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WO2004079015A1 - 大腸菌の検出方法及び大腸菌検出用ファージ - Google Patents

大腸菌の検出方法及び大腸菌検出用ファージ Download PDF

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Publication number
WO2004079015A1
WO2004079015A1 PCT/JP2004/002955 JP2004002955W WO2004079015A1 WO 2004079015 A1 WO2004079015 A1 WO 2004079015A1 JP 2004002955 W JP2004002955 W JP 2004002955W WO 2004079015 A1 WO2004079015 A1 WO 2004079015A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
phage
fluorescence
escherichia coli
coli
detecting
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2004/002955
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English (en)
French (fr)
Inventor
Yasunori Tanji
Hajime Unno
Chiaki Furukawa
Kensuke Onda
Akiko Miya
Yukio Kemmochi
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ebara Corp
Original Assignee
Ebara Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ebara Corp filed Critical Ebara Corp
Publication of WO2004079015A1 publication Critical patent/WO2004079015A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/10—Enterobacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K2319/60—Fusion polypeptide containing spectroscopic/fluorescent detection, e.g. green fluorescent protein [GFP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
    • C12N2795/10111—Myoviridae
    • C12N2795/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting Escherichia coli present in environmental water such as tap water and wastewater in a short time.
  • the coliform group is defined as a public health indicator. If the coliform group is detected in wastewater or environmental water, the water may be directly or indirectly contaminated in human or animal feces. Therefore, the risk of infection with intestinal pathogens such as Salmonella typhi and Shigella can be evaluated. For this reason, the control of coliform bacteria is obligatory in the case of tap water and effluent from sewage treatment plants, etc., and sanitary safety is achieved by disinfecting the target water to reduce the number of coliform bacteria below a certain value. Is secured.
  • the coliform bacteria test is a test method for wastewater standards in the sewerage system.
  • the plate culture method using desoxycholic acid medium is a lactose bouillon-a brilliant green lactose bile bouillon medium (LB-BGLB).
  • the most probable number method (MPN method) is specified as the official method.
  • bacteria detected as coliforms include bacteria that are not present in feces and bacteria that grow easily in wastewater, and may not meet their intended purpose. Furthermore, in recent years, the technology for specifically detecting only Escherichia coli (Escherichia coli) has progressed, and there is a movement to use Escherichia coli instead of the Escherichia coli as a test target.
  • Escherichia coli Escherichia coli
  • Escherichia coli testing is more complicated than the Escherichia coli test, and the final identification requires a long time, and the identification requires a wealth of knowledge and experience. It is inferior in nature.
  • an immunoassay using an antigen-antibody reaction and a method using a specific gene are known.
  • Known immunoassays include a fluorescent antibody method using an antibody labeled with a fluorescent substance and an enzyme immunoassay using an enzyme to label the antibody.
  • a specific antibody against E. coli is obtained by immunizing an animal in advance. Must be created, which is very expensive.
  • the measurement is complicated because it involves multiple processing steps, and requires at least about 1 to 3 hours. Further, there have been known problems such as non-specific adsorption of protein antibodies onto particles.
  • Methods for detecting specific genes include the FISH method using a fluorescently labeled gene probe and the quantitative PCR method using specific PCR primers.
  • FISH method using a fluorescently labeled gene probe
  • quantitative PCR method using specific PCR primers.
  • both the immunoassay method and the gene detection method have a problem that it is difficult to distinguish between dead cells and live cells.
  • I could't.
  • phage Pacteriophage
  • Phages are viruses that infect bacteria and have high specificity in the host range that each phage can infect. Therefore, techniques for identifying bacteria and detecting specific bacteria using phage infection as an index have been proposed.
  • Known methods for detecting bacteria using such phage include a method using a phage stained with a gene and a method using a phage into which a reporter gene has been introduced (for example, Non-Patent Document 1).
  • the phage stained with a gene is adsorbed on the E. coli surface in advance, and the E. coli is visualized by transferring the stained gene into the E. coli.
  • the process of dyeing the gene it is necessary to infect a high concentration of phage, and the sensitivity limit has been pointed out, because the phage gene pre-stained is used as an indicator for the mere localization of the phage gene.
  • the method has a problem in that a complicated process is required, such as adding a carcinogenic gene staining solution to a culture solution of Escherichia coli as a host to prepare stained phages.
  • a phage into which a reporter gene has been introduced is used.
  • Escherichia coli is infected with a phage into which a protein gene having excellent detectability such as a fluorescent enzyme gene or green fluorescent protein (GFP) has been introduced.
  • GFP green fluorescent protein
  • This is a method for detecting a signal derived from the propagated phage.
  • the method of introducing an enzyme gene requires complicated steps such as addition of a substrate necessary for the enzyme reaction and enzymatic reaction time.
  • the method using a fluorescent protein such as GFP has a simple detection step, and it is considered that measurement in a short time is optimal.
  • the methods using fluorescent proteins also have the following problems.
  • the lysing enzymes of the phages grown in general cells cause lysis of the cells, which makes it difficult to visualize the infected cells, which hinders the improvement of accuracy. cause.
  • nonspecific fluorescent particles are specific. Had interfered with detection. That is, there are many microbial particles having autofluorescence in environmental waters such as sewage and river water, and the scattered light emitted by the soil particles overlaps with the target fluorescence wavelength. There is a problem that it cannot be distinguished from enterobacteria.
  • cells are fluorescently labeled by concentrating a fluorescent substance near the cells via an antibody, gene, or phage.
  • an antibody, gene, or phage In this case, non-specific adsorption of antibodies, genes, and phages Interference due to interference is also a major problem.
  • a method of adding a high concentration of protein or a non-ionic surfactant to the reaction solution is used, but it has not been a drastic solution.
  • the present invention has been made in view of the above-mentioned circumstances, and does not cause a decrease in sensitivity due to lysis of Escherichia coli to be detected.
  • the present inventors have found that a phage in which the expression level of a fluorescent protein per phage particle is dramatically increased, and a phage lacking a lytic enzyme is used for the detection of Escherichia coli, and completed the present invention. .
  • the present invention relates to a method for detecting Escherichia coli for detecting Escherichia coli present in a test sample by bringing a phage infecting a specific Escherichia coli into contact with the test sample.
  • a detection method comprising using a phage having a fluorescent protein expressed as a fusion protein with a phage coat protein in a shell, and having a deficiency in a lytic enzyme.
  • the method for detecting Escherichia coli of the present invention provides a very rapid method for detecting Escherichia coli by specifically adsorbing a phage expressing GFP to Escherichia coli and detecting Escherichia coli that emits fluorescence.
  • the method of the present invention using the phage as described above includes detecting intensity-level fluorescence emitted from the fluorescent protein of the phage adsorbed on the Escherichia coli, and / or detecting the presence of the phage in the Escherichia coli. Detecting the intensity level of fluorescence emitted from the fluorescent protein expressed in step (1).
  • the intensity level of fluorescence emitted from the fluorescent protein of the phage adsorbed on E. coli is constant depending on the number of phage adsorbed per cell, regardless of the viability of E. coli present in the test sample.
  • the intensity level of the fluorescence emitted from E. coli as the phage proliferates increases sharply with the expression level of the fluorescent protein in the viable bacteria.
  • the fluorescences of different origins may be detected individually, may be combined as a series of steps, or may be detected simultaneously.
  • M0I can be freely set as required, and thus various modes as described below are conceivable.
  • the number of phage infections per cell (hereinafter, also simply referred to as “M0I”) is increased, the time to lysis is shortened even for short-time contact, and correct detection results are obtained with lysis. Can not be.
  • M0I the number of phage infections per cell
  • the present detection method phage lacking a lytic enzyme is used, so that the accuracy does not decrease due to lysis. Rather, in the present detection method requiring rapidity, it is permissible to increase the number of phage infections in the contacting step, and the number of phage infections per E. coli cell (one cell) is preferably 1 to 500, It is more preferably from 1 to 200, still more preferably from 10 to 50.
  • MI0 can be reduced as needed.
  • the present detection method after the time required for the phage to proliferate after the phage is brought into contact with the test sample, fluorescence detection is performed on the test sample.
  • fluorescence detection is performed on the test sample.
  • the fluorescence emitted from the fluorescent protein expressed and accumulated in the E. coli is detected.
