CN109136196A

CN109136196A - 铜绿假单胞菌噬菌体尾丝蛋白用于制备细菌检测试剂的用途

Info

Publication number: CN109136196A
Application number: CN201811156121.XA
Authority: CN
Inventors: 付志锋; 何勇; 卢曙光
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2018-09-30
Filing date: 2018-09-30
Publication date: 2019-01-04

Abstract

本发明涉及铜绿假单胞菌噬菌体尾丝蛋白用于制备细菌检测试剂的用途，属于微生物检测技术领域。一株铜绿假单胞菌噬菌体，保藏号为CGMCC No.15569。所述的铜绿假单胞菌噬菌体尾丝蛋白P069用于制备细菌检测试剂的用途。本发明的有益效果在于：提供了一种能特异性识别铜绿假单胞菌的尾丝蛋白P069，将其作为分子识别试剂，特异性地捕获铜绿假单胞菌，再结合其他分析技术，针对铜绿假单胞菌全细胞进行检测；该分子识别试剂具有检测快速、方便、准确、特异、灵敏、稳定的优点，有望应用于铜绿假单胞菌的现场检测和快速筛查，能够为临床诊断、食品安全和环境检测等领域检测铜绿假单胞菌提供有力的技术支持平台。

Description

铜绿假单胞菌噬菌体尾丝蛋白用于制备细菌检测试剂的用途

技术领域

本发明涉及铜绿假单胞菌噬菌体尾丝蛋白用于制备细菌检测试剂的用途，属于微生物检测技术领域，尤指以铜绿假单胞菌噬菌体尾丝蛋白P069作为铜绿假单胞菌的分子识别试剂，将其应用到铜绿假单胞菌的检测的技术。

背景技术

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种发酵型革兰阴性致病菌，是三大条件致病菌之一，在肺囊性纤维化病人中致死率相当高，是医院院内感染和新生儿重症监护感染的主要原因。因此，建立快速、方便、灵敏的铜绿假单胞菌检测方法，对于人体健康、疾病治疗有着重要意义。

铜绿假单胞菌的现有检测方法中，主要包括传统培养、聚合酶链式反应(PCR)、免疫分析等方法。作为“金标准”的传统培养方法准确、灵敏，但耗时、费力；基于致病菌遗传物质的PCR方法能显著地缩短地检测时间，灵敏度高，但PCR需要熟练的操作技巧和核酸提取步骤，并且在苛刻的环境条件下，酶的活性会被抑制；免疫分析方法基于致病菌的抗原成份与抗体结合，具有快速、高特异性等特点，但抗体存在批次差异和交叉免疫原性。

因此，寻找快速、特异、批次稳定、鉴别铜绿假单胞菌检测方法迫在眉睫。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供能特异性识别铜绿假单胞菌的噬菌体尾丝蛋白P069，将其作为分子识别试剂，可快速、方便、特异地检测铜绿假单胞菌。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明首先提供一株铜绿假单胞菌噬菌体，菌株名为PAP1，保藏号为CGMCCNo.15569，分类命名为铜绿假单胞菌烈性噬菌体；该铜绿假单胞菌噬菌体于2018年7月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

所述的铜绿假单胞菌噬菌体用于制备细菌检测试剂的用途。

该铜绿假单胞菌噬菌体PAP1的分离方法如下：加入0.33mg固体CaCl₂至3.0L的医院污水中，然后用0.22μm滤膜滤过除菌，过滤液供噬菌体分离用。将过滤液加入上述150mL对数初期的铜绿假单胞菌LB培养基中，37℃和180rpm条件下过夜培养，滤过除菌。取0.3mL滤液与0.3mL铜绿假单胞菌菌液在室温下孵育15min，然后再加入4.0mL半固体LB培养基，涡旋混匀后，立即倒入固体LB平板上，最后在37℃过夜孵育，直到有噬菌斑出现。

铜绿假单胞菌噬菌体PAP1的培养：①挑取铜绿假单胞菌单个菌落，接种至150mL液体LB培养基中，37℃和180rpm条件下培养铜绿假单胞菌约6h至对数生长期初期(OD600＝0.3～0.4)；②加入单个噬菌斑至上述菌液中，37℃和180rpm条件下继续培养约5.5h直至大量细胞碎片出现，菌液变澄清；③在裂解液中分别加入30μL的5μg/μL DNase I和15μL的10μg/μL RNase A，37℃水浴30min；④加入8.76g固体NaCl，轻摇混匀溶解后，冰浴1h，10000g和4℃条件下离心10min，小心收集上清液；⑤加入1.44g固体PEG 8000至收集的上清液中，使PEG 8000终浓度为10％，充分振荡溶解，4℃过夜，使噬菌体形成沉淀，12000g和4℃条件下离心10min，弃去上清液；⑥用1.0mL的TM液分两次洗涤噬菌体沉淀，合并洗涤液；⑦加入等体积氯仿萃取杂蛋白，轻微振荡混匀30s，5000g和4℃条件下离心10min，吸取上层水相；⑧用等体积氯仿按照步骤7重新萃取一次，小心吸取上层水相，测定噬菌体滴度后，备用。

