的每一者的序列分别是根据SEQ ID NO：422-425的氨基酸序列。在所阐释实例中，scFvX及scFvY具有如所示可变链取向(在N→C方向上)，且在每一情形下恒定区至scFvY的连接体是SEQ ID NO：262。另外，CH2恒定结构域是具有V263L或V273E取代的IgG1变体。
通过如表4-5及表4-6中所示的表面等离子共振测定结合间皮素及CD40的示例性双特异性蛋白的结合数据。结合蛋白V5-3、V6-6及V6-8显示与源自人类或食蟹猴的CD40及间皮素的结合。
*值是指指数标志，例如3.0E-09＝3.0×10-9。
*值是指指数标志，例如3.0E-09＝3.0×10-9。
实例1中所述的与表达细胞表面间皮素的HEK293细胞共培养的树突细胞分析中由式(I)的示例性双特异性蛋白的CD40的条件活化的结果示于表4-7中。双特异性结合蛋白V6-2、V6-5及V6-6在间皮素存在下显示树突细胞的活化，如通过IL-12p70的产生所量测。
8.4.3.具有Fab及scFv区的双特异性结合蛋白的设计及生成
制备并评估类似于图1B示例的形式的具有Fab区及scFv区的式(I)的示例性双特异性结合蛋白(表4-8)。Fab区是源自间皮素抗体HuAM15(蛋白质CF1至CF10)及MSLN76923(蛋白质CF11至CF20)。制备CH2恒定区变体V273E及V263L二者。在所有情形下，源自CD40抗体的scFv区的取向是VH→VL(在N→C方向上)，且Fc区至scFv的连接体是SEQ ID NO：262。因此，下表4-8中所示的蛋白质CF1至CF20的重链分别包含根据SEQ ID NO：351至370的氨基酸序列。CF1至CF10的相应轻链包含根据SEQ ID NO：371的序列，且CF11至CF20的相应轻链包含根据SEQ ID NO：372的序列。
针对具有结合间皮素的Fab区及结合CD40的scFv区的双特异性蛋白使用表面等离子共振测定示例性结合数据。人CD40及人类间皮素的数据示于表4-9中，且食蟹猴CD40及食蟹猴间皮素的数据示于表4-10中。蛋白质CF1、CF3及CF19为人CD40及人类间皮素二者提供显著结合亲和力(KD＜4.0×10-7M)。三种蛋白质还提供与食蟹猴CD40的显著结合(KD＜1.5×10-7M)。另外，尽管源自HuAM15的双特异性结合蛋白(CF1及CF3)显著结合至食蟹猴间皮素(KD≤2.9×10-10M)，但具有源自抗体MSLN76923的可变区的CF19蛋白质不结合食蟹猴间皮素或仅较弱地结合。
*值是指指数标志，例如3.0E-09＝3.0×10-9。
*值是指指数标志，例如3.0E-09＝3.0×10-9。
具有Fab区及scFv区的示例性双特异性结合蛋白还展现在细胞表面间皮素存在下树突细胞中CD40的条件活化。表4-11概述利用具有间皮素Fab区及CD40scFv区的这些示例性双特异性结合蛋白获得的数据，且显示树突细胞的间皮素依赖性活化。双特异性结合蛋白CF1、CF3、CF4、CF5及CF9显示树突细胞的条件活化，如通过IL-12p70的产生所量测。
实例5-示例性CD40/间皮素双特异性结合蛋白的产生及纯化
以下方案适于产生及纯化如本文所述的结合CD40及间皮素的式(I)的示例性双特异性结合蛋白，例如SEQ ID NO：401-412中的任一者。将细胞库的冷冻小瓶解冻，用生长培养基稀释，并离心以移除冷冻保藏培养基。随后将细胞再悬浮于补充有6mM谷氨酰胺(Gln)的新鲜生长培养基GIA-1(来自Life Technologies Gibco的化学定义的培养基)中。在36℃下在5％CO2下培养细胞悬浮液。通过在适当大小的细胞培养容器中以界定间隔向足以接种110L种子生物反应器的生物质中添加新鲜培养基来调节体积。于预定活细胞密度下，使用种子生物反应器的培养物以接种3000L短补(short-fill)的生物反应器。在接种及短补的生物反应器二者中，将温度及DO分别控制为36℃及40％的设定点。另外，在两个生物反应器中，通过添加CO2或氢氧化钠维持6.9的pH设定点。培养物保持在短补阶段直至达到预定活细胞密度为止。
产生培养物是在3000L生物反应器中作为分批补料过程实施。向短补培养物中添加产生培养基(补充有6mM Gln的GIA-1)以起始产生阶段。温度于36℃的设定点下开始，随后在定义条件下改变为33℃。将DO维持于40％的设定点下。经由添加CO2或氢氧化钠维持6.9的pH设定点。若需要，添加消泡剂用于泡沫减轻。
于预定活细胞密度下，根据预定义的进料时间表以预定义的体积向生物反应器中添加进料培养基(1.5X JCL-5，一种来自Life Technologies Gibco的化学定义的进料培养基)的浓注添加。在葡萄糖浓度下降低于预定浓度时，还向产生生物反应器中添加40％葡萄糖进料溶液。在细胞存活率达到≤70％时或在开始产生生物反应器阶段后14天(以先发生者为准)起始产生生物反应器的收获。
粗制细胞培养收获经历澄清、蛋白质A层析、病毒灭活、Q膜过滤及羟磷灰石层析。随后通过纳米过滤、超滤及渗滤进一步纯化部分纯化物质，以得到通过添加药物赋形剂经配制的原料药。随后将原料药装瓶并储存。
将粗制细胞培养冷却，且随后经由连续叠片式(disc stack)离心进行压力转移。离心液自离心机直接流入深度型过滤器及Sartorius Sartopore 2增泽过滤器。在处理培养流体后，将深度型过滤器及最终过滤器用缓冲溶液冲洗以收集结合蛋白。收集合并的滤液，并于2℃至12℃下储存。
利用MabSelect SuRe管柱实现蛋白质A层析。在使用之前，在MabSelect SuRe管柱上使用平衡缓冲液实施储存后冲洗步骤。将管柱平衡并将冷冻的澄清收获物直接装载至管柱上。每个循环的典型最大管柱负荷是40g产物/升树脂。在装载后，在管柱上实施两次洗涤，之后用50mM乙酸(pH 3.0)洗脱。基于OD开始并结束洗脱物的收集。在循环之间，对管柱进行洗脱后洗涤并利用平衡缓冲液再生，并在平衡之前利用0.2M氢氧化钠进行再生后洗涤用于下一循环。
使用磷酸将蛋白质A洗脱物的pH调节至3.5±0.1并保持30至60分钟。用精氨酸及Tris中和病毒灭活蛋白质A洗脱物。随后使材料通过串联的Millipore X0HC过滤器及CR40活性碳过滤器，之后通过Sartorius Sartopore 2过滤器。在Sartorius Sartopore 2过滤器后串联放置Q膜过滤器。在Q膜后串联放置第二Sartorius Sartopore 2。在完成装载后，将过滤器用≥128CV的缓冲液的Q膜冲洗以回收保留在过滤器上的任何产物。收集Q滤液及洗涤物，并保持于2℃至25℃下。
CaPure羟磷灰石管柱是以结合-及-洗脱模式操作。将管柱用10mM磷酸钠(pH 6.7)以200cm/hr线性流速平衡5个管柱体积。将包含双特异性结合蛋白的Q过滤器流过池以100cm/hr及以约30g/L容量直接装载至管柱上。装载后，将管柱用3管柱体积的平衡缓冲液洗涤，随后用25mM磷酸钠、114mM氯化钠(pH 6.7)的洗脱缓冲液洗脱。