  • lytic enzyme-deficient phage can sufficiently detect and detect phage-derived fluorescent proteins in live bacteria, and thus detect fluorescence specific to such live bacteria. it can.
  • the number of infected phages per cell (M0I) is set to 1 to 200, preferably 1 to 50 or less, and more preferably 1 to 10 to detect the viable cell count with high accuracy. Becomes possible.
  • one embodiment of the present detection method includes, when the number of infected phages (M0I) is set to a sufficiently high value so that the intensity level of the fluorescence from the adsorbed phages can be detected, Detect only viable bacteria by staining with viable dye Includes making it available.
  • M0I number of infected phages
  • simultaneous detection and detection of the viable and dead bacteria of Escherichia coli is provided by simultaneously separating and detecting the weak fluorescence caused by initial adsorption and the strong fluorescence generated by phage proliferation, and analyzing the results. By doing so, it is possible to easily determine the survival rate of E. coli.
  • the M0I is not only set to a value high enough to detect the intensity level of the fluorescence from the adsorbed phage, but also to It is also important that the intensity level of the fluorescence from the adsorbed phage is set to a value that is significantly lower than the intensity level of the fluorescence from the E. coli.
  • the phage is brought into contact with the test sample, and after the time required for the proliferation of the phage has passed, From the fluorescence distribution observed in the test sample, the fluorescent particles of a relatively low intensity level based on the phage adsorption and the fluorescent particles of a relatively high intensity based on the expression of the fluorescent protein in E. coli And detecting the survival rate of Escherichia coli based on the detected values.
  • the Escherichia coli counting method which counts the distribution of fluorescent particles and counts them, a comparison between the initial adsorption and after the phage proliferation, or a comparison with the fluorescence intensity of each fluorescent particle observed before phage contact is obtained. By doing so, a method for eliminating nonspecific adsorption of phage particles and nonspecific fluorescent signals due to particles having autofluorescence and specifically detecting live bacteria is also provided.
  • the fluorescence distribution observed in the test sample before the phage is contacted, and / or the fluorescence distribution observed in the test sample at the stage when the phage is adsorbed.
  • the fluorescence distribution based on the phage adsorption to E. coli to be detected is determined. Detecting intensity levels of fluorescence and / or intensity levels based on the expression of the fluorescent protein in E. coli to be detected Detecting the fluorescence of
  • the above fluorescence distribution is preferably observed using a fluorescence microscope or a CCD camera.
  • the Escherichia coli counting method which counts fluorescent particles using this detection method, it is detected immediately after initial adsorption and after phage propagation, and further before phage contact with the same sample, using a fluorescence microscope or CCD camera. The number of each fluorescent particle within a certain visual field area and the fluorescence intensity are measured, and the same image is processed to obtain a total of the target Escherichia coli or only the viable Escherichia coli.
  • a method for measuring the number of bacteria, and also for measuring the survival rate, is provided.
  • the present invention also provides a phage for detecting Escherichia coli which expresses a fluorescent protein as a fusion protein with a phage coat protein in the phage coat and has a deficiency in a lytic enzyme.
  • FIG. 1 shows the growth characteristics of E. coli K12 (W3110) after phage infection.
  • FIG. 2 shows an optical micrograph and a fluorescence micrograph 20 minutes after phage infection.
  • 2-1 is a T4 (wt) optical microscope
  • 2-2 is a T4 (wt) fluorescent microscope
  • 2-3 is a T4 (e_) optical microscope
  • 2-4 is a T4 (e-) fluorescent microscope.
  • Figure 3 is a photograph of a light microscope and a fluorescence microscope 60 minutes after phage infection.
  • 3-1 is a T4 (wt) optical microscope
  • 3-2 is a T4 (wt) fluorescence microscope
  • 3-3 is a T4 (e_) fluorescence microscope
  • 3-4 is a T4 (e-) fluorescence microscope.
  • the method for detecting Escherichia coli of the present invention is a method for specifically detecting Escherichia coli by contacting a phage specifically infecting Escherichia coli with Escherichia coli being detected and adsorbing or infecting the phage with Escherichia coli.
  • the method is characterized by detecting the fluorescence of a large amount of fluorescent protein produced in the phage or on the body surface by genetic recombination technology.
  • the phage outer shell The protein is preferably a small outer capsid protein (hereinafter referred to as “Soc”), and the fluorescent protein is preferably a green fluorescent protein (hereinafter referred to as “GFP”).
  • Soc small outer capsid protein
  • GFP green fluorescent protein
  • proteins that can be used in the present invention are not limited thereto.
  • known fluorescent proteins such as those listed below, and Hoc (highly antigenic Outer shell proteins such as outer capsid protein) can be used.
  • Soc is expressed in about 0% of molecules per phage
  • Hoc is expressed in about 160 molecules.
  • Those skilled in the art can appropriately select what kind of fluorescent protein and outer protein should be focused on to successfully display the fluorescent protein on the phage outer shell. Their usefulness is described in the present specification and the present specification. It can be easily confirmed by conducting experiments and the like with reference to the documents disclosed herein.
  • a phage specifically infecting Escherichia coli is used.
  • a phage a phage having high specificity of infection to Escherichia coli and a high infection rate is preferable.
  • T-type phage represented by phage, ⁇ phage, and the like can be used.
  • Such a phage that specifically infects Escherichia coli is available from the US ATCC and the like.
  • a phage specific to a specific Escherichia coli for example, a pathogenic Escherichia coli can be used.
  • a fluorescent protein gene is introduced into such a phage.
  • GFP gene Prasher, DC, et al., Gene, 111: 229-233 (1992); Chalfe, M., et al., Science, 263: 802-805 (1994)
  • EBFP Blue Fluorescent Protein
  • ECFP Cyan Fluorescent Protein
  • EYFP Yeellow Fluorescent Protein
  • DsRed Red Fluorescent Protein
  • Any fluorescent protein gene can be used as long as it can be introduced into pacteriophage and can be expressed in infected bacteria.
  • a method for introducing such a fluorescent protein gene into the above-mentioned batteriophage can be carried out by using a generally used gene recombination technique.
  • the number of fluorescent protein molecules expressed in the phage greatly affects the detection sensitivity and accuracy of Escherichia coli, and this effect is remarkable especially when detection is performed during the initial adsorption. Therefore, as a method for introducing a fluorescent protein gene that solves these problems, a fluorescent protein gene is inserted so that its frame is aligned with the frame downstream or upstream of the main constituent protein gene of the phage outer shell, and the fluorescent protein is introduced. It is desirable that the protein is introduced so as to be expressed on the surface of the phage outer shell as a fusion protein with the outer shell protein.
  • Such transfer methods include inserting the fluorescent protein gene such that the fluorescent protein gene is in frame with the downstream of the stop codon downstream of the Soc gene, which is a coat protein, or the start codon of the Soc gene.
  • a method of preparing a phage expressing a fluorescent protein gene by inserting a fluorescent protein gene into the frame further upstream so as to match the frame can be used.
  • the phage into which the gene is to be introduced is preferably a phage deficient in the lytic enzyme expression ability by introducing an amber mutation (amber mutation) into the gene encoding the lytic enzyme. Eliminating the lysis of phage-infected Escherichia coli, which is a problem at the time of detection, can be expected to increase sensitivity by increasing the number of phages growing in the E. coli body.
  • a method for producing such a phage for example, the same phage is added to a culture solution of Escherichia coli having amber suppressor ability to suppress amber mutation, and the phage is cultured for several hours and then grown.
  • a general phage lysate preparation method for separating phage can be used.
  • the obtained phage is stable for a long period of time by refrigerated storage even in the state of a lysate, and can be further stably stored at room temperature by drying by a freeze-drying method or the like.
  • the phage into which the fluorescent protein gene has been introduced is brought into contact with a detection target and reacted for a certain period of time.
  • the phage or phage suspension may be added directly to the water sample as a contact method, or a method in which a phage-containing solution is brought into contact with E. coli captured on filter paper by filtering the sample. Application it can.
  • the reaction time is the time required for contact between the E. coli and the phage, and is generally affected by the concentration of both the E. coli and the phage. Minutes to 6 hours, preferably 1 minute to 60 minutes, more preferably 3 minutes to 30 minutes. When detecting the fluorescence of the phage grown after infection, the reaction time may be 10 minutes or more, preferably 30 minutes or more. In the present invention using the lytic enzyme-deficient phage, the maximum contact time is not limited even if the reaction is performed for a long time because lysis of Escherichia coli does not occur.