铜绿假单胞菌噬菌体PAP1的特性：PAP1是一株有尾烈性噬菌体，具有70nm大小的头部和130nm长的尾部，吸附潜伏期约为20min，裂解爆发期约为60min，最佳感染复数为0.01。

本发明的第二个方面，提供一种铜绿噬菌体尾丝蛋白P069及其用途。

铜绿假单胞菌噬菌体尾丝蛋白P069，来源于铜绿假单胞菌噬菌体CGMCCNo.15569，其核酸序列如序列SEQ ID No：1所示。

所述的铜绿假单胞菌噬菌体的尾丝蛋白P069，其特征在于：其氨基酸序列如序列SEQ ID No：2所示。

所述的铜绿假单胞菌噬菌体的尾丝蛋白P069用于制备细菌检测试剂的用途。所述细菌为铜绿假单胞菌。

铜绿假单胞菌噬菌体尾丝蛋白P069无内源性裂解活性。利用ATP生物发光表征尾丝蛋白P069的内源性裂解活性：将尾丝蛋白P069与铜绿假单胞菌菌液混合后，利用ATP生物发光检测混合液中的ATP，从而表征其内源性裂解活性，同时用相同体积的溶剂和噬菌体作为阴性和阳性对照。

铜绿假单胞菌噬菌体尾丝蛋白P069具有特异性。利用ATP生物发光，表征尾丝蛋白P069对不同假单胞菌属、不同铜绿假单胞菌株的识别特异性。将尾丝蛋白P069作为铜绿假单胞菌的特异性识别分子试剂，特异性地检测铜绿假单胞菌。

本发明的第三个方面，提供一种检测铜绿假单胞菌的方法。

一种检测铜绿假单胞菌的方法，包括如下步骤：

(1)将铜绿假单胞菌菌悬液标准品用捕获缓冲液稀释制成铜绿假单胞菌菌液，把铜绿假单胞菌尾丝蛋白P069作为特异性分子捕获试剂，当P069特异性捕获铜绿假单胞菌后，用洗涤液清洗，再利用单位点识别生物发光法或双位点识别夹心荧光法，记录光信号，以发光强度对铜绿假单胞菌浓度作图，绘制工作曲线；

(2)利用铜绿假单胞菌尾丝蛋白P069特异性地捕获向待测样品中的铜绿假单胞菌，用洗涤液清洗，再结合单位点识别生物发光法或双位点识别夹心荧光法，记录光信号，根据发光强度和步骤(a)绘制的工作曲线求得待测样品中铜绿假单胞菌的浓度。

所述铜绿假单胞菌尾丝蛋白P069是来源于铜绿假单胞菌噬菌体CGMCC No.15569铜绿假单胞菌尾丝蛋白P069。

优选的，所述检测铜绿假单胞菌的方法为单位点识别生物发光法，步骤为：

(1)将铜绿假单胞菌菌悬液标准品用捕获缓冲液稀释制成铜绿假单胞菌菌液，把尾丝蛋白P069标记到磁性纳米颗粒后作为特异性分子捕获试剂，当P069功能化的磁性纳米颗粒特异性捕获铜绿假单胞菌后，磁性分离后，用洗涤液清洗后，分散到Tris缓冲液中，再加入ATP提取液和β-环糊精裂解释放细菌胞内ATP，接着用ATP生物发光液引发生物信号，记录光信号，以发光强度对铜绿假单胞菌浓度作图，绘制工作曲线；

(2)利用尾丝蛋白特异性地捕获向待测样品中的铜绿假单胞菌，用洗涤液清洗，再结合单位点识别生物发光法，记录光信号，根据发光强度和步骤(1)绘制的工作曲线求得待测样品中铜绿假单胞菌的浓度。

