CN108697692A - 用于增强对于接种疫苗的免疫应答的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

描述了组合物和方法，其中toll样受体7激动剂或toll样受体9激动剂在皮下接种疫苗部位处或其附近的外用施加提供了对接种疫苗的增强应答。增强应答可以是相对于未治疗的但是接种疫苗的对象的提升的抗体效价，和/或对不存在于接种疫苗组合物中的种类发展跨种免疫。

Description

用于增强对于接种疫苗的免疫应答的方法和组合物

本申请要求了2015年7月17日提交的美国临时专利申请号62/194,136的权益。该引用的外部资料和所有其它引用的外部资料通过引用以其全部被并入本文。在通过引用被并入的参考文献中的术语的定义或用途与本文提供的那个术语的定义不一致或相反时，本文提供的那个术语的定义被认为是适用的。

技术领域

本发明的领域是与疫苗制剂具体地流感疫苗制剂一起使用的佐剂。

背景技术

背景描述包括可以有助于理解本发明的信息。这不是承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明相关，或者任何具体地或隐含地引用的出版物是现有技术。

流感对我们的健康服务造成沉重负担(1,2)，在老年人、非常年幼的儿童和患有慢性病的人中造成显著的发病率和死亡率。季节性、动物传染性和大流行性流感是恒定的全球威胁。世界卫生组织估算季节性流感每年在全世界造成250,000-500,000例死亡。最近，抗原性漂移的甲型/瑞士/9715293/2013病毒在欧洲和北美洲的多个国家造成了大爆发(关于漂移的甲型流感(H3N2)病毒传播的潜能的CDC卫生忠告(CDC Health Advisoryregarding the potential for circulation of drifted influenza A(H3N2)viruses)(2015年5月11日在http://emergency.cdc.gov/HAN/han00374.asp下访问)；SkowronskiDM,Drews SJ,Fonseca K,Charest H,Chambers C,Sabaiduc S,et al.Interim estimatesof 2014/5 vaccine effectiveness against influenza A(H3N2)from Canada’ssentinel physician surveillance network.Euro Surveill 2015；20.Pi:21022)。从2014年10月1日到11月22日在美国收集的甲型流感(H3N2)病毒的病毒学监视显示了这些分离株的52％是自甲型/德克萨斯州/50/2012(H3N2)疫苗病毒抗原性漂移的(4)。本文中的所有出版物通过引用被并入，程度如同每个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地指出通过引用被并入。在并入的参考文献中的术语的定义或用途与本文提供的那个术语的定义不一致或相反时，本文提供的那个术语的定义适用并且在参考文献中的那个术语的定义不适用。而且，禽流感病毒比如甲型(H5N1)和最近的甲型(H7N9)——其从它们的起源区域的传播通过空中旅行加速——通常与和传统季节性流感相比高得多的死亡率相关联。因此，大大提前于实际爆发，基于可能的致病毒株预测制作的免疫制剂的保护潜力必然地被限制。

解决该问题的一种途径是增加接种疫苗制剂的复杂性。例如，引起季节性爆发的乙型流感山形(Influenza B Yamagata)和维多利亚毒株(Victoria strain)的共同传播导致需要常规使用四价流感疫苗。但是，这样的途径进一步使季节性流感疫苗的生产复杂化并且没有解决来自预测毒株的遗传性漂移和新流感毒株的意外引入的根本问题。