  • the fluorescence detector used here is not particularly limited as long as it is a device and system capable of specifically detecting fluorescence of a specific wavelength, but a fluorescence microscope, CCD camera, flow cytometer, and fluorescence A photometer.
  • a fluorescence microscope When a fluorescence microscope is used, a certain amount of the above reaction solution is captured directly or on a filter paper to observe the fluorescent particles under a microscope, and the fluorescent particles within a certain visual field area are measured. It is possible to quantitatively detect the concentration.
  • the fluorescent particles on the filter paper may be directly detected.
  • the surface of the filter paper that captures Escherichia coli that has been fluorescently labeled by the above method is irradiated with excitation light having an excitation wavelength that is optimal for the target fluorescent protein, and the generated fluorescence is directly detected by the CCD camera.
  • the obtained fluorescent image is subjected to image processing to remove non-target fluorescent light, and the target fluorescent particles are automatically measured using a system for automatically measuring the number of fluorescent particles. Further, according to the flow cytometer, it can be directly applied to the liquid reaction solution.
  • the number of infected phages per E. coli cell is brought into contact with the cells under extremely large conditions, and the number of fluorescent particles derived from E. coli to which phages are initially adsorbed is counted. It is possible to count the total number of Escherichia coli regardless of whether they are alive or not. At this time, it is possible to measure only living Escherichia coli in a short time by reacting with a fluorescent reagent that detects the respiration of living bacteria and the activity of specific enzymes (such as esterases). .
  • fluorescent reagent examples include, but are not limited to, cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride, fluorescein diacetate or 5- (and 6-) sulfofluorescein diacetate.
  • this method is a simple and quick method for measuring Escherichia coli by distinguishing between live and dead bacteria without being affected by non-specific fluorescent particles, which was a problem with the fluorescence detection method. It provides the law. It should be noted that the above-described embodiment is merely an example, and any one having substantially the same configuration as the technical idea described in the claims of the present invention and exerting the same effect will be described. Even so, they are included in the technical scope of the present invention.
  • Escherichia coli is infected with a lytic enzyme-deficient phage expressing GFP, An example in which Escherichia coli was specifically detected is shown below.
  • Example 1 Method for preparing a T4-e-GFP recombinant phage
  • the gene fragment containing the soc gene encoding T4 phage Soc and its upstream and downstream regions was obtained by PCR using the T4 phage chromosome as type I.
  • the gene encoding GFP contained the gene fragment soc E. coli expression plasmid p QB2 containing this Soc bonded have use a ligase (ligase) over P UC118 is an E. coli expression vector plasmid, the vector plasmid p UC GFPSoc was obtained. Then, Escherichia coli K12 (W3110) was transformed with this pUC-GFPSoc. Further, T4e-phage was infected to the transformed E.
  • ligase ligase
  • T4e-phage is a T4 phage having an amber mutation in the lytic enzyme gene gp-e (Kao, SH, and Mcclain WH, J. virol., 34, p95 (1980)). Screening of T4e-GFP recombinant phage was performed using the fluorescence of the phage plaque as an indicator. At this time, the probability of producing a T4-e-GFP recombinant phage was about 1 / 10,000.
  • Example 2 Method for preparing T4-wtGFP recombinant phage
  • P UC-GFPSoc was prepared in the same manner as in Example 1, and E. coli K1.2 (W3110) was transformed. Further, a wild-type T phage (T4-wt phage) was infected to the transformed E. coli K12 (W3110), and T4-wt recombinant phage displaying GFP was prepared by homologous recombination in the infected E. coli. Screening of the T4-wtGFP recombinant phage was performed using the fluorescence of the phage plaque as an indicator.
  • Example 3 Method for producing PP01-GFP recombinant phage
  • Escherichia coli 0157 A soc gene encoding the Soc of PP01, which is an H7-specific phage, and a gene fragment containing the upstream and downstream regions thereof were obtained by PCR using the chromosome type PP01 phage.
  • the PP01 phage is a phage that the present inventors screened from pig feces using Escherichia coli 0157: H7 as an indicator bacterium. That is included in the p QB2 a gene fragment soc E. coli expression base Kuta one Burasumido containing this Soc bonded using ligase (ligase) over P UC118 is an E.
  • T4-e-phage has an amper mutation in the ⁇ D-e gene, which encodes a lytic enzyme, and has lost the ability to produce the lytic enzyme. Therefore, although it is possible to infect general E. coli K12 strain, it is difficult to prepare a phage lysate because E. coli is not lysed.
  • Escherichia coli CR63 strain is an amber suppressor strain, which suppresses amber mutation of T4-e-phage, can produce lytic enzyme, and replicates and releases phage by T4-e-phage infection. be able to. Therefore, here, T4-e-phage labeled with GFP was used as a host strain in Escherichia coli CR63.
  • the separated phage was resuspended in a small amount of buffer, purified by cesium chloride density gradient centrifugation, and then dialysis was performed to remove cesium chloride.
  • Example 5 Method for preparing a large amount of T4-wt GFP phage
  • T4-wt GFP phage was prepared according to the method for preparing large amounts of T4-e-phage of Example 4. Then, the phage used was T4_wt, and the E. coli to be infected was K12 (W3110) strain.
  • Example 6 Large-scale preparation of PP01-GFP phage
  • E. coli 0157 H7 strain was infected with GFP-labeled PP01-GFP phage. After cultivation for about 6 hours from the addition of phage, the cells were completely lysed by adding black-mouthed form and releasing the strain at 4 ° C for 1 hour. Escherichia coli crushed product was removed as a precipitate by centrifugation.
  • T4wt was infected with phage
  • bacterial growth accompanied by an increase in turbidity was observed 30 minutes after the induction period, and T4wt showed a decrease in turbidity due to bacterial lysis after 40 minutes of infection.
  • T4e- is infected, but turbidity is not reduced due to lack of lytic enzymes.
  • Example 7 Under the infection conditions of Example 7, the fluorescence of Escherichia coli was observed with a fluorescence microscope. Using an epifluorescence phase contrast microscope (AX80T, Olympus), the sample was irradiated with excitation light using a GFP fluorescence observation filter (U-IIBA / GFP, Olympus), and the green fluorescence of GFP was observed. Both T4wtGFP phage and T4e-GFP phage emitted weak fluorescence at the initial adsorption immediately after addition, and after 20 minutes, fluorescence was observed due to adsorption and partial phage growth in the cells. There is no significant difference (Fig. 2). However, 60 minutes after the phage infection, according to FIG.
  • Example 9 Detection of Escherichia coli using T4e-GFP phage using a fluorescence microscope
  • T4e_GFP phage solution suspended in the (5 X 1 0 7 PFU / ml) 1 pair 1 And reacted at 28 ° C. with gentle stirring. Then, a fixed amount of the sample after the reaction for 30 minutes was collected, filtered through a 0.2 ⁇ m filter paper, and further washed with an LB medium. A part of this filter paper was placed on a slide glass, and the fluorescence-encapsulating reagent was evacuated. Then, a cover glass was put on the filter paper, and the green fluorescence of GFP was observed with an epifluorescence microscope.
  • the fluorescence images were captured by a personal computer using a CCD camera, and the number of fluorescent particles was counted in 10 fields of view using an image analysis software IP Lob (Image and Measurement Co., Ltd.), and the average value was calculated.
  • image analysis software IP Lob Image and Measurement Co., Ltd.
  • Example 10 Detection of E. coli using T4e-GFP phage using a CCD camera
  • the obtained image data was analyzed using the image analysis software ARGUS-50 (Hamamatsu Photonitas) to analyze the number of fluorescent particles and the change in fluorescence intensity at each stage before, immediately after, and 30 minutes after the addition of phage.
  • Particles that were absent before the phage addition had weak fluorescence immediately after the addition, and subsequently increased in fluorescence were counted as live E. coli cells.
  • particles that produced weak fluorescence immediately after phage addition and did not show an increase in fluorescence intensity were counted as dead cells of E. coli (Table 2).
  • Table 2 Number of E. coli in environmental water measured by T4e-GFP phage
  • the present invention provides a method for detecting E. coli by using phages that dramatically increase the amount of fluorescent protein expressed per phage particle and / or phages deficient in a lytic enzyme, and the accompanying improvements in sensitivity. Shortening of measurement time can be achieved.