优选的，所述检测铜绿假单胞菌的方法为双位点识别夹心荧光法，步骤为：

(1)将铜绿假单胞菌菌悬液标准品用捕获缓冲液稀释制成铜绿假单胞菌菌液，把尾丝蛋白P069包被到微孔板中，当P069特异性捕获铜绿假单胞菌后，用洗涤液清洗后，加入罗丹明标记的噬菌体尾丝蛋白P069，继续孵育，再加洗涤液清洗后，在激发光照射下激发荧光信号，记录光信号，以荧光强度对铜绿假单胞菌浓度作图，绘制工作曲线；

(2)利用尾丝蛋白特异性地捕获向待测样品中的铜绿假单胞菌，用洗涤液清洗，再结合双位点识别夹心荧光法引发荧光信号，记录荧光信号，根据荧光强度和步骤(1)绘制的工作曲线求得待测样品中铜绿假单胞菌的浓度。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种能特异性识别铜绿假单胞菌的尾丝蛋白P069，将其作为分子识别试剂，特异性地捕获铜绿假单胞菌，再结合其他分析技术，针对铜绿假单胞菌全细胞进行检测；该分子识别试剂具有检测快速、方便、准确、特异、灵敏、稳定的优点，有望应用于铜绿假单胞菌的现场检测和快速筛查，能够为临床诊断、食品安全和环境检测等领域检测铜绿假单胞菌提供有力的技术支持平台。

附图说明

图1为咪唑洗脱蛋白的SDS-PAGE图。泳道1：200mM咪唑洗脱蛋白；泳道2：30mM咪唑洗脱蛋白。

图2A是基于铜绿假单胞菌噬菌体尾丝蛋白P069的单位点识别的生物发光检测铜绿假单胞菌的原理图。

图2B是基于铜绿假单胞菌噬菌体尾丝蛋白P069的双位点识别的夹心荧光检测铜绿假单胞菌的原理图。

图3A为生物发光检测铜绿假单胞菌的线性曲线图(n＝4)。

图3B为荧光检测铜绿假单胞菌的线性曲线图(n＝4)。

图4A为P069功能化磁性颗粒的电镜图。

图4B为铜绿假单胞菌-P069-磁性颗粒的电镜图。

图5为铜绿假单胞菌噬菌体尾丝蛋白P069的特异性检测结果。所有细菌的浓度为4.0×10⁵CFU/mL(n＝4)。Mixture A为金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、屎肠球菌、大肠杆菌、恶臭假单胞菌和青枯假单胞菌的混合物，Mixture B为Mixture A与铜绿假单胞菌的混合物。

图6为TRITC标记P069染色的铜绿假单胞菌的荧光显微镜图片，A为红色荧光场B为明场。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为本技术领域现有常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为可从商业途径得到的试剂和材料。凡根据本发明公开内容所进行的本领域等同替换，均属于本发明的保护范围。

实施例1：铜绿假单胞菌噬菌体尾丝蛋白P069的基因重组表达

一、材料

铜绿假单胞菌噬菌体，菌株名为PAP1，保藏号为CGMCC No.15569。

载体pET-21a(Novagen)

二、方法

1.铜绿假单胞菌噬菌体尾丝蛋白P069目的基因提取

(1)向950μL噬菌体PAP1中加入20μL的10μg/μL RNase A和30μL的5μg/μL DNaseI，37℃，静置1h；

(2)加入1.0mL 40mM的EDTA(pH 8.0)，灭活DNase I；

(3)加入5.0μL蛋白酶K和10mg的SDS，混匀，56℃温育1h，裂解噬菌体衣壳，释放DNA，并降解残留DNase I；

(4)加入2.0mL的平衡酚(pH 8.0)，5000g和4℃条件下离心10min，收集水层；

(5)加入2.0mL的氯仿，5000g和4℃条件下离心10min，收集水层；

(6)加入200μL的3M的醋酸钠和1.2mL的异丙醇，-20℃放置过夜，12000g和4℃条件下离心20min；

(7)加入1.0mL的70％的乙醇洗涤沉淀1次，12000g和4℃条件下离心10min，弃去乙醇；

(8)加入1.0mL的无水乙醇洗涤沉淀1次，12000g和4℃条件下离心10min，弃去乙醇，室温晾干沉淀；

(9)用2.0mL 10mM Tris-EDTA缓冲液溶解沉淀。

2.尾丝蛋白P069基因的PCR扩增

尾丝蛋白P069的正向引物为：ATCATCATATGAAAAAAAAAGCTGATTACAGTCAACTACCTA(SEQ ID No：3)，尾丝蛋白P069的反向引物：TGTCTGCGGCCGCAGAAATGCGCTGCCAGAGAGTG(SEQID No：4)。