使用Sartorius Sartopore 20.1μm预过滤器、之后使用Planova 20N病毒过滤器实施纳米过滤。在产物的病毒过滤之前，将过滤器串用注射用水及10mM磷酸钠(pH 6.7)冲洗。随后将羟磷灰石管柱洗脱物泵送穿过过滤器串，靶向Planova过滤器上的14psig入口压力。
将纳米滤液浓缩至靶浓度，之后利用30kD Millipore Pellicon 3 Ultracel再生纤维素膜渗滤，这些膜是于18℃至25℃下由10渗滤体积的渗滤缓冲液10mM磷酸盐(pH 7.5)实施。渗滤后，收集渗余物并用渗滤缓冲液冲洗系统。随后将渗余物用赋形剂溶液稀释成最终配制品。
实例6-结合CD40及其他肿瘤抗原的式(I)的双特异性结合蛋白的设计及活体外评估
评估针对额外肿瘤抗原的结合结构域在式(I)的双特异性结合蛋白中引导CD40活化的能力。分别使用针对肿瘤抗原柄蛋白-4(克隆66.3)、PSMA(克隆SAM3.1)及EGFR(克隆G30Y)的结构域构建CD40/柄蛋白-4、CD40/PSMA及CD40/EGFR双特异性结合蛋白。在所有情形下，双特异性分子中的CD40结构域是改编自抗人CD40人源化抗体huAb6-1(克隆AD163.162.1)(表6-1)。在所有实例中，CD40结构域在VH→VL方向上是huAb6-1，连接CH3结构域与scFv的连接体包含SEQ ID NO：251，且恒定区是源自具有V273Y取代的人类IgG1。显示scFv内肿瘤抗原可变结构域的取向(在N→C方向上)。
表6-1中的氨基酸序列示于图10B-10D中。
在式(I)的双特异性结合蛋白的阐释性实例中，利用结合至CD40及柄蛋白-4的示例性结合蛋白R87(图11A)以及结合至CD40及PSMA的示例性双特异性蛋白R89(图11B)观察到B细胞活化增强。图11A图解说明在与单独B细胞孵育(上图)或B细胞与HEK293细胞一起培养(中间图)时，类似于同种型匹配的阴性对照，R87诱导最小B细胞增殖。在B细胞与表达柄蛋白-4的HEK293细胞一起培养时(下图)，R87增强B细胞增殖至显著高于由抗CD40抗体huAb6-1刺激的水平。类似地，在图11B中，R89在具有无PSMA的4T1细胞的共培养物中实现极小至无B细胞增殖，但在B细胞与表达PSMA的4T1细胞共培养时，显著增强B细胞增殖。
实例7-结合4-1BB及肿瘤抗原的式(I)的双特异性蛋白的设计及活体外评估
根据本领域已知方法人源化抗4-1BB大鼠抗体TABBY106及TABBY107以提供具有图7D-7E中所示的可变重链及轻链的人源化抗体。使用结构引导方法人源化抗体可变区，如Queen等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]，1989；86：10029-10033)所述。基于序列同源性选择待用作啮齿类动物CDR区的受体的人类V区框架，并在硅内构建可变区的同源性模型。预测与CDR区接触的V区中的氨基酸经啮齿类动物抗体的相应残基(若不同)取代。
抗体hu106-1具有SEQ ID NO：69的VH及SEQ ID NO：89的VL，而hu107-1具有SEQ IDNO：71的VH及SEQ ID NO：94的VL。hu106-1及hu107-1二者展示具有L234A及L235A变体的人类IgG1恒定区。人源化hu107-1展示与如实例3中所述的大鼠TABBY107相比类似的结合特性(通过表面等离子共振)(表7-1)。
*值是指指数标志，例如3.0E-09＝3.0×10-9。
结合4-1BB及间皮素的式(I)的示例性蛋白质是自人源化抗4-1BB抗体的VH及VL以及上文论述的抗间皮素抗体的氨基酸序列生成。示例性结合蛋白的氨基酸序列示于图8I-8M中。
使用表面等离子共振针对包含人源化4-1BB及人源化MSLN结合区的式(I)的双特异性蛋白测定示例性结合数据(表7-2)。保留与人类、食蟹猴及小鼠4-1BB的交叉反应以及与人类间皮素的结合。
*值是指指数标志，例如3.0E-09＝3.0×10-9。
使用0.05nM、0.14nM、0.4nM、1.2nM、3.7nM、11nM、33nM及100nM的测试结合蛋白浓度利用与经人类4-1BB或间皮素转染的HEK293细胞的FACS结合显示示例性结合蛋白与内源性人类4-1BB及间皮素的结合活性以及其各自的EC50。使用表达人类4-1BB(上图)或间皮素(下图)的HEK293细胞(图12A-12B)。使用与不同huIgG1恒定区共有hu106-1的VH及VL的抗4-1BB抗体hu106 IgG1或hu106 V273E(“106.1x1x”，左上图，分别具有人类IgG1或huIgG1V273E变体)、或与不同huIgG1恒定区共有hu107-1的VH及VL的hu107 V273E(“107.1x1x”，下图，具有huIgG1 V273E)或间皮素抗体HuAM15(由上图)作为对照。利用4-1BB及间皮素二者，本披露内容的示例性结合蛋白显示与期望靶标的结合。
在由NF-κB驱动的经人类4-1BB及荧光素酶报导基因转染的HEK293细胞中，结合至4-1BB及间皮素的式(I)的示例性双特异性结合蛋白仅在Fc交联剂存在下显示4-1BB激动剂活性以帮助4-1BB受体的成簇(上图)，且在不存在Fc交联剂、山羊抗人Fcγ抗体下不显示活性(下图)(图13)。根据实例3中所述的4-1BB NF-κB报导基因分析实施NF-κBHEK293细胞分析。
结合至4-1BB及间皮素的式(I)的示例性双特异性结合蛋白显示NF-κB的细胞表面人类间皮素依赖性活化。如图14A-14B中所示，双特异性结合蛋白在表达细胞表面间皮素的HEK293细胞中展现NF-κB的活化(上图)，而在经模拟转染子处理的HEK293细胞中给药双特异性结合蛋白时观察到极小至无活化(下图)。
另外，结合至4-1BB及间皮素二者的式(I)的示例性双特异性结合蛋白还可诱导4-1BB介导的CD8+T细胞的特异性活化。如图15A-15B中所示，根据实例3中所述的分析通过T-细胞增殖(图15A)或干扰素-γ产生(图15B)量测CD8+T细胞的活化，其显示在表达间皮素的CT26细胞而非在含有不表达间皮素的CT26细胞的共培养物的存在下CD8+T细胞的条件活化。以类似方式，在表达间皮素的PC3细胞(上图)而非在单独PC3细胞(下图)的存在下由结合4-1BB及间皮素的双特异性蛋白刺激CD8+T细胞(图15C)。
结合4-1BB及PSMA的式(I)的示例性双特异性蛋白是自人源化抗4-1BB抗体的VH及VL以及抗小鼠PSMA抗体的氨基酸序列生成。抗PSMA抗体的氨基酸序列示于图10A、10J及10K中，且示例性结合蛋白的氨基酸序列示于图10L中。