  • the use of the phage provides a new evaluation method for simultaneously measuring live and dead Escherichia coli and distinguishing them.

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Abstract

　本発明は、特定の大腸菌に感染するファージを被検試料と接触させることにより、該被検試料中に存在する該大腸菌を検出する方法であって、そのファージ外殻にファージ外殻タンパク質との融合タンパク質として蛍光タンパク質を発現しており且つ溶菌酵素に欠損を持つファージを使用することを含む検出方法等に関する。特に本法には、前記大腸菌に吸着したファージの蛍光タンパク質から発せられる強度レベルの蛍光を検出すること、及び／又は前記ファージの吸着に起因して大腸菌内で発現した蛍光タンパク質から発せられる強度レベルの蛍光を検出することが含まれる。

Description

明細書
大腸菌の検出方法及び大腸菌検出用ファージ
技術分野
本発明は水道水や排水など環境水中に存在する大腸菌を短時間に検出する方法 に関する。
背景技術
大腸菌群は公衆衛生的な指標として定義されたものであり、 排水や環境水中か ら大腸菌群が検出されれば、 その水が直接又は間接的にヒトゃ動物の糞便に汚染 されている可能性があると考えられ、 チフス菌や赤痢菌などの腸管系病原菌に対 する感染リスクを評価できる。 そのため、 水道や下水処理場の放流水などにぉレ、 て、 大腸菌群の管理が義務付けられており、 対象水を消毒処理して大腸菌群数を 一定値以下にすることで衛生上の安全度を確保している。 大腸菌群試験は下水道 では排水基準に関わる検定方法でデソキシコール酸培地による平板培養法が、 水 道法や水質汚濁法の排水基準のなかで乳糖ブイョン -プリリアントグリーン乳糖 胆汁ブイヨン培地 (LB-BGLB) による最確数法（MP N法） がそれぞれ公定法とし て定められている。
しかし、 これらの方法は培養工程を有することから操作が煩雑であり、 平板培 養法にあっては 3 5〜3 7 °Cで 1 8〜2 0時間， 最確数法にあっては 3 5〜3 7 °Cで 2 4 ± 2時間の培養時間を必要とし、 測定結果を消毒工程の運転管理に反 映させることは到底できなかった。
一方で、 大腸菌群として検出される細菌のなかには糞便中には存在しない細菌 や排水中で容易に増殖する細菌も含まれており、 本来の目的に合致しない場合が あることも指摘されてきた。 さらに近年、 大腸菌 (ェシエリヒア 'コリ (E s c h e r i c h i a c o 1 i ) ) だけを特異的に検出する技術が進歩してきたこと もあり、 大腸菌群に代って大腸菌を検査対象とする動きも進んでいる。
しかしながら、 大腸菌の検査は大腸菌群の検查に比べ、 さらに検出方法が煩雑 で、 しかも最終的な同定には長時間を要する上、 その同定には豊富な知識及び経 験が必要であり、 汎用性に劣るものである。
このような目的を達成するため、 培養工程をほとんど必要としない短時間、 簡 易測定法も近年多く開発されている。 たとえば、 抗原抗体反応を利用する免疫測 定法、 特異的遺伝子を用いる方法などが知られている。 免疫測定法には、 蛍光物 質で標識した抗体を用いる蛍光抗体法、 酵素で抗体を標識した酵素免疫測定法が 知られるが、 どちらの場合も、 事前に動物を免疫して大腸菌に対する特異抗体を 作成する必要があり、 多大な費用がかかる。 また測定に複数の処理工程を含むこ とから煩雑であり、 最短でも 1〜 3時間程度の時間を必要とする。 さらにタンパ ク質である抗体が非特異的に粒子上に吸着することなどの問題が知られていた。 特異的遺伝子を検出する方法としては、 蛍光標識した遺伝子プローブを用いる FISH法、特異的 PCRプライマーを用いる定量 PCR法などがしられており、 どちら も特異性の高い分析方法であるもの、定量性に課題があり、遺伝子の抽出、増幅、 および検出などに煩雑かつ高度なテク二ックを要する工程を含むことからリアル タイムに結果を知ることは困難であつた。 さらに免疫測定法、 および遺伝子検出 法ともに死菌と生菌の区別が困難である問題もあった。 特に消毒工程の管理を行 なう場合、大腸菌の死菌体を多く含む試料中に存在する,生きた大腸菌だけを特異 的に検出することが必要であることからこれらの方法は原理的に適用できなかつ た。
これらの課題を解決できる方法として、 大腸菌に特異的に感染するパクテリォ ファージ （以下単に 「ファージ」 と記述する） を用いる方法が知られている。 フ ァージは細菌に感染するウィルスであり、 各ファージが感染できる宿主域には高 い特異性がある。 そのため、 ファージの感染を指標にした細菌の同定や特定細菌 の検出技術が提案されている。 このようなファージを用いる細菌の検出法として は、 遺伝子を染色したファージを用いる方法やレポーター遣伝子を導入したファ ージを用いる方法などが知られていた (例えば、 非特許文献 1 )。
非特許文献 1
野上；「特集，微生物制御， パクテリオファージを利用した特定細菌の迅速検出 技術」， 食品工業， 2000-7. 30, pp52-57
しかしながら、 前者のように遺伝子を染色したファージを用いる方法は、 あら かじめ遺伝子を染色したファージの大腸菌表面への吸着や、 染色された遺伝子の 大腸菌内への移動により大腸菌が可視ィ匕されるものであるが、 遺伝子の染色工程 が必要な上、 あらかじめ染色したファージ遺伝子の単なる局在ィ匕を指標とするこ とから、 高濃度のファージを感染させる必要がある上、 感度的な限界が指摘され ていた。 また同法では発がん性を有する遺伝子染色液を宿主である大腸菌の培養 液に添加し、 染色ファージを調製するなど煩雑な工程を有する問題があった。 また、 後者のようにレポーター遺伝子を導入したファージを用いる方法は、 蛍 の発光酵素遺伝子やグリーン蛍光タンパク質（GFP)など検出性に優れるタンパク 質遺伝子を導入したファージを大腸菌に感染させ、 大腸菌内に増殖したファージ 由来のシグナルを検出する方法である。 このうち酵素遺伝子を導入する方法は酵 素反応に必要な基質の添加や酵素反応時間が必要であるなど煩雑な工程を必要と する。
一方、 GFPなどの蛍光タンパク質を用いる方法は検出工程が単純であり、 短時 間での測定が最適であると考えられる。 し力、し、 そのような蛍光タンパク質を用 いた方法にも、 下記のような問題点がある。
①ファージ体内における蛍光タンパク質の発現量によつては十分な感度が得ら れず、 特に初期吸着における大腸菌の可視化の実現が困難である。
②さらに、 これらファージを用いる方法では、 一般菌体内で増殖したファージ の溶菌酵素により菌体の溶菌が起こり、 感染した菌の可視ィヒが困難になる現象が 認められ、 精度の向上に支障を来たす。
③一般に微生物を蛍光標識して検出する方法においては、免疫測定法であるか、 遺伝子検出法である力、或いはファージを用いる方法であるかに関係なく、 非特異 的な蛍光粒子が特異的な検出を妨害していた。 すなわち、 下水や河川水など環境 水中には自家蛍光を有する微生物粒子が多く存在し、 さらには土壌粒子の発する 散乱光が目的の蛍光波長と重複することにより、 これら非特異的な蛍光粒子と大 腸菌とを区別できないという問題がある。 従来の蛍光標識法では、 蛍光物質を抗 体や遺伝子、 あるいはファージを介して菌体近傍に濃縮することで菌体を蛍光標 識するが、 この場合、 抗体や遺伝子、 ファージの非特異的吸着による妨害も大き な問題である。 これらの対処方法には、 反応液中に高濃度のタンパク質や非ィォ ン系界面活性剤を添加する方法が用いられるが、 抜本的な解決にはなっていなか つた 本発明は、 上記諸事情に鑑みなされたもので、 検出すべき大腸菌の溶菌に起因 する感度の低下がなく、 特にその生菌を特異的に検出することができ、 そのよう にして感度が著しく改善された上で短時間測定が可能であり、 また必要ならばフ ァージの初期吸着の検出、 生菌と死菌を区別した検出、 及び/又は非特異的吸着 による妨害の排除が可能である大腸菌の検出法等を提供することを目的とする。