PCR扩增体系为：

反应条件：

3.尾丝蛋白P069重组载体的构建

P069 PCR产物和载体pET-21a双酶切：用Nde I和Not I双酶切体系，在37℃金属浴下反应5h。反应体系如下：

然后将P069酶切产物和pET-21a酶切产物在T4连接酶的作用下，构建重组载体，反应体系如下：

4.尾丝蛋白P069的表达纯化

通过50μg/mL氨苄西林抗性筛选阳性克隆，然后37℃和180rpm条件下培养细菌至OD₆₀₀＝0.6，在16℃和0.1mM的IPTG诱导剂条件下诱导表达尾丝蛋白P069，200W功率超声破碎菌体，4℃和16000离心5min后，收集沉淀，然后用45mL的NTA-0缓冲液(146.1g NaCl、12.11g Tris、500mL，pH 8.0)重悬菌体沉淀，加入5.0mL 10mM的二硫苏糖醇溶液，200W功率超声溶解蛋白质30min，4℃和10000g条件下离心10min收集沉淀，PBS缓冲液重悬沉淀，200W功率超声溶解蛋白质5min，4℃和16000g条件下离心10min收集沉淀，用3.0mL的6M盐酸胍重悬和3.0mL的10mM的二硫苏糖醇溶液溶解P069包涵体，4℃和10000g条件下离心10min收集上清液。

5.尾丝蛋白P069的变性复性

用12.0mL的3M盐酸胍溶液稀释表达纯化所得上清液，4℃条件下滴加200mL的复性液(15.4％还原型谷胱甘肽、3.1％氧化型谷胱甘肽、696.8％精氨酸、7.4％EDTA·2Na·2H₂O、121.2％Tris，pH 8.0)，搅拌混匀24h，然后PEG20000浓缩后，4℃10mM的PBS缓冲液透析过夜，0.22μm过滤器过滤，在Ni-NTA柱中以1mL/min的流速上样P069蛋白溶液，用30mM、60mM、200mM以及500mM咪唑梯度洗脱，收集洗脱液，然后4℃10mM的PBS缓冲液透析，最后加入甘油(终浓度为20％)，-20℃保存。

三、结果

如图1所示，在30mM和200mM的咪唑洗脱液中，在65kD附近出现清晰的目的P069重组蛋白，其它杂蛋白的含量也相对地明显减少。

实施例2.基于铜绿假单胞菌噬菌体尾丝蛋白P069的单位点识别的生物发光检测铜绿假单胞菌

一、材料

铜绿假单胞菌噬菌体尾丝蛋白P069，按实施例1方法制备得到。

铜绿假单胞菌噬菌体，菌株名为PAP1，保藏号为CGMCC No.15569。

磁性纳米颗粒(瑞典Lab on a bead LOABeadsTM AffiAmino)

二、方法

1.制备检测试剂

(1)噬菌体尾丝蛋白P069功能化的磁性纳米颗粒：

取1.0mL磁性颗粒，用1.0mL的PBST洗涤2次后；加入1.0mL的PBST和50μL的活化缓冲液，反应15min，然后用1.0mL的PBST洗涤1次后，加入1.0mL的1.0mg/mL P069溶液，室温反应1小时，接着用PBST洗涤2次，加入80μL的封闭剂，室温反应45min，最后用PBST洗涤2次，用1.0mL的10mM的PBS缓冲液重悬，4℃储存。

(2)铜绿假单胞菌菌悬液标准品：

取铜绿假单胞菌单个菌落接种于LB培养液中，37℃振荡培养5.5小时，用Tris缓冲液(25mM，pH 7.4)重悬细菌并调整细菌浓度至1.0×10⁵CFU/mL。

(3)ATP生物发光液：

0.075mg/mL荧光素酶，0.25mg/mL荧光素，2.5mmol/L乙二胺四乙酸二钠，25mmol/L醋酸镁，2.5mmol/L二硫苏糖醇和1.0mg/mL牛血清白蛋白，用25mmol/L、pH 7.8Tris缓冲液溶解。

(4)ATP提取液：

ATP提取液为Tris缓冲液(25mM，pH 7.4)，其制备方法为：25mM Tris，5.0mM CTAB，2.5mM EDTA，调节pH为7.8。

(5)洗涤液：

洗涤液为PBST缓冲液(10mM，pH 7.4)，其制备方法为：取8.0g氯化钠、0.2g氯化钾、1.44g无水磷酸氢二钠和0.24g磷酸二氢钾溶解于1000mL一级水中，加入50μL的Tween-20，调pH至7.4。