已经发现咪喹莫特(imiquimod)——一种可用于治疗DNA病毒感染的合成toll样受体7(TLR7)激动剂——在实验动物模型中提高流感疫苗免疫原性的某些方面(ThomsenLL,Topley P,Daly MG,Brett SJ,Tite JP.Imiquimod and resiquimod in a mousemodel:adjuvants for DNA vaccination by particle-mediated immunotherapeuticdelivery.Vaccine.2004；22:1799-809；Zuber AK,A,G,Zuber B,Ljungberg K,Fredriksson M,et al.Topical delivery of imiquimod to a mousemodel as a novel adjuvant for human immunodeficiency virus(HIV)DNA.Vaccine.2004；22:1791-8；Weldon WC,Zarnitsyn VG,Esser ES,Taherbhai MT,Koutsonanos DG,Vassilieva EV,et al.Effect of adjuvants on responses to skinimmunization by microneedles coated with influenza subunit vaccine.PLoSOne.2012；7:e41501；Zhang AJ,Li C,To KK,Zhu HS,Lee AC,Li CG,et al.Toll-likereceptor 7 agonist imiquimod in combination with influenza vaccine expeditesand augments humoral immune responses against influenza A(HlNl)pdm09virusinfection in BALB/c mice.Clin Vaccine Immunol.2014；21:570-9)。例如，在皮肤内三价流感疫苗之前利用外用咪喹莫特的治疗在患有慢性病的老年对象中加快、增大和延长针对免疫流感疫苗株的免疫原性(Hung IF,Zhang AJ,To KK,Chan JF,Li C,Zhu HS,etal.Immunogenicity of intradermal trivalent influenza vaccine with topicalimiquimod:a double blind randomized controlled trial.Clin Infect Dis 2014；59:1246-55)。类似研究已经注意到对于接种疫苗种类免疫应答的强化，其作为外用TLR7激动剂咪喹莫特在人和动物模型二者中的作用。诱导的免疫是迅速的并且可以在免疫衰老的老年对象中持续超过一年时期。还已经发现，当与单独的疫苗相比时，咪喹莫特辅助的(即混合和注射有疫苗制剂)疫苗引起针对免疫种类的较高水平的IgG2a抗体、HI效价和IFN-γ细胞应答。咪喹莫特作为佐剂与DNA疫苗的同时皮下施用在小鼠模型中还增强了针对注射的抗原的树突细胞和Thl淋巴细胞应答(Thomsen LL,Topley P,Daly MG,Brett SJ,TiteJP.Imiquimod and resiquimod in a mouse model:adjuvants for DNA vaccination byparticle-mediated immunotherapeutic delivery.Vaccine.2004；22:1799-809；ZuberAK,A,G,Zuber B,Ljungberg K,Fredriksson M,et al.Topicaldelivery of imiquimod to a mouse model as a novel adjuvant for humanimmunodeficiency virus(HIV)DNA.Vaccine.2004；22:1791-8)。但是，针对接种疫苗种类的增加的应答没有解决由抗原性漂移或者新流感病毒株的引入引起的问题，这些新流感病毒不存在于对群体的接种疫苗制剂中。

已经研究了其它策略来通过靶向相对保守的血凝素茎部(stem)、M2和核蛋白，或通过改变病毒载体的递送模式提高流感疫苗的免疫原性和宽度。最近，自组装合成纳米颗粒疫苗的发展也被发现提高流感病毒免疫的效能和宽度(Kanekiyo M,Wei CJ,YassineHM,McTamney PM,Boyington JC,Whittle JR,et al.Self-assembling influenzananoparticle vaccines elicit broadly neutralizing HlNl antibodies.Nature2013；499:102-6)。然而，这些策略仍然局限于细胞系或动物研究的阶段。包括MF59或AS03在内的佐剂的使用已经证明了具有提高的免疫原性的抗原节约效应。不幸地，频繁的局部不良事件限制了其实用性(Montana M,Verhaeghe P,Ducros C,Terme T,Vanelle P,Rathelot P.Safety review:squalene and thimerosal in vaccines.Therapie 2010；65:533-41；Black S,Della Cioppa G,Malfroot A,Nacci P,Nicolay U,Pellegrini M,etal.Safety of MF59-adjuvanted versus non-adjuvanted influenza vaccines inchildren and adolescents:an integrated analysis.Vaccine 2010；28:7331-6)。此外，剂量节约效应在个体——在它们的生命早期已经利用抗原相关的病毒或疫苗致敏的(primed)——中是较不显著的。因此，在皮肤内流感疫苗接种之前施加外用咪喹莫特预处理是提高和拓宽流感疫苗免疫原性的最简单的和现成的策略。还已经注意到，当与重组流感病毒血凝素一起被共同注射时，合成TLR4和TLR7配体的组合可以充当佐剂，并且可以刺激小鼠中的Thl和Th2型免疫应答二者，从而提供针对抗原性漂移的流感病毒的宽的中和抗体(18)。但是，尚不清楚这些途径在广泛的免疫工作之中效果如何。

