CN109071635B - Contorsbody－单链靶标结合物 - Google Patents
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Abstract
本文报道了环状融合多肽，其包含结合结构域的第一部分、结合结构域的第二部分和间隔结构域，其中间隔结构域是多肽并且包含至少25个氨基酸残基，结合结构域的第一部分是多肽并且通过第一接头融合至间隔结构域的N端，结合结构域的第二部分是多肽并且通过第二接头融合至间隔结构域的C端，结合结构域的第一部分和结合结构域的第二部分彼此缔合并形成特异性结合靶标的结合位点。
Description
本发明属于靶标结合分子领域。本文报道了包含间隔结构域的单链结合物，所述间隔结构域位于结合结构域的第一片段和结合结构域的第二片段之间。
发明背景
自1974年Koehler和Milstein开发出第一种单克隆抗体以来，已经有大量努力致力于开发适合人类治疗的抗体。在小鼠和大鼠中已开发出可供使用的第一代单克隆抗体。当用于治疗人类时，这些抗体由于是抗啮齿动物抗体而引起不想要的副作用。已经有大量努力致力于减少甚至消除这种不想要的副作用。
在过去几年中，越来越多的人单克隆抗体或人源化单克隆抗体已经进入市场。众所周知的实例包括例如来自巴塞尔的Hoffmann-La Roche的和
此外，已经开发了衍生自野生型四链Y型抗体形式的新抗体形式。这些形式主要是双特异性和多特异性形式。有关综述参阅例如Kontermann,R.,mAbs 4(2012)182-197。
在US 2009/0175867中，报道了具有效应子功能的单链多价结合蛋白。
在WO2014/131711中报道了双特异性抗体，其中第二和第三抗原结合部分可以直接或者是通过免疫球蛋白铰链区与Fc结构域融合。
在EP 15176083中报道了与全长抗体相比具有降低的分子量的新型抗体形式及其用途。
WO 2007/048022公开了抗体-多肽融合蛋白及其制备和使用方法。
WO 2007/146968公开了具有效应子功能的单链多价结合蛋白。
EP 1 378 520公开了环状单链三特异性抗体。
发明概述
本文报道了作为新型靶标结合物的单环多肽。在该环状多肽中，N端部分包含结合位点的第一部分，C端部分包含结合位点的第二部分。结合位点的第一部分和结合位点的第二部分彼此缔合以形成完整或功能性结合位点。由此多肽被环化。该缔合可以是非共价或共价的。在缔合是共价的情况下，它不是通过肽键，而是例如通过二硫键。
本文报道的一个方面是(特异性)结合靶标的(环状)(单链)融合多肽，其包含结合结构域的第一部分、结合结构域的第二部分和间隔结构域，其中
-间隔结构域是多肽(其折叠后形成结构性结构域)，
-结合结构域的第一部分是多肽，其(直接或)通过第一(肽)接头与间隔结构域的N端融合，
-结合结构域的第二部分是多肽，其(直接或)通过第二(肽)接头与间隔结构域的C端融合，
-(相同(单链)融合多肽的)结合结构域的第一部分和结合结构域的第二部分(共价或非共价彼此缔合/结合)形成特异性结合靶标的(功能性)结合位点。
在一个实施方案中，(环状)(单链)融合多肽包含间隔结构域N端的结合结构域的恰好一部分和间隔结构域C端的相同结合结构域的恰好一个不同的部分。
在一个实施方案中，结合结构域的第一部分是抗体重链可变结构域，结合结构域的第二部分是抗体轻链可变结构域，或反之亦然。
在一个实施方案中，结合结构域的第一部分和结合结构域的第二部分彼此共价缔合。在一个实施方案中，结合结构域的第一部分和结合结构域的第二部分通过除肽键之外的键彼此共价缔合。在一个优选的实施方案中，结合结构域的第一部分和结合结构域的第二部分通过二硫键彼此共价缔合。
在一个实施方案中，结合结构域的第一部分是抗体重链Fab片段(VH+CH1)，结合结构域的第二部分是抗体轻链Fab片段(VL+CL)，或反之亦然。
在一个实施方案中，结合位点不包含一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域/不含抗体可变结构域。
在一个优选的实施方案中，间隔结构域包含至少25个氨基酸残基。在一个实施方案中，间隔结构域包含至少50个氨基酸残基。在一个实施方案中，间隔结构域包含至少100个氨基酸残基。
在一个实施方案中，(环状)(单链)融合多肽发挥效应子功能。在一个实施方案中，效应子功能是ADCC或/和CDC。
在一个实施方案中，间隔结构域包含抗体铰链区或其片段和抗体CH2结构域或其片段。在一个实施方案中，铰链区和抗体CH2结构域或其片段是人IgG1亚类。在一个实施方案中，铰链区和抗体CH2结构域具有SEQ ID NO：105的氨基酸序列。
在一个实施方案中，间隔结构域包含抗体铰链区或其片段、抗体CH2结构域和抗体CH3结构域或其片段。在一个实施方案中，铰链区、抗体CH2结构域和抗体CH3结构域、或其片段是人IgG1亚类。在一个实施方案中，铰链区、抗体CH2结构域和抗体CH3结构域具有选自SEQ ID NO：31至51的氨基酸序列。在一个优选的实施方案中，铰链区、抗体CH2结构域和抗体CH3结构域具有SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：39或SEQ IDNO：40或SEQ ID NO：41的氨基酸序列。
在一个实施方案中，第一和/或第二接头是肽接头。
在一个实施方案中，(特异性)结合靶标的(环状)(单链)融合多肽包含结合结构域的第一部分、结合结构域的第二部分和间隔结构域，其中
-间隔结构域具有选自SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41的氨基酸序列，
-结合结构域的第一部分是抗体重链Fab片段，结合结构域的第二部分是抗体轻链Fab片段，或反之亦然，
-结合结构域的第一部分通过SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：65的第一肽接头与间隔结构域的N端融合，结合结构域的第二部分通过SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：65的第二肽接头与间隔结构域的C端融合，由此第一和第二肽接头彼此独立地选择，和
-抗体重链Fab片段和抗体轻链Fab片段(彼此缔合)形成(特异性)结合靶标的(功能性)结合位点。
在一个实施方案中，(环状)(单链)融合多肽在N至C端方向上包含间隔结构域之前(即，间隔结构域N端)的恰好一个抗体可变结构域，和间隔结构域之后(即，间隔结构域C端)的恰好一个抗体可变结构域。
在一个实施方案中，靶标是细胞表面抗原或者是细胞表面受体的可溶性配体。
在一个实施方案中，结合结构域是常规的Fab、CrossFab或DutaFab。
在一个实施方案中，结合结构域是常规的Fab，其中结合结构域的一部分包含抗体重链可变结构域(VH)和(或完整)第一抗体重链恒定结构域的至少N端片段(CH1)，和相应的另一结合结构域包含抗体轻链可变结构域(VL)和(或完整)抗体轻链恒定结构域(CL)的至少N端片段，或反之亦然。
在一个实施方案中，结合结构域的一部分在N至C端方向上包含VH-CH1，并且结合结构域的另一部分在N至C端方向上包含VL-CL，或反之亦然。
在一个实施方案中，结合结构域是CrossFab，其中结合结构域的两个部分都包含抗体可变结构域和(或完整)抗体恒定结构域的至少N端片段，由此可变结构域和恒定结构域对不是彼此天然缔合，其具有重链结构域和轻链结构域的结构域变换(cross-over)/交换。在一个实施方案中，交换是VH与VL交换或CH1与CL交换。
在一个实施方案中，结合结构域的一部分在N至C端方向上包含VL-CH1，并且结合结构域的另一部分在N至C端方向上包含VH-CL。
在一个实施方案中，结合结构域的一部分在N至C端方向上包含VH-CL，并且结合结构域的另一部分在N至C端方向上包含VL-CH1。
可以通过引入电荷在CrossFab中的结构域交换旁边进一步促进结合结构域的(相应)部分的缔合。在某些情况下，(多环)(二聚体环状)融合多肽至少包含第一(环状)融合多肽和第二(环状)融合多肽。
在一个实施方案中，(多环)融合多肽包含
a)第一(环状)融合多肽，其包含作为结合位点的(特异性)结合第一抗原的Fab，和
b)第二(环状)融合多肽，其包含作为结合位点的特异性结合第二抗原的Fab，其中(第二环状融合多肽的)Fab中的可变结构域VL和VH彼此置换。
a)中的(环状)融合多肽不包含b)中报道的修饰。
在b)中的(环状)融合多肽中
在抗体轻链片段内可变轻链结构域VL被所述Fab的可变重链结构域VH置换，和
在抗体重链片段内可变重链结构域VH被所述Fab的可变轻链结构域VL置换。
在一个实施方案中
i)在(多环融合多肽的)第一(环状)融合多肽的恒定结构域CL中，对应于根据Kabat的124位的位置处的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代，并且其中在(多环融合多肽的)第一(环状)融合多肽的恒定结构域CH1中，对应于根据Kabat EU索引的147位的位置处的氨基酸或对应于根据Kabat EU索引的213位的位置处的氨基酸被带负电荷的氨基酸取代，或者
ii)在(多环融合多肽的)第二(环状)融合多肽的恒定结构域CL中，对应于根据Kabat的124位的位置处的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代，并且其中在(多环融合多肽的)第二(环状)融合多肽的恒定结构域CH1中，对应于根据Kabat EU索引的147位的位置处的氨基酸或对应于根据Kabat EU索引的213位的位置处的氨基酸被带负电荷的氨基酸取代。
在一个优选实施方案中
i)在(多环融合多肽的)第一(环状)融合多肽的恒定结构域CL中，对应于根据Kabat的124位的位置处的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(在一个优选的实施方案中，独立地被赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代)，并且其中在(多环融合多肽的)第一(环状)融合多肽的恒定结构域CH1中，对应于根据Kabat EU索引的147位的位置处的氨基酸或对应于根据Kabat EU索引的213位的位置处的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代，或者
ii)在(多环融合多肽的)第二(环状)融合多肽的恒定结构域CL中，对应于根据Kabat的124位的位置处的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(在一个优选的实施方案中，独立地被赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代)，并且其中在(多环融合多肽的)第二(环状)融合多肽的恒定结构域CH1中，对应于根据Kabat EU索引的147位的位置处的氨基酸或对应于根据Kabat EU索引的213位的位置处的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代。
在一个实施方案中，在(多环融合多肽的)第二(环状)融合多肽的恒定结构域CL中，对应于根据Kabat EU索引的124和123位的位置处的氨基酸被K取代。
在一个实施方案中，在(多环融合多肽的)第二(环状)融合多肽的恒定结构域CH1中，对应于根据Kabat EU索引的147和213位的位置处的氨基酸被E取代。
在一个实施方案中，结合结构域是DutaFab，其中结合结构域的一部分包含抗体重链可变结构域(VH)和(或完整)第一抗体重链恒定结构域(CH1)的至少N端片段，和相应的另一结合结构域包含抗体轻链可变结构域(VL)和(或完整)抗体轻链恒定结构域(CL)的至少N端片段，其中结合结构域在重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的互补对中包含两个非重叠的互补位，其中第一互补位包含来自VL结构域的CDR1和CDR3和VH结构域的CDR2的残基，第二互补位包含来自VH结构域的CDR1和CDR3和VL结构域的CDR2的残基。
本文报道的一个方面是(双环(dicircular))融合多肽，其包含本文报道的第一(环状)融合多肽和本文报道的第二(环状)融合多肽，其中第一和第二(环状)融合多肽相同或不同，并且其中第一(环状)融合多肽的间隔结构域(共价)缀合到第二(环状)融合多肽的间隔结构域。
在一个实施方案中，(双环)融合多肽包含
-(特异性)结合第一靶标的第一(环状)(单链)融合多肽，其包含结合结构域的第一部分、结合结构域的第二部分和间隔结构域，其中
-间隔结构域具有SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：40的氨基酸序列，
-结合结构域的第一部分是抗体重链Fab片段，结合结构域的第二部分是抗体轻链Fab片段，或反之亦然，
-结合结构域的第一部分通过SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：65的第一肽接头与间隔结构域的N端融合，结合结构域的第二部分通过SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：65的第二肽接头与间隔结构域的C端融合，由此第一和第二肽接头彼此独立地选择，和
-抗体重链Fab片段和抗体轻链Fab(片段彼此缔合)形成(特异性)结合第一靶标的(功能性)结合位点，和
-(特异性)结合第二靶标的第二(环状)(单链)融合多肽，其包含结合结构域的第一部分、结合结构域的第二部分和间隔结构域，其中
-间隔结构域具有SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：41的氨基酸序列，
-结合结构域的第一部分是抗体重链Fab片段，结合结构域的第二部分是抗体轻链Fab片段，或反之亦然，
-结合结构域的第一部分通过SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：65的第一肽接头与间隔结构域的N端融合，并且结合结构域的第二部分通过SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：65的第二肽接头与间隔结构域的C端融合，由此第一和第二肽接头彼此独立地选择，和
-抗体重链Fab片段和抗体轻链Fab片段(彼此缔合)形成(特异性)结合第二靶标的(功能性)结合位点。
在一个实施方案中，(环状)(单链)融合多肽中的每一个多肽在N至C端方向上包含间隔结构域之前(即，间隔结构域N端)的恰好一个抗体可变结构域和间隔结构域之后(即，间隔结构域C端)的恰好一个抗体可变结构域。
在一个实施方案中，靶标是细胞表面抗原或者是细胞表面受体的可溶性配体。
在一个实施方案中，结合结构域是常规的Fab、CrossFab或DutaFab。
在一个实施方案中，一个或每个结合结构域是常规的Fab，其中结合结构域的一部分包含抗体重链可变结构域(VH)和(或完整)第一抗体重链恒定结构域(CH1)的至少N端片段，和相应的另一结合结构域包含抗体轻链可变结构域(VL)和(或完整)抗体轻链恒定结构域(CL)的至少N端片段。
在一个实施方案中，结合结构域的一部分在N至C端方向上包含VH-CH1，并且结合结构域的另一部分在N至C端方向上包含VL-CL，或反之亦然。
在一个实施方案中，一个或每个结合结构域是CrossFab，其中结合结构域的两个部分都包含抗体可变结构域和(或完整)抗体恒定结构域的至少N端片段，由此可变结构域和恒定结构域对不是天然彼此缔合，其具有重链结构域和轻链结构域的结构域变换/交换。在一个实施方案中，交换是VH与VL交换或CH1与CL交换。
在一个实施方案中，结合结构域的一部分在N至C端方向上包含VL-CH1，并且结合结构域的另一部分在N至C端方向上包含VH-CL。
在一个实施方案中，结合结构域的一部分在N至C端方向上包含VH-CL，并且结合结构域的另一部分在N至C端方向上包含VL-CH1。
可以通过引入电荷在CrossFab中的结构域交换旁边进一步促进相关结合结构域的缔合。在这种情况下，(多环)(二聚体环状)融合多肽至少包含第一(环状)融合多肽和第二(环状)融合多肽。
在一个实施方案中，(多环)融合多肽包含
a)第一(环状)融合多肽，其包含作为结合位点的(特异性)结合第一抗原的Fab，和
b)第二(环状)融合多肽，其包含作为结合位点的(特异性)结合第二抗原的Fab，其中(第二(环状)融合多肽的)Fab中的可变结构域VL和VH彼此置换。
a)中的(环状)融合多肽不包含b)中报道的修饰。
b)中的(环状)融合多肽中
在抗体轻链片段内可变轻链结构域VL被所述Fab的可变重链结构域VH置换，和
在抗体重链片段内可变重链结构域VH被所述Fab的可变轻链结构域VL置换。
在一个实施方案中
i)在(多环融合多肽的)第一(环状)融合多肽的恒定结构域CL中，对应于根据Kabat的124位的位置处的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代，并且其中在(多环融合多肽的)第一(环状)融合多肽的恒定结构域CH1中，对应于根据Kabat EU索引的147位的位置的氨基酸或对应于根据Kabat EU索引的213位的位置的氨基酸被带负电荷的氨基酸取代，或者
ii)在(多环融合多肽的)第二(环状)融合多肽的恒定结构域CL中，对应于根据Kabat的124位的位置处的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代，并且其中在(多环融合多肽的)第二(环状)融合多肽的恒定结构域CH1中，对应于根据Kabat EU索引的147位的位置处的氨基酸或对应于根据Kabat EU索引的213位的位置处的氨基酸被带负电荷的氨基酸取代。
在一个优选实施方案中
i)在(多环融合多肽的)第一(环状)融合多肽的恒定结构域CL中，对应于根据Kabat的124位的位置处的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(在一个优选的实施方案中，独立地被赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代)，并且其中在(多环融合多肽的)第一(环状)融合多肽的恒定结构域CH1中，对应于根据Kabat EU索引的147位的位置处的氨基酸或对应于根据Kabat EU索引的213位的位置处的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代，或者
ii)在(多环融合多肽的)第二(环状)融合多肽的恒定结构域CL中，对应于根据Kabat的124位的位置处的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(在一个优选的实施方案中，独立地被赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代)，并且其中在(多环融合多肽的)第二(环状)融合多肽的恒定结构域CH1中，对应于根据Kabat EU索引的147位的位置处的氨基酸或对应于根据Kabat EU索引的213位的位置处的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代。
在一个实施方案中，在(多环融合多肽的)第二(环状)融合多肽的恒定结构域CL中，对应于根据Kabat EU索引的124和123位的位置处的氨基酸被K取代。
在一个实施方案中，在(多环融合多肽的)第二(环状)融合多肽的恒定结构域CH1中，对应于根据Kabat EU索引的147和213位的位置处的氨基酸被E取代。
在一个实施方案中，一个或每个结合结构域是DutaFab，其中结合结构域的一部分包含抗体重链可变结构域(VH)和(或完整)第一抗体重链恒定结构域(CH1)的至少N端片段，和相应的另一结合结构域包含抗体轻链可变结构域(VL)和(或完整)抗体轻链恒定结构域(CL)的至少N端片段，其中结合结构域在重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的互补对中包含两个非重叠互补位，其中第一互补位包含来自VL结构域的CDR1和CDR3以及VH结构域的CDR2的残基，和第二互补位包含来自VH结构域的CDR1和CDR3以及VL结构域的CDR2的残基。本文报道的一个方面是编码本文报道的环状融合多肽的分离的核酸。
本文报道的一个方面是一对分离的核酸，其一起编码本文报道的二聚体(环状)融合多肽。
本文报道的一个方面是宿主细胞，其包含本文报道的核酸或本文报道的核酸对。
本文报道的一个方面是产生(环状或双环)融合多肽的方法，包括培养本文报道的宿主细胞，从而产生(环状或双环)融合多肽并从细胞或培养基中回收(环状或双环)融合多肽。
本文报道的一个方面是免疫缀合物，其包含本文报道的(环状)融合多肽和细胞毒性剂。
本文报道的一个方面是药物制剂，其包含本文报道的(环状)融合多肽或本文报道的(二聚体)(环状)融合多肽和可药用载体。
本文报道的一个方面是本文报道的(环状)融合多肽或本文报道的二聚体(环状)融合多肽用作药物。
本文报道的一个方面是本文报道的(环状)融合多肽或本文报道的二聚体(环状)融合多肽在制备药物中的用途。
发明的详细描述
I.定义
结入扣(knobs into holes)二聚化模块及其在抗体工程化中的用途描述于Carter P.；Ridgway J.B.B.；Presta L.G.:Immunotechnology，第2卷，第1期，1996年2月，第73-73页(1)。
关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息在以下文献中给出：Kabat,E.A.,等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)。
如本文所用，重链和轻链的所有恒定区和结构域的氨基酸位置根据Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中描述的Kabat编号系统编号，在本文中称为“根据Kabat编号”。具体地，Kabat等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991)的Kabat编号系统(参见第647-660页)用于κ和λ同种型的轻链恒定区CL，Kabat EU索引编号系统(参见第661-723页)用于恒定重链结构域(CH1、铰链、CH2和CH3，在这种情况下其在本文中通过引用“根据Kabat EU索引编号”进一步阐明)。
用于实施本发明的有用方法和技术描述于例如Ausubel,F.M.(编辑),CurrentProtocols in Molecular Biology,第I至III卷(1997)；Glover,N.D.和Hames,B.D.编辑,DNA Cloning:A Practical Approach,第I和II卷(1985),牛津大学出版社；Freshney,R.I.(编辑),Animal Cell Culture–a practical approach,IRL出版社有限公司(1986)；Watson,J.D.,等人,Recombinant DNA,第二版,CHSL出版社(1992)；Winnacker,E.L.,FromGenes to Clones；N.Y.,VCH出版社(1987)；Celis,J.编辑,Cell Biology,第二版,学术出版社(1998)；Freshney,R.I.,Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique,第二版,Alan R.Liss,Inc.,N.Y.(1987)。
重组DNA技术的使用使得能够产生核酸的衍生物。例如，这些衍生物可以通过取代、改变、交换、缺失或插入在个别或几个核苷酸位置进行修饰。修饰或衍生化可以例如通过定点诱变进行。这些修饰可以由本领域技术人员容易地进行(参见例如Sambrook,J.等人,Molecular Cloning:A laboratory manual(1999)Cold Spring Harbor LaboratoryPress,美国纽约；Hames,B.D.和Higgins,S.G.,Nucleic acid hybridization–apractical approach(1985)IRL出版社,英国牛津)。
必须注意，如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“一种”，“一个”和“该”包括复数指代，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提及“一个细胞”包括多个这样的细胞及本领域技术人员已知的等同物，等等。同样，术语“一种”(或“一个”)、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可互换使用。还应注意，术语“包含”、“包括”和“具有”可互换使用。
术语“约”表示其后的数值的+/-20％的范围。在一个实施方案中，术语“约”表示其后的数值的+/-10％的范围。在一个实施方案中，术语“约”表示其后的数值的+/-5％的范围。
“亲和力”是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映结合对的成员(例如，抗体和抗原)之间的1：1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可由解离常数(kd)表示。亲和力可以通过本领域已知的常规方法(包括本文所述的那些)测量。
术语“氨基酸序列标签”表示通过具有特异性结合特性的肽键彼此连接的氨基酸残基的序列。在一个实施方案中，氨基酸序列标签是亲和力或纯化标签。在一个实施方案中，氨基酸序列标签选自Arg-标签、His-标签、Flag标签、3xFlag-标签、Strep-标签、Nano-标签、SBP-标签、c-myc-标签、S-标签、钙调蛋白结合肽、纤维素结合结构域、几丁质结合结构域、GST-标签或MBP-标签。在一个实施方案中，氨基酸序列标签选自SEQ ID NO：01(RRRRR)、或SEQ ID NO：02(RRRRRR)、或SEQ ID NO：03(HHHHHH)、或SEQ ID NO：04(KDHLIHNVHK EFHAHAHNK)、或SEQ ID NO：05(DYKDDDDK)、或SEQ ID NO：06(DYKDHDGDYKDHDIDYKDDD DK)、或SEQ ID NO：07(AWRHPQFGG)、或SEQ ID NO：08(WSHPQFEK)、或SEQ IDNO：09(MDVEAWLGAR)、或SEQ ID NO：10(MDVEAWLGAR VPLVET)、或SEQ ID NO：11(MDEKTTGWRGGHVVEGLAGE LEQLRARLEH HPQGQREP)、或SEQ ID NO：12(EQKLISEEDL)、或SEQ ID NO：13(KETAAAKFER QHMDS)、或SEQ ID NO：14(KRRWKKNFIA VSAANRFKKI SSSGAL)、或SEQ ID NO：15(纤维素结合结构域)、或SEQ ID NO：16(纤维素结合结构域)、或SEQ ID NO：17(TNPGVSAWQV NTAYTAGQLV TYNGKTYKCL QPHTSLAGWE PSNVPALWQL Q)、或SEQ ID NO：18(GST-标签)或SEQ ID NO：19(MBP-标签)。
术语“氨基酸取代”表示用不同的“置换”氨基酸残基置换预定的亲本氨基酸序列中的至少一个氨基酸残基。一个或多个置换残基可以是“天然存在的氨基酸残基”(即由遗传密码编码)，并且选自：丙氨酸(Ala)；精氨酸(Arg)；天冬酰胺(Asn)；天冬氨酸(Asp)；半胱氨酸(Cys)；谷氨酰胺(Gln)；谷氨酸(Glu)；甘氨酸(Gly)；组氨酸(His)；异亮氨酸(Ile)：亮氨酸(Leu)；赖氨酸(Lys)；蛋氨酸(Met)；苯丙氨酸(Phe)；脯氨酸(Pro)；丝氨酸(Ser)；苏氨酸(Thr)；色氨酸(Trp)；酪氨酸(Tyr)；和缬氨酸(Val)。在一个实施方案中，置换残基不是半胱氨酸。本文氨基酸取代的定义中还包括用一个或多个非天然存在的氨基酸残基的取代。“非天然存在的氨基酸残基”表示除了上面列出的那些天然存在的氨基酸残基之外的残基，其能够共价结合多肽链中的相邻氨基酸残基。非天然存在的氨基酸残基的实例包括正亮氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、高丝氨酸、aib和其他氨基酸残基类似物，如Ellman等人,Meth.Enzym.202(1991)301-336中描述的那些。为了产生这种非天然存在的氨基酸残基，可以使用Noren等人(Science 244(1989)182)和/或Ellman等人(同上)的方法。简而言之，这些方法包括用非天然存在的氨基酸残基化学激活抑制性tRNA，然后体外转录和翻译RNA。还可以通过化学肽合成以及随后将这些肽与重组产生的多肽(如抗体或抗体片段)融合将非天然存在的氨基酸掺入肽中。
术语“抗体依赖性细胞毒性(ADCC)”是由Fc受体结合介导的功能，并且是指在效应细胞存在下由抗体Fc区介导的靶细胞的裂解。通过在效应细胞如新鲜分离的PBMC(外周血单个核细胞)或从血沉棕黄层纯化的效应细胞如单核细胞或NK(自然杀伤)细胞的存在下，用包含本文报道的多环融合多肽的Fc区处理表达靶标的红细胞类(例如表达重组靶标的K562细胞)制备物来测量ADCC。靶细胞用Cr-51标记，随后与多环融合多肽孵育。将标记的细胞与效应细胞孵育，并分析上清液中释放的Cr-51。对照包括靶内皮细胞与效应细胞的孵育，但没有多环融合多肽。通过测量与表达Fcγ受体的细胞(如重组表达FcγRI和/或FcγRIIA的细胞或NK细胞(基本上表达FcγRIIIA))的结合来研究多环融合多肽诱导介导ADCC的初始步骤的能力。在一个优选的实施方案中，测量与NK细胞上的FcγR的结合。
术语“结合至”表示结合位点与其靶标的结合，如，例如包含抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域的抗体结合位点与相应抗原的结合。可以使用例如测定法(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)测定该结合。
例如，在测定法的一个可能的实施方案中，抗原与表面结合，并且通过表面等离子共振(SPR)测量抗体结合位点的结合。结合的亲和力由术语ka(结合常数：结合以形成复合物的速率常数)、kd(解离常数；复合物解离的速率常数)和KD(kd/ka)定义。备选地，在共振信号高度和解离行为方面，SPR传感图的结合信号可以直接与参照的应答信号进行比较。
术语“CH1结构域”表示抗体重链多肽的一部分，其约从EU 118位延伸至EU 215位(EU编号系统)。在一个实施方案中，CH1结构域具有 的氨基酸序列。
术语“CH2结构域”表示抗体重链多肽的一部分，其约从EU 231位延伸至EU 340位(根据Kabat的EU编号系统)。在一个实施方案中，CH2结构域具有 的氨基酸序列。CH2结构域的独特之处在于它不与另一个结构域紧密配对。而是，两个N-连接的支链碳水化合物链插入完整天然Fc区的两个CH2结构域之间。据推测，碳水化合物可以提供结构域-结构域配对的替代并有助于稳定CH2结构域。Burton,Mol.Immunol.22(1985)161-206。
术语“CH3结构域”表示抗体重链多肽的部分，其约从EU 341位延伸至EU 446位。在一个实施方案中，CH3结构域具有 的氨基酸序列。
抗体或Fc区的“类别”是指重链或其片段所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五种主要类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
如本文所用的术语“细胞毒性剂”是指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性剂包括但不限于放射性同位素(例如，At-211、I-131、I-125、Y-90、Re-186、Re-188、Sm-153、Bi-212、P-32、Pb-212和Lu的放射性同位素)；化疗剂或药物(例如，氨甲喋呤、阿霉素(adriamicin)、长春花生物碱(长春新碱、长春碱、依托泊苷)、多柔比星、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、柔红霉素或其它嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段如核溶酶；抗生素；毒素如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或变体；以及下面公开的各种抗肿瘤剂或抗癌剂。
术语“补体依赖性细胞毒性(CDC)”是指在补体存在下由本文报道的抗体Fc区诱导的细胞裂解。在一个实施方案中，通过在补体存在下用本文报道的多环融合多肽处理表达靶标的人内皮细胞来测量CDC。在一个实施方案中，细胞用钙荧光素标记。如果多环融合多肽以30μg/ml的浓度诱导20％或更多的靶细胞裂解，则存在CDC。可以在ELISA中测量与补体因子C1q的结合。在这种测定法中，原则上用浓度范围的多环融合多肽包被ELISA板，向其中加入纯化的人C1q或人血清。通过针对C1q的抗体以及随后的过氧化物酶标记的缀合物检测C1q的结合。对结合的检测(最大结合Bmax)测量为过氧化物酶底物(2,2'-连氮基-二-[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸酯])在405nm处的光密度(OD405)。
如本文所用的术语“结构域变换”表示在一对抗体重链VH-CH1片段及其相应的相关抗体轻链，即在抗体结合臂中(即在Fab片段中)，结构域序列偏离天然序列，其中至少一个重链结构域被其相应的轻链结构域替代，或反之亦然。存在三种一般类型的结构域交换，(i)CH1和CL结构域的交换，其导致具有VL-CH1结构域序列的结构域变换轻链和具有VH-CL结构域序列的结构域变换重链片段(或具有VH-CL-铰链-CH2-CH3结构域序列的全长抗体重链)，(ii)VH和VL结构域的结构域交换，其导致具有VH-CL结构域序列的结构域变换轻链和具有VL-CH1结构域序列的结构域变换重链片段，和(iii)完整轻链(VL-CL)和完整VH-CH1重链片段的结构域变换(“Fab变换”)，其导致具有VH-CH1结构域序列的结构域变换轻链和具有VL-CL结构域序列的结构域变换重链片段(所有上述结构域序列以N端至C端的方向表示)。
如本文所用，关于相应的重链和轻链结构域的术语“彼此置换”是指上述的结构域变换。因此，当CH1和CL结构域“彼此置换”时，是指项目(i)中提到的结构域变换以及所得的重链和轻链结构域序列。因此，当VH和VL“彼此置换”时，是指项目(ii)中提到的结构域变换；当CH1和CL结构域“彼此置换”以及VH1和VL结构域“彼此置换”时，是指项目(iii)中提到的结构域变换。包括结构域变换的双特异性抗体报道在，例如，WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO 2009/080254和Schaefer,W.等人,Proc.Natl.Acad.Sci USA108(2011)11187-11192中。
用本文报道的方法产生的多特异性抗体基本上包含Fab片段，其包括如上文项目(i)中提及的CH1和CL结构域的结构域变换，或如上文项目(ii)提及的VH和VL结构域的结构域变换。特异性结合相同抗原的Fab片段构建为具有相同的结构域序列。因此，在多特异性抗体中包含多于一个具有结构域变换的Fab片段的情况下，所述Fab片段特异性结合相同的抗原。
“效应子功能”是指可归因于抗体Fc区的那些生物学活性，其随着其所衍生自的抗体类别而变化。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；下调细胞表面受体(例如B-细胞受体)；和B-细胞激活。
Fc受体结合依赖性效应子功能可以通过抗体Fc区与Fc受体(FcR)的相互作用来介导，Fc受体是造血细胞上的特化细胞表面受体。Fc受体属于免疫球蛋白超家族，并且已经显示通过免疫复合物的吞噬作用介导抗体包被的病原体的去除，以及通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)裂解呈递Fc区的红细胞和多种其他细胞靶标(例如肿瘤细胞)(参见例如Van de Winkel,J.G.和Anderson,C.L.,J.Leukoc.Biol.49(1991)511-524)。FcR由其对免疫球蛋白同种型的特异性来定义：IgG型Fc区的Fc受体被称为FcγR。Fc受体结合描述在例如Ravetch,J.V.和Kinet,J.P.,Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492；Capel,P.J.等人,Immunomethods 4(1994)25-34；de Haas,M.等人,J.Lab.Clin.Med.126(1995)330-341；Gessner,J.E.等人,Ann.Hematol.76(1998)231-248。
IgG型抗体Fc区受体(FcγR)的交联引发多种效应子功能，包括吞噬作用、抗体依赖性细胞毒性和炎性介质的释放、以及免疫复合物清除和抗体产生的调节。在人类中，已经表征了三类FcγR，它们是：
-FcγRI(CD64)以高亲和力结合单体IgG，并在巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞上表达。修饰Fc区IgG中氨基酸残基E233-G236、P238、D265、N297、A327和P329(根据Kabat的EU索引编号)中的至少一个残基降低与FcγRI的结合。IgG2 233-236位残基被取代成IgG1和IgG4，103倍降低与FcγRI的结合，并消除人单核细胞对抗体致敏红细胞的应答(Armour,K.L.等人,Eur.J.Immunol.29(1999)2613–2624)。
-FcγRII(CD32)以中等至低亲和力与复合IgG结合并广泛表达。该受体可分为两种亚型，FcγRIIA和FcγRIIB。FcγRIIA存在于参与杀伤的许多细胞(例如巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞)上，并且似乎能够激活杀伤过程。FcγRIIB似乎在抑制过程中起作用，且发现存在于B细胞、巨噬细胞和肥大细胞和嗜酸性粒细胞上。在B细胞上，其似乎起到抑制免疫球蛋白进一步产生和同种型转换为例如IgE类的作用。在巨噬细胞上，FcγRIIB通过FcγRIIA介导抑制吞噬作用。在嗜酸性粒细胞和肥大细胞上，B-型可能有助于抑制这些细胞通过IgE与其独立受体的结合而进行的激活。例如，发现包含在氨基酸残基E233-G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、R292和K414(根据Kabat的EU索引编号)中的至少一个具有突变的IgG Fc区的抗体对FcγRIIA的结合降低。
-Fcγ RIII(CD16)以中等至低亲和力结合IgG，并以两种类型存在。Fcγ RIIIA存在于NK细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和一些单核细胞和T细胞上，并介导ADCC。FcγRIIIB在嗜中性粒细胞上高度表达。例如，发现包含在氨基酸残基E233-G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、S239、E269、E293、Y296、V303、A327、K338和D376(根据Kabat的EU指数编号)中的至少一个具有突变的IgG Fc区的抗体对FcγRIIIA的结合降低。
绘制人IgG1上对Fc受体的结合位点、以上提及的突变位点和用于测量与FcγRI和FcγRIIA的结合的方法描述于Shields,R.L.等人J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604。