式(I)的双特异性结合蛋白结合至4-1BB及PSMA二者且显示NF-κB的细胞表面小鼠PSMA依赖性活化。如图15D-15E中所示，双特异性结合蛋白在表达细胞表面PSMA的HEK293细胞中展现NF-κB的活化(图15D)。另外，hu106mPSMA-1及hu106mPSMA-2在表达PSMA的CT26细胞存在下而非在含有不表达PSMA的CT26细胞的共培养物中在CD8+T细胞中显示活化(图15E)。
结合4-1BB及B7-H4的式(I)的示例性双特异性蛋白是自人源化抗4-1BB抗体的VH及VL以及抗B7-H4抗体的氨基酸序列生成。抗B7-H4抗体的氨基酸序列示于图10E-10G中，且示例性结合蛋白的氨基酸序列示于图10H-10I中。
根据图2A的DVD-Ig形式的双特异性结合蛋白是利用hu106-1的4-1BB可变结构域及HuAM15的间皮素结构域生成。然而，与上述式(I)的双特异性结合蛋白相反，4-1BB DVD-Ig双特异性蛋白在与CD8+T细胞共培养的表达间皮素的CT26中不显示CD8+T细胞的条件活化。
实例8-CD40/肿瘤抗原双特异性蛋白在癌细胞培养物中显示活体外抗肿瘤活性
式(I)的示例性双特异性结合蛋白显示介导培养物中的肿瘤细胞的杀死的条件免疫活化。实施分析，其测试示例性CD40/MSLN双特异性结合蛋白在刺激人类自体moDC以驱动T细胞以杀死表达MSLN的肿瘤细胞系中的能力。在此分析中，将稳定表达MSLN及绿色荧光蛋白(GFP)的PC3肿瘤细胞与自体DC及T细胞一起培养，并用对照或双特异性分子处理。在处理4天后，基于绿色荧光量化活细胞。如图16中所示，与同种型匹配的阴性对照抗体相比，经结合CD40及间皮素二者的示例性双特异性结合蛋白处理的培养物中的活细胞数目降低，表明式(I)的CD40/MSLN双特异性结合蛋白展现活体外抗肿瘤活性。
实例9-CD40/肿瘤抗原双特异性蛋白在预防性癌症模型中显示活体内抗肿瘤活性
已显示在预防性癌症动物模型中，结合至CD40及肿瘤抗原的式(I)的双特异性蛋白可防止表达细胞表面肿瘤抗原的肿瘤细胞生长。评估示例性双特异性结合蛋白抑制表达同源肿瘤抗原的PC3异种移植物肿瘤生长的能力。向NSG小鼠皮下接种纯化T细胞(5×105)、自体DC(1×105)及PC3-MSLN、PC3-柄蛋白-4或PC3-PSMA细胞(1×106)的混合物。在接种后立即腹膜内注射1mg/kg的抗CD40抗体或对照抗体或1mg/kg的式(I)的双特异性蛋白的单一剂量。每隔一天利用测径器量测肿瘤体积。每一数据点代表一组8只动物的平均肿瘤体积。
如图17A-17B中所示，与同种型对照相比，结合至CD40及间皮素(MSLN)、PSMA或柄蛋白-4的示例性结合蛋白对预防表达各自的细胞表面抗原的PC3人类前列腺癌肿瘤生长展现更强效效应。在具有表达MSLN的PC3细胞(图17A，上图)及表达柄蛋白-4的PC3细胞(图17B，上图)的两个模型中，与抗CD40抗体huAb6-1相比，双特异性蛋白h24及R87分别显示更佳或类似抗肿瘤活性。结合CD40及PSMA的双特异性蛋白B89提供比利用其相应抗CD40抗体huAb6-1观察的抗肿瘤活性更佳的抗肿瘤活性(图17A，下图)。相比之下，在不表达间皮素的PC3细胞中(图17B，下图)，双特异性结合蛋白h24显示与同种型对照抗体统计上不同的效应。
实例10-小鼠同基因肿瘤模型中示例性CD40/间皮素双特异性蛋白的评估
为测试CD40/MSLN双特异性蛋白是否可增强治疗窗，生成靶向鼠类CD40及MSLN的概念验证(proof-of-concept)式(I)分子LB-1。LB-1含有源自1C10(结合至小鼠CD40的激动剂抗CD40单克隆抗体)的N-末端scFv(VH→VL)、之后是鼠类IgG1铰链、重链CH2/CH3、及源自抗MSLN单克隆抗体克隆MOR06626的C-末端scFv结构域(VH→VL)(参见美国专利申请号2011/0027268)，其与人类及鼠类MSLN二者具有交叉反应性。LB-1的氨基酸序列(SEQ ID NO：400)示于图8A中。
小鼠双特异性式(I)蛋白质LB-1的结合数据概述于表10-1中。尽管分别与具有鼠类IgG1(mIgG1)的抗体1C10及MOR06626相比，LB-1显示与CD40及间皮素的EC50结合稍微减弱，对于每一靶标保存最大结合。
8.10.1.CD40/间皮素双特异性蛋白LB-1在小鼠同基因肿瘤模型中显示活体内抗肿瘤活性
使用稳定表达MSLN的鼠类肿瘤细胞系4T1(4T1-MSLN)以确立同基因免疫感受态Balb/c小鼠中的肿瘤。在4T1-MSLN同基因小鼠模型中比较式(I)的示例性双特异性结合蛋白LB-1与抗CD40 1C10mIgG1的效能及毒性。将具有4T1-MSLN肿瘤(50mm3)的小鼠随机化成以下8个组：5mg/kg的鼠类同种型对照组、5mg/kg的抗MSLN抗体MOR06626 mIgG1、及抗CD40抗体1C10 mIgG1及双特异性蛋白LB-1的组，其各自具有1.25、2.5及5mg/kg的三个剂量组。随后开始给药，1qw(即，每周一次给药)，持续3周。在第二剂量后24小时取血样，且针对ALT水平进行VetScan分析。通过细胞因子多任务分析(Millipore)量测血清细胞因子。
抗CD40抗体1C10 mIgG1及双特异性结合蛋白LB-1二者都以剂量依赖性方式抑制4T1-MSLN肿瘤生长，而抗MSLN抗体MOR06626 mIgG1具有与抗体同种型相当的抗肿瘤活性(图18)。于5mg/kg剂量下，双特异性结合蛋白LB-1及抗CD40抗体1C10 mIgG1二者都显示与同种型对照相比显著更高的肿瘤生长抑制。
8.10.2.CD40/间皮素双特异性蛋白LB-1显示与文献抗CD40抗体1C10相比降低的活体内毒性
在上述实验中，在细胞表面间皮素存在下活化CD40的示例性双特异性蛋白LB-1显示与相同剂量的抗CD40抗体1C10相比改良的肝毒性。于5mg/kg的有效剂量水平下，抗CD40抗体1C10诱导肝毒性，如由循环中肝酶丙氨酸转氨酶(ALT)的升高水平所指示。于相同剂量水平下，双特异性式(I)分子LB-1实现抗肿瘤效能而在循环中不引起ALT升高。如图19中所示，双特异性蛋白LB-1的肝毒性低于5mg/kg的抗体1C10的肝毒性，如由小鼠肝中升高的ALT水平所量测。
另外，于各自5mg/kg下，双特异性结合蛋白LB-1不呈现在施用相同剂量的抗CD40抗体1C10时所显示的升高的血清细胞因子水平。如图20中所示，与给药LB-1或对照小鼠IgG1相比，利用1C10观察白介素-6(IL-6)及TNF-α(“TNFa”)(左)、以及角质细胞化学吸引剂(KC)、干扰素γ诱导的蛋白质10(IP-10)及由干扰素-γ诱导的单核因子(MIG)(右)的升高的细胞因子水平。
进一步药效学分析指示，尽管抗CD40抗体1C10及双特异性蛋白LB-1二者都活化循环B细胞，但LB-1在循环中较不强效且其活性似乎更局限于肿瘤引流淋巴结。此外，双特异性蛋白LB-1增强肿瘤特异性T细胞反应(数据未显示)，这可能是由于抗原呈递细胞的肿瘤局限活化。
实例11-Balb/c小鼠肿瘤模型中示例性4-1BB/PSMA双特异性蛋白的评估