2.检测：参照图2A所示，步骤如下。

(1)将铜绿假单胞菌菌悬液标准品用缓冲液稀释制成铜绿假单胞菌工作菌液，向1.0mL铜绿假单胞菌工作菌液中加入15μL的尾丝蛋白P069功能化的磁性纳米颗粒悬浮液(以缓冲液为溶剂)，室温孵育1h，磁性分离，获得铜绿假单胞菌-尾丝蛋白P069功能化磁性纳米颗粒复合物，用洗涤液清洗3次，再加入100μL的ATP提取液和100μL的7.5mM的β-环糊精，继续反应2min直至铜绿假单胞菌被裂解，取50μL裂解液，再通过MPI-A型毛细管电泳电化学发光检测仪注入50μL ATP生物发光液与之反应，记录生物发光信号，以生物发光强度对铜绿假单胞菌浓度作图，绘制工作曲线；

(2)向1.0mL铜绿假单胞菌工作菌液中加入15μL的尾丝蛋白P069功能化磁性纳米颗粒(图4A)悬浮液(以缓冲液为溶剂)，室温孵育1h，磁性分离，获得铜绿假单胞菌-尾丝蛋白P069功能化磁性纳米颗粒复合物(图4B)，用洗涤液清洗3次，再加入100μL的ATP提取液和100μL的7.5mM的β-环糊精，继续反应2min直至铜绿假单胞菌被裂解，取50μL裂解液，再通过MPI-A型毛细管电泳电化学发光检测仪注入50μL ATP生物发光液与之反应，记录生物发光信号，根据生物发光强度和步骤(1)绘制的工作曲线求得铜绿假单胞菌的浓度。三、结果

检测方法步骤(1)中，铜绿假单胞菌工作菌液的浓度分别为2.0×10³、4.0×10³、2.0×10⁴、4.0×10⁴、2.0×10⁵、4.0×10⁵和2.0×10⁶CFU/mL，以生物发光强度对铜绿假单胞菌浓度作图，所得工作曲线如图3A所示，随着铜绿假单胞菌浓度的增加，生物发光强度不断增大，二者在2.0×10³-2.0×10⁶CFU/mL范围内呈现良好的线性关系，R²＝0.9970，检测限(S/N＝3)为6.7×10²CFU/mL，说明使用尾丝蛋白P069作为铜绿假单胞菌分子识别试剂可灵敏地检测铜绿假单胞菌。

上述步骤(1)中，在铜绿假单胞菌工作菌液中加入金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、屎肠球菌、大肠杆菌、恶臭假单胞菌和青枯假单胞菌，然后按上述同样方法进行检测。结果参见图5，这6种模式菌对铜绿假单胞菌的检测均不构成干扰，说明使用尾丝蛋白P069作为铜绿假单胞菌分子识别试剂可特异地检测铜绿假单胞菌。

检测方法步骤(2)中，分别选取健康志愿者的尿液(稀释10倍)、Sprague-Dawley血浆(稀释10倍)、5％葡萄糖注射液作为生物样本，高温灭菌后，向其中添加已知浓度的铜绿假单胞菌，作为待测样品，按上述方法进行检测。结果如表1所示，待测样品中铜绿假单胞菌的加标回收率在87.3％-98.5％范围内，RSD值在7.6％以下，说明使用尾丝蛋白P069作为铜绿假单胞菌分子识别试剂可准确地检测铜绿假单胞菌。

表1铜绿假单胞菌实际样品检测的加标回收率

实施例3.基于铜绿假单胞菌噬菌体尾丝蛋白P069的双位点识别的夹心荧光检测铜绿假单胞菌

一、材料

铜绿假单胞菌噬菌体，菌株名为PAP1，保藏号为CGMCC No.15569。

DMSO：购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司

TRITC：购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司

二、方法

1.制备检测试剂

(1)噬菌体尾丝蛋白P069：按实施例1方法制备

(2)铜绿假单胞菌菌悬液标准品：

(3)罗丹明标记的噬菌体尾丝蛋白P069：

在暗室中，用DMSO溶解TRITC至3.0mg/mL，然后在暗室中，缓慢加入100μL的TRITC溶液到1.0mL的P069溶液中(1.0mg/mL)，温和地混匀蛋白质溶液，4℃避光反应过夜反应，最后用10mM PBS透析纯化48h。