试剂(例如药物制剂)的“有效量”是指为实现所需治疗或预防结果，在必要的剂量和时间段内的有效的量。
术语“表位”是指靶标和结合位点之间特异性结合所需的给定靶标的部分。表位可以是连续的，即由靶标中存在的相邻结构元件形成，或者是不连续的，即由位于靶标一级序列(如在作为靶标的蛋白质的氨基酸序列)中的不同位置上的结构元件形成，但是在靶标在天然环境(例如在体液)中采用的三维结构中非常接近。
如本文所用的术语“Fc受体”是指激活受体，其特征在于存在与受体相关的细胞质ITAM序列(参见例如Ravetch,J.V.和Bolland,S.,Annu.Rev.Immunol.19(2001)275-290)。这些受体是FcγRI、FcγRIIA和FcγRIIIA。术语“不结合FcγR”表示在抗体浓度为10μg/ml时，本文报道的抗体与NK细胞的结合是如在WO 2006/029879中报道的抗OX40L抗体LC.001的结合的10％或更低。
虽然IgG4显示降低的FcR结合，但其他IgG亚类的抗体显示强结合。然而，Pro238、Asp265、Asp270、Asn297(Fc碳水化合物的缺失)、Pro329、Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434和His435是提供如果改变也降低FcR结合的残基(Shields,R.L.等人J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604；Lund,J.等人,FASEB J.9(1995)115-119；Morgan,A.等人,Immunology 86(1995)319-324；和EP 0 307 434)。
在一个实施方案中，本文报道的环状单链融合多肽的间隔结构域是抗体Fc区。
在一个实施方案中，本文报道的环状融合多肽中的Fc区是IgG1或IgG2亚类，并且包含突变PVA236、GLPSS331和/或L234A/L235A/P329G。
在一个实施方案中，本文报道的环状融合多肽中的Fc区是IgG1亚类，并且包含突变L234A/L235A。在一个实施方案中，环状融合多肽中的Fc区还包含突变P329G。在一个实施方案中，本文报道的环状融合多肽中的Fc区是IgG1亚类，并且包含突变L234A/L235A/P329G(均根据Kabat的EU索引编号)。
在一个实施方案中，本文报道的环状融合多肽中的Fc区是IgG4亚类，并且包含突变L235E。在一个实施方案中，环状融合多肽中的Fc区还包含突变S228P。在一个实施方案中，环状融合多肽中的Fc区还包含突变P329G。在一个实施方案中，本文报道的环状融合多肽中的Fc区是IgG4亚类，并且包含突变S228P/L235E/P329G(均根据Kabat的EU索引编号)。
本文的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C端区域，其含有恒定区的至少一部分。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226、或从Pro230、或从Ala231延伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。
本文报道的环状融合多肽可包含Fc区，在一个实施方案中为衍生自人源的Fc区。在一个实施方案中，Fc区包含人恒定区的所有部分。Fc区直接参与补体激活、C1q结合、C3激活和Fc受体结合。与C1q的结合由Fc区中定义的结合位点引起。这种结合位点在现有技术中是已知的并且描述于例如Lukas,T.J.等人,J.Immunol.127(1981)2555-2560；Brunhouse,R.和Cebra,J.J.,Mol.Immunol.16(1979)907-917；Burton,D.R.等人,Nature 288(1980)338-344；Thommesen,J.E.等人,Mol.Immunol.37(2000)995-1004；Idusogie,E.E.等人,J.Immunol.164(2000)4178-4184；Hezareh,M.等人,J.Virol.75(2001)12161-12168；Morgan,A.等人,Immunology 86(1995)319-324；和EP 0 307 434。这类结合位点是例如L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和P329(根据Kabat的EU索引编号)。亚类IgG1、IgG2和IgG3的抗体通常显示补体激活、C1q结合和C3激活，而IgG4不激活补体系统、不结合C1q并且不激活C3。“抗体的Fc区”是本领域技术人员公知的术语，并且基于木瓜蛋白酶切割抗体来定义。在一个实施方案中，Fc区是人Fc区。在一个实施方案中，Fc区是人IgG4亚类，其包含突变S228P和/或L235E和/或P329G(根据Kabat的EU索引编号)。在一个实施方案中，Fc区是人IgG1亚类，其包含突变L234A和L235A和任选的P329G(根据Kabat的EU索引编号)。
术语“铰链区”表示抗体重链多肽的一部分，其在野生型抗体重链中连接CH1结构域和CH2结构域，例如，从根据Kabat的EU编号系统的约216位到约230位，或者从根据Kabat的EU编号系统的约226位到约230位。其他IgG亚类的铰链区可以通过与IgG1亚类序列的铰链区半胱氨酸残基比对来确定。
铰链区通常是由具有相同氨基酸序列的两个多肽组成的二聚体分子。铰链区通常包含约25个氨基酸残基并且是柔性的，允许结合的靶标结合位点独立地移动。铰链区可以细分为三个结构域：上部、中部和下部铰链结构域(参见例如Roux等人,J.Immunol.161(1998)4083)。
在一个实施方案中，铰链区具有氨基酸序列DKTHTCPXCP(SEQ ID NO：23)，其中X是S或P。在一个实施方案中，铰链区具有氨基酸序列HTCPXCP(SEQ ID NO：24)，其中X是S或P。在一个实施方案中，铰链区具有氨基酸序列CPXCP(SEQ ID NO：25)，其中X是S或P。
术语“野生型Fc区”表示与天然存在的Fc区的氨基酸序列同一的氨基酸序列。野生型人Fc区包括天然人IgG1Fc区(非A和A同种异型)、天然人IgG2 Fc区、天然人IgG3Fc区和天然人IgG4Fc区以及天然存在的其变体。野生型Fc区表示在SEQ ID NO：26(IgG1，高加索人同种异型)、SEQ ID NO：27(IgG1，非裔美国人同种异型)、SEQ ID NO：28(IgG2)、SEQ ID NO：29(IgG3)和SEQ ID NO：30(IgG4)中。
术语“变体(人)Fc区”表示通过至少一个“氨基酸突变”而不同于“野生型”(人)Fc区氨基酸序列的氨基酸序列。在一个实施方案中，与天然Fc区相比，变体Fc区具有至少一个氨基酸突变，例如，约一个至约十个氨基酸突变，在一个实施方案中，在天然Fc区中约一个至约五个氨基酸突变。在一个实施方案中，(变体)Fc区与野生型Fc区具有至少约80％的同源性，在一个实施方案中，变体Fc区具有至少约90％的同源性，在一个实施方案中，变体Fc区具有至少约95％的同源性。
变体(人)Fc区由包含的氨基酸突变定义。因此，例如，术语P329G表示变体Fc区相对于亲本(野生型)Fc区在氨基酸位置329处具有脯氨酸至甘氨酸的突变(根据Kabat的EU索引编号)。野生型氨基酸的残基可以是未指定的，在这种情况下，前述变体称为329G。术语“突变”表示天然存在的氨基酸的变化以及非天然存在的氨基酸的变化(参见例如US 6,586,207、WO 98/48032、WO 03/073238、US 2004/0214988、WO 2005/35727、WO 2005/74524、Chin,J.W.等人,J.Am.Chem.Soc.124(2002)9026-9027；Chin,J.W.和Schultz,P.G.,ChemBioChem 11(2002)1135-1137；Chin,J.W.等人,PICAS United States of America 99(2002)11020-11024；Wang,L.和Schultz,P.G.,Chem.(2002)1-10)。
IgG1亚类的野生型人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列，其起始于第227位的半胱氨酸残基并且终止于第446位的甘氨酸残基：
具有突变T366S、L368A和Y407V的IgG1亚类的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
具有突变T366W的IgG1亚类的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
具有突变L234A和L235A的IgG1亚类的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
具有突变L234A、L235A、T366S、L368A和Y407V的IgG1亚类的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
具有突变L234A、L235A和T366W的IgG1亚类的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
具有突变L234A、L235A和P329G的IgG1亚类的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
具有突变L234A、L235A、P329G、T366S、L368A和Y407V的IgG1亚类的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
具有突变L234A、L235A、P329G和T366W的IgG1亚类的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
具有突变L234A、L235A、P329G、Y349C、T366S、L368A和Y407V的IgG1亚类的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
具有突变L234A、L235A、P329G、S354C和T366W的IgG1亚类的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
具有突变L234A、L235A、P329G、S354C、T366S、L368A和Y407V的IgG1亚类的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
具有突变L234A、L235A、P329G、Y349C和T366W的IgG1亚类的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
具有突变I253A、H310A和H435A的IgG1亚类的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
具有突变H310A、H433A和Y436A的IgG1亚类的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
具有突变M252Y、S254T和T256E的IgG1亚类的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
IgG4亚类的野生型人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
具有突变S228P和L235E的IgG4亚类的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
具有突变S228P、L235E和P329G的IgG4亚类的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
具有突变S228P、L235E、P329G、T366S、L368A和Y407V的IgG4亚类的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
具有突变S228P、L235E、P329G和T366W的IgG4亚类的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
“构架”或“FR”是指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常以下列顺序出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，是指具有与天然抗体结构基本相似的结构的抗体。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和由其衍生的后代，而不考虑传代次数。子代可能与亲本细胞的核酸含量不完全相同，但可能含有突变。本文包括由于在最初转化细胞中的筛选或选择而具有相同功能或生物学活性的突变后代。
“人源化”抗体是指嵌合抗体，其包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基。在某些实施方案中，人源化抗体将包含至少一个、通常两个可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部HVR(例如，CDR)对应于非人抗体的HVR，并且全部或基本上全部的FR对应于人抗体的FR。人源化抗体任选地可以包含衍生自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”是指已经历人源化的抗体。
如本文所用，术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变结构域的每个区域，其包含序列中高变的氨基酸残基区段(stretch)(“互补决定区”或“CDR”)和/或形成结构上定义的环(“高变环”)，和/或含有接触抗原的残基(“抗原接触”)。通常，抗体包含六个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)和三个在VL中(L1、L2、L3)。
HVR包括
(a)在氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)处存在的高变环(Chothia,C.和Lesk,A.M.,J.Mol.Biol.196(1987)901-917)；
(b)在氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)处存在的CDR(Kabat,E.A.等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIH Publication 91-3242)；
(c)在氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)处存在的抗原接触(MacCallum等人J.Mol.Biol.262:732-745(1996))；和
(d)(a)、(b)和/或(c)的组合，包括氨基酸残基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)和94-102(H3)。
除非另有说明，否则可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如，FR残基)在本文中根据Kabat等人，见上文所述的编号。
“免疫缀合物”是本文报道的与一种或多种分子(包括但不限于细胞毒性剂)缀合的环状融合多肽。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养动物(例如奶牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物如猴)、兔和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。
“分离的”环状融合多肽，即双环融合多肽或多环融合多肽是已经从其天然环境的组分中分离的多肽。在一些实施方案中，通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱法(例如，离子交换或反相HPLC)所测定，将环状融合多肽纯化至大于95％或99％的纯度。关于评估纯度的方法的综述，参见例如，Flatman,S.等人,J.Chromatogr.B848(2007)79-87。
“分离的”核酸是指已经从其天然环境的组分中分离的核酸分子。分离的核酸包括在通常含有核酸分子的细胞中含有的核酸分子，但该核酸分子存在于染色体外或存在于与其天然染色体位置不同的染色体位置。
“编码(多)环状融合多肽的分离的核酸”是指各自编码环状融合多肽的单链多肽的一种(同源多聚的(多)环状融合多肽)或多种(异源多聚的(多)环状融合多肽)核酸分子，其包括在单个载体或分开的多个载体中的这种/这类核酸分子，以及存在于宿主细胞中一个或多个位置处的这种/这类核酸分子。
术语“轻链”表示天然IgG抗体的较短多肽链。基于其恒定结构域的氨基酸序列，抗体的轻链可以被划分为称为kappa(κ)和lambda(λ)的两种类型中的一种，人κ轻链恒定结构域参见SEQ ID NO：52，人λ轻链恒定结构域参见SEQ ID NO：53。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群获得的抗体，即，包含在群中的各抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了可能的变体抗体之外，例如，含有天然发生的突变或在单克隆抗体制剂的生产过程中产生的突变，这些变体通常以少量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每一单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群获得，并不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法、此类方法和本文所述的用于制备单克隆抗体的其他示例性方法。
“裸环状融合多肽”是指不与部分(例如，细胞毒性部分)或放射性标记缀合的环状融合多肽。裸环状融合多肽可以存在于药物制剂中。
“天然抗体”是指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由二硫键连接的两条相同的轻链和两条相同的重链组成。从N端到C端，每条重链具有可变区(VH)，也称为可变重链结构域或重链可变结构域，接着是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)，其中铰链区位于第一和第二恒定结构域之间。类似地，从N端到C端，每条轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域，接着是恒定轻链(CL)结构域。基于其恒定结构域的氨基酸序列，抗体的轻链可以被划分为称为卡帕(κ)和拉姆达(λ)的两种类型中的一种。
术语“包装说明书”用于指通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书，其包含关于使用这些治疗产品的适应症、用法、剂量、施用、组合治疗、禁忌症和/或警告的信息。
术语“互补位”是指靶标和结合位点之间特异性结合所需的给定抗体分子的部分。互补位可以是连续的，即由结合位点中存在的相邻氨基酸残基形成，或者是不连续的，即由位于氨基酸残基的一级序列(如氨基酸残基CDR的氨基酸序列)中不同位置的氨基酸残基形成，但在结合位点采用的三维结构中非常接近。
术语“肽接头”表示天然和/或合成来源的接头。肽接头由线性氨基酸链组成，其中20个天然存在的氨基酸是通过肽键连接的单体结构单元。该链的长度为1至50个氨基酸残基，优选1至28个氨基酸残基，特别优选3至25个氨基酸残基。肽接头可含有重复的氨基酸序列或天然存在的多肽的序列。肽接头具有确保环状融合多肽的结构域通过允许结构域正确折叠并合适地呈现而发挥其生物学活性的功能。优选地，肽接头是“合成肽接头”，其被指定为富含甘氨酸、谷氨酰胺和/或丝氨酸残基。这些残基例如以多达5个氨基酸的小重复单元排列，如GGGS(SEQ ID NO：54)、GGGGS(SEQ ID NO：55)、QQQG(SEQ ID NO：56)、QQQQG(SEQ IDNO：57)、SSSG(SEQ ID NO：58)或SSSSG(SEQ ID NO：59)。这个小的重复单元可以重复两到五次以形成多聚体单元，如例如，(GGGS)2(SEQ ID NO：60)、(GGGS)3(SEQ ID NO：61)、(GGGS)4(SEQ ID NO：62)、(GGGS)5(SEQ ID NO：63)、(GGGGS)2(SEQ ID NO：64)、(GGGGS)3(SEQ IDNO：65)或(GGGGS)4(SEQ ID NO：66)。在多聚体单元的氨基和/或羧基端末端，可以加入多达六个的额外任意、天然存在的氨基酸。其它合成的肽接头由单个氨基酸组成，其重复10至20次，并且可以在氨基和/或羧基端末端包含多达六个的额外任意、天然存在的氨基酸，如，例如接头GSSSSSSSSSSSSSSSG(SEQ ID NO：67)中的丝氨酸。所有肽接头可以由核酸分子编码，因此可以重组表达。由于接头本身是肽，因此抗融合肽(antifusogenicpeptide)通过在两个氨基酸之间形成的肽键与接头连接。
相对于参照多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在比对序列和引入缺口(根据需要)以获得最大百分比序列同一性后，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，不考虑任何保守取代为序列同一性的一部分。为了确定氨基酸序列同一性百分比，可以以本领域技术范围内的各种方式实现比对，例如，使用公众可用的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括在被比较序列全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，为了本文的目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2生成％氨基酸序列同一性的值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech，Inc.编写，源代码与用户文档已经在美国版权局，华盛顿特区，20559提交，其在美国版权登记号TXU510087下注册。ALIGN-2程序可从加利福尼亚州南旧金山的Genentech Inc.公开获得，或者可以从源代码编译。应编译ALIGN-2程序以在UNIX操作系统上使用，包括数字UNIX V4.0D。序列比较的所有参数均由ALIGN-2程序设置，没有改变。
在使用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A相对于、与或针对给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可以表示为相对于、与或针对给定氨基酸序列B具有或包含某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：100乘以X/Y分数
其中X是在A和B的程序比对中由序列比对程序ALIGN-2得到的评分为相同匹配的氨基酸残基数，其中Y是B中氨基酸残基的总数。将理解，当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A相对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另有说明，否则本文使用的全部％氨基酸序列同一性的值使用ALIGN-2计算机程序如前一段中所述获得。
术语“药物制剂”是指这样形式的制剂，其使得其中所包含的活性成分的生物学活性是有效的，并且其不含有对施用该制剂的受试者具有不可接受的毒性的其它成分。
“可药用载体”是指药物制剂中除活性成分之外的对受试者无毒的成分。可药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
如本文所用，“治疗”(及其语法变体，如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指试图改变被治疗个体的自然病程的临床干预，其可以用于预防或在临床病理期间进行。期望的治疗效果包括但不限于防止疾病的发生或复发、症状的缓解、疾病的任何直接或间接病理结果的减少、防止转移、降低疾病进展的速度、改善或缓解疾病状态、缓解或改善预后。在一些实施方案中，本发明的抗体用于延迟疾病的发展或减缓疾病的进展。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的结构域，其参与抗体与抗原的结合。天然抗体的重链和轻链可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守构架区(FR)和三个高变区(HVR)(参见，例如，Kindt,T.J.等人KubyImmunology,第6版,W.H.Freeman和Co.,N.Y.(2007),第91页)。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，可以使用来自结合抗原的抗体的VH或VL结构域分离结合特定抗原的抗体，以分别筛选互补VL或VH结构域的文库(参见例如，Portolano,S.等人,J.Immunol.150(1993)880-887；Clackson,T.等人,Nature 352(1991)624-628)。
如本文所用，术语“载体”是指能够使与其连接的另一核酸增殖的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及并入其已导入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
以下使用不同结构和特异性的环状融合多肽举例说明本发明。这些仅用于举例说明本发明。不应被解释为限制。真正的范围在权利要求中阐述。
II.本文报道的环状融合多肽
本发明至少部分基于以下发现：轻链可变结构域与(全长)重链的C端的融合(或反之亦然)，导致形成相应VH和VL结构域的功能性结合位点，即单个多肽链内的可变轻链结构域和可变重链结构域对形成功能性VH/VL对，从而通过链内环化形成功能性结合位点。
本发明至少部分基于以下发现：可以提供包含单个(环状)多肽的靶标结合物。在该(环状)多肽中，N端部分包含结合结构域的第一部分，C端部分包含结合结构域的第二部分。结合结构域的第一部分和结合结构域的第二部分(彼此缔合)形成完整或功能性结合位点。由此多肽被环化。
本发明至少部分基于以下发现：通过修饰连接各抗体可变结构域与中心间隔结构域(如，例如Fc区多肽)相应的N-和C端的肽接头的长度，来调节所得(双环)二聚融合多肽中两个结合位点的几何结构/距离是可能的。
本发明至少部分基于以下发现：二聚体(即双环)融合多肽的结合几何结构可以基于第一接头和第二接头的长度(即接头长度比)而改变。由此，将两个Fab样结合臂的几何结构相对于彼此固定是可能的。
本文公开了一种环状融合多肽，其包含结合结构域的第一部分、结合结构域的第二部分和间隔结构域，其中
-间隔结构域是多肽，例如，折叠后形成结构性结构域，
-结合结构域的第一部分是多肽，并通过第一(肽)接头与间隔结构域的N端融合，
-结合结构域的第二部分是多肽，并通过第二(肽)接头与间隔结构域的C端融合，
-(相同融合多肽的)结合结构域的第一部分和结合结构域的第二部分彼此缔合并形成特异性结合靶标的(功能性)结合位点。
结合结构域的第一部分和结合结构域的第二部分可以彼此非共价或共价缔合。如果该缔合是共价的，则该缔合是通过除肽键之外的键，如通过二硫键缔合。
间隔结构域是折叠后形成结构性结构域的多肽。因此，间隔结构域可以小于100个氨基酸残基，但需要在结构上限制以固定结合基序。示例性间隔结构域是五聚体卷曲螺旋(coil-coils)、抗体铰链区或抗体Fc区或其片段。
本文报道的环状融合多肽是单链多肽。环状融合多肽的一般结构如图1所示。
本文还报道了二聚体，即双环融合多肽，其包含本文报道的第一环状融合多肽和本文报道的第二环状融合多肽，其中第一和第二环状融合多肽相同或不同，并且其中第一环状融合多肽的间隔结构域通过至少一个非肽键与第二环状融合多肽的间隔结构域缀合，在一个实施方案中，通过至少一个二硫键与第二环状融合多肽的间隔结构域缀合。
在这种情况下，间隔结构域是二聚化结构域，即间隔结构域的结构特性是提供二聚化功能。
同样，如果三聚化结构域或四聚化结构域分别用作间隔结构域，则可以获得三聚体(即三环融合多肽)和四聚体(即四环融合多肽)。
本文报道的多环融合多肽也称为Contorsbody。双环融合多肽/Contorsbody的一般结构显示在图2A(具有二聚化间隔结构域)和2B(没有二聚化间隔结构域)，三环融合多肽/Contorsbody的一般结构显示在图3，四环融合多肽/Contorsbody的一般结构显示在图4A(具有四聚化间隔结构域)和4B(没有四聚化间隔结构域)。
作为二聚化结构域的实例，如果间隔结构域是抗体Fc区，并且结合结构域是抗体Fab重链和轻链片段，则该特异性Contorsbody是抗体形式。与正常IgG抗体相比，Contorsbody仅使用一条链而不是重链和轻链。Contorsbody的特殊性在于Fc区编码序列位于重链Fab片段和轻链Fab片段之间。
以下使用该特异性Contorsbody显示本文报道的双环融合多肽的特定性质。除Fab片段外，还可以将分离的可变结构域用作结合位点的部分。
具有“铰链-CH2-CH3”间隔结构域作为重链Fab片段和轻链Fab片段之间的二聚化结构域的本文报道的单链融合多肽通过它们的Fc区二聚化，从而形成呈现两个Fab的抗体的完整Fc部分，其中两个Fab以彼此的方向固定。相反，在正常IgG型抗体中，两个Fab更柔韧且方向差异很大。
两个结合位点相对于彼此的几何结构可以在Contorsbody中通过所用接头的长度进行调节。在示例性实施方案中IgG型正常抗体和本文报道的双环融合多肽的结合位点之间的方向和空间距离显示在图5中。
IgG型常规抗体的结合位点之间的空间距离为约80埃或更大。本文报道的双环融合多肽的结合位点之间的空间距离可以在约20埃至约50埃之间，这取决于形成双环融合多肽的各个环状融合多肽中肽接头的长度和长度比。根据预期的几何结构选择肽接头。在一个实施方案中，肽接头彼此独立地选自SEQ ID NO：54至SEQ ID NO：70的肽接头。
II.1.本文报道的单特异性多环融合多肽
单特异性多环融合多肽包含两个或更多个本文报道的环状融合多肽，其中每个环状融合多肽特异性结合相同靶标上的相同表位，即包含相同的结合位点。
示例性单特异性多环融合多肽是抗Her2Contorsbody(包含SEQ ID NO：96的环状融合多肽)。它是通过用含有编码环状融合多肽的核苷酸序列的载体转染HEK293细胞而产生的。
已经发现，常规蛋白A亲和色谱法适合于提取培养上清液的含有Fc区的一部分。备选地，可以使用通过GSG肽接头连接的六组氨酸C端标签(SEQ ID NO：03)用于纯化目的。
在第二纯化步骤中使用制备型大小排阻色谱法将环状融合多肽从产物相关杂质中分离，主要是环状融合多肽的更高级结构(对于IgG型抗体，在色谱图中也看到一小部分聚集体)(参见例如图15)。这种构建体的典型产率平均为10mg/升。已分几批表达了抗Her2Contorsbody(从0.5升至2升摇瓶规模)。通过质谱法分析产品质量(参见图6)。确认产品的特性，其纯度等级高于95％。
使用表面等离子体共振(SPR，例如BIAcore)在两个不同的设置中确定双环形式(参见图2A)和四环形式(参见图4B)的抗Her2Contorsbody的结合，以便评估与IgG型的常规抗Her2抗体相比，分子的亲和力和亲合力。
在第一个设置(下表中的1；针对亲和力)中，通过与SPR芯片表面缀合的抗人Fc区抗体捕获相应的抗Her2Contorsbody。使用Her2细胞外结构域(ECD)作为分析物。在第二个设置(下表中的2；针对亲合力)中，将抗Her2抗体帕妥珠单抗(以Perjeta(R)销售)固定在芯片表面上，由此捕获Her2的ECD。使用相应的Contorsbody作为分析物。使用系列浓度的分析物测量IgG型参照抗体曲妥珠单抗、二价抗Her2Contorsbody和四价抗Her2Contorsbody的亲合力。作为参考，在两个设置中都使用了抗Her2抗体曲妥珠单抗(以Perjeta(R)销售)。
与IgG型常规抗体相比，Contorsbody更紧密。
已经在增殖测定法中测试了抗Her2Contorsbody。与使用了化学交联的曲妥珠单抗Fab的Scheer等人(Scheer等人,PLoS One 7(2012)e51817)类似，抗Her2Contorsbody募集细胞表面的受体并促进激活信号。曲妥珠单抗是位于受体茎结构域上的Her2表位的结合物，其使受体彼此远离，并因此拮抗增殖。图7显示曲妥珠单抗与双环和四环抗Her2Contorsbody的不同作用，其分别为抗增殖和促增殖。
已经确定了抗Her2Contorsbody与FcRn受体结合的能力。与曲妥珠单抗(IgG型，IgG1亚类的抗体)相比，两种抗Her2Contorsbody与人FcRn受体的结合令人惊讶地更高，即双环Contorsbody和四环Contorsbody分别为约10x和30x(参见图8A)。针对食蟹猴FcRn，曲妥珠单抗和Contorsbody表现类似(见图8B)，二聚体Contorsbody比曲妥珠单抗具有4.5倍更高的亲和力，四聚体Contorsbody比曲妥珠单抗具有61倍更高的亲和力。
已经评估了抗Her2Contorsbody引发抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的能力。通过与FcγR结合，IgG可以触发ADCC。在图9中，显示了抗Her2Contorsbody和曲妥珠单抗的ADCC动力学。
使用色氨酸自发荧光，Contorsbody的第一热变性温度Tm1约为63℃。使用静态光散射，确定Contorsbody的聚集起始温度约为66℃。使用动态光散射，确定Contorsbody的聚集起始温度约为66℃。在所有实验中，制剂是在20mMHis/His*HCl，140mM NaCl中的1mg/mLContorsbody。
通过质谱可以确认无混合Fab形成。
双环单特异性Contorsbody的其他实例是抗cMET Contorsbody(SEQ ID NO：97的环状融合多肽)和具有不同可变结构域的抗CD20Contorsbody((1)SEQ ID NO：98的环状融合多肽；(2)SEQ ID NO：99的环状融合多肽)。在下表中给出了这些Contorsbody的表达率、产率和质量。
所有Contorsbody均在HEK-293细胞中瞬时表达，产率范围为2至15mg/L。蛋白A柱后的产物高于85％，通过SEC柱色谱法纯化掉副产物，通常纯度高达96％以上。
II.2.多特异性多环融合多肽
多特异性多环融合多肽包含两个或更多个本文报道的环状融合多肽，其中每个环状融合多肽特异性结合不同靶标和/或相同靶标上的不同表位，即包含至少两个不同特异性的结合位点。
不受该理论的束缚，假定单链多肽中结合位点的相应结构域的自组装比链间缔合普遍，即换句话说，在单环融合多肽表达后，结合位点的各个非功能性结构域缔合并形成功能性结合位点。例如，如果功能性结合位点是Fab并且间隔结构域是Fc区，则Fab部分，即重链片段(VH-CH1)和轻链片段(VK-CK)形成组成型、有结合能力的Fab部分，该第一组装的环状融合多肽的孤半Fc部分连续地与另一环状融合多肽缔合形成双环融合多肽(包含两个单环融合多肽的二聚体的Contorsbody)。为了获得多特异性多环融合多肽，必须促进分离的环状融合多肽的异源二聚化。一个示例性的异源二聚化促进元件是根据结入扣技术的突变。
在Fc区间隔结构域的相应N-和C端修饰接头的长度是可能的，以改变所得双特异性Contorsbody的两个结合位点的几何结构/距离；对于单特异性Contorsbody也是如此。
可以通过改变结合位点彼此的相对位置来修饰结合位点的几何结构/距离。
例如，在Fab作为结合位点的情况下，重链Fab片段和轻链Fab片段的结构域序列可以反转，即，例如，重链Fab片段可以分别具有结构域序列VH-CH1或CH1-VH(从N端到C端)，同样轻链Fab片段可以具有结构域序列VL-CL或CL-VL(从N端到C端)或混合的。假设在间隔结构域之前和之后(例如，在Fc区之前和之后)存在接头(以N至C端的方向)，则将Fab片段限制为在其与间隔结构域相关的方向上。因此，VH结构域的相对位置或者接近Fc区(文中称为“VH-in”)，或者远离Fc区(文中称为“VH-out”)(参见图10和11)。
也可以在使用CrossMab技术时修饰组装行为，即在一个臂中进行结构域交换。这可以进一步与交换或非交换臂中的电荷变体组合。图12中显示了用于产生双特异性双环融合多肽的具有相应方向的抗cMET环状融合多肽的示例性链。VH-out、VH-in、以及这些不同链组合的相应表达率、产率和质量在下表中给出。
VH-out-结＝SEQ ID NO：100，
VH-in-结＝SEQ ID NO：101，
VH-out-扣＝SEQ ID NO：102，
VH-out-扣-CH-CL-交换＝SEQ ID NO：103，
VH-in-扣-VH-VL-交换＝SEQ ID NO：104。
本文报道的环状融合多肽可以包含任何类型的双组分或多组分复合物，只要多聚化结构域(如，例如半Fc区)能够插入所得单链多肽的序列中。这种多组分复合物的实例是负载肽的MHC-I复合物。相应Contorsbody如图13所示。
在MHC-I IgG型抗体融合体和本文报道的双环融合多肽之间基于MHC-I介导的杀伤细胞募集和细胞去除的效果是相当的(图14)。
制备常规多特异性抗体的普遍适用的技术也可用于和适用于制备本文报道的多特异性多环融合多肽。
例如，制备多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein,C.和Cuello,A.C.,Nature 305(1983)537-540,WO 93/08829和Traunecker,A.等人,EMBO J.10(1991)3655-3659)和“结入扣”工程化(参见例如US 5,731,168)。还可以通过用于制备抗体Fc-异源二聚体分子的工程化静电转向效应来制备多特异性抗体(WO2009/089004)；交联两个或多个抗体或片段(参见，例如，US 4,676,980和Brennan,M.等人,Science 229(1985)81-83)；使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体(参见，例如，Kostelny,S.A.等人,J.Immunol.148(1992)1547-1553)；使用“双体抗体(diabody)”技术制备双特异性抗体片段(参见，例如，Holliger,P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6444-6448)；和使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruber,M等人,J.Immunol.152(1994)5368-5374)；和制备三特异性抗体，如例如Tutt,A.等人,J.Immunol.147(1991)60-69)中所述。
在所有方面的一个实施方案中，本文报道的环状融合多肽是多特异性多环融合多肽，其需要至少两个环状融合多肽的异源二聚化。
同样地，本文报道的一个方面是本文报道的多聚(优选二聚)环状融合多肽，其中第一环状融合多肽特异性结合第一靶标，第二环状融合多肽特异性结合第二靶标，每个环状融合多肽包含作为间隔结构域的异源二聚化结构域。
Contorsbody中包含的Fc区可以具有(野生型；SEQ ID NO：31))或没有FcR效应子功能(没有FcγIII效应子功能，具有突变L234A、L235A、P329G(SEQ ID NO：37)；没有FcRn效应子功能，具有突变I253A、H310A、H435A(SEQ ID NO：44)或H310A、H433A、Y436A(SEQ IDNO：45)；根据Kabat EU索引编号)。