式(I)的示例性双特异性蛋白Hu106mPSMA-3(SEQ ID NO：447)及Hu106mPSMA-4(SEQ ID NO：448)各自展现与小鼠4-1BB及PSMA二者的结合。因此，其经选择用于在活体内实验中进一步评估以显示靶接合。根据部分8.3.3.2中所述分析获得的4-1BB FACS结合数据概述于下表11-1中。具有muIgG1恒定区的抗4-1BB抗体hu106-1(“hu106-1 mIgG1”)及恒定区中具有T252M的hu106-1 mIgG1(“hu106-1 T252M mIgG1”)、以及抗4-1BB结合蛋白Hu106mPSMA-3及Hu106mPSMA-4都展现约1nM的活体外结合。
仅出于简化蛋白质纯化的目的，hu106-1 mIgG1 T252M、Hu106mPSMA-3及Hu106mPSMA-4都含有CH2结构域中的T252M氨基酸取代以增强对蛋白质A的亲和力。参见Nagaoka，M.等人Protein Eng.[蛋白质工程]，第16(4)卷，243-245页(2003)。Hu106mPSMA-4与Hu106mPSMA-3的不同之处在于前一结合蛋白具有额外氨基酸取代N297A。先前已显示此突变可减小抗CD3抗体与小鼠FcγR的结合。参见Chao等人ImmunologicalInvestigations，第38卷，第76-92页(2009)。如上表11-1中通过比较hu106-1 mIgG1及hu106-1 T252M mIgG1所例示，突变对通过FACS的4-1BB结合具有最小效应。
结合4-1BB及PSMA的原型双特异性蛋白还显示如通过FACS量测的抗PSMA性质且概述于下表11-2中。双特异性蛋白Hu106mPSMA-3及Hu106mPSMA-4的PSMA结合活性与具有含有L234A/L235A双重突变的鼠类IgG2a同种型(“mIgG2a AA”)的PSMA抗体SAM103相当。
使用稳定表达PSMA的鼠类肿瘤细胞系CT26(CT26-PSMA)以确立同基因免疫感受态Balb/c小鼠中的肿瘤。在CT26-PSMA同基因小鼠模型中比较式(I)的示例性双特异性结合蛋白Hu106mPSMA-3及Hu106mPSMA-4与抗4-1BB抗体hu106-1 mIgG1 T252M的效能及毒性。将具有CT26-PSMA肿瘤(100mm3)的小鼠随机化成以下组(n＝8/组)：10mg/kg的鼠类同种型对照组、10mg/kg的抗4-1BB抗体hu106-1 mIgG1 T252M、及双特异性蛋白Hu106mPSMA-3及Hu106mPSMA-4的组，各自为10.7mg/kg以考虑双特异性蛋白的较高分子量。在接种后第18、20及22天给药抗体或结合蛋白总共三次。在第三剂量后24小时取血样，且针对ALT水平进行VetScan分析。通过细胞因子多任务分析(Millipore)量测血清细胞因子。
在10mg/kg的同种型抗体TIB191 mIgG1的三个剂量后，CT26-PSMA肿瘤继续生长，而不显著改变肿瘤生长速率(图21)。相比之下，经抗4-1BB抗体hu106-1 mIgG1 T252M或双特异性结合蛋白Hu106mPSMA-3或Hu106mPSMA-4处理的小鼠组都展现活体内效能，如通过与同种型处理相比肿瘤生长速率减小所量测。个体动物的数据显示同种型处理的动物的效能的均匀缺乏(图22A，上图)，但经抗体hu106-1 mIgG1 T252M(图22A，下图)或双特异性蛋白Hu106mPSMA-3(图22B，上图)处理的小鼠中的肿瘤生长速率降低。另外，在用双特异性蛋白Hu106mPSMA-4处理后，8只动物中的6只展现肿瘤生长速率减弱(图22B，下图)。
通过抗体或结合蛋白的第三及最后剂量后单核细胞趋化蛋白-1(“MCP-1”)、粒细胞巨噬细胞群落刺激因子(“GM-CSF”)、白介素-6(“IL-6”)及角质细胞化学吸引剂(“KC”)的血清水平量测促炎性细胞因子释放(图23A及23B)。与用抗体hu106-1 mIgG1 T252M处理相比，在双特异性蛋白Hu106mPSMA-3或Hu106mPSMA-4处理后，血清MCP-1、GM-CSF、IL-6及KC的水平较低。对于这些促炎性细胞因子而言，双特异性蛋白处理后的血清细胞因子水平与同种型处理后的细胞因子的血清水平相当。
还针对指示潜在肝毒性的CD45+免疫细胞浸润评估小鼠肝试样。收获小鼠的肝试样并于10％福尔马林(formalin)中固定过夜以经处理并包埋于石蜡块中。自这些块切出载玻片并通过免疫组织化学用大鼠抗小鼠CD45Ab(Becton Dickenson，编号550539)染色。扫描经染色载玻片并通过HALO影像分析(Indica Labs，Corrales，NM，USA)量化每一扫描影像上的CD45阳性免疫细胞。
在第26天收集肝(n＝7-9/组)以评估可表明毒性的免疫细胞浸润。与经抗体hu106-1 mIgG1 T252M处理的组相比，经Hu106mPSMA-3及Hu106mPSMA-4处理的小鼠的肝中的CD45+免疫细胞浸润减少(图23C)。
9.实施例
1.一种双特异性结合蛋白，其包含式(I)的两种多肽
X-H-Fc-L-scFvY (I)，
其中X是scFvX或Fab区，X特异性结合第一抗原且scFvY特异性结合第二抗原，H是铰链区，Fc包含免疫球蛋白的CH2及CH3区，L是多肽连接体，scFvX及scFvY各自独立地是单链可变片段，两种抗原中的一种是免疫调节性蛋白且另一种是肿瘤抗原。
2.如实施例1所述的双特异性结合蛋白，其中该免疫调节性蛋白是选自肿瘤坏死因子受体超家族蛋白及CD28家族蛋白的蛋白。
3.如实施例1或2所述的双特异性结合蛋白，其中该免疫调节性蛋白是选自CD40、4-1BB、TNFR2、ICOS、TRAILR1及TRAILR2。
4.如实施例1至3中任一项所述的双特异性结合蛋白，其中该肿瘤抗原是细胞表面肿瘤抗原。
5.如实施例1至4中任一项所述的双特异性结合蛋白，其中该肿瘤抗原是来自脑癌、乳癌、胃癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌及前列腺癌。
6.如实施例1至5中任一项所述的双特异性结合蛋白，其中该肿瘤抗原是选自间皮素、柄蛋白-4、表皮生长因子受体、前列腺特异性膜抗原及B7-H4。
7.如实施例1至6中任一项所述的双特异性结合蛋白，其中X是scFvX。
8.如实施例7所述的双特异性结合蛋白，其中该第一抗原是免疫调节性蛋白且该第二抗原是肿瘤抗原。
9.如实施例7或8所述的双特异性结合蛋白，其中scFvX或scFvY包含选自以下的VH区：
及选自以下的VL区：
10.如实施例7或8所述的双特异性结合蛋白，其中scFvX或scFvY包含选自以下的VH区：
及选自以下的VL区：
11.如实施例7至10中任一项所述的双特异性结合蛋白，其中scFvX或scFvY包含选自以下的VH区：
及选自以下的VL区：