発明の要旨
本発明者等は、 ファージー粒子あたりの蛍光タンパク質の発現量が飛躍的に増 強されたファージであって、 溶菌酵素欠損型のファージを大腸菌の検出に用いる ことを見出し、本発明を完成させた。また、この種のファージを利用することで、 大腸菌の生菌と死菌を区別して同時に測定するという新しレ、評価技術を確立した。 すなわち、 本発明は、 特定の大腸菌に感染するファージを被検試料と接触させ ることにより、 該被検試料中に存在する該大腸菌を検出するための大腸菌の検出 方法であって、 そのファージ外殻にファージ外殻タンパク質との融合タンパク質 として発現している蛍光タンパク質を有し且つ溶菌酵素に欠損を持つファージを 使用することを含む検出方法を提供する。
従って、 本発明の大腸菌検出法には、 GFP を発現したファージを大腸菌に特異 的に吸着させ、 蛍光を発する大腸菌を検出することによる極めて迅速な大腸菌検 出法が提供される。
上記のようなファージを利用する本発明の方法には、 前記大腸菌に吸着したフ ァージの蛍光タンパク質から発せられる強度レベルの蛍光を検出すること、 及び /又は前記ファージの吸着に起因して大腸菌内で発現した蛍光タンパク質から発 せられる強度レベルの蛍光を検出することを含む。
概して、 大腸菌に吸着したファージの蛍光タンパク質から発せられる蛍光の強 度レベルは、 被検試料内に存在する大腸菌の生死に関わりなく、 一細胞あたりの ファージ吸着数に依存して一定であるが、 他方で、 ファージの増殖に伴って大腸 菌内から発せられる蛍光の強度レベルは、 その生菌内での蛍光タンパク質の発現 量に伴って急激に上昇する。 本検出法において、 それら異なる由来の蛍光をそれ ぞれ単独で検出してもよいし、 一連の工程として組み合わせもよいし、 また同時 的検出を行ってもよい。 とりわけ、 本検出法によれば、 M0I を必要に応じて自在に設定することができ るので、 下記に挙げられるような様々な態様が考えられる。
迅速で高精度な生菌特異的検出
一般に、一細胞あたりのファージ感染数（以下単に 「M0I」 とも記述する） を多 くすると短時間の接触であっても溶菌までの時間が短くなり、 溶菌に伴って正し い検出結果が得られなくなる。 これに対し、 本検出法においては、 溶菌酵素欠損 型のファージを使用するので溶菌による精度低下が生じない。 むしろ、 迅速性が 求められる本検出法においては、 接触工程におけるファージ感染数を増やすこと も許容され、 大腸菌のー菌体 （一細胞） あたりの感染ファージ数は、 好ましくは 1〜5 0 0、 より好ましくは 1〜2 0 0、 さらに好ましくは 1 0〜5 0である。 他方、 MI0は必要に応じて小さくすることもできる。 つまり、 本検出法の一態 様では、 前記被検試料にファージを接触させてから該ファージの増殖に必要とさ れる時間を経た後に該被検試料にっレ、ての蛍光検出を行うことにより、 前記大腸 菌内に発現し蓄積された蛍光タンパク質から発せられる蛍光を検出する。 上述し たように溶菌酵素欠損型ファージによれば、 生菌内にファージ由来の蛍光タンパ ク質を十分に蓄積させて検出することができるので、 そのような生菌に特異的な 蛍光を検出できる。 この態様では、菌体あたりの感染ファージ数 (M0I) は、 1〜 2 0 0、好ましくは 1〜5 0以下、さらに好ましくは 1〜 1 0にすることにより、 精度の高い生菌数の検出が可能となる。
死菌と生菌の検出
また、 MI0を十分に大きく設定することで、 前記ファージ吸着のみに起因する 蛍光が検出可能になることから、 大腸菌にファージが吸着した直後における蛍光 を計数できる。 このようにして先ず大腸菌の死菌と生菌を区別することなく網羅 的に検出してもよい。 この場合、 さらに生菌のみを染色する色素を用いて二重染 色することによって、 上記と同様に、 培養工程を全く必要とせずに極めて短時間 で大腸菌の生菌を特異的に検出できるし、 また死菌と生菌とを判別して検出でき る。 したがって、本検出法の一態様には、前記感染ファージ数 (M0I) が前記吸着 ファージからの蛍光の強度レベルが検出可能となる程度に十分に高 ヽ値に設定さ れた場合において、 さらに、 生菌染色用色素で染色することにより生菌のみを検 出可能にすることが含まれる。
大腸菌の生残数の簡易な測定
上述のように、 初期吸着によって生じる弱レ、蛍光とファージの増殖によって生 じる強い蛍光を同時に分別して検出することによって、 大腸菌の生菌 ·死菌同時 検出法が提供され、 その結果を解析することで、 容易に大腸菌生残率を求めるこ とが可能になる。
生菌と死茼とを区別して効率的に検出するためには、 前記 M0Iは、 前記吸着フ ァージからの蛍光の強度レベルが検出可能となる程度に十分に高い値に設定され るだけではなく、 前記吸着ファージからの蛍光の強度レベルが、 前記大腸菌内か らの蛍光の強度レベルを有意に下回る程度の値に設定されることも重要である。 このように由来の異なる蛍光に強度差を設けることにより、大腸菌の全菌、死菌、 生菌を同時に判別して検出することが可能となる。
上記のようにして生残数を容易に得られる本検出法の一態様には、 前記被検試 料にファージを接触させてから該ファージの増殖に必要とされる時間を経た後、 当該被検試料中に観測される蛍光分布から、 前記ファージ吸着に基づく比較的低 い強度レベルの蛍光粒子と、 前記大腸菌内での蛍光タンパク質の発現に基づく比 較的高レ、強度レベルの蛍光粒子とに分別して検出し、 そして、 それら検出値に基 づいて大腸菌の生残率を求めることが含まれる。
また、 蛍光粒子の分布を捕らえて計数を行なう大腸菌計数法によれば、 初期吸 着直後とファージ増殖後とでの比較、 あるいはファージ接触前に認められる各蛍 光粒子の蛍光強度との比較を行うことで、 ファージ粒子の非特異的な吸着や自家 蛍光を有する粒子による非特異的な蛍光シグナルを排除し、 なおかつ生菌を特異 的に検出する方法も提供される。
上記のような本検出法の一態様には、 前記ファージを接触させる前の段階で被 検試料中に観測される蛍光分布、 及び/又は前記ファージが吸着した段階で該被 検試料中に観測される蛍光分布と、 該ファージの増殖に必要とされる時間が経過 した段階で該被検試料中に観測される蛍光分布とを比較することにより、 検出さ れるべき大腸菌へのファージ吸着に基づく強度レベルの蛍光を検出すること、 及 ぴ 又は検出されるべき大腸菌内での蛍光タンパク質の発現に基づく強度レベル の蛍光を検出することが含まれる。
また、 上記のような蛍光分布は、 蛍光顕微鏡や CCDカメラを使用して観測する とよい。 特に、 各蛍光の強度レべノレの判別、 計数、 比較処理のためには、 前記検 試料中に観測される各蛍光分布を CCD力メラで撮影した画像データとして得るこ とが好ましい。 力べして、 本検出法により蛍光粒子の計数を行なう大腸菌計数法 において、 蛍光顕微鏡や CCDカメラにより、 同一試料における初期吸着直後とフ ァージ増殖後、 あるいはさらにファージ接触前のそれぞれの段階に認められる各 蛍光粒子の一定視野面積内の数、 および蛍光強度を計測し、 なおかつ同画像を処 理して、 目的とする大腸菌の全菌、 または生菌のみを特異的に計数する大腸菌生 菌、 全菌数の測定法、 さらには生残率の測定法が提供される。
さらに本発明は、 ファージ外殻にファージ外殻タンパク質との融合タンパク質 として蛍光タンパク質を発現しており且つ溶菌酵素に欠損を持つ大腸菌検出用フ ァージをも提供する。
図面の簡単な説明
図 1は、 ファージを感染させた後の大腸菌 K12 (W3110)の増殖特性を示す。 図 2は、 ファージ感染 20分後の光学顕微鏡写真と蛍光顕微鏡写真である。 2-1 は T4(wt)光学顕微鏡、 2-2は T4(wt)蛍光顕微鏡、 2-3は T4(e_)光学顕微鏡、 2-4 は T4(e-)蛍光顕微鏡である。