结合位点可选自包含一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域的抗体结合位点、包含MHC-样结构域和β-2-微球蛋白的FcRn、或一对DARPINS(设计的锚蛋白重复结构域)、串联scFv和一连串两个Anticalins。
通常，每次需要几何限制来固定两个结合位点的方向时，可以使用Contorsbody。
在一个实施方案中，间隔结构域包含标签。在一个实施方案中，标签与环状融合多肽的C端缀合。
在一个实施方案中，间隔结构域包含多聚化结构域。在一个实施方案中，多聚化结构域选自抗体Fc区及其变体、和Tetranectin结构域及其变体。
间隔结构域可以是形成多聚体的单螺旋结构域，或者是已知的多聚化功能性天然蛋白质，并且作为多聚化组装将其自身的功能带给Contorsbody。例如，Myc/Max/Mad家族二聚体或亮氨酸拉链生成二聚的卷曲螺旋，COMP(软骨寡聚体基质蛋白)生成五聚体卷曲螺旋样系统，其间和在头对头方向上具有二硫键。还有其他几种具有头对尾方向的系统，如SARAH(人MST1C端二聚化结构域(残基431-487))、二聚化结构域、具有用于使Fab以180°固定的二硫键的卷曲螺旋。还可以使用生腱蛋白C(TNC)三聚化结构域。
III.结合位点
III.1.抗体片段衍生的结合位点
在某些实施方案中，本文报道的环状融合多肽中的结合位点包含抗体重链可变结构域(VH)和抗体轻链可变结构域(VL)。
在某些实施方案中，环状融合多肽的结合位点是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab'、Fab'-SH和Fv片段。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson,P.J.等人,Nat.Med.9(2003)129-134。关于scFv片段的综述，参见例如Plueckthun,A.,In；ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore(编辑),Springer-Verlag,New York(1994),第269-315页；还参见WO 93/16185；US 5,571,894和US5,587,458。对于包含补救受体结合表位残基并具有增加的体内半寿期的Fab片段的讨论，参见US 5,869,046。
抗体片段也可以是“双作用Fab”或“DAF”(例如，参见US 2008/0069820)。
单结构域抗体是包含抗体重链可变结构域的全部或部分或抗体轻链可变结构域的全部或部分的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见，例如US 6,248,516)。
抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生，如本文所述。
如果结合位点是Fab，那么Fab可以是常规Fab、CrossFab或DutaFab。
在常规Fab的情况下，结合结构域的一部分包含抗体重链可变结构域(VH)和(或完整)第一抗体重链恒定结构域(CH1)的至少N端片段，相应的另一结合结构域包含抗体轻链可变结构域(VL)和(或完整)抗体轻链恒定结构域(CL)的至少N端片段。这些结构域的顺序可以是任何顺序，只要其缔合和形成(功能性)结合位点是可能的(即不被阻止)。
在一个实施方案中，结合结构域的一部分在N至C端方向上包含VH-CH1，并且结合结构域的另一部分在N至C端方向上包含VL-CL。
在CrossFab的情况下，结合结构域的两个部分包含抗体可变结构域和(或完整)抗体恒定结构域的至少N端片段，由此可变结构域和恒定结构域对彼此不是天然缔合的，并通过重链结构域和轻链结构域的结构域变换/交换获得。这可以是VH与VL交换或CH1与CL交换。这些结构域的顺序可以是任何顺序，只要其缔合和形成(功能性)结合位点是可能的(即不被阻止)。
在一个实施方案中，结合结构域的一部分在N至C端方向上包含VL-CH1，结合结构域的另一部分在N至C端方向上包含VH-CL。
在一个实施方案中，结合结构域的一部分在N至C端方向上包含VH-CL，结合结构域的另一部分在N至C端方向上包含VL-CH1。
在多环融合多肽的情况下，在CrossFab中的结构域交换之外还可以通过引入电荷促进相关结合结构域的缔合。在这种情况下，多环融合多肽至少包含第一环状融合多肽和第二环状融合多肽。
在一个实施方案中，多环融合多肽包含
a)第一环状融合多肽，其包含作为结合位点的特异性结合第一抗原的Fab，和
b)第二环状融合多肽，其包含作为结合位点的特异性结合第二抗原的Fab，其中(第二环状融合多肽的)Fab中可变结构域VL和VH彼此置换。
a)中的环状融合多肽不含b)中报道的修饰。
在b)中的环状融合多肽中
在抗体轻链片段内可变轻链结构域VL被所述Fab的可变重链结构域VH置换，和
在抗体重链片段内可变重链结构域VH被所述Fab的可变轻链结构域VL置换。
在一个实施方案中
i)在多环融合多肽的第一环状融合多肽的恒定结构域CL中，对应于根据Kabat的124位的位置处的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代，并且其中在多环融合多肽的第一环状融合多肽的恒定结构域CH1中，对应于根据Kabat EU索引的147位的位置处的氨基酸或对应于根据Kabat EU索引的213位的位置处的氨基酸被带负电荷的氨基酸取代，或者
ii)在多环融合多肽的第二环状融合多肽的恒定结构域CL中，对应于根据Kabat的124位的位置处的氨基酸被带正电的氨基酸取代，并且其中在多环融合多肽的第二环状融合多肽的恒定结构域CH1中，对应于根据Kabat EU索引的147位的位置处的氨基酸或对应于根据Kabat EU索引的213位的位置处的氨基酸被带负电荷的氨基酸取代。
在一个优选实施方案中
i)在多环融合多肽的第一环状融合多肽的恒定结构域CL中，对应于根据Kabat的124位的位置处的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(在一个优选的实施方案中，独立地被赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代)，并且其中在多环融合多肽的第一环状融合多肽的恒定结构域CH1中，对应于根据Kabat EU索引的147位的位置处的氨基酸或对应于根据Kabat EU索引的213位的位置处的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代，或者
ii)在多环融合多肽的第二环状融合多肽的恒定结构域CL中，对应于根据Kabat的124位的位置处的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(在一个优选的实施方案中，独立地被赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代)，并且其中在多环融合多肽的第二环状融合多肽的恒定结构域CH1中，对应于根据Kabat EU索引的147位的位置处的氨基酸或对应于根据Kabat EU索引的213位的位置处的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代。
在一个实施方案中，在多环融合多肽的第二环状融合多肽的恒定结构域CL中，对应于根据Kabat EU索引的124和123位的位置处的氨基酸被K取代。
在一个实施方案中，在多环融合多肽的第二环状融合多肽的恒定结构域CH1中，对应于根据Kabat EU索引的147和213位的位置处的氨基酸被E取代。
在多环融合多肽的第一环状融合多肽的恒定结构域CL的一个优选实施方案中，对应于根据Kabat EU索引的124和123位的位置处的氨基酸被K取代，并且在多环融合多肽的第一环状融合多肽的恒定结构域CH1中对应于根据Kabat EU索引的147和213位的位置处的氨基酸被E取代。
在一个实施方案中，在多环融合多肽的第二环状融合多肽的恒定结构域CL中，对应于根据Kabat EU索引的124和123位的位置处的氨基酸被K取代，并且其中在多环融合多肽的第二环状融合多肽的恒定结构域CH1中，对应于根据Kabat EU索引的147和213位的位置处的氨基酸被E取代，并且在多环融合多肽的第一环状融合多肽的可变结构域VL中，对应于根据Kabat的38位的位置处的氨基酸被K取代，在多环融合多肽的第一环状融合多肽的可变结构域VH中，对应于根据Kabat的39位的位置处的氨基酸被E取代，在多环融合多肽的第二环状融合多肽的可变结构域VL中，对应于根据Kabat的38位的位置处的氨基酸被K取代，并且在多环融合多肽的第二环状融合多肽的可变结构域VH中，对应于根据Kabat的39位的位置处的氨基酸被E取代。
在DutaFab的情况下，结合结构域的一部分包含抗体重链可变结构域(VH)和(或完整)第一抗体重链恒定结构域(CH1)的至少N端片段，相应的另一结合结构域包含抗体轻链可变结构域(VL)和(或完整)抗体轻链恒定结构域(CL)的至少N端片段，其中本文所述结合结构域在重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的互补对中包含两个非重叠的互补位，其中第一互补位包含来自VL结构域的CDR1和CDR3和VH结构域的CDR2的残基，第二互补位包含来自VH结构域的CDR1和CDR3和VL结构域的CDR2的残基。
在一个实施方案中，第一互补位包含来自VL结构域的CDR1和CDR3和VH结构域的CDR2的残基，第二互补位包含来自VH结构域的CDR1和CDR3和VL结构域的CDR2的残基。
在一个实施方案中，结合位点的重链可变结构域基于人VH3家族重链序列，并且结合位点的轻链可变结构域基于人Vκ1家族轻链序列。
在一个实施方案中，结合位点的重链可变结构域基于人VH3家族重链序列，并且结合位点的轻链可变结构域基于人Vλl家族轻链序列。
III.2.嵌合和人源化抗体衍生的结合位点
在某些实施方案中，本文报道的环状融合多肽中的结合位点包含抗体重链可变结构域(VH)和抗体轻链可变结构域(VL)。在某些实施方案中，可变结构域是衍生自嵌合抗体(例如人源化抗体)的嵌合结构域。
“构架”或“FR”是指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常以下列顺序出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
如本文所用，术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变结构域的各区域，其包含序列中高变的氨基酸残基区段(“互补决定区”或“CDR”)和/或形成结构上定义的环(“高变环”)，和/或含有接触抗原的残基(“抗原接触”)。通常，抗体包含六个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)和三个在VL中(L1、L2、L3)。
HVR包括
(a)在氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)处存在的高变环(Chothia,C.和Lesk,A.M.,J.Mol.Biol.196(1987)901-917)；
(b)在氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)处存在的CDR(Kabat,E.A.等人,Sequences of Proteins ofImmunologicalInterest,第5版，Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991),NIH Publication 91-3242)；
(c)在氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)处存在的抗原接触(MacCallum等人J.Mol.Biol.262:732-745(1996))；和
(d)(a)、(b)和/或(c)的组合，包括氨基酸残基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)和94-102(H3)。
除非另有说明，否则可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如，FR残基)在本文中根据Kabat等人，见上文所述的编号。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，人源化非人抗体以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR(例如CDR)(或其部分)衍生自非人抗体，并且FR(或其部分)衍生自人抗体序列。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，衍生HVR残基的抗体)的相应残基取代，例如，以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其制备方法综述于例如Almagro,J.C.和Fransson,J.,Front.Biosci.13(2008)1619-1633中，并进一步描述于例如，Riechmann,I.等人,Nature332(1988)323-329；Queen,C.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)10029-10033；US5,821,337,US 7,527,791,US 6,982,321,和US 7,087,409；Kashmiri,S.V.等人,Methods36(2005)25-34(描述了特异性决定区(SDR)接枝)；Padlan,E.A.,Mol.Immunol.28(1991)489-498(描述了“表面重修”)；Dall’Acqua,W.F.等人,Methods 36(2005)43-60(描述了“FR改组”)；和Osbourn,J.等人,Methods 36(2005)61-68和Klimka,A.等人,Br.J.Cancer 83(2000)252-260(描述了“导向选择”方法以进行FR改组)。
可用于人源化的人构架区包括但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的构架区(参见例如，Sims,M.J.等人,J.Immunol.151(1993)2296-2308；衍生自轻链或重链可变区特定亚组的人抗体共有序列的构架区(参见例如，Carter,P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)4285-4289；和Presta,L.G.等人,J.Immunol.151(1993)2623-2632)；人成熟(体细胞突变的)构架区或人种系构架区(参见例如，Almagro,J.C.和Fransson,J.,Front.Biosci.13(2008)1619-1633)；和筛选FR文库衍生的构架区(参见例如，Baca,M.等人,J.Biol.Chem.272(1997)10678-10684和Rosok,M.J.等人,J.Biol.Chem.271(1996922611-22618)。
III.3.人抗体衍生的结合位点
在某些实施方案中，本文报道的环状融合多肽中的结合位点包含抗体重链可变结构域(VH)和抗体轻链可变结构域(VL)。在某些实施方案中，可变结构域来自人抗体。
可以使用本领域已知的各种技术产生人抗体。人抗体一般描述于van Dijk,M.A.和van de Winkel,J.G.,Curr.Opin.Pharmacol.5(2001)368-374和Lonberg,N.,Curr.Opin.Immunol.20(2008)450-459中。
可以通过将免疫原施用给转基因动物来制备人抗体，所述转基因动物已被修饰以应答抗原攻击产生具有人可变区的完整人抗体或完整抗体。这些动物通常含有全部或部分人免疫球蛋白基因座，其取代内源性免疫球蛋白基因座，或者其在染色体外存在或随机整合到动物的染色体中。在这种转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座通常已被灭活。关于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg,N.,Nat.Biotech.23(2005)1117-1125。还参见例如描述XENOMOUSETM技术的US 6,075,181和US 6,150,584；描述技术的US5,770,429；描述K-技术的US 7,041,870；描述技术的US 2007/0061900；描述免疫重构建的小鼠的WO 2007/131676。可以进一步修饰由这些动物产生的完整抗体的人可变区。
人抗体也可以通过基于杂交瘤的方法制备。已经描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系(参见例如，Kozbor,D.,J.Immunol.133(1984)3001-3005；Brodeur,B.R.等人,Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications,Marcel Dekker,Inc.,New York(1987),第51-63页；和Boerner,P.等人,J.Immunol.147(1991)86-95)。通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体也描述于Li,J.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103(2006)3557-3562。另外的方法包括例如在US 7,189,826(描述从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni，J.，现代免疫学26(2006)265-268(描述人-人杂交瘤)中描述的那些。人杂交瘤技术(Trioma技术)也描述于Vollmers,H.P.和Brandlein,S.,Histology and Histopathology 20(2005)927-937和Vollmers,H.P.和Brandlein,S.,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology27(2005)185-191。
还可以通过分离选自人衍生的噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列来产生人抗体。然后可以将这种可变结构域序列与期望的人恒定结构域组合。从抗体文库中选择人抗体的技术描述如下。
III.4.文库衍生的抗体结合位点
在某些实施方案中，本文报道的环状融合多肽中的结合位点包含抗体重链可变结构域(VH)和抗体轻链可变结构域(VL)。在某些实施方案中，通过筛选组合文库中具有期望的一种或多种活性的抗体来分离可变结构域。
例如，本领域已知多种方法用于产生噬菌体展示文库并筛选这些文库中的具有期望的结合特征的抗体。这些方法综述在例如Hoogenboom,H.R.等人,Methods in MolecularBiology 178(2001)1-37，并进一步描述在例如McCafferty,J.等人,Nature 348(1990)552-554；Clackson,T.等人,Nature 352(1991)624-628；Marks,J.D.等人,J.Mol.Biol.222(1992)581-597；Marks,J.D.和Bradbury,A.,Methods in Molecular Biology 248(2003)161-175；Sidhu,S.S.等人,J.Mol.Biol.338(2004)299-310；Lee,C.V.等人,J.Mol.Biol.340(2004)1073-1093；Fellouse,F.A.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(2004)12467-12472；和Lee,C.V.等人,J.Immunol.Methods 284(2004)119-132。
在某些噬菌体展示方法中，通过聚合酶链反应(PCR)分别克隆VH和VL基因的组库(repertoires)，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以如Winter,G.等人,Ann.Rev.Immunol.12(1994)433-455所述筛选抗原结合噬菌体。噬菌体通常展示作为单链Fv(scFv)片段或作为Fab片段的抗体片段。来自免疫来源的文库为免疫原提供高亲和力结合位点，而不需要构建杂交瘤。备选地，可以克隆天然组库(例如，来自人)以提供针对多种非自身和自身抗原的单一来源抗体，而无需任何免疫，如Griffiths,A.D.等人,EMBO J.12(1993)725-734所述。最后，可以通过克隆来自干细胞的非重排V-基因区段，并使用含有随机序列的PCR引物编码高度可变的CDR3区并在体外完成重排，来合成地制备天然文库，如Hoogenboom,H.R.和Winter,G.,J.Mol.Biol.227(1992)381-388所述。描述人抗体噬菌体文库的专利公开包括，例如：US 5,750,373和US 2005/0079574、US 2005/0119455、US 2005/0266000、US 2007/0117126、US 2007/0160598、US 2007/0237764、US 2007/0292936和US2009/0002360。
从人抗体文库分离的抗体或抗体片段在本文中被认为是人抗体或人抗体片段。
IV.异源多(二)聚化结构域
为了确保各个环状融合多肽的正确缔合以形成异源-多环融合多肽，可以使用不同的技术。其中之一是所谓的“结入扣”工程化(参见例如US 5,731,168)。多环融合多肽也可以通过工程化静电转向效应制备Fc-异源二聚体分子来制备(WO2009/089004)；交联两个或更多个环状融合多肽(参见例如，US 4,676,980和Brennan,M.等人,Science 229(1985)81-83)；使用亮氨酸拉链以产生双环融合多肽(参见例如，Kostelny,S.A.等人,J.Immunol.148(1992)1547-1553)。
已经描述了几种用于CH3-修饰以支持异源二聚化的方法，例如在WO 96/27011、WO98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954、WO 2013/096291中描述，其通过引用并入本文作为参考。
通常，在本领域已知的方法中，第一重链的CH3结构域和第二重链的CH3结构域都以互补的方式工程化，使得包含一个工程化CH3结构域的重链不再与相同结构的另一重链同源二聚化(例如，CH3-工程化的第一重链不能再与另一CH3-工程化的第一重链同源二聚化；并且CH3-工程化的第二重链不能再与另一CH3-工程化的第二重链同源二聚化)。因此，包含一个工程化的CH3结构域的重链被迫与另一包含以互补方式工程化的CH3结构域的重链异源二聚化。对于该实施方案，第一重链的CH3结构域和第二重链的CH3结构域通过氨基酸取代以互补方式工程化，使得第一重链和第二重链被迫异源二聚化，而第一重链和第二重链不能再同源二聚化(例如由于空间原因)。
本文如上所引用和包括的本领域已知的支持重链异源二聚化的不同方法被认为是用于提供本文报道的多特异性抗体的不同替代方法，其包含特异性结合第一抗原的衍生自第一抗体的“非变换Fab区”、和特异性结合第二抗原的衍生自第二抗体的“变换Fab区”，与上述特定氨基酸取代组合。
可以通过“结入扣”技术改变本文报道的多环融合多肽(Contorsbody)的CH3结构域，该技术以几个例子详细描述于例如WO 96/027011、Ridgway,J.B.等人,Protein Eng.9(1996)617-621；和Merchant,A.M.等人,Nat.Biotechnol.16(1998)677-681。在该方法中，改变两个CH3结构域的相互作用表面以增加含有这两个CH3结构域的两条重链的异源二聚化。(两个重链的)两个CH3结构域中的每一个可以是“结”，而另一个是“扣”。二硫键的引入进一步稳定了异源二聚体(Merchant,A.M.等人,Nature Biotech.16(1998)677-681；Atwell,S.等人,J.Mol.Biol.270(1997)26-35)并提高了产率。
在一个优选的实施方案中，本文报道的多环融合多肽在“结链”(即第一环状融合多肽)的CH3结构域中包含T366W突变并且在“扣链”(即第二环状融合多肽)的CH3结构域中包含T366S、L368A、Y407V突变(根据Kabat EU索引编号)。还可以使用CH3结构域之间另外的链间二硫键(Merchant,A.M.等人,Nature Biotech.16(1998)677-681)，例如通过将Y349C突变引入“结链”的CH3结构域，并将E356C突变或S354C突变引入“扣链”的CH3结构域。因此，在另一个优选的实施方案中，本文报道的多环融合多肽在两个CH3结构域之一中包含Y349C和T366W突变，并在两个CH3结构域的另一个中包含E356C、T366S、L368A和Y407V突变，或者本文报道的多环融合多肽在两个CH3结构域之一中包含Y349C和T366W突变并且在两个CH3结构域的另一个中包含S354C、T366S、L368A和Y407V突变(一个CH3结构域中另外的Y349C突变和另一个CH3结构域中另外的E356C或S354C突变形成链间二硫键)(根据Kabat EU索引编号)。
但是，也可以备选地或额外地使用如EP 1 870 459A1所述的其他结入扣技术。在一个实施方案中，本文报道的多环融合多肽在“结链”的CH3结构域中包含R409D和K370E突变并且在“扣链”的CH3结构域中包含D399K和E357K突变(根据Kabat EU索引编号)。
在一个实施方案中，本文报道的多环融合多肽在“结链”的CH3结构域中包含T366W突变，在“扣链”的CH3结构域中包含T366S、L368A和Y407V突变，并且在“结链”的CH3结构域中另外包含R409D和K370E突变，以及在“扣链”的CH3结构域中包含D399K和E357K突变(根据Kabat EU索引编号)。
在一个实施方案中，本文报道的多环融合多肽在两个CH3结构域之一中包含Y349C和T366W突变，并且在两个CH3结构域的另一个中包含S354C、T366S、L368A和Y407V突变，或者本文报道的多环融合多肽在两个CH3结构域之一中包含Y349C和T366W突变，在两个CH3结构域的另一个中包含S354C、T366S、L368A和Y407V突变，并且在“结链”的CH3结构域中另外地包含R409D和K370E突变以及在“扣链”的CH3结构域中另外地包含D399K和E357K突变(根据Kabat EU索引编号)。
除了“结入扣技术”之外，本领域已知用于修饰多环融合多肽重链的CH3结构域以实施异源二聚化的其他技术。这些技术，尤其是WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954和WO 2013/096291中描述的技术，在本文中被认为是与本文报道的多环融合多肽组合的“结入扣技术”的替代方案。
在本文报道的多环融合多肽的一个实施方案中，使用EP 1870459中描述的方法用于支持多环融合多肽的第一重链和第二重链的异源二聚化。该方法基于在第一和第二重链二者之间的CH3/CH3-结构域界面中的特定氨基酸位置处引入带相反电荷的带电荷氨基酸。
因此，该实施方案涉及本文报道的多环融合多肽，其中在抗体的三级结构中，第一重链的CH3结构域和第二重链的CH3结构域形成位于相应抗体CH3结构域之间的界面，其中第一重链CH3结构域和第二重链CH3结构域相应的氨基酸序列各自包含位于环状融合多肽三级结构的所述界面内的一组氨基酸，其中从位于一条重链CH3结构域的界面中的氨基酸组中，用一个带正电荷的氨基酸取代第一氨基酸，以及从位于另一条重链CH3结构域的界面中的氨基酸组中，用一个带负电荷的氨基酸取代第二氨基酸。根据该实施方案的多环融合多肽在本文中也称为“CH3(+/-)-工程化的多环融合多肽”(其中缩写“+/-”代表在相应的CH3结构域中引入的带相反电荷的氨基酸)。
在本文报道的所述CH3(+/-)-工程化的多环融合多肽的一个实施方案中，带正电荷的氨基酸选自K、R和H，带负电荷的氨基酸选自E或D。
在本文报道的所述CH3(+/-)-工程化的多环融合多肽的一个实施方案中，带正电荷的氨基酸选自K和R，带负电荷的氨基酸选自E或D。
在本文报道的所述CH3(+/-)-工程化的多环融合多肽的一个实施方案中，带正电荷的氨基酸是K，带负电荷的氨基酸是E。
在本文报道的所述CH3(+/-)-工程化的多环融合多肽的一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，409位的氨基酸R被D取代，并且位置上的氨基酸K被E取代，在另一条重链的CH3结构域中，399位的氨基酸D被K取代，357位的氨基酸E被K取代(根据Kabat EU索引编号)。
在本文报道的多环融合多肽的一个实施方案中，使用WO2013/157953中描述的方法用于支持多环融合多肽的第一重链和第二重链的异源二聚化。在本文报道的所述多环融合多肽的一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，366位的氨基酸T被K取代，在另一条重链的CH3结构域中，351位的氨基酸L被D取代(根据Kabat EU索引编号)。在本文报道的所述多环融合多肽的另一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，366位的氨基酸T被K取代，351位的氨基酸L被K取代，在另一条重链的CH3结构域中，351位的氨基酸L被D取代(根据Kabat EU索引编号)。
在本文报道的所述多环融合多肽的另一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，366位的氨基酸T被K取代，351位的氨基酸L被K取代，并且在另一条重链的CH3结构域中，351位的氨基酸L被D取代(根据Kabat EU索引编号)。另外，以下取代中的至少一个包含在另一条重链的CH3结构域中：349位的氨基酸Y被E取代，349位的氨基酸Y被D取代，368位的氨基酸L被E取代(根据Kabat EU索引编号)。在一个实施方案中，368位的氨基酸L被E取代(根据Kabat EU索引编号)。
在本文报道的多环融合多肽的一个实施方案中，使用WO2012/058768中描述的方法用于支持多环融合多肽的第一环状融合多肽和第二环状融合多肽的异源二聚化。在本文报道的所述多环融合多肽的一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，351位的氨基酸L被Y取代，407位的氨基酸Y被A取代，在另一条重链的CH3结构域中，366位的氨基酸T被A取代，409位的氨基酸K被F取代(根据Kabat EU索引编号)。在另一个实施方案中，除了上述取代之外，在另一条重链的CH3结构域中，位置411(最初为T)、399(最初为D)、400(最初为S)、405(最初为F)、390(最初为N)和392(最初为K)中的至少一个氨基酸被取代(根据Kabat EU索引编号)。优选的取代是：
-用选自N、R、Q、K、D、E和W的氨基酸取代411位的氨基酸T(根据Kabat EU索引编号)，
-用选自R、W、Y和K的氨基酸取代399位的氨基酸D(根据Kabat EU索引编号)，
-用选自E、D、R和K的氨基酸取代400位的氨基酸S(根据Kabat EU索引编号)，
-用选自I、M、T、S、V和W的氨基酸取代405位的氨基酸F(根据Kabat EU索引编号)；
-用选自R、K和D的氨基酸取代390位的氨基酸N(根据Kabat EU索引编号)；和
-用选自V、M、R、L、F和E的氨基酸取代392位的氨基酸K(根据Kabat EU索引编号)。
在本文报道的所述多环融合多肽的另一个实施方案中(根据WO2012/058768工程化)，在一条重链的CH3结构域中，351位的氨基酸L被Y取代，407位的氨基酸Y被A取代，在另一条重链的CH3结构域中，366位的氨基酸T被V取代，409位的氨基酸K被F取代(根据KabatEU索引编号)。在本文报道的所述多环融合多肽的另一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，407位的氨基酸Y被A取代，在另一条重链的CH3结构域中，366位的氨基酸T被A取代，409位的氨基酸K被F取代(根据Kabat EU索引编号)。在所述最后一个实施方案中，在所述其他重链的CH3结构域中，392位的氨基酸K被E取代，411位的氨基酸T被E取代，399位的氨基酸D被R取代，400位的氨基酸S被R取代(根据Kabat EU索引编号)。
在本文报道的多环融合多肽的一个实施方案中，使用WO2011/143545中描述的方法用于支持多环融合多肽的第一环状融合多肽和第二环状融合多肽的异源二聚化。在本文报道的所述多环融合多肽的一个实施方案中，在位置368和/或409处引入两条重链的CH3结构域中的氨基酸修饰(根据Kabat EU索引编号)。
在本文报道的多环融合多肽的一个实施方案中，使用WO2011/090762中描述的方法用于支持多环融合多肽的第一环状融合多肽和第二环状融合多肽的异源二聚化。WO2011/090762涉及根据“结入扣”技术的氨基酸修饰。在本文报道的所述CH3(KiH)-工程化的多环融合多肽的一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，366位的氨基酸T被W取代，在另一条重链的CH3结构域中407位的氨基酸Y被A取代(根据Kabat EU索引编号)。在本文报道的所述CH3(KiH)-工程化的多环融合多肽的另一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，366位的氨基酸T被Y取代，在另一条重链的CH3结构域中，407位的氨基酸Y被T取代(根据Kabat EU索引编号)。
在本文报道的IgG2同种型的多环融合多肽的一个实施方案中，使用WO2011/090762中描述的方法用于支持多环融合多肽的第一重链和第二重链的异源二聚化。
在本文报道的多环融合多肽的一个实施方案中，使用WO 2009/089004中描述的方法用于支持多环融合多肽的第一环状融合多肽和第二环状融合多肽的异源二聚化。在本文报道的所述多环融合多肽的一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，392位的氨基酸K或N被带负电荷的氨基酸取代(在一个优选实施方案中，被E或D取代，在一个优选的实施方案中，被D取代)，在另一条重链的CH3结构域中，399位的氨基酸D、356位的氨基酸E或D或357位的氨基酸E被带正电荷的氨基酸取代(在一个优选的实施方案中被K或R取代，在一个优选的实施方案中，被K取代，在一个优选的实施方案中，399或356位的氨基酸被K取代)(根据Kabat EU索引编号)。在一个进一步的实施方案中，除了上述取代之外，在一条重链的CH3结构域中，409位的氨基酸K或R被带负电荷的氨基酸取代(在一个优选实施方案中，被E或D取代，在一个优选的实施方案中，被D取代)(根据Kabat EU索引编号)。在一个更进一步的实施方案中，除了上述取代之外或作为其替代，在一条重链的CH3结构域中，439位的氨基酸K和/或370位的氨基酸K彼此独立地被带负电荷的氨基酸取代(在一个优选实施方案中被E或D取代，在一个优选实施方案中被D取代)(根据Kabat EU索引编号)。
在本文报道的多环融合多肽的一个实施方案中，使用WO 2007/147901中描述的方法用于支持多环融合多肽的第一环状融合多肽和第二环状融合多肽的异源二聚化。在本文报道的所述多环融合多肽的一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，253位的氨基酸K被E取代，282位的氨基酸D被K取代，322位的氨基酸K被D取代，并且在另一条重链的CH3结构域中，239位的氨基酸D被K取代，240位的氨基酸E被K取代，292位的氨基酸K被D取代(根据Kabat EU索引编号)。
在本文报道的多环融合多肽的一个实施方案中，使用WO 2007/110205中描述的方法用于支持多环融合多肽的第一环状融合多肽和第二环状融合多肽的异源二聚化。
在本文报道的所有方面和实施方案的一个实施方案中，多环融合多肽是双环融合多肽或三环融合多肽。在一个优选的实施方案中，多环融合多肽是双特异性双环融合多肽。
在本文报道的所有方面的一个实施方案中，多环融合多肽具有IgG型抗体的恒定结构域结构。在本文报道的所有方面的一个另外的实施方案中，多环融合多肽的特征在于所述多环融合多肽包含人亚类IgG1的Fc区，或具有突变L234A和L235A以及任选地P329G的人亚类IgG1的Fc区。在本文报道的所有方面的一个进一步的实施方案中，多环融合多肽的特征在于所述多环融合多肽包含人亚类IgG2的Fc区。在本文报道的所有方面的一个进一步的实施方案中，多环融合多肽的特征在于所述多环融合多肽包含人亚类IgG3的Fc区。在本文报道的所有方面的一个进一步的实施方案中，多环融合多肽的特征在于所述多环融合多肽包含人亚类IgG4的Fc区或具有另外的突变S228P和L235E以及任选地P329G的人亚类IgG4的Fc区。
V.变体
在某些实施方案中，涵盖本文提供的环状融合多肽的氨基酸序列变体。例如，可能期望改善环状融合多肽的结合亲和力和/或其他生物学特性。可以通过将适当的修饰引入编码环状融合多肽的核苷酸序列中、或通过肽合成来制备环状融合多肽的氨基酸序列变体。此类修饰包括，例如，环状融合多肽的氨基酸序列内残基的缺失、和/或插入和/或取代。可以制备缺失、插入和取代的任何组合以实现最终构建体，条件是最终构建体具有所期望的特征，例如抗原结合。
a)取代、插入和缺失变体
在某些实施方案中，提供了具有一个或多个氨基酸取代的环状融合多肽变体。用于取代诱变的感兴趣位点包括HVR和FR。保守取代显示在以下表中“优选取代”的标题下。更多的基本变化提供在以下表中“示例性取代”的标题下，并且以下参照氨基酸侧链类别进一步描述。可以将氨基酸取代引入感兴趣的环状融合多肽中，并筛选产物的所需活性，例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性、或改善的ADCC或CDC。
氨基酸可根据常见的侧链特性分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链方向的残基：Gly、Pro；
(6)芳香性：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代需要将这些类别之一中的成员交换为另一类别。
一种类型的取代变体涉及取代亲本环状融合多肽的一个或多个高变区残基(例如包含衍生自人源化或人抗体的结合位点)。通常，选择用于进一步研究的所得变体相对于亲本环状融合多肽在某些生物学特性(例如，增加的亲和力、降低的免疫原性)中将具有修饰(例如，改善)和/或将基本上保留亲本环状融合多肽的某些生物学特性。示例性取代变体是亲和力成熟的环状融合多肽，其可以例如，使用如本文所述的那些基于噬菌体展示的亲和力成熟技术方便地产生。简而言之，突变一个或多个HVR残基并在噬菌体上展示变体环状融合多肽并筛选特定的生物学活性(例如结合亲和力)。