(4)洗涤液：

2.检测：原理参照图2B所示，步骤如下。

(1)将铜绿假单胞菌菌悬液标准品用缓冲液稀释制成铜绿假单胞菌工作菌液，加入100μL的10μg/mL的P069溶液至96孔微板中，37℃包被2h，然后用300μL的PBST洗涤液洗涤3次，接着加入150μL的封闭液至96孔微板，37℃封闭1.5h，再用300μL的PBST洗涤液洗涤3次，然后加入100μL的铜绿假单胞菌菌液，37℃孵育1h，接着用300μL的PBST洗涤液洗涤3次，再加入100μL的0.5mg/mL TRITC-P069，在室温混合孵育1h，最后用300μL的PBST洗涤液洗涤3次，在激发波长和发射波长分别544nm和570nm下检测荧光信号，以荧光强度对铜绿假单胞菌浓度作图，绘制工作曲线。

(2)1.0mL铜绿假单胞菌工作菌液，照步骤(1)方法引发荧光信号，记录荧光信号，根据生物发光强度和步骤(1)绘制的工作曲线求得铜绿假单胞菌的浓度。

三、结果

如图6所示，当尾丝蛋白P069标记TRITC后，在铜绿假单胞菌表面可观察到TRITC的红色荧光。

检测方法步骤(1)中，铜绿假单胞菌工作菌液的浓度分别为4.0×10²、4.0×10³、4.0×10⁴、4.0×10⁵和4.0×10⁶CFU/mL，以荧光强度对铜绿假单胞菌浓度作图，所得工作曲线如图3B所示，随着铜绿假单胞菌浓度的增加，荧光强度不断增大，二者在4.0×10²-4.0×10⁶CFU/mL范围内呈现良好的线性关系，R²＝0.9989，检测限(S/N＝3)为1.7×10²CFU/mL，说明使用尾丝蛋白P069作为铜绿假单胞菌分子识别试剂可灵敏地检测铜绿假单胞菌。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多等同替换。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有等同替换，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 西南大学

<120> 铜绿假单胞菌噬菌体尾丝蛋白用于制备细菌检测试剂的用途

<130> XDRC18I020

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2046

<212> DNA

<213> 铜绿假单胞菌噬菌体(Pseudomonas aeruginosa)