図 3は'、 ファージ感染 60分後の光学顕微鏡と蛍光顕微鏡の写真である。 3-1は T4(wt)光学顕微鏡、 3-2は T4(wt)蛍光顕微鏡、 3-3は T4(e_)光学顕微鏡、 3-4は、 T4(e-)蛍光顕微鏡である。
発明の詳細な記載
以下、 本発明の細菌の検出方法について詳しく説明する。
本発明の大腸菌の検出方法は、 大腸菌に特異的に感染するファージを被検出対 象中の大腸菌と接触させ、 同ファージを大腸菌に吸着、 または、 感染させること により大腸菌を特異的に検出するものであり、 吸着、 または感染したファージの 検出方法として、 遺伝子組み換え技術によってファージ体内、 または体表に多量 に生産された蛍光タンパク質の蛍光を検出することを特徴とするものである。 そのように蛍光タンパク質を外殻に組み込むにあたっては、 ファージ外殻タン パク質としては Small outer capsidタンパク質 （以下 「Soc」 と記述する） が好 ましく、蛍光タンパク質としては、 グリーン蛍光タンパク質（以下「GFP」 と記述 する） が好ましい。 但し、 本発明に使用可能なタンパク質は、 それらに限定され るわけではなく、 例えば、 GFP以外にも下に列挙されたような公知の蛍光タンパ ク質、 また、 Soc以外にも Hoc (highly antigenic outer capsid protein) 等の 外殻タンパク質を使用できる。 因みに、 Socはファージあたり ％0分子程度で発 現されるのに対し、 Hocは 160分子程度で発現される。 蛍光タンパク質をファー ジ外殻に首尾良く提示させのに如何なる蛍光タンパク質と外殻タンパク質に着目 すべきかは、 当業者ならば適宜選択することができるし、 それらの有用性は、 本 明細書及ぴここに開示された文献を参照して実験等を行うことにより簡易に確か めることができる。
以下、 各工程毎に説明する。
本発明においては、 大腸菌に特異的に感染するファージを利用するが、 このよ うなファージとしては、 大腸菌に対する感染の特異性、 感染率の高いものが好ま しく、 このような好ましい例としては、 大腸菌ファージに代表される T系ファー ジ、 λファージなどが利用できる。 このような大腸菌に特異的に感染するファー ジは米国 ATCC等で入手可能である。 また、大腸菌の中でも特定の大腸菌、例えば 病原性大腸菌に特異的なファージも用いることができる。
本発明におレ、ては、 このようなファージに対して蛍光タンパク質遺伝子を導入 する。 本発明に用いられる代表的な蛍光タンパク質遗伝子として、 GFP遺伝子 (Prasher, D. C.， et al. , Gene, 111： 229-233 (1992)； Chalfe, M.， et al. , Science, 263 : 802-805 (1994) )を挙げることができ、 EBFP (Blue Fluorescent Protein)遺伝 子、 ECFP (Cyan Fluorescent Protein)遗 ナ、 EYFP (Yellow Fluorescent Protein) 遺伝子、 DsRed (Red Fluorescent Protein)遺伝子 (現在、 Genbankに submit中， Matz, M. V. , et al. , Nature Biotech.、 17:969- 973 (1999) )なども同様に利用可能であ るが、 これらに限定されるものではなく、 上述のように、 パクテリオファージ内 に導入することが可能であり、 かつ感染した細菌内において発現することができ る蛍光タンパク質遺伝子であれば、 あらゆる蛍光タンパク質遺伝子を用レヽること ができる。 このような蛍光タンパク質遺伝子を上述したようなバタテリオファージ内に導 入する方法としては、 一般的に行われている遺伝子組み換え技術を用いて行うこ とができる。 しかしファージ内に発現する蛍光タンパク質の分子数は大腸菌の検 出感度、 および精度に大きく影響するものであり、 特に初期の吸着時において検 出を行う場合にはこの影響は顕著である。 よってこれらの課題を解決する蛍光タ ンパク質遺伝子の導入方法としては、 ファージ外殻の主要な構成タンパク質遺伝 子の下流または上流にフレームが合うように蛍光タンパク質遺伝子を揷入し、 蛍 光タンパク質が外殻タンパク質との融合タンパク質としてファージ外殻表層で発 現するように導入されることが望ましい。
このような導入法としては、 蛍光タンパク質遣伝子を外殻タンパク質である Soc遺伝子下流の停止コドンより下流側に蛍光タンパク質遺伝子をフレームが合 うように揷入するか、 もしくは Soc遺伝子の開始コドンより上流側に蛍光タンパ ク質遺伝子をフレームが合うように揷入し、 蛍光タンパク質遺伝子発現ファージ を作成する方法等を挙げることができる。
さらに遺伝子を導入するファージは、 溶菌酵素をコードする遺伝子にアンバー 変異 (amber mutation)を導入することにより、 溶菌酵素発現能を欠損したファー ジであることが望ましく、 同ファージを利用することで、 検出時に問題となるフ ァージ感染大腸菌の溶菌から解消されるうえ、 大腸菌体内で増殖するファージ数 が増加することにより感度の上昇が期待できる。
このようなファージの生産方法としては、 たとえば、 アンバー変異を抑制する ァンパーサブレッサー（amber suppressor)能を有する大腸菌の培養液に同ファー ジを添加し数時間継続して培養した後、 増殖したファージを分離する、 一般的な ファージ溶菌液の調整法が利用できる。 得られたファージは、 溶菌液の状態でも 冷蔵保存することで長期間安定であり、 凍結乾燥法などの方法によつて乾燥する ことで、 常温でもさらに安定的に保存できる。
本発明においては、 次に、 上記蛍光タンパク質遺伝子が導入されたファージを 被検出対象と接触させ、 一定時間反応する。 接触方法としては、 水試料に直接上 記ファージ、 またはファージ懸濁液を添加すればよく、 また試料をろ過してろ紙 上に捕捉した大腸菌に対して、 ファージを含む溶液を接触させる方法なども適用 できる。
反応時間は、 ファージの初期吸着を指標とする場合においては、 大腸菌とファ ージが接触するために必要な時間であり、 大腸菌とファージ両濃度によつて影響 をうけるものの、 一般的には 0分間から 6時間でよく、 好ましくは 1分間から 6 0分間、 より好ましくは、 3分間から 3 0分間である。 また感染後に増殖したフ ァージの蛍光を検出する場合においては、 反応時間は 1 0分間以上でよく、 好ま しくは 3 0分間以上である。 なお、 溶菌酵素欠損ファージを用いる本発明におい ては、 長時間の反応によっても、 大腸菌の溶菌が起こらないことから最大の接触 時間が限定されることはない。
この反応は大腸菌の増殖に最適な温度条件を考慮して 2 0 °Cから 4 0 °Cの間で 加温することが好ましく、 また大腸菌の増殖に必要な基質を共存させることも効 果的であるが、 必ずしも必要でない。
そして、 本検出法では、 蛍光検出装置を用いて上記蛍光タンパク質に由来する 蛍光を発する細菌粒子を検出する。 ここで用いる蛍光検出装置としては、 特定波 長の蛍光を特異的に検出できる装置、 システムであれば特に限定されるものでは ないが、 蛍光顕微鏡、 CCDカメラ、 フローサイトメ一ター、 さらには蛍光光度計 などが挙げられる。 このうち蛍光顕微鏡を用いる場合は、 上記反応液の一定量を 直接、 またはろ紙上に捕捉して蛍光粒子を顕微鏡観察し、 一定視野面積内の蛍光 粒子を測定することで被検出対象中の大腸菌濃度を定量的に検出することが可能 である。 なお、 ろ紙上の大腸菌に対してファージを反応させる場合においては、 直接ろ紙上の蛍光粒子を検出すればよい。 CCDカメラを用いる場合は、 目的の蛍 光タンパク質に最適な励起波長を有する励起光を上記方法により蛍光標識した大 腸菌を捕捉したろ紙表面に照射し、 発生する蛍光を CCDカメラで直接検出する。 これらの方法においては、 得られた蛍光画像を画像処理して目的以外の蛍光を排 除し、 目的とする蛍光粒子数を自動的に測定するシステムを用いて自動計測する ことが好ましい。 また、 フローサイトメーターによれば、 液体状の上記反応液に 対して直接適用することも可能である。