可以在HVR中进行改变(例如，取代)，例如，以改善环状融合多肽的亲和力。这种改变可以在HVR“热点”中进行，所述“热点”，即由在体细胞成熟过程中经历高频率突变的密码子编码的残基(参见例如，Chowdhury,P.S.,Methods Mol.Biol.207(2008)179-196)和/或与抗原接触的残基，测试所得变体VH或VL的结合亲和力。通过构建和从二级文库中重新选择的亲和力成熟已经在例如Hoogenboom,H.R.等人，Methods in Molecular Biology 178(2002)1-37中描述了。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法中的任何一种(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)将多样性引入选择用于成熟的可变基因中。然后创建二级文库。然后筛选文库以鉴定具有期望的亲和力的任何环状融合多肽变体。引入多样性的另一方法涉及HVR-定向方法，其中几个HVR残基(例如，每次4-6个残基)被随机化。例如可以使用丙氨酸扫描诱变或建模特别地鉴定参与抗原结合的HVR残基。特别是通常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在某些实施方案中，取代、插入或缺失可以发生在一个或多个HVR内，只要这种改变不会实质性降低环状融合多肽结合预期靶标的能力。例如，可以在HVR中进行不实质上降低结合亲和力的保守改变(例如，如本文提供的保守取代)。例如，这种改变可以在HVR中的抗原接触残基之外。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，各HVR是未改变的，或含有不超过一个、两个或三个氨基酸取代。
用于鉴定可以靶向诱变的环状融合多肽的残基或区域的有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham,B.C.和Wells,J.A.,Science 244(1989)1081-1085所述。在该方法中，鉴定靶残基的一个或一组残基(例如带电荷残基，如arg、asp、his、lys和glu)并用中性或带负电荷的氨基酸(例如丙氨酸或聚丙氨酸)替代以确定是否影响环状融合多肽与其靶标的相互作用。可以在对初始取代显示功能敏感性的氨基酸位置处引入进一步的取代。备选地或额外地，靶-环状融合多肽复合物的晶体结构，以鉴定环状融合多肽与其靶标之间的接触点。可以作为取代候选物靶向或消除这些接触残基和邻近残基。可以筛选变体以确定其是否含有期望的性质。
氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基端融合(长度范围从一个残基到含有一百个或更多个残基的多肽)，和单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N端甲硫氨酰基残基的环状融合多肽。环状融合多肽分子的其他插入变体包括环状融合多肽的N-或C端与酶(例如对于ADEPT)或多肽(其增加环状融合多肽的血清半寿期)的融合。
b)糖基化变体
在某些实施方案中，改变本文提供的环状融合多肽以增加或降低环状融合多肽糖基化的程度。通过改变氨基酸序列使得产生或移除一个或多个糖基化位点，可以方便地完成环状融合多肽糖基化位点的添加或缺失。
当环状融合多肽包含Fc区时，可以改变与其连接的碳水化合物。包含由哺乳动物细胞产生的环状融合多肽的天然Fc区通常包含支链的双触角寡糖，其通常通过N-键连接至Fc区CH2结构域的Asn297(参见例如，Wright,A.和Morrison,S.L.,TIBTECH 15(1997)26-32)。寡糖可包括各种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸、以及与双触角寡糖结构的“茎”中的GlcNAc连接的岩藻糖。在一些实施方案中，可以对本发明的环状融合多肽中的寡糖进行修饰，以产生具有某些改善性质的环状融合多肽变体。
在一个实施方案中，提供了具有碳水化合物结构的环状融合多肽变体，所述碳水化合物结构缺乏(直接或间接地)连接至Fc区的岩藻糖。例如，这种环状融合多肽中岩藻糖的量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。例如，如WO 2008/077546中所述，如通过MALDI-TOF质谱法测量的，通过计算相对于连接Asn 297的所有糖结构的总和(例如复合、杂化和高甘露糖结构)，Asn297上的糖链内岩藻糖的平均量来确定岩藻糖的量。Asn297是指位于Fc区的约297位的天冬酰胺残基(Fc区残基的EU编号)；然而，由于抗体中微小的序列变异，Asn297也可位于297位上游或下游约±3个氨基酸，即位于294位至300位之间。此类岩藻糖基化变体可具有改善的ADCC功能(参见例如，US 2003/0157108；US 2004/0093621)。与“去岩藻糖基化”或“岩藻糖缺乏”抗体变体相关的出版物的实例包括：US2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO 2005/053742；WO2002/031140；Okazaki,A.等人,J.Mol.Biol.336(2004)1239-1249；Yamane-Ohnuki,N.等人,Biotech.Bioeng.87(2004)614-622。能够产生去岩藻糖基化环状融合多肽的细胞系的实例包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lec13CHO细胞(Ripka,J.等人,Arch.Biochem.Biophys.249(1986)533-545；US 2003/0157108；和WO 2004/056312,尤其是实施例11)、和敲除细胞系，如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除的CHO细胞(参见例如,Yamane-Ohnuki,N.等人,Biotech.Bioeng.87(2004)614-622；Kanda,Y.等人,Biotechnol.Bioeng.94(2006)680-688；WO 2003/085107)。
进一步提供环状融合多肽变体，其具有二等分寡糖(bisectedoligosaccharides)，例如，其中与环状融合多肽Fc区连接的双触角寡糖被GlcNAc二等分。此类环状融合多肽变体可具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的实例描述于例如WO 2003/011878；US 6,602,684和US 2005/0123546。还提供了在与Fc区连接的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的环状融合多肽变体。此类环状融合多肽变体可具有改善的CDC功能。此类抗体变体描述于例如WO 1997/30087；WO 1998/58964和WO 1999/22764。
c)Fc区变体
在某些实施方案中，可以将一个或多个氨基酸修饰引入本文提供的环状融合多肽的Fc区，从而产生Fc区变体。Fc区变体可包含人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)，其在一个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰(例如取代)。
在某些实施方案中，本发明考虑具有一些但不是全部效应子功能的环状融合多肽变体，在体内半寿期是重要的但某些效应子功能(如补体和ADCC)是不必要的或有害的的应用中，所述变体成为期望的候选者。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定法以确认CDC和/或ADCC活性的降低/消除。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定法以确保环状融合多肽缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。用于介导ADCC的原代细胞(NK细胞)仅表达Fc(RIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达总结于Ravetch,J.V.和Kinet,J.P.,Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492的464页的表3中。用于评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的非限制性实例描述于US 5,500,362(参见例如Hellstrom,I.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83(1986)7059-7063；和Hellstrom,I.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82(1985)1499-1502)；US 5,821,337(参见Bruggemann,M.等人,J.Exp.Med.166(1987)1351-1361)。备选地，可以使用非放射性测定方法(参见，例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA；和非放射性细胞毒性测定法(Promega,Madison,WI)。用于此类测定法的有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。备选地或额外地，可以在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如，在Clynes,R.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(1998)652-656中公开的动物模型中。还可以进行C1q结合测定法以确认抗体不能结合C1q并因此缺乏CDC活性(参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA)。为了评估补体激活，可以进行CDC测定法(参见例如，Gazzano-Santoro,H.等人,J.Immunol.Methods 202(1996)163-171；Cragg,M.S.等人,Blood 101(2003)1045-1052；和Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood 103(2004)2738-2743)。还可以使用本领域已知的方法进行FcRn结合和体内清除/半寿期测定(参见例如，Petkova,S.B.等人,Int.Immunol.18(2006:1759-1769)。
具有降低的效应子功能的包含Fc区的环状融合多肽包括具有Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个取代(US 6,737,056)的那些多肽。此类Fc区突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327的两个或更多个位置处具有取代的Fc区突变体，包括所谓的“DANA”Fc区突变体，其具有残基265和297向丙氨酸的取代(US 7,332,581)。
描述了具有改善或减弱的与FcR结合的包含某些Fc区的环状融合多肽变体(参见例如，US 6,737,056；WO 2004/056312和Shields,R.L.等人,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)。
在某些实施方案中，环状融合多肽变体包含具有一个或多个氨基酸取代的Fc区，这些取代改善ADCC，例如Fc区的298、333和/或334位的取代(残基的EU编号)。
在一些实施方案中，在Fc区中进行改变(即，改善或减弱)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)的改变，例如，如US 6,194,551、WO 99/51642和Idusogie,E.E.等人,J.Immunol.164(2000)4178-4184中所述。
在US 2005/0014934中描述了具有增加的半寿期和改善的与新生儿Fc受体(FcRn)结合的抗体，所述FcRn负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer,R.L.等人,J.Immunol.117(1976)587-593,和Kim,J.K.等人,J.Immunol.24(1994)2429-2434)。那些抗体包含其中具有一个或多个取代的Fc区，其改善Fc区与FcRn的结合。此类Fc变体包括在Fc区残基：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434中的一个或多个位置处具有取代的那些变体，例如，Fc区残基434的取代(US 7,371,826)。
还参见Duncan,A.R.和Winter,G.,Nature 322(1988)738-740；US 5,648,260；US5,624,821和WO 94/29351，其涉及Fc区变体的其他实例。
在所有方面的一个实施方案中，环状融合多肽包含(所有位置根据Kabat的EU索引)
i)人IgG1亚类的同源二聚体Fc区，任选地具有突变P329G、L234A和L235A，或
ii)人IgG4亚类的同源二聚体Fc区，任选地具有突变P329G、S228P和L235E，或
iii)人IgG1亚类的同源二聚体Fc区，任选地具有突变P329G、L234A、L235A、I253A、H310A和H435A，或任选地具有突变P329G、L234A、L235A、H310A、H433A和Y436A，或
iv)异源二聚体Fc区，其中
a)一个Fc区多肽包含突变T366W，另一个Fc区多肽包含突变T366S、L368A和Y407V，或
b)一个Fc区多肽包含突变T366W和Y349C，另一个Fc区多肽包含突变T366S、L368A、Y407V和S354C，或
c)一个Fc区多肽包含突变T366W和S354C，另一个Fc区多肽包含突变T366S、L368A、Y407V和Y349C，
或者
v)人IgG1亚类的异源二聚体Fc区，其中两个Fc区多肽都包含突变P329G、L234A和L235A和
a)一个Fc区多肽包含突变T366W，另一个Fc区多肽包含突变T366S、L368A和Y407V，或
b)一个Fc区多肽包含突变T366W和Y349C，另一个Fc区多肽包含突变T366S、L368A、Y407V和S354C，或
c)一个Fc区多肽包含突变T366W和S354C，另一个Fc区多肽包含突变T366S、L368A、Y407V和Y349C，
或者
vi)人IgG4亚类的异源二聚体Fc区，其中两个Fc区多肽都包含突变P329G、S228P和L235E，和
a)一个Fc区多肽包含突变T366W，另一个Fc区多肽包含突变T366S、L368A和Y407V，或
b)一个Fc区多肽包含突变T366W和Y349C，另一个Fc区多肽包含突变T366S、L368A、Y407V和S354C，或
c)一个Fc区多肽包含突变T366W和S354C，另一个Fc区多肽包含突变T366S、L368A、Y407V和Y349C，
或者
vii)i)、ii)和iii)之一与vi)、v)和vi)之一的组合。
在本文报道的所有方面的一个实施方案中，包含CH3结构域的环状融合多肽包含额外的C端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447，根据Kabat EU索引编号)。在本文报道的所有方面的一个实施方案中，包含CH3结构域的环状融合多肽包含额外的C端甘氨酸残基(G446，根据Kabat EU索引编号)。
本文报道的环状融合多肽在一个实施方案中包含Fc区，其特征在于其是具有突变PVA236、L234A/L235A和/或GLPSS331(根据Kabat的EU索引编号)的人亚类IgG1，或亚类IgG4。在进一步的实施方案中，环状融合多肽的特征在于包含任何IgG类别的Fc区，在一个实施方案中是IgG1或IgG4亚类，其在E233、L234、L235、G236、D270、N297、E318、K320、K322、A327、A330、P331和/或P329中含有至少一个突变(根据Kabat的EU索引编号)。进一步地在一个实施方案中，环状融合多肽包含人IgG4亚类的Fc区，其含有突变S228P，或突变S228P和L235E(Angal,S.等人,Mol.Immunol.30(1993)105-108)(根据Kabat的EU索引编号)。
包含在本文报道的环状融合多肽中的Fc区多肽的C端可以是以氨基酸残基PGK结尾的完整C端。C端可以是缩短的C端，其中已经除去了一个或两个C端氨基酸残基。在一个优选的实施方案中，C端是以氨基酸残基PG结尾的缩短的C端。
d)半胱氨酸工程化的环状融合多肽
在某些实施方案中，可能期望产生半胱氨酸工程化的环状融合多肽，其中一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在特定的实施方案中，被取代的残基出现在环状融合多肽的可及位点。通过用半胱氨酸取代那些残基，从而在环状融合多肽的可及位点上放置反应性硫醇基团，并可用于将环状融合多肽与其他部分(如药物部分或接头-药物部分)缀合，以产生免疫缀合物，如本文进一步描述的。在某些实施方案中，本文报道的环状融合多肽(尤其是Contorsbody)的下列残基中的任何一个或多个可以被半胱氨酸取代：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；和重链Fc区的S400(EU编号)。可以以与如US 7,521,541中所述的抗体相似的方式产生半胱氨酸工程化的环状融合多肽。
e)环状融合多肽衍生物
在某些实施方案中，可进一步修饰本文提供的环状融合多肽以包含本领域已知且易于获得的其他非蛋白性质的部分。适于衍生化环状融合多肽的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三氧杂环己烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、和葡聚糖或聚(N-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇(propropylene glycol)均聚物、环氧丙烷(prolypropyleneoxide)/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性而在制造中具有优势。聚合物可以是任何分子量，并且可以是支链或非支链的。与环状融合多肽连接的聚合物的数量可以变化，并且如果连接多于一种聚合物，这些聚合物可以是相同或不同的分子。通常，用于衍生化的聚合物的数量和/或类型可以基于以下考虑因素来确定：所述考虑因素包括但不限于待改善的环状融合多肽的特定性质或功能、环状融合多肽衍生物是否将用于特定条件下的治疗，等。
在另一个实施方案中，提供了环状融合多肽与可以通过暴露于辐射而选择性加热的非蛋白性质的部分的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白性质的部分是碳纳米管(Kam,N.W.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102(2005)11600-11605)。辐射可以是任何波长，包括但不限于不损害普通细胞的波长，但是该波长将非蛋白性质的部分加热到一定温度，在该温度下，接近抗体-非蛋白性质的部分的细胞被杀死。
f)血脑屏障穿梭缀合物
在某些实施方案中，可以进一步修饰本文提供的环状融合多肽以包含一种或多种本领域已知且容易获得的血脑屏障穿梭模块。
血脑屏障穿梭模块的特征在于对血脑屏障受体具有结合特异性。这种结合特异性可以通过将血脑屏障穿梭模块与本文报道的环状融合多肽融合来获得，或者可以通过将作为多特异性(单或多)环状融合多肽的结合特异性之一的结合特异性引入血脑屏障受体来获得，因此，该结合特异性包含对治疗靶标的结合特异性和对血脑屏障受体的结合特异性。
一个或多个血脑屏障穿梭模块可以融合至本文报道的环状融合多肽的轻链或重链的任何端。在一个优选的实施方案中，血脑屏障穿梭模块融合至环状融合多肽的C端。在一个优选的实施方案中，血脑屏障穿梭模块融合至环状融合多肽的N端。
一个或多个血脑屏障穿梭模块可以直接或者是通过肽接头与相应的环状融合多肽融合。在一个优选的实施方案中，肽接头具有氨基酸序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：64)，或GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：65)或(G4S)6(SEQ ID NO：70)。
血脑屏障穿梭模块可以是抗体scFv片段或Fab。在一个实施方案中，血脑屏障穿梭模块是scFv，其在N至C端顺序上包含轻链可变结构域-轻链恒定结构域-肽接头-重链可变结构域-重链恒定结构域1。
在一个实施方案中，血脑屏障穿梭模块是具有(G4S)6肽接头(SEQ ID NO：70)的抗转铁蛋白受体-抗体8D3的人源化变体的scFv片段或Fab。
术语“其人源化变体”表示通过在人构架上接枝鼠8D3抗体的HVR而获得的分子，其中在每个构架区(FR)和/或高变区(HVR)中任选地彼此独立地引入一至三个突变。
抗转铁蛋白受体抗体8D3(参见例如Boado,R.J.等人,Biotechnol.Bioeng.102(2009)1251-1258)是鼠抗体，其中重链可变结构域具有SEQ ID NO：71的氨基酸序列，并且其中轻链可变结构域具有SEQ ID NO：72(变体1)或SEQ ID NO：73(变体2)的氨基酸序列。
在一个实施方案中，血脑屏障穿梭模块是抗转铁蛋白受体-抗体299的人源化变体的scFv片段或Fab(参见WO2017/055541)。
术语“其人源化变体”表示通过在人构架上接枝299抗体的HVR而获得的分子，其中在每个构架区(FR)和/或高变区(HVR)中任选地彼此独立地引入一至三个突变。
抗转铁蛋白受体抗体299是兔抗体，其中重链可变结构域具有SEQ ID NO：74的氨基酸序列，轻链可变结构域具有SEQ ID NO：75的氨基酸序列。
在一个实施方案中，血脑屏障穿梭模块包含转铁蛋白受体结合特异性，其包含(a)包含SEQ ID NO：76的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：77的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：78、79或80的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：81的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：82的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：83的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个实施方案中，血脑屏障穿梭模块包含至少一对SEQ ID NO：84的重链可变结构域和SEQ ID NO：85的轻链可变结构域，形成转铁蛋白受体的结合位点。
在一个实施方案中，血脑屏障穿梭模块包含至少一对SEQ ID NO：86的重链可变结构域和SEQ ID NO：87的轻链可变结构域，形成转铁蛋白受体的结合位点。
在一个实施方案中，血脑屏障穿梭模块包含至少一对SEQ ID NO：88的重链可变结构域和SEQ ID NO：87的轻链可变结构域，形成转铁蛋白受体的结合位点。
在一个实施方案中，血脑屏障穿梭模块是抗转铁蛋白受体-抗体494的人源化变体的scFv片段或Fab(参见EP 15187820)。
术语“其人源化变体”表示通过在人构架上接枝494抗体的HVR而获得的分子，其中在每个构架区(FR)和/或高变区(HVR)中任选地彼此独立地引入一至三个突变。
抗转铁蛋白受体抗体494是鼠抗体，其中重链可变结构域具有SEQ ID NO：89的氨基酸序列，轻链可变结构域具有SEQ ID NO：90的氨基酸序列。
在一个实施方案中，血脑屏障穿梭模块是特异性结合人转铁蛋白受体(huTfR)和食蟹猴转铁蛋白受体(cyTfR)的抗转铁蛋白受体抗体的scFv片段或Fab。在某些实施方案中，抗转铁蛋白受体抗体
-结合人转铁蛋白受体(huTfR)和食蟹猴转铁蛋白受体(cyTfR)，和/或
-对人转铁蛋白受体的解离速率等于或小于(即，不超过)抗转铁蛋白受体抗体128.1对食蟹猴转铁蛋白受体的解离速率，其中解离速率由表面等离子体共振测定，并且其中抗转铁蛋白受体抗体128.1具有SEQ ID NO：91的重链可变结构域和SEQ ID NO：92的轻链可变结构域，和/或
-以0.1 1/s至0.005 1/s之间并且包括0.1 1/s和0.005 1/s的对人转铁蛋白受体的解离速率结合。
本文报道的一个方面是特异性结合人转铁蛋白受体和食蟹猴转铁蛋白受体的抗转铁蛋白受体抗体，其包含
i)衍生自SEQ ID NO：74的重链可变结构域的人源化重链可变结构域，和
ii)衍生自SEQ ID NO：75的轻链可变结构域的人源化轻链可变结构域，
其中抗体对人转铁蛋白的解离速率等于或小于(即，不超过)抗转铁蛋白受体抗体128.1对食蟹猴转铁蛋白受体的解离速率，
其中通过表面等离子共振测定解离速率，并且
其中抗转铁蛋白受体抗体128.1具有SEQ ID NO：91的重链可变结构域和SEQ IDNO：92的轻链可变结构域。
在一个实施方案中，抗体在轻链可变结构域中在80位具有脯氨酸氨基酸残基(P)(根据Kabat编号)。
在一个实施方案中，抗体在轻链可变结构域中在91位具有天冬酰胺氨基酸残基(N)(根据Kabat编号)。
在一个实施方案中，抗体在轻链可变结构域中在93位具有丙氨酸氨基酸残基(A)(根据Kabat编号)。
在一个实施方案中，抗体在重链可变结构域中在100g位具有丝氨酸氨基酸残基(S)(根据Kabat编号)。
在一个实施方案中，抗体在重链可变结构域中在100g位具有谷氨酰胺氨基酸残基(Q)(根据Kabat编号)。
在一个实施方案中，抗体在重链可变结构域中在65位具有丝氨酸氨基酸残基(S)(根据Kabat编号)。
在一个实施方案中，抗体在重链可变结构域中在105位具有谷氨酰胺氨基酸残基(Q)(根据Kabat编号)。
在一个实施方案中，抗体在轻链可变结构域中在80位具有脯氨酸氨基酸残基(P)、在轻链可变结构域中在91位具有天冬酰胺氨基酸残基(N)、在轻链可变结构域中在93位具有丙氨酸氨基酸残基(A)、在重链可变结构域中在100g位具有丝氨酸氨基酸残基(S)、在重链可变结构域中在65位具有丝氨酸氨基酸残基(S)、并且在重链可变结构域中在105位具有谷氨酰胺氨基酸残基(Q)(根据Kabat编号)。
在一个实施方案中，抗体在轻链可变结构域中在80位具有脯氨酸氨基酸残基(P)、在轻链可变结构域中在91位具有天冬酰胺氨基酸残基(N)、在轻链可变结构域中在93位具有丙氨酸氨基酸残基(A)、在重链可变结构域中在100g位具有谷氨酰胺氨基酸残基(Q)、在重链可变结构域中在65位具有丝氨酸氨基酸残基(S)、并且在重链可变结构域中在105位具有谷氨酰胺氨基酸残基(Q)(根据Kabat编号)。
本文报道的一个方面是特异性结合人转铁蛋白受体(huTfR)的抗转铁蛋白受体抗体，其包含
i)与SEQ ID NO：88的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列，和
ii)与SEQ ID NO：87的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的轻链可变结构域(VL)，
其中所述抗体与包含SEQ ID NO：88的重链可变结构域(VH)序列和SEQ ID NO：87的轻链可变结构域(VL)序列的抗体具有大约相同的解离速率。
在一个方面，本文提供了本文报道的环状融合多肽，其通过肽接头与结合血脑屏障受体的单价结合实体缀合。
在一个方面，本文提供了本文报道的双环融合多肽，其中一个环状融合多肽通过肽接头与结合血脑屏障受体的单价结合实体缀合。
在一个方面，本文提供了本文报道的双环融合多肽，其中两个环状融合多肽各自通过肽接头单独与结合血脑屏障受体的单价结合实体缀合。该缀合物包含两个与血脑屏障受体结合的单价结合实体。
在一个实施方案中，结合血脑屏障受体的单价结合实体选自蛋白质、多肽和肽。
在一个实施方案中，结合血脑屏障受体的单价结合实体包含选自血脑屏障受体配体、scFv、Fv、scFab、VHH的分子，在一个优选的实施方案中是scFv或scFab。
在一个实施方案中，血脑屏障受体选自转铁蛋白受体、胰岛素受体、胰岛素样生长因子受体、低密度脂蛋白受体相关的蛋白8、低密度脂蛋白受体相关的蛋白1和结合肝素的表皮生长因子样生长因子。在一个优选的实施方案中，血脑屏障受体是转铁蛋白受体。
在一个实施方案中，结合血脑屏障受体的单价结合实体包含针对转铁蛋白受体的一个scFab或一个scFv，更具体地是识别包含在SEQ ID NO：93、94或95的氨基酸序列中的转铁蛋白受体中的表位的scFab或scFv。
在一个实施方案中，结合血脑屏障受体的单价结合实体通过接头与环状融合多肽的C端末端偶联。
在一个实施方案中，肽接头是具有至少15个氨基酸长度的氨基酸序列，更优选具有18至25个氨基酸长度。
在一个优选的实施方案中，缀合物包含本文报道的环状融合多肽(特异性结合脑靶标)作为脑效应子实体、序列GGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：68)的接头和作为单价结合实体结合作为血脑受体的人转铁蛋白受体的一个scFab，其中scFab通过接头与环状融合多肽的C端末端偶联，并且其中scFab识别包含在SEQ ID NO：93、94或95的氨基酸序列中的人转铁蛋白受体中的表位。
在一个优选的实施方案中，缀合物包含本文报道的双环融合多肽(特异性结合脑靶标)作为脑效应实体、序列GGSGGGGSGGGGSGG GGS(SEQ ID NO：68)的两个接头和作为单价结合实体与作为血脑受体的人转铁蛋白受体结合的两个scFab，其中每个scFab通过一个接头与不同环状融合多肽的C端末端偶联，并且其中scFab识别包含在SEQ ID NO：93、94或95的氨基酸序列中的人转铁蛋白受体中的表位。
在一个实施方案中，第一环状融合多肽包含第一二聚化模块，第二环状融合多肽包含第二二聚化模块，以允许两个环状融合多肽同源或/和异源二聚化。
在一个实施方案中，第一环状融合多肽的异源二聚化模块是结重链Fc区，第二环状融合多肽的异源二聚化模块是扣重链Fc区(根据结入扣策略；参见例如WO 96/027011；Ridgway,J.B.等人,Prot.Eng.9(1996)617-621；Merchant,A.M.等人,Nat.Biotechnol.16(1998)677-681)。二硫键的引入进一步稳定了异源二聚体(Merchant,A.M.等人,Nat.Biotech.16(1998)677-681；Atwell,S.等人,J.Mol.Biol.270(1997)26-35)并提高产率。
在一个实施方案中，第一环状融合多肽的同源二聚化模块是重链Fc区，第二环状融合多肽的同源二聚化模块是重链Fc区，其中两个Fc区通过氨基酸取代S364G、L368F、D399K和K409D修饰(其中氨基酸位置根据Kabat的EU索引编号)。修饰/突变保持相同链之间的相互吸引作用，但导致不同链的排斥。
在一个实施方案中，第一环状融合多肽的异源二聚化模块是结重链Fc区，第二环状融合多肽的异源二聚化模块是扣重链Fc区(根据结入扣策略)，其中一个Fc区通过氨基酸取代S364G、L368F、D399K和K409D修饰(其中氨基酸位置根据Kabat的EU索引编号)。修饰/突变降低扣链之间的相互吸引作用并促进异源二聚化。
当提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时，通常使用“EU编号系统”或“EU索引”(例如，Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中报道的EU索引，通过引用明确地并入本文作为参考)。
本文报道的环状融合多肽缀合物可用于将环状融合多肽转运穿过血脑屏障。
在一个实施方案中，在其C端末端与作为单价结合实体的、结合人转铁蛋白受体的scFab偶联的环状融合多肽在N至C端方向上具有以下结构：
·环状融合多肽，
·肽接头，其将环状融合多肽的C端末端偶联至scFab的VL结构域的N端末端，在一个优选的实施方案中，肽接头具有氨基酸序列GGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：68)，
·scFab的可变轻链结构域(VL)和Cκ轻链结构域，
·肽接头，其将scFab的Cκ轻链结构域的C端末端偶联至scFab的VH结构域的N端末端，在一个优选实施方案中，肽接头具有氨基酸序列(G4S)4GG(SEQ ID NO：69)，
·scFab抗体的可变重链结构域(VH)和IgG CH1重链结构域。
在一个实施方案中，在其C端末端与作为单价结合实体的、结合人转铁蛋白受体的scFv偶联的环状融合多肽在N至C端方向上具有以下结构：
·环状融合多肽，
·肽接头，其将环状融合多肽的C端末端偶联至scFv抗体片段的VL结构域的N端末端，在一个优选实施方案中，肽接头是具有氨基酸序列GGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：68)的肽，
·可变轻链结构域(VL)，
·肽接头，其将可变轻链结构域的C端末端偶联至scFv的VH结构域的N端末端，在一个优选实施方案中，肽接头是具有氨基酸序列(G4S)4GG(SEQ ID NO:69)的肽，
·scFv抗体片段的可变重链结构域(VH)。
一个血脑屏障穿梭模块
在一个方面，环状融合多肽或多环融合多肽包含恰好一个血脑屏障结合特异性或穿梭模块，因此至少是双特异性的，其中血脑屏障结合特异性或穿梭模块包含
-SEQ ID NO：71和72或73的抗人转铁蛋白受体抗体8D3的可变结构域的人源化变体，或
-SEQ ID NO：88的重链可变结构域和SEQ ID NO：87的轻链可变结构域对，或
-SEQ ID NO：89和90的抗人转铁蛋白受体抗体494的可变结构域的人源化变体，
由此，血脑屏障结合特异性或穿梭模块将(多)环状融合多肽转运穿过血脑屏障
一个或两个血脑屏障穿梭模块
在一个方面，环状融合多肽或多环融合多肽包含一个或两个血脑屏障结合特异性或穿梭模块，因此至少是双特异性的，其中血脑屏障穿梭结合位点或模块衍生自与血脑屏障受体(BBB-R、BBB-R结合特异性)以低亲和力结合的抗体，其中衍生自以低亲和力与血脑屏障受体结合的抗体的血脑屏障结合特异性或穿梭模块将(多)环状融合多肽转运穿过血脑屏障。
在一个实施方案中，BBB-R选自转铁蛋白受体(TfR)、胰岛素受体、胰岛素样生长因子受体(IGF受体)、低密度脂蛋白受体相关蛋白8(LRP8)、低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)和结合肝素的表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)。在另一个这样的方面，BBB-R是人BBB-R。在一个这样的方面，BBB-R是TfR。在另一个这样的方面，BBB-R是TfR，并且抗体不抑制TfR活性。在另一个这样的方面，BBB-R是TfR，并且抗体不抑制TfR与转铁蛋白的结合。
在一个实施方案中，抗体不损害BBB-R与一种或多种其天然配体的结合。在一个这样的实施方案中，抗体以不抑制hTfR与人转铁蛋白结合的方式特异性结合人转铁蛋白受体(hTfR)。
在一个实施方案中，针对BBB-R的BBB-R结合特异性具有约1nM至约100μM的IC50。在一个实施方案中，IC50为约5nM至约100μM。在一个实施方案中，IC50为约50nM至约100μM。在一个实施方案中，IC50为约100nM至约100μM。在一个实施方案中，针对BBB-R的BBB-R结合特异性具有约5nM至约10μM的亲和力。在一个实施方案中，当缀合至环状融合多肽或包含在环状融合多肽中时，针对BBB-R的BBB-R结合特异性具有约30nM至约1μM的亲和力。在一个实施方案中，当缀合至环状融合多肽或包含在环状融合多肽中时，针对BBB-R的BBB-R结合特异性具有约50nM至约1μM的亲和力。在一个实施方案中，使用scatchard分析测量针对BBB-R的BBB-R结合特异性或环状融合多肽缀合物的亲和力。在一个实施方案中，使用BIACORE分析测量针对BBB-R的BBB-R结合特异性或环状融合多肽缀合物的亲和力。在一个实施方案中，使用竞争性ELISA测量针对BBB-R的BBB-R结合特异性或环状融合多肽缀合物的亲和力。
含有血脑屏障穿梭的缀合物的用途
在另一个实施方案中，本文提供了增加CNS暴露于环状融合多肽的方法，其中所述环状融合多肽与以低亲和力结合BBB-R的抗体或抗体片段偶联，从而增加CNS暴露于环状融合多肽。
术语“偶联”包括其中抗BBB-R抗体结合特异性作为第二结合特异性引入至少为双特异性环状融合多肽中的情况。术语“偶联”还包括其中抗BBB-R抗体结合特异性作为独立的结合特异性缀合在环状融合多肽中的情况。
在一个实施方案中，相对于偶联对BBB-R没有低亲和力的典型抗体的环状融合多肽的CNS暴露，测量CNS对环状融合多肽的暴露的增加。在一个实施方案中，CNS对环状融合多肽的暴露的增加测量为CNS中发现的环状融合多肽的量相对于施用后血清中发现的量的比率。在一个实施方案中，CNS暴露的增加导致大于0.1％的比率。在一个实施方案中，CNS对环状融合多肽的暴露的增加测量为相对于在不存在偶联的抗BBB-R抗体的情况下CNS对环状融合多肽的暴露。在一个实施方案中，通过成像测量CNS对环状融合多肽的暴露的增加。在一个实施方案中，通过间接读数(如一种或多种生理症状的改变)测量CNS对环状融合多肽的暴露的增加。
一种增加施用于受试者的环状融合多肽在CNS中保留的方法，其中环状融合多肽与以低亲和力结合BBB-R的抗体或抗体片段偶联，使得环状融合多肽在CNS中的保留增加。
在另一个实施方案中，本文提供了优化环状融合多肽的药代动力学和/或药物动力学以在受试者的CNS中有效的方法，其中所述环状融合多肽与以低亲和力结合BBB-R的抗体或抗体片段偶联，其中选择抗体或抗体片段，使得与环状融合多肽偶联后其对BBB-R的亲和力产生与环状融合多肽缀合的抗体或抗体片段穿过BBB的转运量，优化了CNS中环状融合多肽的药代动力学和/或药物动力学。
在另一个实施方案中，本发明提供了治疗哺乳动物神经疾病的方法，包括用结合BBB-R并与环状融合多肽偶联的抗体或抗体片段治疗哺乳动物，其中选择对BBB-R具有低亲和力的抗体，从而改善抗体和偶联的环状融合多肽的CNS摄取。在一个实施方案中，治疗导致疾患症状的减轻或消除。在另一方面，治疗导致神经疾病的改善。
在所有先前方面的一个实施方案中，针对BBB-R的抗BBB-R抗体具有约1nM至约100μM的IC50。在另一个这样的实施方案中，IC50为约5nM至约100μM。在另一个这样的实施方案中，IC50为约50nM至约100μM。在另一个这样的实施方案中，IC50为约100nM至约100μM。在另一个实施方案中，针对BBB-R的抗体具有约5nM至约10μM的亲和力。在另一个实施方案中，当与环状融合多肽偶联时，针对BBB-R的抗体具有约30nM至约1μM的亲和力。在另一个实施方案中，当与环状融合多肽偶联时，针对BBB-R的抗体具有约50nM至约1μM的亲和力。在一个实施方案中，使用scatchard分析测量针对BBB-R的抗BBB-R抗体或环状融合多肽缀合物的亲和力。在另一个实施方案中，使用BIACORE分析测量针对BBB-R的抗BBB-R抗体或环状融合多肽缀合物的亲和力。在另一个实施方案中，使用竞争性ELISA测量针对BBB-R的抗BBB-R抗体或环状融合多肽缀合物的亲和力。
在另一个实施方案中，标记环状融合多肽缀合物。在另一个实施方案中，抗BBB-R抗体或片段不损害BBB-R与一种或多种其天然配体的结合。在另一个实施方案中，抗BBB-R抗体以不抑制hTfR与人转铁蛋白结合的方式特异性结合hTfR。在另一个实施方案中，将环状融合多肽缀合物施用于哺乳动物。在另一个实施方案中，哺乳动物是人。在另一个实施方案中，哺乳动物患有神经疾病。在另一个实施方案中，神经疾病选自阿尔茨海默氏病(AD)、中风、痴呆、肌营养不良症(MD)、多发性硬化症(MS)、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、囊性纤维化、Angelman综合征、Liddle综合征、帕金森病、皮克病、派杰氏病、癌症和创伤性脑损伤。