12.如实施例1至11中任一项所述的双特异性结合蛋白，其中这两种多肽各自包含SEQ ID NO：401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、419、420及421中的任一者的氨基酸序列。
13.一种式(II)的多肽：scFvX-H-Fc-L-scFvY (II)，
其中L是多肽连接体，H是铰链区，Fc包含免疫球蛋白的CH2及CH3区，scFvX及scFvY各自独立地是单链可变片段，scFvX特异性结合第一抗原，scFvY特异性结合第二抗原，且这两种抗原中的一种是免疫调节性蛋白且另一种是肿瘤抗原。
14.如实施例13所述的多肽，其中该第一抗原是免疫调节性蛋白且该第二抗原是肿瘤抗原。
15.如实施例13或14所述的多肽，其中该免疫调节性蛋白是CD40或4-1BB。
16.如实施例13至15中任一项所述的多肽，其中该肿瘤抗原是选自间皮素、柄蛋白-4、表皮生长因子受体、前列腺特异性膜抗原及B7-H4。
17.如实施例13至16中任一项所述的多肽，其中scFvX-具有式(V)或(VI)的结构：
VH X-LX-VL X- (V)
VL X-LX-VH X- (VI)
其中VH X是可变重链，VL X是可变轻链，且LX是多肽连接体。
18.如实施例13至17中任一项所述的多肽，其中-scFvY具有式(VII)或(VIII)的结构：
-VL Y-LY-VH Y (VII)
-VH Y-LY-VL X (VIII)
其中VH Y是可变重链，VL Y是可变轻链，且LY是多肽连接体。
19.如实施例13至18中任一项所述的多肽，其中scFvX-具有式(V)的结构，且-scFvY具有式(VII)的结构。
20.如实施例13至19中任一项所述的多肽，其中VHX的氨基酸序列是：EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSITSNYYWNWIRQPPGKGLEWMGYIRYDGSNNYNPSLKNRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARLDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：17)；且VL X的氨基酸序列是DAVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLENTNGNTFLNWYLQKPGQSPQLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQVTHVPFTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO：44)。
21.如实施例13至20中任一项所述的多肽，其中VH Y的氨基酸序列是：EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGDTFKRYYVHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGVSTTYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAEVRGSGFNYFGMDVWGQGTL VTVSS(SEQ ID NO：120)；且VL Y的氨基酸序列是：SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYASWYQQKPGQSPVLVIYQDNRRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSDTYVFGTGTKVTVL(SEQ ID NO：137)。
22.如实施例13至21中任一项所述的多肽，其中L具有包含以下的氨基酸序列：VDGASSPVNVSSPSVQDI(SEQ ID NO：251)；VDGASSPVNVGSPSVQDI(SEQ ID NO：253)；GASSPVNVSSPSV(SEQ ID NO：254)；GGGGSGGGNGTGSGGGGS(SEQ ID NO：255)；LSAGGHGGLDNDTSAFHL(SEQ ID NO：256)；SDKTHTSPPSPAPESSGG(SEQ ID NO：257)；VTTTDFQIQTEMAATMET(SEQ ID NO：258)；DFLPTTAQPTKKSTLKKR(SEQ ID NO：259)；TESRSPPAENEVSTPMQA(SEQ ID NO：260)；GGGGSGGGNGSGSGGGGS(SEQ ID NO：261)；或GGGGSGGGSGGGSGGGGS(SEQ ID NO：262)。
23.如实施例13至22中任一项所述的多肽，其中LX及LY各自具有包含以下的氨基酸序列：GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：301)；GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：302)；GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：303)；GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQID NO：304)；GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：305)；或GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：306)。
24.一种式(III)的多肽：
Fab-H-Fc-L-ScFvY (III)，
其中L是多肽连接体，H是铰链区，Fc包含免疫球蛋白的CH2及CH3区，Fab是片段抗原结合区，scFvY是单链可变片段，Fab特异性结合第一抗原，scFvY特异性结合第二抗原，且该第一抗原是肿瘤抗原且该第二抗原是免疫调节性蛋白。
25.一种式(IV)的多肽：
VH-CH1-H-Fc-L-scFvY (IV)，
其中L是多肽连接体，VH-CH1在与包含VL-CL的肽组合时特异性结合第一抗原，CH1是CH1恒定结构域，CL是轻链恒定结构域，H是铰链区，Fc包含免疫球蛋白的CH2及CH3区，VH是可变重链，VL是可变轻链，scFvY是单链可变片段，scFvY特异性结合第二抗原，且该第一抗原是肿瘤抗原且该第二抗原是免疫调节性蛋白。
26.如实施例24或25所述的多肽，其中-scFvY具有式(VII)或(VIII)的结构：
-VL Y-LY-VH Y (VII)
-VH Y-LY-VL X (VIII)
其中VH Y是可变重链，VL Y是可变轻链，且LY是多肽连接体。