本発明では、 上記方法により作成した蛍光強度が極めて強く、 感染時において も宿主大腸菌を溶菌しないことを特徴とする優れたファージを用いることから、 以下のような特徴ある検出法を実現できる。
すなわち、本発明では大腸菌一細胞あたりの感染ファージ数 (M0I) を極めて大 きくする条件で接触させ、 ファージが初期吸着した大腸菌由来の蛍光粒子を計数 することで、 1 0分以内の極めて短時間で生死を問わず大腸菌の全菌数を計数す ることが可能である。 またこのとき、 生きた細菌の持つ呼吸や特定酵素 （エステ ラーゼなど） の活性を検出する蛍光試薬を反応させることで、 生きた大腸菌だけ を特異的、 力 短時間で測定することも可能である。 このような蛍光試薬として は、 ΰ一 cyano - 2， 3 - ditolyl tetrazolium ch丄 oride、 fluorescein diacetate ある いは 5- (and 6-) sulfofluorescein diacetateなどを利用できるがこの限りでは ない。
一方、 細菌を蛍光標識する他の方法で指摘されているように、 環境試料中には 特異蛍光を妨害する因子があることが知られている。 たとえば、 蛍光標識物の非 特異的な吸着や自家蛍光を有する粒子による擬似陽性シグナルの影響である。 し かし本法によれば、 非特異的な蛍光粒子を排除して、 大腸菌だけを特異的に検出 することが可能である。 すなわち、 本発明では、 初期吸着時の大腸菌粒子の蛍光 強度がファージ增殖後の蛍光強度と比べて有意に弱い蛍光強度を示すように大腸 菌のー細胞あたりの感染ファージ数 (M0I) を設定し、初期吸着時における蛍光粒 子をすぺて非特異的な蛍光粒子として排除することで大腸菌の生菌に特異的な検 出法を確立した。 またファージ吸着時の試料中の蛍光粒子を排除し、 初期吸着時 の蛍光粒子とファージ増殖後の蛍光粒子における蛍光強度の違レヽを比較すること により、 同一試料中の大腸菌の全菌、 生菌をそれぞれ検出することが可能である ことから、 生残率を算出することも容易である。
以上のように本法は、 蛍光検出法にぉレ、て問題であった非特異的な蛍光粒子の 影響を受けることなく、 生菌、 死菌を区別して大腸菌を簡単、 迅速に測定する方 法を提供するものである。 なお、 あくまでも上記実施形態は、 例示であり、 本発 明の特許請求の範囲に記載された技術的思想と実質的に同一な構成を有し、 同様 な作用効果を奏するものは、 いかなるものであっても本発明の技術的範囲に包含 される。
GFPを発現させた溶菌酵素欠損ファージを大腸菌に感染させ、 GFPの蛍光により 大腸菌を特異的に検出した実施例を以下に示す。
実施例
実施例 1 ： T4- e- GFP組換えファ一ジの作成方法
T4ファージ Socをコードする soc遺伝子とその上流おょぴ下流域を含む遺伝子 断片を T4ファージ染色体を铸型に用い PCR法により得た。この Socを含む遺伝子 断片 socと大腸菌発現用プラスミド p QB2に含まれる GFPをコードする 遺伝 子を大腸菌発現ベクタープラスミドである PUC118上で連結酵素（リガーゼ）を用 いて結合し、 ベクタープラスミド p UC- GFPSoc を得た。 そしてこの p UC- GFPSoc により大腸菌 K12 (W3110)を形質転換した。 さらにこの形質転換体大腸菌 K12 (W3110)に T4e-ファージを感染させて感染大腸菌内における相同組換えによ り、 GFPを提示した T4e-組換え体ファージを作成した。 なお、 T4e-ファージは溶 菌酵素遺伝子 gp-eにアンバー変異を持つ T4 ファージである （Kao，S. H.， and Mcclain W. H. , J. virol. , 34, p95 (1980) )。 T4e- GFP組換え体ファージのスク リーユングは、 ファージプラ一クの蛍光発光を指標として行なつた。 この時、 T4- e一 GFP組換えファージを生じる確率は約 1/10, 000であった。
実施例 2 ： T4-wtGFP組換えファージの作成方法
実施例 1と同様の操作により p UC-GFPSocを作成し、 大腸菌 K1.2 (W31 10)を形質 転換した。 さらにこの形質転換体大腸菌 K12 (W3110)に野生型 T ファージ（T4 - wt ファージ） を感染させて感染大腸菌内における相同組換えにより、 GFP を提示し た T4-wt組換え体ファージを作成した。 T4- wtGFP組換え体ファージのスクリ一二 ングは、 ファージプラークの蛍光発光を指標として行なった。
実施例 3 ： PP01-GFP組換えファ一ジの製作方法
大腸菌 0157： H7特異的ファージである PP01の Socをコードする soc遺伝子とそ の上流および下流域を含む遺伝子断片を PP01 ファージ染色体を錶型に用い PCR 法により得た。 なお、 PP01ファージは発明者らがブタ糞便より大腸菌 0157 :H7を 指標細菌としてスクリーニングしたファージである。 この Socを含む遺伝子断片 socと大腸菌発現べクタ一ブラスミドである p QB2に含まれる を大腸菌発現べ クタ一プラスミドである PUC118上で連結酵素（リガーゼ）を用いて結合し、 p UC-GFPSocを得た。そしてこの p UC-GFPSocにより大腸菌 0157： H7を形質転換した。 さらにこの形質転換体大腸菌 0157： H7に PP01ファージを感染させて感染大腸菌内 における相同組換えにより、 GFPを提示した PP01ファージ組換え体ファージを作 成した。
PP01-GFP組換え体ファージのスクリーニングは、ファージプラークの蛍光発光 を指標として行なった。
実施例 4 ： T4-e- GFPファージの大量調整方法
T4 - e—ファージは溶菌酵素をコードする ^D-e遺伝子にアンパー変異を有し、 溶 菌酵素を産生する能力を喪失している。 したがって、 一般の大腸菌 K12株には感 染することはできても、 大腸菌を溶菌しないためファージ溶菌液の作成は困難で ある。 —方、 大腸菌 CR63株はアンバーサプレッサー株であり、 T4- e—ファージの 持つァンバー変異を抑制し、溶菌酵素を産生することができ、 T4 - e-ファージの感 染によりファージを複製および放出することができる。 そこで、 ここでは GFPで 標識された T4 - e—ファージを大腸菌 CR63株を宿主株として使用した。
大腸菌 CR63株の培養体に対して同ファージを感染させ、ファージ添加から約 6 時間の培養後、 クロ口ホルムを加え、 4°C恒温下で 1時間放置することにより、菌 体を完全に溶菌した。 そして遠心分離により大腸菌破枠物を沈殿として取り除い た。 PEG6000および NaClを加えファージを沈殿させ、遠心分離により沈殿したフ ァージを分離した。
分離したファージを少量の緩衝液に再懸濁し、 セシウムクロライド密度勾配遠 心による精製後、 透析によりセシウムクロライドを取り除いた。
実施例 5 ： T4-wt GFPファージの大量調整方法
実施例 4の T4- e—ファージの大量調整方法に準じて、 T4- wt GFPファージ調整し た。伹し、使用するファージを T4_wt、感染させる大腸菌を K12 (W3110)株とした。 実施例 6 ： PP01- GFPファージの大量調整方法
GFPで標識された PP01- GFPファージを大腸菌 0157 :H7株に感染させた。ファー ジ添加から約 6時間の培養後、クロ口ホルムを加え、 4°C恒温下で 1時間放匱する ことにより、 菌体を完全に溶菌した。 遠心分離により大腸菌破砕物を沈殿として 取り除いた。
PEG6000およぴ NaClを加えファージを沈殿させ、遠心分離により沈殿したファ ージを分離した。 分離したファージを少量の緩衝液に再懸濁し、 セシウムクロラ ィド密度勾配遠心による精製後、 透析によりセシウムクロライドを取り除いた。 実施例 7 ： T4GFPファージによる大腸菌感染時の溶菌特性