作为血脑屏障穿梭的非共价复合物
非共价复合物的一部分是血脑屏障穿梭模块(BBB-穿梭模块)，其是双特异性抗体，具有对半抗原的第一结合特异性和对血脑屏障受体(BBBR)的第二结合特异性。这种BBB穿梭模块识别血脑屏障上的可转胞的细胞表面靶标(如TfR、LRP或其他靶标，BBB-R)并同时结合至半抗原化的环状融合多肽。
更详细地，环状融合多肽与半抗原缀合，并通过血脑屏障穿梭的半抗原结合位点复合。该复合物是定义的和稳定的，并且特异性地将半抗原化的环状融合多肽通过血脑屏障递送。由于半抗原化的环状融合多肽以非共价方式通过血脑屏障穿梭复合，一方面半抗原化的环状融合多肽在其循环中的期间与其递送载体(＝血脑屏障穿梭＝双特异性抗体)结合，但另一方面也可以在转胞作用后有效释放。可以在不干扰环状融合多肽活性的情况下实现与半抗原的缀合。血脑屏障穿梭不含有非一般的共价添加物，因此避免了任何免疫原性风险。半抗原化环状融合多肽与含有半抗原特异性结合位点的双特异性抗体的复合物赋予环状融合多肽良好的生物物理行为。此外，这种复合物能够将负荷靶向显示由双特异性抗体的第二结合特异性识别的抗原的细胞或组织。
尽管被半抗原化以及尽管被血脑屏障穿梭(＝双特异性抗体)复合，但环状融合多肽仍然保留其功能。此外，双特异性抗体的血脑屏障受体结合位点在复合的半抗原化环状融合多肽存在下保留其结合特异性和亲和力。本文报道的半抗原化的环状融合多肽与双特异性抗体的复合物可用于将环状融合多肽特异性地靶向表达血脑屏障受体的细胞。由于半抗原化的环状融合多肽以非共价方式与双特异性抗体偶联，因此内化或转胞作用后可释放环状融合多肽。
VI.重组方法和组合物
可以使用重组方法和组合物产生环状融合多肽如抗体，例如，如US 4,816,567中所述。在一个实施方案中，提供了编码本文所述的环状融合多肽的分离的核酸。此类核酸可以编码包含一个环状融合多肽的氨基酸序列，以及任选地还编码包含第二环状融合多肽的氨基酸序列(例如，双环融合多肽的第一环状融合多肽和第二环状融合多肽)。在进一步的实施方案中，提供了包含此类核酸的一个或多个载体(例如，表达载体)。在进一步的实施方案中，提供了包含此类核酸的宿主细胞。在一个这样的实施方案中，宿主细胞包含(例如，已转化有)：(1)载体，其包含编码包含环状融合多肽(同源聚合的或同源多聚的环状融合多肽)的氨基酸序列、和任选地在异源二聚的双环融合多肽的情况下编码包含第二环状融合多肽的第二氨基酸序列的核酸，在多环融合多肽的情况下任选地包含编码其他环状融合多肽的氨基酸序列的其他核酸，或(2)在异源二聚的双环融合多肽的情况下，第一载体包含编码包含第一环状融合多肽的氨基酸序列的核酸，第二载体包含编码包含第二环状融合多肽的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供了制备环状融合多肽的方法，其中该方法包括在适于表达环状融合多肽的条件下培养如上所述包含编码环状融合多肽的核酸的宿主细胞，和任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)中回收环状融合多肽。
为了重组产生环状融合多肽，分离编码例如如上所述抗体的核酸，并将其插入一个或多个载体中，用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。使用常规方法可以容易地制备此类核酸。
用于克隆或表达编码环状融合多肽的载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中产生环状融合多肽，特别是当不需要糖基化和Fc效应子功能时。对于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见例如US 5,648,237、US 5,789,199和US 5,840,523(还参见Charlton,K.A.,Methods in Molecular Biology,第248卷,Lo,B.K.C.(编辑),Humana Press,Totowa,NJ(2003),第245-254页,描述了大肠杆菌中抗体片段的表达)。表达后，可以从细菌细胞糊中以可溶性级分分离环状融合多肽，并且可以进一步纯化。
除原核生物外，真核微生物如丝状真菌或酵母是编码环状融合多肽的载体的合适克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已经被“人源化”的真菌和酵母菌株，导致产生具有部分或完全人糖基化模式的环状融合多肽(参见Gerngross,T.U.,Nat.Biotech.22(2004)1409-1414；Li,H.等人,Nat.Biotech.24(2006)210-215)。
用于表达糖基化环状融合多肽的合适宿主细胞也衍生自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒菌株，其可以与昆虫细胞一起使用，特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。
植物细胞培养物也可用作宿主(参见，例如，US 5,959,177、US 6,040,498、US 6,420,548、US 7,125,978和US 6,417,429(描述了用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术))。
脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293细胞，例如Graham,F.L.等人,J.Gen Virol.36(1977)59-74中所述)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠睾丸支持细胞(TM4细胞，例如Mather,J.P.,Biol.Reprod.23(1980)243-252中所述)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；布法罗大鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(HepG2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞，如，例如Mather,J.P.等人,AnnalsN.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中所述；MRC 5细胞；和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub,G.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)4216-4220)；和骨髓瘤细胞系如Y0、NS0和Sp2/0。关于适用于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见，例如，Yazaki,P.和Wu,A.M.,Methods in Molecular Biology,第248卷,Lo,B.K.C.(编辑),Humana Press,Totowa,NJ(2004)，第255-268页。
VII.测定法
本文提供的环状融合多肽可通过本领域已知的用于测定多肽与其靶标结合的多种测定法鉴定、筛选或表征其物理/化学性质和/或生物学活性。
VIII.免疫缀合物
本发明还提供免疫缀合物，其包含本文报道的环状融合多肽与一种或多种细胞毒性剂缀合，所述细胞毒性剂如化疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物来源的蛋白质毒素、酶活性毒素、或其片段)或放射性同位素。
在一个实施方案中，免疫缀合物是环状融合多肽-药物缀合物，其中环状融合多肽与一种或多种药物缀合，所述药物包括但不限于美登木素生物碱(参见US 5,208,020、US5,416,064和EP 0 425 235B1)；奥瑞他汀(auristatin)如一甲基奥瑞他汀药物部分DE和DF(MMAE和MMAF)(参见US 5,635,483、US 5,780,588和US 7,498,298)；尾海兔素；加利车霉素或其衍生物(参见US 5,712,374、US 5,714,586、US 5,739,116、US 5,767,285、US 5,770,701、US 5,770,710、US 5,773,001和US 5,877,296；Hinman,L.M.等人,Cancer Res.53(1993)3336-3342；和Lode,H.N.等人,Cancer Res.58(1998)2925-2928)；蒽环霉素如道诺霉素或多柔比星(参见Kratz,F.等人,Curr.Med.Chem.13(2006)477-523；Jeffrey,S.C.等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.16(2006)358-362；Torgov,M.Y.等人,Bioconjug.Chem.16(2005)717-721；Nagy,A.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(2000)829-834；Dubowchik,G.M.等人,Bioorg.&Med.Chem.Letters 12(2002)1529-1532；King,H.D.等人,J.Med.Chem.45(20029 4336-4343；和US 6,630,579)；甲氨蝶呤；长春地辛；紫杉烷，如多西紫杉醇、紫杉醇、拉罗他赛、tesetaxel和奥他赛；单端孢霉烯；和CC1065。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含本文报道的环状融合多肽与酶活性毒素或其片段缀合，所述酶活性毒素或其片段包括但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、蒴莲素A链、α-八叠球菌、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素蛋白、Phytolacaamericana蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥阜草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素(gelonin)、mitogellin、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、伊诺霉素(enomycin)和单端孢霉烯(tricothecenes)。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含本文报道的环状融合多肽与放射性原子缀合，以形成放射性缀合物。各种放射性同位素可用于生产放射性缀合物。实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。当放射性缀合物用于检测时，其可以包括用于闪烁扫描研究的放射性原子，例如TC99m或I123，或用于核磁共振(NMR)成像的自旋标记(也称为磁共振成像，MRI)，如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
可以使用多种双功能蛋白偶联剂制备环状融合多肽和细胞毒性剂的缀合物，所述双功能蛋白偶联剂如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基噻吩(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(如己二亚酰二甲酯HCl)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(如戊二醛)、双叠氮化合物(如双(p-叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮基衍生物(如双-(p-重氮基苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，可以如Vitetta,E.S.等人,Science 238(1987)1098-1104中所述制备蓖麻毒素免疫毒素。碳-14-标记的1-异硫氰酸基苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与环状融合多肽缀合的示例性螯合剂(参见WO94/11026)。接头可以是“可切割的接头”，其促进细胞中细胞毒性药物的释放。例如，可以使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头或含二硫化物的接头(Chari,R.V.等人,Cancer Res.52(1992)127-131；US 5,208,020)。
本文的免疫缀合物明确考虑但不限于用交联剂制备的此类缀合物，所述交联剂包括但不限于可商业获得(例如，从Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A获得)的BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC和磺基-SMPB、和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)。
IX.用于诊断和检测的方法和组合物
在某些实施方案中，本文提供的任何环状融合多肽可用于检测生物样品中其靶标的存在。如本文所用的术语“检测”包括定量或定性检测。在某些实施方案中，生物样品包含血液、血清、血浆、细胞或组织。
在一个实施方案中，提供了在诊断或检测方法中使用的环状融合多肽。在另一方面，提供了检测生物样品中环状融合多肽的靶标的存在的方法。在某些实施方案中，该方法包括在允许环状融合多肽与其靶标结合的条件下使生物样品与本文所述的环状融合多肽接触，和检测在环状融合多肽与其靶标之间是否形成复合物。此类方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，使用环状融合多肽选择适合用所述环状融合多肽治疗的受试者。
在某些实施方案中，提供了标记的环状融合多肽。标记包括但不限于直接检测的标记或部分(如荧光、发色、致密电子、化学发光和放射性标记)，以及例如通过酶促反应或分子相互作用间接检测的部分(如酶或配体)。示例性的标记包括但不限于放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I，荧光团如稀土螯合物或荧光素及其衍生物，罗丹明及其衍生物，丹酰，伞形酮，萤光素酶例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(US 4,737,456)，荧光素，2,3-二氢酞嗪二酮，辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，杂环氧化酶如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，与使用过氧化氢氧化染料前体的酶如HRP、乳过氧化物酶或微过氧化物酶偶联，生物素/抗生物素蛋白，自旋标记(spin labels)，噬菌体标记，稳定自由基等。
X.药物制剂
通过将具有期望纯度的此类环状融合多肽与一种或多种任选的可药用载体混合以冻干制剂或水溶液的形式制备本文所述的环状融合多肽的药物制剂(Remington'sPharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.(编辑)(1980))。可药用载体通常在所用剂量和浓度下对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂例如磷酸、柠檬酸和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲基氯化铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)的多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚(乙烯基吡咯烷酮)；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子如钠；金属复合物(例如锌-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。本文的示例性可药用载体还包括间质药物分散剂，如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，如rhuPH20(Baxter International,Inc.)。某些示例性sHASEGP和使用方法，包括rhuPH20，描述于US2005/0260186和US 2006/0104968中。在一个方面，sHASEGP与一种或多种额外的糖胺聚糖酶如软骨素酶组合。
示例性的冻干抗体制剂描述于US 6,267,958中。水性抗体制剂包括US6,171,586和WO 2006/044908中描述的那些，后者的制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲液。
根据所治疗的具体适应症的需要，本文的制剂还可含有多于一种的活性成分，优选那些具有互补活性而不会相互产生不利影响的活性成分。这些活性成分合适地以对预期目的有效的量组合存在。
活性成分可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中，例如在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳、纳米颗粒和纳米胶囊)中或在粗乳液中分别为羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。这些技术在Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，
A.(编辑)(1980)中公开。
可以制备缓释制备物。缓释制备物的合适实例包括含有环状融合多肽的固体疏水聚合物的半透性基质，该基质是成形制品的形式，例如，薄膜或微胶囊。
用于体内施用的制剂通常是无菌的。例如，通过无菌过滤膜过滤可以容易地实现无菌。
XI.治疗方法和组合物
本文提供的任何环状融合多肽均可用于治疗方法中。
在一个方面，提供了用作药物的环状融合多肽。在其他方面，提供了用于治疗疾病的环状融合多肽。在某些实施方案中，提供了用于治疗方法中的环状融合多肽。在某些实施方案中，本发明提供用于治疗患有疾病的个体的方法中的环状融合多肽，所述方法包括向个体施用有效量的环状融合多肽。在一个这样的实施方案中，所述方法还包括向个体施用有效量的至少一种其他治疗剂。根据任何上述实施方案的“个体”优选是人。
在另一方面，本发明提供环状融合多肽在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，药物用于治疗疾病。在进一步的实施方案中，药物用于治疗疾病的方法中，所述方法包括向患有所述疾病的个体施用有效量的药物。在一个这样的实施方案中，所述方法还包括向个体施用有效量的至少一种其他治疗剂。根据任何上述实施方案的“个体”可以是人。
在另一方面，本发明提供了治疗疾病的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向患有这种疾病的个体施用有效量的环状融合多肽。在一个这样的实施方案中，所述方法还包括向个体施用有效量的至少一种其他治疗剂。根据任何上述实施方案的“个体”可以是人。
在另一方面，本发明提供了包含本文提供的任何环状融合多肽的药物制剂，例如，用于任何上述治疗方法中。在一个实施方案中，药物制剂包含本文提供的任何环状融合多肽和可药用载体。在另一个实施方案中，药物制剂包含本文提供的任何环状融合多肽和至少一种其他治疗剂。
本文报道的环状融合多肽可单独使用或与治疗中的其他药剂组合使用。例如，本发明的环状融合多肽可以与至少一种其他治疗剂共同施用。
上述这种组合治疗包括组合施用(其中两种或更多种治疗剂包括在相同或分开的制剂中)和分开施用，在分开施用的情况下，本发明的环状融合多肽可以在另外一种或多种治疗剂施用之前、同时、和/或之后施用。在一个实施方案中，环状融合多肽的施用和其他治疗剂的施用在彼此的约一个月内、或在约一周、两周或三周内、或在约一天、两天、三天、四天、五天或六天内发生。本发明适合的环状融合多肽也可以与放疗组合使用。
本发明的环状融合多肽(和任何其他治疗剂)可以通过任何合适的方式施用，包括肠胃外、肺内和鼻内，并且如果需要局部治疗、病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。剂量可以通过任何合适的途径，例如，通过注射，如静脉内或皮下注射，部分取决于施用是短暂的还是慢性的。本文考虑了各种给药方案，包括但不限于在不同时间点上的单次或多次施用、推注施用(bolus administration)和脉冲输注。
本发明的环状融合多肽将以符合良好医学实践的方式配制、给药和施用。在此背景下考虑的因素包括所治疗的特定疾病、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床状况、疾患的原因、药剂的递送部位、施用方法、施用方案以及医生所知的其他因素。环状融合多肽不必、但任选地与一种或多种目前用于预防或治疗考虑中的疾患的药剂配制。这些其他药剂的有效量取决于制剂中存在的环状融合多肽的量、疾患或治疗的类型、以及上面讨论的其他因素。这些通常以与本文所述的相同剂量和施用途径使用，或者以本文所述剂量的约1％至99％使用，或以经验/临床确定为合适的任何剂量和任何途径使用。
为了预防或治疗疾病，本发明环状融合多肽的合适剂量(当单独使用或与一种或多种其他治疗剂组合使用时)将取决于待治疗的疾病类型、环状融合多肽的类型、疾病的严重程度和病程、环状融合多肽是否用于预防或治疗目的施用、先前的治疗、患者的临床病史和对环状融合多肽的反应、以及主治医师的判断。环状融合多肽适合一次或在一系列治疗中向患者施用。例如，无论是通过一次或多次分开施用、或通过连续输注，根据疾病的类型和严重程度，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.5mg/kg-10mg/kg)的环状融合多肽可以是用于向患者施用的初始候选剂量。取决于上述因素，一种典型的日剂量可以为约1μg/kg至100mg/kg或更高的范围。对于数天或更长时间的重复施用，取决于病症，通常持续治疗直至发生期望的疾病症状抑制。环状融合多肽的一个示例性剂量范围为约0.05mg/kg至约10mg/kg。因此，可以向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任何组合)中的一个或多个剂量。这些剂量可以间歇施用，例如，每周或每三周(例如，使患者接受约2至约20，或例如约6个剂量的环状融合多肽)。可施用初始较高负荷剂量，然后施用一个或多个较低剂量。然而，其他剂量方案可能是有用的。通过常规技术和测定法可以容易地监测该治疗的进展。
应当理解，可以使用本发明的免疫缀合物代替环状融合多肽或除了环状融合多肽之外还使用本发明的免疫缀合物进行任何上述制剂或治疗方法。
XII.制品
在本发明的另一方面，提供了含有可用于治疗、预防和/或诊断病患的物质的制品。所述制品包括容器和容器上或与容器相关的标签或包装说明书。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可以由多种材料形成，例如玻璃或塑料。所述容器容纳组合物，所述组合物本身或与另一种有效治疗、预防和/或诊断病症的组合物组合，并且可具有无菌进入口(例如，所述容器可以是具有由皮下注射针头可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的环状融合多肽。标签或包装说明书表明该组合物用于治疗所选择的病症。此外，制品可包括(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的环状融合多肽；(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含额外的细胞毒性剂或其他治疗剂。本发明该实施方案中的制品还可包含包装说明书，其表明该组合物可用于治疗特定病症。备选地或额外地，制品还可包含第二(或第三)容器，其包含可药用缓冲液，例如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。其还可以包括从商业和用户角度期望的其他物质，包括其他缓冲液、稀释液、过滤器、针头和注射器。
本文引用的所有文献(科学、书籍或专利)均通过引用并入本文作为参考。
提供以下实施例和附图以帮助理解本发明，本发明的实际范围在所附权利要求中阐述。应理解在不脱离本发明精神的情况下，可以在所述步骤中进行修改。
附图说明
图1本文报道的环状融合多肽的一般结构的示意图。
图2本文报道的双环融合多肽的一般结构的示意图。
图3本文报道的三环融合多肽的一般结构的示意图。
图4本文报道的四环融合多肽的一般结构的示意图。
图5：IgG型正常抗体和本文报道的示例性双环融合多肽的结合位点之间的方向和空间距离。
图6通过质谱法进行的本文报道的环状融合多肽的产品质量分析。
图7曲妥珠单抗和双环和四环抗Her2Contorsbody分别在增殖方面的不同影响。
图8本文报道的示例性双环融合多肽与FcRn的结合。
图9抗Her2Contorsbody和曲妥珠单抗的ADCC动力学。
图10+11VH结构域在“VH-in”方向(靠近Fc区)和“VH-out”方向(更远离Fc区)的相对位置和方向的示意图。
图12抗cMET环状融合多肽的示例性链，其具有用于产生本文报道的双特异性双环融合多肽的相应方向。
图13本文报道的双环融合多肽，其中一个环状融合多肽包含VH/VL对作为结合位点，且另一个环状融合多肽包含负载肽的MHC-I复合物作为结合位点。
图14MHC-I IgG型抗体融合体以及本文报道的和图13中显示的双环融合多肽的基于MHC-I介导的杀伤细胞募集和细胞去除的效果。
图15不同Contorsbody形式的UV消光色谱图(280nm)。
XIII.实施例
以下是本发明的方法和组合物的实施例。应当理解，在给出以上提供的一般描述的情况下，可以实践各种其他实施方案。
材料和方法
重组DNA技术
如Sambrook,J.等人,Molecular cloning:A laboratory manual；Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989中所述，使用标准方法操作DNA。根据制造商的说明书使用分子生物学试剂。
基因和寡核苷酸合成
通过Geneart GmbH(Regensburg，Germany)的化学合成制备所需的基因区段。将合成的基因片段克隆到大肠杆菌质粒中用于增殖/扩增。通过DNA测序验证亚克隆基因片段的DNA序列。备选地，通过退火化学合成的寡核苷酸或通过PCR组装短的合成DNA片段。由metabion GmbH(Planegg-Martinsried，Germany)制备各个寡核苷酸。
试剂
如果没有另外说明，则根据制造商提供的方案使用所有商业化学品、抗体和试剂盒。
实施例1
构建用于环状融合多肽的表达质粒
为了表达本文报道的环状融合多肽，使用包含以下功能元件的转录单元：
-来自人巨细胞病毒的即刻早期增强子和启动子(P-CMV)，包括内含子A，
-人重链免疫球蛋白5'-非翻译区(5'UTR)，
-鼠免疫球蛋白重链信号序列，
-编码相应的环状融合多肽的核酸，和
-牛生长激素聚腺苷酸化序列(BGH pA)。
基本/标准哺乳动物表达质粒在包括待表达的目的基因的表达单元/盒的旁边含有
-来自载体pUC18的复制起点，其允许该质粒在大肠杆菌中复制，和
-β-内酰胺酶基因，其赋予大肠杆菌中氨苄青霉素抗性。
实施例2
环状融合多肽的表达
使用Transfection Reagent 293-free(Novagen)在悬浮适应的HEK293F(FreeStyle 293-F细胞；Invitrogen)细胞中进行环状融合多肽的瞬时表达。
在125ml摇瓶中解冻后(在37℃、7％CO2、85％湿度、135rpm孵育/摇动)，通过稀释将细胞传代至少4次(体积30ml)。
将细胞在250ml体积中扩增至3×105个细胞/ml。三天后，将细胞分开并以7×105个细胞/ml的密度新接种在1升摇瓶中的250ml体积中。于24小时后转染，细胞密度约为1.4-2.0×106个细胞/ml。
在转染之前，用预热的(水浴；37℃)Opti-MEM(Gibco)将250μg质粒-DNA稀释至终体积10ml。将溶液轻轻混合并在室温下孵育不超过5分钟。然后将333.3μl的29-free转染试剂加入到DNA-OptiMEM溶液中。然后将溶液轻轻混合并在室温下孵育15-20分钟。将全部体积的混合物加入到具有250ml HEK-细胞培养体积的1L摇瓶中。
在37℃、7％CO2、85％湿度、135rpm下孵育/摇动6或7天。
通过在2,000rpm、4℃、持续10分钟的第一离心步骤收获上清液。然后将上清液转移到新的离心烧瓶中，在4,000rpm、4℃、持续20分钟进行第二离心。然后使无细胞上清液通过0.22μm瓶顶过滤器过滤并储存在冰箱(-20℃)中。
实施例3
纯化环状融合多肽
将含有抗体的培养上清液过滤并通过两个色谱步骤纯化。使用用PBS(1mM KH2PO4、10mM Na2HPO4、137mM NaCl、2.7mM KCl)，pH 7.4平衡的HiTrap MabSelectSuRe(GEHealthcare)通过亲和色谱法捕获抗体。通过用平衡缓冲液洗涤除去未结合的蛋白质，用50mM柠檬酸盐缓冲液(pH 2.8)回收抗体，洗脱后立即用1M Tris-碱(pH9.0)中和至pH6.0。Superdex 200TM(GE Healthcare)上的大小排阻色谱法用作第二纯化步骤。在20mM组氨酸缓冲液、0.14M NaCl，pH6.0中进行大小排阻色谱法。用装备有Biomax-SK膜(Millipore,Billerica,MA)的Ultrafree-CL离心过滤单元浓缩含有抗体的溶液，并储存在-80℃。
实施例4
抗Her2环状融合多肽的结合
表面等离子体共振Her2受体结合
芯片表面：CM5-芯片
T：37℃和25℃，分别用于测定设置1和2
运行缓冲液：PBS+0.05％(v/v)吐温20
稀释缓冲液：运行缓冲液+0.1％BSA
分析物：c(HER2ECD)＝0.41-900nM，用于测定设置1；
c(二聚抗Her2Contorsbody)＝3.7-300nM，
c(四聚抗Her2Contorsbody)＝1.85-150nM，
c(曲妥珠单抗)＝3.7-300nM，用于测定设置2
配体：二聚和四聚抗Her2Contorsbody、曲妥珠单抗通过抗人Fc区抗体结合用于测定设置1；Her2-ECD通过帕妥珠单抗结合用于测定设置2。
响应单位与分子量直接成比例。分析物结合的理论最大值基于Her2ECD的已知结合水平。100％＝1分子二聚抗Her2Contorsbody或曲妥珠单抗分别与2分子HER2ECD结合；1分子四聚抗Her2Contorsbody与4分子HER2ECD结合。
实施例5
ADCC测定法-ACEA
用Accutase“溶解”BT-474细胞，在培养基中计数并使细胞密度为2×10E5个细胞/ml。将50μl培养基移液到96孔板上的每个孔中，在ACEA上测量背景效应，最后加入50μl细胞悬浮液/孔(＝10,000个细胞/孔)。将板置于ACEA中，在15分钟后测量细胞指数。然后通过移液移除培养基，用AIM-V培养基进行洗涤步骤，并加入三种不同浓度的50μl抗体。计数自然杀伤细胞并置于AIM-V中至细胞密度为6×10E5。在ACEA中加入50μl(30,000个细胞/孔，使E/T 3：1，每5分钟测定细胞指数。24小时后，停止实验，计算2小时和4小时后的ADCC。
实施例6
二聚抗Her2环状融合多肽的质谱分析
PNGase F获自Roche Diagnostics GmbH(14.3U/μl；磷酸钠溶液，EDTA和甘油)。在消化之前，由冻干物新鲜重构在IgG抗体铰链区中特异性切割的蛋白酶。
用PNGase F进行酶促去糖基化
用10mM磷酸钠缓冲液(pH7.1)将50μg Contorsbody稀释至终浓度0.6mg/ml，并用1μl PNGaseF在37℃去糖基化16小时。
酶促切割
用200mM Tris缓冲液(pH8.0)将去糖基化的样品稀释至终浓度0.5mg/ml，随后用IgG特异性蛋白酶在37℃消化1小时。
ESI-QTOF质谱
使用40％乙腈和2％甲酸(v/v)在Sephadex G25柱(Kronlab,5x250mm,TAC05/250G0-SR)上通过HPLC对样品脱盐。在配备TriVersa NanoMate源(Advion)的maXis 4GUHR-QTOF MS系统(Bruker Daltonik)上通过ESI-QTOFMS测定总质量。用碘化钠(WatersToF G2-样品试剂盒2部分:700008892-1)进行校准。对于消化的Contorsbody，在1000-4000m/z(ISCID：30eV)进行数据采集。评估原始质谱并将其转化为单独的相对摩尔质量。为了显示可视化结果，使用专有软件生成解卷积质谱。
序列表
<110> 豪夫迈·罗氏有限公司
<120> Contorsbody－单链靶标结合物
<130> P33504-WO
<150> EP16167920
<151> 2016-05-02
<160> 105
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg标签
<400> 1
Arg Arg Arg Arg Arg
1 5
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Arg标签 2
<400> 2
Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1 5
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> His标签
<400> 3
His His His His His His
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸标签
<400> 4
Lys Asp His Leu Ile His Asn Val His Lys Glu Phe His Ala His Ala
1 5 10 15
His Asn Lys
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸标签
<400> 5
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 6
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸标签
<400> 6
Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr
1 5 10 15
Lys Asp Asp Asp Asp Lys
20
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸标签
<400> 7
Ala Trp Arg His Pro Gln Phe Gly Gly
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸标签
<400> 8
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5
<210> 9
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸标签
<400> 9
Met Asp Val Glu Ala Trp Leu Gly Ala Arg
1 5 10
<210> 10
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸标签
<400> 10
Met Asp Val Glu Ala Trp Leu Gly Ala Arg Val Pro Leu Val Glu Thr
1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸标签
<400> 11
Met Asp Glu Lys Thr Thr Gly Trp Arg Gly Gly His Val Val Glu Gly
1 5 10 15
Leu Ala Gly Glu Leu Glu Gln Leu Arg Ala Arg Leu Glu His His Pro
20 25 30
Gln Gly Gln Arg Glu Pro
35
<210> 12
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸标签
<400> 12
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10
<210> 13
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸标签
<400> 13
Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp Ser
1 5 10 15
<210> 14
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸标签
<400> 14
Lys Arg Arg Trp Lys Lys Asn Phe Ile Ala Val Ser Ala Ala Asn Arg
1 5 10 15
Phe Lys Lys Ile Ser Ser Ser Gly Ala Leu
20 25
<210> 15
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氨基酸标签
<400> 15
Pro Ala Thr Thr Thr Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr Gln Ser His Tyr
1 5 10 15
Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Val Cys Ala Ser
20 25 30
Gly Thr Thr Cys Gln Val Leu Asn Pro Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu
35 40 45
<210> 16
<211> 32
<212> PRT
<213> 溶纤维丁酸弧菌（Butyrivibrio fibrisolvens）
<400> 16
Met Asp Trp Asn Ala Asn Ile Ala Pro Gly Asn Ser Val Glu Phe Gly
1 5 10 15
Ile Gln Gly Ala Gly Ser Val Gly Asn Val Ile Asp Ile Thr Val Glu
20 25 30
<210> 17
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 几丁质结合结构域
<400> 17
Thr Asn Pro Gly Val Ser Ala Trp Gln Val Asn Thr Ala Tyr Thr Ala
1 5 10 15
Gly Gln Leu Val Thr Tyr Asn Gly Lys Thr Tyr Lys Cys Leu Gln Pro
20 25 30
His Thr Ser Leu Ala Gly Trp Glu Pro Ser Asn Val Pro Ala Leu Trp