27.如实施例26所述的多肽，其中VH Y的氨基酸序列是：EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSITSNYYWNWIRQPPGKGLEWMGYIRYDGSNNYNPSLKNRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARLDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：17)；且VL Y的氨基酸序列是DAVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLENTNGNTFLNWYLQKPGQSPQLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQVTHVPFTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO：44)。
28.如实施例26或27所述的多肽，其中L具有包含以下的氨基酸序列：VDGASSPVNVSSPSVQDI(SEQ ID NO：251)；VDGASSPVNVGSPSVQDI(SEQ ID NO：253)；GASSPVNVSSPSV(SEQ ID NO：254)；GGGGSGGGNGTGSGGGGS(SEQ ID NO：255)；LSAGGHGGLDNDTSAFHL(SEQ ID NO：256)；SDKTHTSPPSPAPESSGG(SEQ ID NO：257)；VTTTDFQIQTEMAATMET(SEQ ID NO：258)；DFLPTTAQPTKKSTLKKR(SEQ ID NO：259)；TESRSPPAENEVSTPMQA(SEQ ID NO：260)；GGGGSGGGNGSGSGGGGS(SEQ ID NO：261)；或GGGGSGGGSGGGSGGGGS(SEQ ID NO：262)。
29.如实施例26至28中任一项所述的多肽，其中LY具有包含以下的氨基酸序列：GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：301)；GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：302)；GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：303)；GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQID NO：304)；GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：305)；或GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：306)。
30.如实施例1至29中任一项所述的多肽，其中该Fc包含IgG1、IgG2或IgG4的CH2区。
31.如实施例30所述的多肽，其中该CH2区是包含氨基酸取代V263L或V273E的变体人类IgG1。
32.如实施例1至31中任一项所述的多肽，其中H是包含氨基酸取代C220S的变体IgG1铰链。
33.如实施例1至32中任一项所述的多肽，其中Fc包含氨基酸取代D356E及L358M。
34.一种药物组合物，其包含如实施例1至12中任一项所述的双特异性结合蛋白及药学上可接受的运载体。
35.一种核酸，其包含编码如实施例1至12中任一项所述的双特异性结合蛋白的核苷酸序列。
36.一种载体，其包含如实施例35所述的核酸。
37.一种原核宿主细胞，其经如实施例36所述的载体转化。
38.一种真核宿主细胞，其经如实施例36所述的载体转化。
39.一种真核宿主细胞，其经工程化以表达实施例35所述的核酸。
40.如实施例39所述的真核宿主细胞，其是哺乳动物宿主细胞。
41.一种产生双特异性结合蛋白的方法，其包含：(a)培养如实施例38或实施例39所述的宿主细胞，及(b)回收该蛋白质。
42.一种活化免疫系统的方法，其包含向有需要的患者施用如实施例1至12中任一项所述的双特异性结合蛋白或如实施例34所述的药物组合物。
43.一种治疗癌症的方法，其包含向有需要的患者施用如实施例1至12中任一项所述的双特异性结合蛋白或如实施例34所述的药物组合物。
本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请及其他文件都是出于所有目的通过引用以其整体并入本文中，其并入程度如同出于所有目的将每个单独出版物、专利、专利申请或其他文件单独指明以引用方式并入一般。
尽管已阐释并描述多个具体实施例，但应了解，可在不背离本发明精神及范畴的情形下作出各种改变。

Claims (82)

1.一种能够结合CD40且能够结合间皮素的双特异性结合蛋白，其包含式(II)的两种多肽：
scFvX-H-Fc-L-scFvY (II)，
其中
L是多肽连接体，
H是铰链区，
Fc包含免疫球蛋白的CH2及CH3区，
scFvX及scFvY各自独立地是单链可变片段，
scFvX特异性结合第一抗原，
scFvY特异性结合第二抗原，并且
这两种抗原中的一种是CD40且另一种是间皮素。
2.如权利要求1所述的双特异性结合蛋白，其中scFvX-具有式(V)或(VI)的结构：
VH X-LX-VL X-(V)，
VL X-LX-VH X-(VI)，
其中VH X是可变重链，VL X是可变轻链，且LX是多肽连接体。
3.如权利要求1或2所述的双特异性结合蛋白，其中-scFvY具有式(VII)或(VIII)的结构：
-VL Y-LY-VH Y (VII)，
一VH Y-LY-VL X (VIII)，
其中VH Y是可变重链，VL Y是可变轻链，且LY是多肽连接体。
4.如权利要求1至3中任一项所述的双特异性结合蛋白，其中L具有包含SEQ ID NO：251及253-262中的任一者的氨基酸序列。
5.如权利要求2或3所述的双特异性结合蛋白，其中LX及LY各自具有包含SEQ ID NO：301-306中的任一者的氨基酸序列。
6.如权利要求1至5中任一项所述的双特异性结合蛋白，其中结合CD40的该scFv包含具有根据SEQ ID NO：25的CDR-H1、根据SEQ ID NO：26的CDR-H2及根据SEQ ID NO：27的CDR-H3的VH，以及具有根据SEQ ID NO：55的CDR-L1、根据SEQ ID NO：56的CDR-L2及根据SEQ IDNO：57的CDR-L3的VL。
7.如权利要求6所述的双特异性结合蛋白，其中结合CD40的该scFv包含根据SEQ IDNO：17-23中的任一者的VH及根据SEQ ID NO：44-51中的任一者的VL。
8.如权利要求7所述的双特异性结合蛋白，其中结合CD40的该scFv包含根据SEQ IDNO：17的VH及根据SEQ ID NO：44的VL。
9.如权利要求7所述的双特异性结合蛋白，其中结合CD40的该scFv包含根据SEQ IDNO：18的VH及根据SEQ ID NO：44的VL。