因此，对于简单的、有效的和良好耐受的组合物和方法仍存在需要，这些组合物和方法为疫苗制剂提供了增强的免疫应答和/或拓宽范围的有效应答。

发明内容

本发明主题提供了组合物和方法，其增强治疗对象对接种疫苗组合物的免疫应答。这通过将包括toll样受体7激动剂的外用制品施加至经皮接种疫苗被施加的区域周围的皮肤实现。增强的免疫应答包括：(1)相对于在不施加外用制品的情况下通过施用疫苗产生的抗体效价的提高的抗体效价，和(2)对不存在于接种疫苗组合物中的种类生成有效的免疫应答。

本发明构思的一个实施方式是通过在接种疫苗时或就在接种疫苗之前施加外用制剂至接种疫苗部位提高对接种疫苗的免疫应答的方法，其中外用制剂包括toll样受体7激动剂和/或toll样受体9激动剂。在这样的方法中，也在接种疫苗部位处施加疫苗(其包括接种疫苗种类，比如三价流感疫苗、多价流感疫苗和/或冠状病毒疫苗)。可以在施加外用制品和/或施用疫苗之后向治疗区域施加屏障。在一些实施方式中，在施用疫苗的5分钟内施加外用制品。在施加疫苗的一段时间(例如，1至6小时)之后，去除外用制剂。外用制剂被选择以提供toll样受体7激动剂和/或toll样受体9激动剂，其量足以提供针对不存在于疫苗中的非接种疫苗种类的有效保护，和/或为接种疫苗种类提供提高的抗体效价——相对于没有外用制剂的情况下在接种疫苗时生成的抗体效价。在一些实施方式中，接种疫苗种类包括流感病毒和/或冠状病毒。在一些实施方式中，非接种疫苗种类包括与在接种疫苗种类中呈现的流感病毒/冠状病毒不同的流感病毒和/或不同的冠状病毒。在优选的实施方式中，toll样受体7激动剂包括咪喹莫特。在一些实施方式中，外用制剂被配制以提供在大约2mg和大约20mg之间的toll样受体激动剂至皮肤。在一些实施方式中，外用制剂被提供为toll样受体7激动剂和/或toll样受体9激动剂的纳米乳液。在仍其它实施方式中，外用制剂被供应为施加设备的一部分。

发明构思的另一个实施方式是toll样受体7激动剂和/或toll样受体9激动剂在制备提供对疫苗(例如，三价流感疫苗、多价流感疫苗和/或冠状病毒疫苗)的增强应答的外用制剂中的用途。增强的应答包括对不存在于疫苗中的种类发展保护性免疫应答，该疫苗被用于免疫利用外用制剂治疗的接种疫苗的对象。这样的疫苗可以包括流感病毒和/或冠状病毒，在这种情况下对不同流感病毒和/或冠状病毒引起保护性免疫应答。在一些实施方式中，这样的增强免疫应答包括对存在于疫苗中的种类发展提高的抗体效价——相对于在没有利用外用制剂治疗的接种疫苗的对象中实现的接种疫苗应答。在优选的实施方式中，toll样受体7激动剂是咪喹莫特。在一些实施方式中，外用制剂被配制以在施加时提供在大约2mg和大约20mg之间的toll样受体7激动剂和/或toll样受体9激动剂。在仍其它实施方式中，外用制剂被提供为器械的一部分。

本发明构思的另一个实施方式是toll样受体7激动剂和/或toll样受体9激动剂在制备提供对疫苗(例如，三价流感疫苗、多价流感疫苗和/或冠状病毒疫苗)的增强应答的试剂盒中的用途。增强应答包括对不存在于疫苗中的种类发展保护性免疫应答，该疫苗被用于免疫利用外用制剂治疗的接种疫苗的对象。这样的疫苗可以包括流感病毒和/或冠状病毒，在这种情况下对不同流感病毒和/或冠状病毒引起保护性免疫应答。在一些实施方式中，这样的增强免疫应答包括对存在于疫苗中的种类发展提高的抗体效价——相对于在没有利用外用制剂治疗的接种疫苗的对象中实现的接种疫苗应答。在优选的实施方式中，toll样受体7激动剂是咪喹莫特。在一些实施方式中，外用制剂被配制以在施加时提供在大约2mg和大约20mg之间的toll样受体7激动剂和/或toll样受体9激动剂。在仍其它实施方式中，外用制剂被提供为器械的一部分，例如粘附至皮肤的器械。在一些实施方式中，试剂盒可以包括屏障、膜和/或微针设备。