35 40 45
Gln Leu Gln
50
<210> 18
<211> 209
<212> PRT
<213> 皱波角叉菜（Chondrus crispus）
<400> 18
Met Pro Glu Ile Lys Leu Thr Tyr Phe Asp Met Arg Gly Arg Ala Glu
1 5 10 15
Ala Ser Arg Leu Ala Leu Val Val Gly Glu Ile Pro Phe Glu Asp Glu
20 25 30
Arg Val Val Phe Asp His Trp Lys Glu Ala Lys Pro Lys Thr Pro Tyr
35 40 45
Ala Ala Leu Pro Met Leu Thr Val Asp Gly Met Gln Val Ala Gln Ser
50 55 60
Asp Ala Ile Leu Arg Tyr Cys Gly Lys Leu Ala Gly Leu Tyr Pro Ser
65 70 75 80
Asp Pro Leu Glu Ala Ala Lys Val Asp Glu Val Gly Gly Val Ile Asp
85 90 95
Asp Val Thr His Ala Met Tyr Arg Tyr Arg Gly Asp Asp Lys Asp Lys
100 105 110
Leu Arg Glu Glu Arg Asp Lys Phe Ser Lys Val Asp Val Pro Arg Tyr
115 120 125
Val Gly Ala Leu Glu Lys Arg Leu Glu Ala Phe Gly Asp Gly Pro Trp
130 135 140
Ala Val Gly Gly Asn Met Thr Ile Ala Asp Leu His Ile Cys His Leu
145 150 155 160
Val Thr Asn Ile Arg Cys Gly Met Leu Asp Phe Val Asp Lys Asp Leu
165 170 175
Leu Glu Gly Tyr Val Arg Ile Val Lys Ser Tyr Ser Ala Val Met Glu
180 185 190
His Pro Lys Val Thr Glu Trp Tyr Glu Lys Lys Pro Val Lys Met Phe
195 200 205
Ser
<210> 19
<211> 396
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 19
Met Lys Ile Lys Thr Gly Ala Arg Ile Leu Ala Leu Ser Ala Leu Thr
1 5 10 15
Thr Met Met Phe Ser Ala Ser Ala Leu Ala Lys Ile Glu Glu Gly Lys
20 25 30
Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu
35 40 45
Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr Gly Ile Lys Val Thr Val Glu
50 55 60
His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly
65 70 75 80
Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr
85 90 95
Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln
100 105 110
Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys
115 120 125
Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn
130 135 140
Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala
145 150 155 160
Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn
165 170 175
Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly
180 185 190
Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly
195 200 205
Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu
210 215 220
Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu
225 230 235 240
Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp
245 250 255
Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys Val Asn Tyr Gly Val Thr Val
260 265 270
Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser Lys Pro Phe Val Gly Val Leu
275 280 285
Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu
290 295 300
Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn
305 310 315 320
Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu
325 330 335
Leu Ala Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys
340 345 350
Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala
355 360 365
Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp
370 375 380
Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Arg Ile Thr Lys
385 390 395
<210> 20
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 20
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val
<210> 21
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 21
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Trp Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
35 40 45
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
50 55 60
Glu Ser Thr Tyr Arg Trp Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
65 70 75 80
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
85 90 95
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
100 105
<210> 22
<211> 106
<212> PRT
<213> 智人
<400> 22
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1 5 10 15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
100 105
<210> 23
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> X=S或P
<400> 23
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Xaa Cys Pro
1 5 10
<210> 24
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X=S或P
<400> 24
His Thr Cys Pro Xaa Cys Pro
1 5
<210> 25
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> X=S或P
<400> 25
Cys Pro Xaa Cys Pro
1 5
<210> 26
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人
<400> 26
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 27
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人
<400> 27
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 28
<211> 326
<212> PRT
<213> 智人
<400> 28
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 29
<211> 377
<212> PRT
<213> 智人
<400> 29
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro
100 105 110
Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg
115 120 125
Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys
130 135 140
Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
145 150 155 160
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
165 170 175
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
180 185 190
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr
195 200 205
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
210 215 220
Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
225 230 235 240
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
245 250 255
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln
260 265 270
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
275 280 285
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
290 295 300
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn
305 310 315 320
Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
325 330 335
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile
340 345 350
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln
355 360 365
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370 375
<210> 30
<211> 327
<212> PRT
<213> 智人
<400> 30
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 31
<211> 221
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (131)..(131)
<223> X=E或D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (133)..(133)
<223> X=M或L
<400> 31
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10 15
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
20 25 30
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
35 40 45
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
50 55 60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
65 70 75 80
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
100 105 110
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
115 120 125
Ser Arg Xaa Glu Xaa Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145 150 155 160
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
180 185 190
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
195 200 205
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
210 215 220
<210> 32
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有扣突变的IgG1同种型的变体人Fc区
<400> 32
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10 15
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
20 25 30
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
35 40 45
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
50 55 60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
65 70 75 80
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
100 105 110
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
115 120 125
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val
130 135 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145 150 155 160
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
180 185 190
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
195 200 205
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
210 215 220
<210> 33
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有结突变的IgG1同种型的变体人Fc区
<400> 33
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10 15
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
20 25 30
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
35 40 45
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
50 55 60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
65 70 75 80
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
100 105 110
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
115 120 125
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145 150 155 160
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
180 185 190
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
195 200 205
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
210 215 220
<210> 34
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有突变L234A, L235A的IgG1同种型的变体人Fc区
<400> 34
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10 15
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
20 25 30
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
35 40 45
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
50 55 60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
65 70 75 80
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
100 105 110
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
115 120 125
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145 150 155 160
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
180 185 190
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
195 200 205
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
210 215 220
<210> 35
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有L234A, L235A和扣突变的IgG1同种型的变体人Fc区
<400> 35
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10 15
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
20 25 30
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
35 40 45
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
50 55 60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
65 70 75 80
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
100 105 110
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
115 120 125
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val
130 135 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145 150 155 160
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
180 185 190
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
195 200 205
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
210 215 220
<210> 36
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有L234A, L235A和结突变的IgG1同种型的变体人Fc区
<400> 36
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10 15
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
20 25 30
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
35 40 45
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
50 55 60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
65 70 75 80
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
100 105 110
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
115 120 125
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145 150 155 160
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
180 185 190
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
195 200 205
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
210 215 220
<210> 37
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有L234A, L235A和P329G突变的IgG1同种型的变体人Fc区
<400> 37
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10 15
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
20 25 30
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
35 40 45
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
50 55 60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
65 70 75 80
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
100 105 110
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
115 120 125
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145 150 155 160
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
180 185 190
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
195 200 205
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
210 215 220
<210> 38
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有L234A, L235A, P329G 和扣突变的IgG1同种型的变体人Fc区
<400> 38
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10 15
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
20 25 30
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
35 40 45
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
50 55 60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
65 70 75 80
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
100 105 110
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
115 120 125
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val
130 135 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145 150 155 160
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
180 185 190
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
195 200 205
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
210 215 220
<210> 39
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有L234A, L235A, P329G和结突变的IgG1同种型的变体人Fc区
<400> 39
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10 15
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
20 25 30
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
35 40 45
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
50 55 60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
65 70 75 80
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
100 105 110
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
115 120 125
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145 150 155 160
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
180 185 190
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
195 200 205
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
210 215 220
<210> 40
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有突变L234A, L235A, P329G, Y349C, T366S, L368A和Y407V的IgG1亚类的变体人Fc区
<400> 40
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10 15
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
20 25 30
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
35 40 45
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
50 55 60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
65 70 75 80
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
100 105 110
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro
115 120 125
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val
130 135 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145 150 155 160
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
180 185 190
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
195 200 205
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
210 215 220
<210> 41
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有L234A, L235A, P329G和S354C, T366W突变的IgG1亚类的变体人Fc区
<400> 41
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10 15
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
20 25 30
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
35 40 45
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
50 55 60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
65 70 75 80
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
100 105 110
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
115 120 125
Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145 150 155 160
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
180 185 190
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
195 200 205
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
210 215 220
<210> 42
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有L234A, L235A, P329G和S354C, T366S, L368A和Y407V突变的IgG1亚类的变体人Fc区
<400> 42
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10 15
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
20 25 30
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
35 40 45
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
50 55 60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
65 70 75 80
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
100 105 110
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
115 120 125
Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val
130 135 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145 150 155 160
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
180 185 190
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
195 200 205
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
210 215 220
<210> 43
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有L234A, L235A, P329G和Y349C, T366W突变的IgG1亚类的变体人Fc区
<400> 43
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10 15
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
20 25 30
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
35 40 45
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
50 55 60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
65 70 75 80
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
100 105 110
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro
115 120 125
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145 150 155 160
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
180 185 190
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
195 200 205
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
210 215 220
<210> 44
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有突变I253A, H310A和H435A的IgG1亚类的变体人Fc区
<400> 44
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10 15
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ala Ser Arg Thr Pro
20 25 30
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
35 40 45
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
50 55 60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
65 70 75 80
Leu Thr Val Leu Ala Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
100 105 110
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
115 120 125