10.如权利要求7所述的双特异性结合蛋白，其中结合CD40的该scFv包含根据SEQ IDNO：17的VH及根据SEQ ID NO：49的VL。
11.如权利要求7所述的双特异性结合蛋白，其中结合CD40的该scFv包含根据SEQ IDNO：17的VH及根据SEQ ID NO：50的VL。
12.如权利要求1至11中任一项所述的双特异性结合蛋白，其中结合间皮素的该scFv包含具有根据SEQ ID NO：241的CDR-H1、根据SEQ ID NO：242的CDR-H2及根据SEQ ID NO：243的CDR-H3的VH，以及具有根据SEQ ID NO：244的CDR-L1、根据SEQ ID NO：245的CDR-L2及根据SEQ ID NO：246的CDR-L3的VL。
13.如权利要求12所述的双特异性结合蛋白，其中结合间皮素的该scFv包含根据SEQID NO：107-128中的任一者的VH及根据SEQ ID NO：136-142中的任一者的VL。
14.如权利要求13所述的双特异性结合蛋白，其中结合间皮素的该scFv包含根据SEQID NO：120的VH及根据SEQ ID NO：137的VL。
15.如权利要求13所述的双特异性结合蛋白，其中结合间皮素的该scFv包含根据SEQID NO：120的VH及根据SEQ ID NO：141的VL。
16.如权利要求1至11中任一项所述的双特异性结合蛋白，其中结合间皮素的该scFv包含根据SEQ ID NO：129的VH及根据SEQ ID NO：143的VL。
17.如权利要求1至16中任一项所述的双特异性结合蛋白，其中这两种多肽各自包含SEQ ID NO：405、406、407、408、412、419、420及421中的任一者的氨基酸序列。
18.如权利要求17所述的双特异性结合蛋白，其中这两种多肽各自包含SEQ ID NO：405的氨基酸序列。
19.如权利要求17所述的双特异性结合蛋白，其中这两种多肽各自包含SEQ ID NO：406的氨基酸序列。
20.如权利要求17所述的双特异性结合蛋白，其中这两种多肽各自包含SEQ ID NO：407的氨基酸序列。
21.如权利要求17所述的双特异性结合蛋白，其中这两种多肽各自包含SEQ ID NO：408的氨基酸序列。
22.如权利要求17所述的双特异性结合蛋白，其中这两种多肽各自包含SEQ ID NO：412的氨基酸序列。
23.如权利要求17所述的双特异性结合蛋白，其中这两种多肽各自包含SEQ ID NO：419的氨基酸序列。
24.如权利要求17所述的双特异性结合蛋白，其中这两种多肽各自包含SEQ ID NO：420的氨基酸序列。
25.如权利要求17所述的双特异性结合蛋白，其中这两种多肽各自包含SEQ ID NO：421的氨基酸序列。
26.一种药物组合物，其包含如权利要求1至25中任一项所述的双特异性结合蛋白及药学上可接受的运载体。
27.一种治疗癌症的方法，其包括向有需要的患者施用如权利要求1至25中任一项所述的双特异性结合蛋白或如权利要求26所述的药物组合物，任选地其中该癌症是实体瘤。
28.一种能够结合4-1BB且能够结合前列腺特异性膜抗原的双特异性结合蛋白，其包含式(II)的两种多肽：
scFvX-H-Fc-L-scFvY (II)，
其中
L是多肽连接体，
H是铰链区，
Fc包含免疫球蛋白的CH2及CH3区，
scFvX及scFvY各自独立地是单链可变片段，
scFvX特异性结合第一抗原，
scFvY特异性结合第二抗原，并且
这两种抗原中的一种是4-1BB且另一种是前列腺特异性膜抗原。
29.如权利要求28所述的双特异性结合蛋白，其中scFvX-具有式(V)或(VI)的结构：
VH X-LX-VL X-(V)，
VL X-LX-VH X-(VI)，
其中VH X是可变重链，VL X是可变轻链，且LX是多肽连接体。
30.如权利要求28或29所述的双特异性结合蛋白，其中-scFvY具有式(VII)或(VIII)的结构：
-VL Y-LY-VH Y (VII)，
-VH Y-LY-VL X (VIII)，
其中VH Y是可变重链，VL Y是可变轻链，且LY是多肽连接体。
31.如权利要求28至30中任一项所述的双特异性结合蛋白，其中L具有包含SEQ ID NO：251及253-262中的任一者的氨基酸序列。
32.如权利要求29或30所述的双特异性结合蛋白，其中LX及LY各自具有包含SEQ ID NO：301-306中的任一者的氨基酸序列。
33.如权利要求28至32中任一项所述的双特异性结合蛋白，其中结合4-1BB的该scFv包含具有根据SEQ ID NO：280的CDR-H1、根据SEQ ID NO：281的CDR-H2及根据SEQ ID NO：282的CDR-H3的VH，以及具有根据SEQ ID NO：283的CDR-L1、根据SEQ ID NO：284的CDR-L2及根据SEQ ID NO：285的CDR-L3的VL。
34.如权利要求28至32中任一项所述的双特异性结合蛋白，其中结合4-1BB的该scFv包含根据SEQ ID NO：69-72中任一者的VH及根据SEQ ID NO：89-95中的任一者的VL。
35.如权利要求34所述的双特异性结合蛋白，其中结合4-1BB的该scFv包含根据SEQ IDNO：69的VH及根据SEQ ID NO：89的VL。
36.如权利要求34所述的双特异性结合蛋白，其中结合4-1BB的该scFv包含根据SEQ IDNO：71的VH及根据SEQ ID NO：94的VL。
37.如权利要求28至36中任一项所述的双特异性结合蛋白，其中结合前列腺特异性膜抗原的该scFv包含根据SEQ ID NO：191-197中任一者的VH及根据SEQ ID NO：201-207中的任一者的VL。
38.如权利要求37所述的双特异性结合蛋白，其中结合前列腺特异性膜抗原的该scFv包含根据SEQ ID NO：192的VH及根据SEQID NO：202的VL。
39.如权利要求28至38中任一项所述的双特异性结合蛋白，其中这两种多肽各自包含SEQ ID NO：445-448中的任一者的氨基酸序列。
40.如权利要求39所述的双特异性结合蛋白，其中这两种多肽各自包含SEQ ID NO：446的氨基酸序列。
41.如权利要求39所述的双特异性结合蛋白，其中这两种多肽各自包含SEQ ID NO：447的氨基酸序列。
42.如权利要求39所述的双特异性结合蛋白，其中这两种多肽各自包含SEQ ID NO：448的氨基酸序列。
43.一种药物组合物，其包含如权利要求28至42中任一项所述的双特异性结合蛋白及药学上可接受的运载体。
44.一种治疗癌症的方法，其包含向有需要的患者施用如权利要求28至42中任一项所述的双特异性结合蛋白或如权利要求43所述的药物组合物，任选地其中该癌症是实体瘤。
45.一种能够结合CD40且能够结合间皮素的双特异性结合蛋白，其包含式(III)的两种多肽：
Fab-H-Fc-L-scFvY(III)，