<400> 1

atggctgatt acagtcaact acctattgaa aatatttggt ccacaggcgg ggatatggta 60

gccccgaccc ctgcgcagca gcaaggcgga tggggtattc agtcggttcc tcgccaatgg 120

tggaactgga agtggaacct tcacgatact aacctagcgt atttgctaca gaagggcatc 180

ccagagtgga ctagtacaca agagtacatt gctaacaaat cgttctgcac tagaggtgga 240

tttgtttaca aggctgttcg tacccataca ggtagcgacc cggccaccgc taaccccaac 300

tgggcccgag ctttcgcaga ctttaccaca tctagctctg cacttggaag cctgacacca 360

agagacggtg gaatcccgtt cttcattagt gccacaggag ctagcgtgtt tgactctacg 420

gcttatggtc gtggaatgtt gaatgtagct aacgccgcag cagccagaaa ctatatttcg 480

gctcaagaaa gttctgttgt actgtctaac ctgtccactg tgactagggc tgccaacaca 540

gttccgtact tcaatacgga tacctccatg gctaccttca acatcacagc gttcggaaga 600

ggacttgtca acgcggctaa tgctgaaaac gcaagaggtt tcctaggcct agctaactct 660

gctatcatca cagccgatcc agctaacaga gcccacactc tggtctatag agacgctgct 720

ggtaacttca acgctggtgt gattacggcc accctgtctg gaaacgcaac cacagctaac 780

aagctaaggg ctccagttac aatcaacggt gtagcattcg acggaagcca gaacattgtt 840

cttccgggcc tagatacaag ttatgctgga acggttgcac gcctccacat caacggagca 900

aacctttcga gtgcagacaa gacgactcag ctagcattga ggaataagtc tgacactgac 960

tggattagcc tcgctgtagt agatgacaac attctgcaat tcgtgttcag aagcgctaca 1020

aacccagttg tccagattgg taacgaagtt atccttcaca caggaaacca gttctctctg 1080

ggcccgactc ttacagacgc taggtctcgt ctgggtctcg acagactcac tcaaggtagc 1140

tctgatactc aagtcttccc cagcaccttg aacaatggcc cctacttgac cgtacaacct 1200

acggctatcg gaggattcaa cggtagcact aacggatggc tgttccgatt cgacgctaat 1260

ggtaacatga ctcatggtac agttcctgcc gctagaatca ctggtctgtc caactcggct 1320

cagattccag ccacaactac ggcgcaggct aactctcttg ttcagagaga cgcagacgga 1380

ggattcagcg ctattgcgat taatgcgtat ggcactatcg tcgggtacgg ctctaacatc 1440

ttcagtagag catcgggcac tggcaacgcc cacatcgggt tccagagagc gaacggaaca 1500

gaactcggtc ttatctgggg ggcccagtct aacaactcga tgaacttccg ggtagctggt 1560

ggctccaccg cagtgtcgat taccggtctg gacatgactg ttactggaag agtcaatgct 1620

accacactaa acgcctctgg aaacgtgaat gcgacaggca acgttaacgc cgggagcgct 1680

acgctcaata cagcagggaa tatcacagga gccgcttacg gagcctatgg ttctctgacc 1740

aactgggttg attcggtata tgccaagaag ggagaaattc ctaacgatat cgcaagagcc 1800

ggagccgctt gggacgctgt aggtcagtat attctggcgg gagatcaatc tggaggctct 1860

ggcggcccgg gtacaattag agccgggaac cagttgagac cttactctac gatcagctat 1920

acagccggta gcctgcccgc tggctcttac agatgcatgg gcgcgttcgc tgctggcgga 1980

aaccagatca ctctctggca gcgcatttct gcggccgcac tcgagcacca ccaccaccac 2040

cactaa 2046

<210> 2

<211> 670

<212> PRT

<213> 铜绿假单胞菌噬菌体(Pseudomonas aeruginosa)