具体实施方式

下列描述包括可以用于理解本发明的信息。这不是承认本文提供的任何信息是现有技术或者与当前要求保护的发明相关，或者具体地或隐含地引用的任何出版物是现有技术。

发明主题提供了组合物和方法，其中包含toll样受体7激动剂和/或toll样受体7激动剂的组合物在接种疫苗的时间或就在接种疫苗的时间之前被外用地施加在病毒疫苗注射部位处或其附近。所得到的对接种疫苗的免疫应答在提供对接种疫苗病毒种类的较高效价免疫应答(相对于在不存在外用施加的组合物的情况下观察到的应答)和在提供对在免疫组合物中没有发现的病毒株的有效免疫应答二者中增强。适合的病毒种类包括流感和/或冠状病毒种类。根据各个示例性和优选的实施方式的下列详细描述，本发明主题的各个目标、特征、方面和优势将变得更明显。

应当理解，公开的技术提供了许多有利的技术效果，其包括在不需要再配制疫苗的情况下提高由病毒接种疫苗制品给予的保护效力和宽度。

下列讨论提供了本发明主题的许多实例实施方式。虽然每个实施方式代表发明要素的单个组合，但是考虑本发明主题包括公开要素的所有可能的组合。因而，如果一个实施方式包括要素A、B和C，并且第二实施方式包括要素B和D，则考虑本发明主题也包括A、B、C或D的其它剩余组合，即使没有被明确地公开。

如在本文说明书中和遍及所附权利要求书所使用的，“一个(a,an)”和“该(the)”的含义包括复数指代对象，除非上下文另外明确地指示。而且，如在本文说明书中所使用的，“在……中”的含义包括“在……中”和“在……上”，除非上下文另外明确地指示。

本文中值的范围的叙述仅仅意欲用作单独地提及落入该范围内的每个单独值的速记方法。除非在本文中另外指示，每个单独值被并入说明书，如同其在本文中被单独叙述。本文描述的所有方法可以以任何适合的顺序进行，除非在本文中另外指出或者上下文另外明确地矛盾。关于本文中的某些实施方式提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“比如”)的使用仅仅意欲更好地阐明本发明并且不对另外要求保护的发明的范围施加限制。说明书中的语言都不应当被解释为指示对于实践本发明必不可少的任何非要求保护的要素。

在一些实施方式中，用于描述和要求保护本发明的某些实施方式的表达成分，特征比如浓度、反应条件等的数量的数字将被理解为在一些情况下被术语“大约”修饰。因此，在一些实施方式中，在撰写的说明书和所附权利要求书中陈述的数值参数是近似值，其可以根据由具体实施方式要求获得的期望特征而改变。在一些实施方式中，数值参数应当根据报道的有效数字的数目和通过应用普通的四舍五入技术来解释。尽管陈述本发明的一些实施方式的宽范围的数值范围和参数是近似值，但是在具体实例中陈述的数值尽可能精确地被报道。在本发明的一些实施方式中呈现的数值可以包含必然地源自在它们的各自试验测量中发现的标准偏差的某些误差。

本发明人已经发现了toll样受体7激动剂(比如咪喹莫特)和/或toll样受体9激动剂可以被外用地施加(例如，作为药膏)以提供对病毒疫苗制品的增强的免疫应答。在优选的实施方式中，疫苗制品包括与季节性流感种类/毒株(例如，单价、二价、三价和/或多价流感疫苗)和/或冠状病毒对应的病毒抗原。增强的免疫应答可以在接种疫苗的时间、就在接种疫苗之前或之后在施加toll样受体7激动剂和/或toll样受体9激动剂时被观察到。例如，本发明构思的toll样受体7激动剂和/或toll样受体9激动剂组合物可以在接种疫苗之前小于或等于1小时、小于或等于30分钟、小于或等于20分钟、小于或等于10分钟、小于或等于5分钟、小于或等于2分钟、或小于或等于1分钟被施加至接种疫苗注射部位处和/或其周围的皮肤的表面。类似地，在其它实施方式中，toll样受体激动剂组合物可以在接种疫苗之后1小时、小于或等于30分钟、小于或等于20分钟、小于或等于10分钟、小于或等于5分钟、小于或等于2分钟、或小于或等于1分钟被施加。在施加和/或接种疫苗之后，toll样受体7激动剂和/或toll样受体9激动剂组合物可以保留在皮肤表面上适当位置持续一段时间。例如，toll样受体7激动剂和/或toll样受体9激动剂组合物可以在接种疫苗之后保留在适当位置持续至少15分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少6小时、至少12小时、至少16小时、或至少24小时或更多。在一些实施方式中，利用包含toll样受体7激动剂和/或toll样受体9激动剂的组合物治疗的皮肤的区域在该接种疫苗后时期期间被屏障比如屏障膜或绷带保护。