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145 150 155 160
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
180 185 190
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
195 200 205
Asn Ala Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
210 215 220
<210> 45
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有突变H310A, H433A和Y436A的IgG1亚类的变体人Fc区
<400> 45
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10 15
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
20 25 30
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
35 40 45
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
50 55 60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
65 70 75 80
Leu Thr Val Leu Ala Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
100 105 110
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
115 120 125
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145 150 155 160
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
180 185 190
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu Ala
195 200 205
Asn His Ala Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
210 215 220
<210> 46
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有突变M252Y, S254T和T256E的IgG1亚类的变体人Fc区
<400> 46
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10 15
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro
20 25 30
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
35 40 45
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
50 55 60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
65 70 75 80
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
100 105 110
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
115 120 125
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145 150 155 160
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
180 185 190
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
195 200 205
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
210 215 220
<210> 47
<211> 221
<212> PRT
<213> 智人
<400> 47
Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10 15
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
20 25 30
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
35 40 45
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
50 55 60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
65 70 75 80
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
100 105 110
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
115 120 125
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145 150 155 160
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
180 185 190
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
195 200 205
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
210 215 220
<210> 48
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG4同种型的变体人Fc区，具有S228P和L235E突变
<400> 48
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10 15
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
20 25 30
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
35 40 45
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
50 55 60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
65 70 75 80
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
100 105 110
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
115 120 125
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145 150 155 160
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
180 185 190
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
195 200 205
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
210 215 220
<210> 49
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG4同种型的变体人Fc区，具有S228P, L235E和P329G突变
<400> 49
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10 15
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
20 25 30
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
35 40 45
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
50 55 60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
65 70 75 80
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Gly Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
100 105 110
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
115 120 125
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145 150 155 160
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
180 185 190
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
195 200 205
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
210 215 220
<210> 50
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG4同种型的变体人Fc区，具有S228P 和L235E突变
<400> 50
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Gly Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly
225
<210> 51
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG4同种型的变体人Fc区，具有S228P, L235E和P329G突变
<400> 51
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Gly Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly
225
<210> 52
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 52
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 53
<211> 105
<212> PRT
<213> 智人
<400> 53
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
20 25 30
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
35 40 45
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
50 55 60
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
65 70 75 80
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
85 90 95
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100 105
<210> 54
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 54
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 55
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 55
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 56
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 56
Gln Gln Gln Ser
1
<210> 57
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 57
Gln Gln Gln Gln Ser
1 5
<210> 58
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 58
Ser Ser Ser Gly
1
<210> 59
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 59
Ser Ser Ser Ser Gly
1 5
<210> 60
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 60
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 61
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 61
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 62
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 62
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 63
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 63
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 64
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 64
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 65
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 65
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 66
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 66
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 67
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 67
Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser
1 5 10 15
Gly
<210> 68
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 68
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser
<210> 69
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 69
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20
<210> 70
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 70
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 71
<211> 118
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 71
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Ile Arg Gln Ala Pro Lys Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Met Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Lys Met Asn Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Val Pro Thr Ser His Tyr Val Val Asp Val Trp Gly Gln Gly Val
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 72
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 72
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu Glu
1 5 10 15
Glu Ile Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asn Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Ser Arg Val Gln Val
65 70 75 80
Glu Asp Ile Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Ala Tyr Asn Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 73
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗TfR mAb 8D3 VL变体L104V L106I
<400> 73
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu Glu
1 5 10 15
Glu Ile Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asn Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Ser Arg Val Gln Val
65 70 75 80
Glu Asp Ile Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Ala Tyr Asn Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 74
<211> 122
<212> PRT
<213> 穴兔（Oryctolagus cuniculus）
<400> 74
Gln Ser Met Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala
20 25 30
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Tyr Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr
65 70 75 80
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Tyr
85 90 95
Gly Thr Ser Tyr Pro Asp Tyr Gly Asp Ala Asn Gly Phe Asp Pro Trp
100 105 110
Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 75
<211> 110
<212> PRT
<213> 穴兔
<400> 75
Ala Tyr Asp Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Val Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Glu Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Cys Tyr Ser Ser Ser Asn
85 90 95
Val Asp Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100 105 110
<210> 76
<211> 7
<212> PRT
<213> 穴兔
<400> 76
Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
1 5
<210> 77
<211> 5
<212> PRT
<213> 穴兔
<400> 77
Trp Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 78
<211> 17
<212> PRT
<213> 穴兔
<400> 78
Arg Tyr Gly Thr Ser Tyr Pro Asp Tyr Gly Asp Ala Asn Gly Phe Asp
1 5 10 15
Pro
<210> 79
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 299-000 HVR-H3 DASG
<400> 79
Arg Tyr Gly Thr Ser Tyr Pro Asp Tyr Gly Asp Ala Ser Gly Phe Asp
1 5 10 15
Pro
<210> 80
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 299-000 HVR-H3 DAQG
<400> 80
Arg Tyr Gly Thr Ser Tyr Pro Asp Tyr Gly Asp Ala Gln Gly Phe Asp
1 5 10 15
Pro
<210> 81
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 299-000 HVR-L1 RAA
<400> 81
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 82
<211> 7
<212> PRT
<213> 穴兔
<400> 82
Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser
1 5
<210> 83
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 299-000 HVR-L3 NYA
<400> 83
Gln Gln Asn Tyr Ala Ser Ser Asn Val Asp Asn Thr
1 5 10
<210> 84
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗TfR mAb 567 VH (=人源化299 VH_基础)
<400> 84
Gln Ser Met Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala
20 25 30
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Tyr Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr
65 70 75 80
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Tyr
85 90 95
Gly Thr Ser Tyr Pro Asp Tyr Gly Asp Ala Asn Gly Phe Asp Pro Trp
100 105 110
Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 85
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗TfR mAb 567 VL (=人源化299 VL_基础)
<400> 85
Ala Tyr Asp Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Val Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Glu Ser
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Ser Asn
85 90 95
Val Asp Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100 105 110
<210> 86
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗TfR mAb 932 VH (=人源化299 VH_突变的)
<400> 86
Gln Ser Met Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr
1 5 10 15
Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala
20 25 30
Met Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Tyr Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Ser
50 55 60
Arg Val Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Ser Leu Lys Leu Ser
65 70 75 80
Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Tyr
85 90 95
Gly Thr Ser Tyr Pro Asp Tyr Gly Asp Ala Asn Gly Phe Asp Pro Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 87
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗TfR mAb 932 VL (=人源化299 VL_突变的)
<400> 87
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Tyr Ala Ser Ser Asn
85 90 95
Val Asp Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 88
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 299-023 VH人源化变体_DASG
<400> 88
Gln Ser Met Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr
1 5 10 15
Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala
20 25 30
Met Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Tyr Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Ser
50 55 60
Arg Val Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Ser Leu Lys Leu Ser
65 70 75 80
Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Tyr
85 90 95
Gly Thr Ser Tyr Pro Asp Tyr Gly Asp Ala Ser Gly Phe Asp Pro Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 89
<211> 119
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 89
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Val Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Pro Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Ile Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asp Thr Lys Cys Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Val Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Val Arg Asp Tyr Leu Tyr Pro Tyr Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 90
<211> 108
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 90
Lys Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Met Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Leu Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Tyr
20 25 30
Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gln Ser Pro Glu Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Gln Thr Tyr Asn Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
100 105
<210> 91
<211> 118
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 91
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Pro His Asn Gly Gly Thr Asp Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 92
<211> 106
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 92
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Ile Arg Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Asn Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 93
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人转铁蛋白受体片段
<400> 93
Ile Gly Gln Asn Met Val Thr Ile Val Gln Ser Asn Gly Asn Leu
1 5 10 15
<210> 94
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人转铁蛋白受体片段
<400> 94
Asn Met Val Thr Ile Val Gln Ser Asn Gly Asn Leu Asp Pro Val
1 5 10 15
<210> 95
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人转铁蛋白受体片段
<400> 95
Gln Ser Asn Gly Asn Leu Asp Pro Val Glu Ser Pro Glu Gly Tyr
1 5 10 15
<210> 96
<211> 693
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗Her2环状融合多肽
<400> 96
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
225 230 235 240
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
245 250 255
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
260 265 270
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
275 280 285
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
290 295 300
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
305 310 315 320
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
325 330 335
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
340 345 350
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
355 360 365
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
370 375 380
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
385 390 395 400
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
405 410 415
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
420 425 430
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
435 440 445
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly
450 455 460
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
465 470 475 480
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
485 490 495
Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
500 505 510
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val
515 520 525
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
530 535 540
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
545 550 555 560
His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
565 570 575
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
580 585 590
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
595 600 605
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
610 615 620
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
625 630 635 640
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
645 650 655
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
660 665 670
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Ser Gly His
675 680 685
His His His His His
690
<210> 97
<211> 692
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗cMet环状融合多肽
<400> 97
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
225 230 235 240
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
245 250 255
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
260 265 270
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
275 280 285
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
290 295 300
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
305 310 315 320
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
325 330 335
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
340 345 350
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
355 360 365
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
370 375 380
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
385 390 395 400
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