T4GFP ファージによる大腸菌感染時の溶菌特性を解析した。 対数増殖初期にあ る大腸菌 （ COJ K- 12 (W3110)株） の培養液 （LB, ca. ) に M0I=5 となるように T4T½tGFPファージおよび、 T4e- GFPファージ添加して、 0D660nmの径時変化を測 定した （図 1 )。
なお、 図 1において、 Controlは、 ファージを感染させなかったとき、 T4wtは 時間 0でファージ （T4(wt) ) を M0I=5で感染させたとき、 T4e-は時間 0でファー ジ (T4 (e-) ) を M0I=5で感染させたときを示す。 同図で示されるように、 コント ロールでは、 誘導期を経て 30分以降濁度の上昇を伴う菌体の増殖が認められ、 T4wtでは感染 40分以降、 菌体の溶菌による濁度の減少が認められるが、 T4e -で は感染は成立するが、 溶菌酵素を欠損しているために、 濁度の減少が認められな い。
実施例 8 ：大腸菌の蛍光観察
実施例 7の感染条件において、 蛍光顕微鏡により大腸菌の蛍光を観察した。 落 射蛍光位相差顕微鏡 （AX80T、 ォリンパス） を用い、 GFP蛍光観察用フィルター (U-丽 IBA/GFP、 ォリンパス） を用いて試料に励起光を照射し、 GFPの緑色の蛍光 を観察した。 T4wtGFPファージ、 および T4e-GFPファージとも添加直後の初期吸 着において弱い蛍光を発し、 2 0分後には、 吸着およぴ一部菌体内におけるファ ージの増殖による蛍光が認められたが、 両者に大きな差は無い （図 2 )。 しかし、 ファージ感染 6 0分後、 図 3によると、 T4 (wt)では溶菌が始まり、 菌体数の減少 が見られる。 ただし、 溶菌しないもの、 または大きな菌体破片には複製したファ ージが吸着しており、 蛍光顕微鏡で検出できる。 し力 し、 その割合は培養時間の 経過に伴い減少する。 一方、 T 4 (e-) では溶菌が生じないので、長時間の培養に よっても、 高い蛍光発光が認められた。
実施例 9 ： T4e-GFPファージによる蛍光顕微鏡を用いた大腸菌の検出
大腸菌を含む環境水に対して、 LB培地 （1 % Tryptone, 0. 5 % Yeast Extract, 1 % NaCl, pH 7) に懸濁した T4e_GFP ファージ液 （5 X 1 0 7PFU/ml) を 1対 1 で混合し、 2 8 °Cで弱く撹拌しながら反応させた。 そして、 3 0分反応後の検体 の一定量を分取して、 0. 2 μ mのろ紙でろ過し、さらに LB培地でろ紙を洗浄した。 このろ紙の一部をスライドグラス上に置き、 蛍光封入試薬を敵下した後、 カバー ガラスを乗せて落射蛍光顕微鏡で GFPの緑色の蛍光を観察した。 蛍光画像は CCD カメラによりパーソナノレコンピュータに取り込み、 画像解析ソフトウェア IP Lob (株式会社イメージ アンドメジャーメント) を用いて、 蛍光を有する粒子数を 1 0視野においてカウントし平均値を算出した。 ここでは強い蛍光強度を示す粒 子を生菌として、 弱い蛍光を示す粒子を死菌体、 その合計を全菌として計数した
(表 1 )。 表 1 . T4e-GFPファ一ジによリ測定した環境水中の大腸菌数
Figure imgf000016_0001
実施例 1 0 ： T4e- GFPファージによる CCDカメラを用いた大腸菌の検出
環境水 1 m 1を 0. 2 μ πιのろ紙でろ過し、 さらに LB培地でろ紙を洗浄した。 さ らに LB培地に懸濁したファージ （109PFU/m 1 ) をろ紙上に添加し、 1 0分間 2 8 °Cで反応した。 再びろ紙を LB培地で洗浄し、 同ろ紙に励起光を照射しながら、 ろ紙上の緑色蛍光粒子の数と蛍光強度を CCDカメラ （VIM CAMERA C2400- 47、浜 松ホトュクス） を用いてマクロ観察した。 なお、 観察はすべて遮光した計測箱の 中で行なった。 得られた画像データは、 画像解析ソフトウエア ARGUS- 50 (浜松 ホトニタス） を用いて、 ファージ添加前、 添加直後、 3 0分後の各段階における 蛍光粒子の数、 蛍光強度の変化を解析し、 ファージ添加前に存在せず、 添加直後 に弱い蛍光を有し、その後に蛍光が強くなる粒子を大腸菌の生菌として計数した。 また同時にファージ添加直後に弱い蛍光を生じ、 蛍光強度の増大が認められない 粒子を大腸菌の死菌体として計数した （表 2 )。 表 2 . T4e-GFPファージにより測定した環境水中の大腸菌数
Figure imgf000017_0001
発明の効果
本発明は、 ファージ粒子あたりの蛍光タンパク質の発現量を飛躍的に多くした ファージ、 および、 または溶菌酵素欠損型のファージを用いることにより、 大腸 菌の検出法において、 著しい感度の向上、 およびそれに伴う測定時間の短縮が達 成できる。 さらに同ファージを用いることにより、 大腸菌の生菌と死菌を区別し て同時に測定する新しレ、評価手法が提供される。

Claims

請求の範囲
1 . 特定の大腸菌に感染するファージを被検試料と接触させることによ り、 該被検試料中に存在する該大腸菌を検出する方法であって、 そのファージ外 殻にファージ外殻タンパク質との融合タンパク質として蛍光タンパク質を発現し ており且つ溶菌酵素に欠損を持つファージを使用することを含む検出方法。
2 . 前記大腸菌に吸着したファージの蛍光タンパク質から発せられる強 度レベルの蛍光を検出すること、 及び z又は前記ファージの吸着に起因して大腸 菌内で発現した蛍光タンパク質から発せられる強度レベルの蛍光を検出すること を含む、 請求項 1に記載の検出方法。
3 . 大腸菌の一細胞あたりの感染ファージ数 (M0I) は、前記吸着ファ一 ジからの蛍光の強度レベルが、 前記大腸菌内からの蛍光の強度レベルを有意に下 回る程度の値に設定される、 請求項 2に記載の検出方法。
4 . 大腸菌の一細胞あたりの感染フ了一ジ数 (M0I) は、前記吸着フ了一 ジからの蛍光の強度レベルが検出可能となる程度に十分に高レ、値に設定される、 請求項 2又は 3に記載の検出方法。
5 . 前記感染ファージ数 (M0I) が前記吸着ファージからの蛍光の強度レ ベルが検出可能となる程度に十分に高い値に設定された場合において、 さらに、 生菌染色用色素で染色することにより生菌を選択的に検出可能にすることを含む、 請求項 4に記載の検出方法。
6 · 前記被検試料にファージを接触させてから該ファージの増殖に必要 とされる時間を経た後に該被検試料についての蛍光検出を行うことにより、 前記 大月昜菌内に発現し蓄積された蛍光タンパク質から発せられる蛍光を検出可能にす ることを含む、 請求項 2〜 5のレ、ずれか 1項に記載の検出方法。
7. 前記被検試料にファージを接触させてから該ファージの増殖に必要 とされる時間を経た後、 当該被検試料中に観測される蛍光分布から、 前記ファー ジ吸着に基づく比較的低!/、強度レベルの蛍光粒子と、 前記大腸菌内での蛍光タン パク質の発現に基づく比較的高い強度レベルの蛍光粒子とに分別して検出し、 そ して、 それら検出値に基づいて大腸菌の生残率を求めることを含む、 請求項 4〜 6のいずれか 1項に記載の検出方法。
8 . 前記ファージを接触させる前の段階で被検試料中に観測される蛍光 分布、 及び/又は前記ファージが吸着した段階で該被検試料中に観測される蛍光 分布と、 該ファージの増殖に必要とされる時間が経過した段階で該被検試料中に 観測される蛍光分布とを比較することにより、 検出されるべき大腸菌へのファー ジ吸着に基づく強度レベルの蛍光を検出すること、 及び Z又は検出されるべき大 腸菌内での蛍光タンパク質の発現に基づく強度レベルの蛍光を検出することを含 む、 請求項 4〜 7のいずれか 1項に記載の検出方法。
9 . 前記検試料中に観測される各蛍光分布は、 CCDカメラにより得られ た画像データであることを含む、 請求項 7又は 8に記載の検出方法。
1 0 . ファージ外殻にファージ外殻タンパク質との融合タンパク質として 蛍光タンパク質を発現しており且つ溶菌酵素に欠損を持つ大腸菌検出溶用ファー ジ。
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