接种疫苗可以通过任何适合的方法执行。适合的方法包括皮下或皮内注射、肌肉内注射和微针接种疫苗。这样的微针接种疫苗可以使用微针设备或者通过使用微针贴片实施。类似地，可以使用破坏皮肤的角质层的方法——包括胶带剥离和使用激光和/或超声能量的破坏——经皮实施免疫。

在本发明构思的实施方式中，包括toll样受体7激动剂和/或toll样受体9激动剂的外用制品可以施加至接种疫苗部位处的区域或其附近。在本发明构思的一些实施方式中，这样的外用制品可以被施加至包围接种疫苗部位的大约1cm²的区域。在其它实施方式中，使用外用制品治疗的区域可以是接种疫苗部位周围的大约4cm²、9cm²、16cm²或更多。在本发明构思的实施方式中，利用外用制品治疗的区域至少部分地与接种疫苗部位重叠。在优选的实施方式中，接种疫苗部位可以近似地位于外用治疗区域的中心。

本发明构思的一些实施方式包括施用器或施加设备，其可以帮助保健服务提供者恰当的利用这样的外用制品。这样的设备可以在将外用制品施加至皮肤表面之后利用。在其它实施方式中，这样的设备可以与将外用制品施加至皮肤表面同时被应用。在这类实施方式中，外用制品可以包含在施加设备中和/或形成施加设备的一部分。适合的施加设备可以包括屏障(比如屏障膜)，其可以阻止施加的外用制品从皮肤表面转移。这样的屏障膜可以通过任何适合的方式被固定至皮肤表面，例如粘合剂、弹性绷带或来自衣服的压力。可选地，在一些实施方式中，外用制品可以被配制以提供这样的屏障膜的粘附。例如，外用制品的媒介的成分可以被选择以提供足够的牵引力和/或附着力以至少瞬时地固定屏障膜至治疗的皮肤表面(例如，通过提供湿润的、胶粘的和/或凝胶状的表面纹理)。在本发明构思的一些实施方式中，这样的试剂盒可以包括型板或在其上将施加外用制品的区域的类似代表。这样的型板可以包括期望的接种疫苗部位的指示，并且在一些实施方式中可以至少瞬时地粘附至皮肤表面。

本发明构思的另一实施方式是用于利用包括toll样受体7激动剂和/或toll样受体9激动剂的外用制品的试剂盒。这样的试剂盒可以被用于增强患者对接种疫苗的应答。这样的试剂盒可以包括外用制品和如上面所描述的施加设备，所述外用制品包括在药学上可接受的介质中的toll样受体7激动剂和/或toll样受体9激动剂。在一些实施方式中，这样的试剂盒可以包括使用说明书。这样的说明书可以包括用于相对于递送疫苗至患者为施加外用制品定时的指令、外用制品将保留在治疗的皮肤表面上适当位置的时间、用于从皮肤表面去除外用制品的说明和/或用于护理(aftercare)接种疫苗和/或治疗部位的说明。