其中
L是多肽连接体，
H是铰链区，
Fc包含免疫球蛋白的CH2及CH3区，
Fab是片段抗原结合区，
scFvY是单链可变片段，
Fab特异性结合第一抗原，
scFvY特异性结合第二抗原，并且
该第一抗原是间皮素且该第二抗原是CD40。
46.如权利要求45所述的双特异性结合蛋白，其中-scFvY具有式(VII)或(VIII)的结构：
-VL Y-LY-VH Y (VII)，
-VH Y-LY-VL X (VIII)，
其中VH Y是可变重链，VL Y是可变轻链，且LY是多肽连接体。
47.如权利要求45或46所述的双特异性结合蛋白，其中L具有包含SEQ ID NO：251及253-262中的任一者的氨基酸序列。
48.如权利要求46所述的双特异性结合蛋白，其中LY具有包含SEQ ID NO：301-306中的任一者的氨基酸序列。
49.如权利要求45至48中任一项所述的双特异性结合蛋白，其中结合CD40的该scFv包含具有根据SEQ ID NO：25的CDR-H1、根据SEQ ID NO：26的CDR-H2及根据SEQ ID NO：27的CDR-H3的VH，以及具有根据SEQ ID NO：55的CDR-L1、根据SEQ ID NO：56的CDR-L2及根据SEQID NO：57的CDR-L3的VL。
50.如权利要求45至49中任一项所述的双特异性结合蛋白，其中结合CD40的该scFv包含根据SEQ ID NO：17-23中任一者的VH及根据SEQ ID NO：44-51中的任一者的VL。
51.如权利要求50所述的双特异性结合蛋白，其中结合CD40的该scFv包含根据SEQ IDNO：17的VH及根据SEQ ID NO：44的VL。
52.如权利要求50所述的双特异性结合蛋白，其中结合CD40的该scFv包含根据SEQ IDNO：22的VH及根据SEQ ID NO：48的VL。
53.如权利要求50所述的双特异性结合蛋白，其中结合CD40的该scFv包含根据SEQ IDNO：23的VH及根据SEQ ID NO：49的VL。
54.如权利要求45至53中任一项所述的双特异性结合蛋白，其中结合间皮素的该Fab包含根据SEQ ID NO：107-129中任一者的VH及根据SEQ ID NO：136-143中的任一者的VL。
55.如权利要求54所述的双特异性结合蛋白，其中结合间皮素的该Fab包含根据SEQ IDNO：120的VH及根据SEQ ID NO：137的VL。
56.如权利要求54所述的双特异性结合蛋白，其中结合间皮素的该Fab包含根据SEQ IDNO：129的VH及根据SEQ ID NO：143的VL。
57.如权利要求45至56中任一项所述的双特异性结合蛋白，其中这两种多肽各自包含SEQ ID NO：351-370中的任一者的重链氨基酸序列及SEQ ID NO：371或372的轻链氨基酸序列。
58.如权利要求57所述的双特异性结合蛋白，其中这两种多肽各自包含SEQ ID NO：359的重链氨基酸序列及SEQ ID NO：371的轻链氨基酸序列。
59.如权利要求57所述的双特异性结合蛋白，其中这两种多肽各自包含SEQ ID NO：360的重链氨基酸序列及SEQ ID NO：371的轻链氨基酸序列。
60.如权利要求57所述的双特异性结合蛋白，其中这两种多肽各自包含SEQ ID NO：369的重链氨基酸序列及SEQ ID NO：372的轻链氨基酸序列。
61.如权利要求57所述的双特异性结合蛋白，其中这两种多肽各自包含SEQ ID NO：370的重链氨基酸序列及SEQ ID NO：372的轻链氨基酸序列。
62.一种药物组合物，其包含如权利要求45至61中任一项所述的双特异性结合蛋白及药学上可接受的运载体。
63.一种治疗癌症的方法，其包含向有需要的患者施用如权利要求45至61中任一项所述的双特异性结合蛋白或如权利要求62所述的药物组合物，任选地其中该癌症是实体瘤。
64.一种双特异性结合蛋白，其包含式(I)的两种多肽：
X-H-Fc-L-scFvY (I)，
其中
X是scFvX或Fab区，
其中X特异性结合第一抗原且scFvY特异性结合第二抗原，
H是铰链区，
Fc包含免疫球蛋白的CH2及CH3区，
L是多肽连接体，
scFvX及scFvY各自独立地是单链可变片段，这两种抗原中的一种是免疫调节性蛋白且另一种是肿瘤抗原，且
该双特异性结合蛋白活化该免疫调节性蛋白。
65.如权利要求64所述的双特异性结合蛋白，其中该免疫调节性蛋白是选自肿瘤坏死因子受体超家族蛋白及CD28家族蛋白的蛋白。
66.如权利要求64或65所述的双特异性结合蛋白，其中该免疫调节性蛋白是选自CD40、4-1BB、TNFR2、ICOS、TRAILR1及TRAILR2。
67.如权利要求64至66中任一项所述的双特异性结合蛋白，其中该肿瘤抗原是细胞表面肿瘤抗原。
68.如权利要求64至67中任一项所述的双特异性结合蛋白，其中该肿瘤抗原是来自脑癌、乳癌、胃癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌及前列腺癌。
69.如权利要求64至68中任一项所述的双特异性结合蛋白，其中该肿瘤抗原是选自间皮素、柄蛋白-4、表皮生长因子受体、前列腺特异性膜抗原及B7-H4。
70.如权利要求64至69中任一项所述的双特异性结合蛋白，其中X是scFvX。
71.如权利要求70所述的双特异性结合蛋白，其中该第一抗原是免疫调节性蛋白且该第二抗原是肿瘤抗原。
72.如权利要求64至71中任一项所述的双特异性结合蛋白，其中L具有包含SEQ ID NO：251及253-262中的任一者的氨基酸序列。
73.一种药物组合物，其包含如权利要求64至72中任一项所述的双特异性结合蛋白及药学上可接受的运载体。
74.一种治疗癌症的方法，其包括向有需要的患者施用如权利要求64至72中任一项所述的双特异性结合蛋白或如权利要求73所述的药物组合物，任选地其中该癌症是实体瘤。
75.一种核酸，其包含编码如权利要求1至25、28至42、45至61及64至72中任一项所述的双特异性结合蛋白的核苷酸序列。
76.一种载体，其包含如权利要求74所述的核酸。
77.一种原核宿主细胞，其经如权利要求76所述的载体转化。
78.一种真核宿主细胞，其经如权利要求76所述的载体转化。
79.一种真核宿主细胞，其经工程化以表达如权利要求75所述的核酸。
80.如权利要求79所述的真核宿主细胞，其是哺乳动物宿主细胞。
81.一种产生双特异性结合蛋白的方法，所述方法包括：(a)培养如权利要求78或权利要求79所述的宿主细胞，及(b)回收该蛋白质。
82.一种活化免疫系统的方法，所述方法包括向有需要的患者施用如权利要求1至25、28至42、45至61及64至72中任一项所述的双特异性结合蛋白；或如权利要求26、43、62及73中任一项所述的药物组合物。
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