<400> 2

Met Ala Asp Tyr Ser Gln Leu Pro Ile Glu Asn Ile Trp Ser Thr Gly

1 5 10 15

Gly Asp Met Val Ala Pro Thr Pro Ala Gln Gln Gln Gly Gly Trp Gly

20 25 30

Ile Gln Ser Val Pro Arg Gln Trp Trp Asn Trp Lys Trp Asn Leu His

35 40 45

Asp Thr Asn Leu Ala Tyr Leu Leu Gln Lys Gly Ile Pro Glu Trp Thr

50 55 60

Ser Thr Gln Glu Tyr Ile Ala Asn Lys Ser Phe Cys Thr Arg Gly Gly

65 70 75 80

Phe Val Tyr Lys Ala Val Arg Thr His Thr Gly Ser Asp Pro Ala Thr

85 90 95

Ala Asn Pro Asn Trp Ala Arg Ala Phe Ala Asp Phe Thr Thr Ser Ser

100 105 110

Ser Ala Leu Gly Ser Leu Thr Pro Arg Asp Gly Gly Ile Pro Phe Phe

115 120 125

Ile Ser Ala Thr Gly Ala Ser Val Phe Asp Ser Thr Ala Tyr Gly Arg

130 135 140

Gly Met Leu Asn Val Ala Asn Ala Ala Ala Ala Arg Asn Tyr Ile Ser

145 150 155 160

Ala Gln Glu Ser Ser Val Val Leu Ser Asn Leu Ser Thr Val Thr Arg

165 170 175

Ala Ala Asn Thr Val Pro Tyr Phe Asn Thr Asp Thr Ser Met Ala Thr

180 185 190

Phe Asn Ile Thr Ala Phe Gly Arg Gly Leu Val Asn Ala Ala Asn Ala

195 200 205

Glu Asn Ala Arg Gly Phe Leu Gly Leu Ala Asn Ser Ala Ile Ile Thr

210 215 220

Ala Asp Pro Ala Asn Arg Ala His Thr Leu Val Tyr Arg Asp Ala Ala

225 230 235 240

Gly Asn Phe Asn Ala Gly Val Ile Thr Ala Thr Leu Ser Gly Asn Ala

245 250 255

Thr Thr Ala Asn Lys Leu Arg Ala Pro Val Thr Ile Asn Gly Val Ala

260 265 270

Phe Asp Gly Ser Gln Asn Ile Val Leu Pro Gly Leu Asp Thr Ser Tyr

275 280 285

Ala Gly Thr Val Ala Arg Leu His Ile Asn Gly Ala Asn Leu Ser Ser

290 295 300

Ala Asp Lys Thr Thr Gln Leu Ala Leu Arg Asn Lys Ser Asp Thr Asp

305 310 315 320

Trp Ile Ser Leu Ala Val Val Asp Asp Asn Ile Leu Gln Phe Val Phe

325 330 335

Arg Ser Ala Thr Asn Pro Val Val Gln Ile Gly Asn Glu Val Ile Leu

340 345 350

His Thr Gly Asn Gln Phe Ser Leu Gly Pro Thr Leu Thr Asp Ala Arg

355 360 365

Ser Arg Leu Gly Leu Asp Arg Leu Thr Gln Gly Ser Ser Asp Thr Gln

370 375 380

Val Phe Pro Ser Thr Leu Asn Asn Gly Pro Tyr Leu Thr Val Gln Pro

385 390 395 400

Thr Ala Ile Gly Gly Phe Asn Gly Ser Thr Asn Gly Trp Leu Phe Arg

405 410 415

Phe Asp Ala Asn Gly Asn Met Thr His Gly Thr Val Pro Ala Ala Arg

420 425 430

Ile Thr Gly Leu Ser Asn Ser Ala Gln Ile Pro Ala Thr Thr Thr Ala

435 440 445

Gln Ala Asn Ser Leu Val Gln Arg Asp Ala Asp Gly Gly Phe Ser Ala

450 455 460

Ile Ala Ile Asn Ala Tyr Gly Thr Ile Val Gly Tyr Gly Ser Asn Ile

465 470 475 480

Phe Ser Arg Ala Ser Gly Thr Gly Asn Ala His Ile Gly Phe Gln Arg

485 490 495

Ala Asn Gly Thr Glu Leu Gly Leu Ile Trp Gly Ala Gln Ser Asn Asn

500 505 510

Ser Met Asn Phe Arg Val Ala Gly Gly Ser Thr Ala Val Ser Ile Thr

515 520 525

Gly Leu Asp Met Thr Val Thr Gly Arg Val Asn Ala Thr Thr Leu Asn

530 535 540

Ala Ser Gly Asn Val Asn Ala Thr Gly Asn Val Asn Ala Gly Ser Ala

545 550 555 560

Thr Leu Asn Thr Ala Gly Asn Ile Thr Gly Ala Ala Tyr Gly Ala Tyr

565 570 575

Gly Ser Leu Thr Asn Trp Val Asp Ser Val Tyr Ala Lys Lys Gly Glu

580 585 590

Ile Pro Asn Asp Ile Ala Arg Ala Gly Ala Ala Trp Asp Ala Val Gly

595 600 605

Gln Tyr Ile Leu Ala Gly Asp Gln Ser Gly Gly Ser Gly Gly Pro Gly

610 615 620

Thr Ile Arg Ala Gly Asn Gln Leu Arg Pro Tyr Ser Thr Ile Ser Tyr

625 630 635 640

Thr Ala Gly Ser Leu Pro Ala Gly Ser Tyr Arg Cys Met Gly Ala Phe

645 650 655

Ala Ala Gly Gly Asn Gln Ile Thr Leu Trp Gln Arg Ile Ser

660 665 670

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atcatcatat gaaaaaaaaa gctgattaca gtcaactacc ta 42

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgtctgcggc cgcagaaatg cgctgccaga gagtg 35

Claims

1.一株铜绿假单胞菌噬菌体，其特征在于：该铜绿假单胞菌噬菌体，菌株名为PAP1，保藏号为CGMCC No.15569，分类命名为铜绿假单胞菌烈性噬菌体；该铜绿假单胞菌噬菌体于2018年7月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.权利要求1所述的铜绿假单胞菌噬菌体用于制备细菌检测试剂的用途。

3.铜绿假单胞菌噬菌体尾丝蛋白P069，其特征在于：来源于铜绿假单胞菌噬菌体CGMCCNo.15569，其核酸序列如序列SEQ ID No：1所示。

4.根据权利要求3所述的铜绿假单胞菌噬菌体的尾丝蛋白P069，其特征在于：其氨基酸序列如序列SEQ ID No：2所示。

5.根据权利要求3或4所述的铜绿假单胞菌噬菌体的尾丝蛋白P069用于制备细菌检测试剂的用途。

6.一种检测铜绿假单胞菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(2)利用铜绿假单胞菌尾丝蛋白P069特异性地捕获向待测样品中的铜绿假单胞菌，用洗涤液清洗，再结合单位点识别生物发光法或双位点识别夹心荧光法，记录光信号，根据发光强度和步骤(1)绘制的工作曲线求得待测样品中铜绿假单胞菌的浓度。

7.根据权利要求6所述的一种检测铜绿假单胞菌的方法，其特征在于：所述方法为单位点识别生物发光法。

8.根据权利要求7所述的一种检测铜绿假单胞菌的方法，其特征在于，所述方法步骤为：

9.根据权利要求6所述的一种检测铜绿假单胞菌的方法，其特征在于：所述方法为双位点识别夹心荧光法。

10.根据权利要求9所述的一种检测铜绿假单胞菌的方法，其特征在于，所述方法步骤为：