适合的toll样受体7激动剂包括咪喹莫特、CL075、CL097、CL264、CL307、gardiquimod^TM、洛索立宾和R848。适合的toll样受体9激动剂包括agatolimod、MGN1703、CPG7909、PF-3512676、ISS 1018、IMO-2055和CpG-28。包含这样的toll样受体7激动剂和/或toll样受体9激动剂的外用可施加的组合物可以包括药学上可接受的媒介，并且可以被配制为喷剂、洗剂、药膏、凝胶、乳液、微乳液、纳米乳液或其它适合的溶液和/或悬浮液。这样的外用制剂可以被配制以在施加制剂时提供从大约0.1mg、1mg、2.5mg、5mg、7.5mg、10mg、12.5mg、15mg、20mg或更多的toll样受体7激动剂和/或toll样受体9激动剂至个体。任选地，这样的外用制剂可以包括指示剂，例如染料，以提供皮肤的区域已经被治疗的可视指示。在一些实施方式中，toll样受体7激动剂和/或toll样受体9激动剂组合物被提供为粘附至皮肤表面的贴片的一部分，并且其施加toll样受体7激动剂和/或toll样受体9激动剂至皮肤同时另外地提供屏障膜。这样的贴片可以被配制以允许在施加之后通过贴片的材料的接种疫苗。在一些实施方式中，外用制剂包括toll样受体7激动剂和/或toll样受体9激动剂的纳米乳液，其可以相对于传统悬浮液、溶液和/或乳液加速toll样受体7激动剂和/或toll样受体9激动剂的吸收。在其它实施方式中，外用制剂利用微针(例如微针阵列或贴片)施加。

应当理解，可以通过使用外用施加的toll样受体7激动剂和/或toll样受体9激动剂生成两种独特且不同形式的增强的接种疫苗应答。在增强的接种疫苗应答的一种形式中，对于免疫种类或病毒株的可量化的免疫应答(例如，抗体效价)在接种疫苗部位处接受利用toll样受体7激动剂和/或toll样受体9激动剂的外用治疗的个体或群体中增强(即提高)——相对于不接受这种外用治疗的等同的接种疫苗的对照(例如接受相同接种疫苗)。例如，与从通过相同施用途径接受相同疫苗但是缺少外用治疗的对照个体或群体观察到的GMT相比，在接种疫苗部位或其附近接受利用toll样受体7激动剂和/或toll样受体9激动剂的外用治疗的个体或群体可以具有对于接种疫苗流感种类或毒株的1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、10倍或更高的GMT(几何平均效价)。

增强的接种疫苗应答的另一种形式可以是对疫苗制剂中不存在的病毒种类或毒株诱导功能性免疫，该疫苗制剂用于对在接种疫苗部位或其附近接受利用toll样受体7激动剂和/或toll样受体9激动剂的外用治疗的个体接种疫苗(即交叉保护)。例如，在接种疫苗部位或其附近接受利用toll样受体7激动剂和/或toll样受体9激动剂的外用治疗的个体或群体可以发展对不形成接种疫苗混合物一部分的流感种类或毒株的有效免疫应答(例如，抗体效价)，而对非接种疫苗种类或毒株的这样的保护性应答从通过相同施用途径接受相同疫苗但是缺少外用治疗的对照个体或群体没有观察到。在一些实施方式中，产生两种类型的增强的接种疫苗应答。

方法

在双盲、随机对照试验中，在2014年初，年龄为18-30岁的健康志愿者接受2013-14北半球冬季三价流感疫苗(TIV)。将合格的对象随机分配(1:1:1:1)为4个组：外用咪喹莫特药膏接着皮肤内TIV(IQ)、外用水性乳膏接着皮肤内TIV(ID)、外用水性乳膏接着肌肉内TIV(IM)和外用咪喹莫特药膏接着皮肤内生理盐水注射(NS)。志愿者和调查员对于施加的外用治疗的类型不知情。测量血凝抑制(HI)和中和抗体效价(NT)。主要结果是第7天的血清转化率。其它结果包括在第7天和21天时针对疫苗和非疫苗株(包括甲型/瑞士/9715293/2013样病毒，其在2014年末出现)的血清保护率和GMT倍数增加。

研究设计和干预

在包含时间，获得参与者的人口数据。进行无分层的简单随机化。将参与者随机地分为4个组，试验组(IQ)和三个对照组(分别地ID、IM和NS)。由研究护士在所有参与者右臂的三角肌区域标记16cm²的正方形。在IQ和NS组中，在接种疫苗前5分钟，研究护士将施加一囊剂含量的Aldara^TM(5％，在250mg乳膏中的12.5mg的咪喹莫特)至皮肤上的标记区域。在ID和IM组中，由研究护士施加没有作用的水性乳膏BP^TM(AFT药物，新西兰)代替Aldara^TM。IQ和ID组中的参与者接受单一剂量的0.1mL皮肤内流感三价疫苗(15μg血凝素[HA]/株)。在IM组中，参与者接受单一剂量的0.5mL肌肉内流感疫苗(15μg血凝素/株)。在NS组中，参与者接受单一剂量的0.1mL生理盐水作为假疫苗。在乳膏被吸收并且通过70％酒精棉球进行皮肤消毒之后，在标记区域的中心注射疫苗。在接种疫苗之后6小时通过利用自来水洗涤由参与者去除药膏(Aldara^TM或水性乳膏BP)。