405 410 415
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
420 425 430
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
435 440 445
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
450 455 460
Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro
465 470 475 480
Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr
485 490 495
Ser Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Lys Gly Leu
500 505 510
Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Leu Pro
515 520 525
Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln
530 535 540
Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr
545 550 555 560
Tyr Cys Ala Pro Ser Tyr Tyr Tyr Gly Gly Lys His Val Ala Leu Phe
565 570 575
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
580 585 590
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
595 600 605
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
610 615 620
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
625 630 635 640
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
645 650 655
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
660 665 670
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
675 680 685
Pro Lys Ser Cys
690
<210> 98
<211> 693
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD20环状融合多肽 (1)
<400> 98
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly
100 105 110
Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys
225 230 235 240
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
245 250 255
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
260 265 270
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
275 280 285
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
290 295 300
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
305 310 315 320
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
325 330 335
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
340 345 350
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
355 360 365
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
370 375 380
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
385 390 395 400
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
405 410 415
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
420 425 430
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
435 440 445
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly
450 455 460
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala
465 470 475 480
Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala
485 490 495
Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser
500 505 510
Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val
515 520 525
Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr
530 535 540
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
545 550 555 560
Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
565 570 575
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
580 585 590
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
595 600 605
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
610 615 620
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
625 630 635 640
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
645 650 655
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
660 665 670
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Ser Gly His
675 680 685
His His His His His
690
<210> 99
<211> 697
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD20环状融合多肽 (2)
<400> 99
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser
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Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
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195 200 205
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
225 230 235 240
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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325 330 335
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340 345 350
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370 375 380
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Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
405 410 415
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420 425 430
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450 455 460
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530 535 540
Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr
545 550 555 560
Tyr Cys Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr
565 570 575
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Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys
595 600 605
Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val
610 615 620
Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln
625 630 635 640
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser
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Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His
660 665 670
Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
675 680 685
Gly Ser Gly His His His His His His
690 695
<210> 100
<211> 689
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗cMet环状融合多肽 VH-out-结
<400> 100
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
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50 55 60
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65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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100 105 110
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115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
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Ser Cys Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys
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Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
245 250 255
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
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275 280 285
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290 295 300
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Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
325 330 335
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
340 345 350
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355 360 365
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Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
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Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
420 425 430
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
435 440 445
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
450 455 460
Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr
465 470 475 480
Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile
485 490 495
Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln
500 505 510
Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Val Tyr Asn Ala Lys Thr
515 520 525
Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
530 535 540
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr
545 550 555 560
Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly
565 570 575
Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile
580 585 590
Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val
595 600 605
Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys
610 615 620
Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu
625 630 635 640
Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
645 650 655
Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr
660 665 670
His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu
675 680 685
Cys
<210> 101
<211> 692
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗cMet环状融合多肽 VH-in-结
<400> 101
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
225 230 235 240
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
245 250 255
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
260 265 270
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
275 280 285
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
290 295 300
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
305 310 315 320
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
325 330 335
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
340 345 350
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr
355 360 365
Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
370 375 380
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
385 390 395 400
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
405 410 415
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
420 425 430
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
435 440 445
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
450 455 460
Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro
465 470 475 480
Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr
485 490 495
Ser Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Lys Gly Leu
500 505 510
Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Leu Pro
515 520 525
Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln
530 535 540
Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr
545 550 555 560
Tyr Cys Ala Pro Ser Tyr Tyr Tyr Gly Gly Lys His Val Ala Leu Phe
565 570 575
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
580 585 590
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
595 600 605
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
610 615 620
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
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Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
645 650 655
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
660 665 670
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
675 680 685
Pro Lys Ser Cys
690
<210> 102
<211> 685
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗cMet环状融合多肽 VH-out-扣
<400> 102
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ala Tyr
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Phe Ile Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Arg Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Asn Thr Phe Tyr Asp Gln Ser Phe
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Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Trp Asp Tyr Asn Tyr Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
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Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
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Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys
225 230 235 240
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
245 250 255
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
260 265 270
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
275 280 285
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
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Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
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Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
325 330 335
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355 360 365
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys
370 375 380
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
385 390 395 400
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
405 410 415
Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
420 425 430
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
435 440 445
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly
450 455 460
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485 490 495
Ser Ser Ser Val Ser His Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
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Ala Pro Arg Leu Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val
515 520 525
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
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565 570 575
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
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595 600 605
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Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
625 630 635 640
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660 665 670
Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
675 680 685
<210> 103
<211> 686
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗cMet环状融合多肽 VH-out-扣-CH-CL-变换的
<400> 103
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ala Tyr
20 25 30
Phe Ile Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Arg Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Asn Thr Phe Tyr Asp Gln Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
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180 185 190
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
195 200 205
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys
225 230 235 240
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
245 250 255
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
260 265 270
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
275 280 285
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
290 295 300
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
305 310 315 320
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
325 330 335
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
340 345 350
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr
355 360 365
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser
370 375 380
Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
385 390 395 400
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
405 410 415
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
420 425 430
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
435 440 445
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
450 455 460
Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr
465 470 475 480
Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu
485 490 495
Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser His Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln
500 505 510
Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Leu
515 520 525
Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp
530 535 540
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr
545 550 555 560
Phe Cys His Gln Arg Thr Asn Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr
565 570 575
Lys Leu Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
580 585 590
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
595 600 605
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
610 615 620
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
625 630 635 640
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
645 650 655
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
660 665 670
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
675 680 685
<210> 104
<211> 683
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗cMet环状融合多肽 VH-out-扣-VH-VL-变换的
<400> 104
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser His Leu
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys His Gln Arg Thr Asn Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr Lys
100 105 110
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
115 120 125
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
130 135 140
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
145 150 155 160
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
165 170 175
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
180 185 190
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
195 200 205
Lys Ser Cys Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu
450 455 460
Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile
465 470 475 480
Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ala Tyr Phe Ile Asn Trp
485 490 495
Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Tyr
500 505 510
Pro Tyr Asn Gly Asn Thr Phe Tyr Asp Gln Ser Phe Gln Gly Gln Val
515 520 525
Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser
530 535 540
Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Asp
545 550 555 560
Tyr Asn Tyr Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
565 570 575
Ser Ala Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
580 585 590
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
595 600 605
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
610 615 620
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
625 630 635 640
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
645 650 655
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
660 665 670
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
675 680
<210> 105
<211> 120
<212> PRT
<213> 智人
<400> 105
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
115 120
Claims (6)
1.二聚融合多肽，其包含
特异性结合靶标的第一融合多肽，所述第一融合多肽包含结合结构域的第一部分、结合结构域的第二部分和间隔结构域，其中
-间隔结构域是多肽并包含至少25个氨基酸残基，
-结合结构域的第一部分是直接或者是通过第一肽接头融合至间隔结构域的N端的多肽，
-结合结构域的第二部分是直接或者是通过第二肽接头融合至间隔结构域的C端的多肽，
-相同单链融合多肽的结合结构域的第一部分和结合结构域的第二部分缔合并形成特异性结合该靶标的功能性结合位点；和
特异性结合靶标的第二融合多肽，所述第二融合多肽包含结合结构域的第一部分、结合结构域的第二部分和间隔结构域，其中
-间隔结构域是多肽并包含至少25个氨基酸残基，
-结合结构域的第一部分是直接或者是通过第一接头融合至间隔结构域的N端的多肽，
-结合结构域的第二部分是直接或者是通过第二接头融合至间隔结构域的C端的多肽，
-相同单链融合多肽的结合结构域的第一部分和结合结构域的第二部分缔合并形成特异性结合该靶标的功能性结合位点，
其中第一和第二融合多肽相同或不同，并且其中第一融合多肽的间隔结构域共价缀合到第二融合多肽的间隔结构域，
其中所述间隔结构域是抗体Fc区；
其中所述结合结构域的第一部分是抗体重链Fab片段，和所述结合结构域的第二部分是抗体轻链Fab片段，或反之亦然。
2.根据权利要求1所述的二聚融合多肽，其中所述结合结构域的第一部分和所述结合结构域的第二部分通过二硫键彼此共价缔合。
3.分离的核酸对，其一起编码权利要求1或2所述的二聚融合多肽。
4.一种宿主细胞，其包含权利要求3所述的核酸对。
5.一种产生融合多肽的方法，其包括培养权利要求4所述的宿主细胞从而产生融合多肽或二聚融合多肽，和从细胞或培养基中回收融合多肽或二聚融合多肽。
6.一种药物制剂，其包含根据权利要求1或2所述的二聚融合多肽和可药用载体。
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