为了维持盲选，所有参与者被分配序号，并且随机化列表连接4个研究组的每个序号，不同在于递送途径和施加的预处理药膏的类型。只有研究护士了解施加的外用治疗类型。参与者和调查员二者保持对施加的外用治疗类型不知情，直到研究完成。在接种疫苗期间，递送途径对于参与者是知情的。

流感疫苗

由Sanofi-Pasteur MSD^TM制造使用的皮肤内Intanza^TM15(Sanofi-Pasteur,Lyon,France)和肌肉内Vaxigrip^TM(Sanofi-Pasteur,Lyon,France)流感疫苗二者。两种疫苗都被灭活，无佐剂的(non-adjuvanted)疫苗被配制以包含15μg的甲型流感/加利福尼亚/07/2009(H1N1)样病毒、甲型流感/维多利亚/361/2011(H3N2)样病毒和乙型流感/马萨诸塞州/2/2012样病毒(乙型/山形谱系)的HA。皮肤内注射设备——BD Soluvia^TM微注射系统，由预填充的三价流感疫苗组成，其中单一1.5mm针垂直地穿透至皮肤。BD Soluvia^TM是当前被批准用于流感疫苗的仅有的预填充皮肤内设备。

通过首先要求对象在临床前提下保持30分钟进行免疫后观察来评估安全性。出院之前填写即时不良事件清单，这覆盖严重过敏反应的时段。此外，给予对象日记簿以记录在接种疫苗后的前7天内呈现的局部和全身不良事件的症状。全身症状包括发烧(体温≥37.5℃)、头痛、不适、肌痛、关节痛和严重的不良事件，和局部症状包括发红、肿胀、硬结、瘀斑和疼痛被记录为征集事件(solicited event)。发红、肿胀、硬结和瘀斑基于大小分级：1级<20mm和2级>20mm。疼痛相应地分级：1级是触摸疼痛并且2级是胳膊移动时疼痛。在接种疫苗后21天的随访时收集日记簿。

免疫原性测量

在接种疫苗后基线(baseline)、7天和21天，从参与者取血用于抗体分析。使用血凝素-抑制(HI)分析用于疫苗株，并且通过HI和中和抗体(NT)分析二者用于非疫苗株，根据标准方法，测量血清抗体效价。欧洲药品评价局(European Medicines EvaluationAgency)的专卖医药产品委员会(Committee for Proprietary Medicinal Products)(CPMP)指南被用于HI分析的免疫原性测量。年龄在18和60岁之间的成年对象中满意的(即有效的)抗体应答基于下列指示要求中的至少一种：1)>70％实现≥40的HI效价(血清保护率)或2)几何平均效价(GMT)倍数增加>2.5倍或3)>40％实现抗体效价(血清转化率)的4倍上升。对于NT分析，比较4个组中的四种非疫苗株的GMT。

主要结果测量是第7天时通过HI分析的血清转化率。次要结果测量包括在接种疫苗后第7和21天的通过HI分析的GMT、GMT倍数增加和血清保护率以及通过NT分析的GMT。也比较4个组之间的从第7和21天通过HI分析的血清转化率和接种疫苗后的不良事件。

此外，为了评估在TIV接种疫苗之前通过咪喹莫特预处理对四种非疫苗流感毒株：甲型/HK/485197/14(H3N2瑞士谱系)、甲型/HK/408027/09(大流行前(prepandemic)季节性H1N1)、甲型/WSN/33(H1N1)、乙型/HK/418078/11(维多利亚谱系)的交叉保护作用，针对这些病毒株的通过HI和NT分析的血清保护、血清转化和GMT倍数增加在接种疫苗后第7和21天时测量。

血凝素-抑制分析

使用参考抗原和如上面所陈述的四种非疫苗株测试成对血清样品(接种疫苗前和后)的血凝素-抑制(HI)抗体，该参考抗原包括三种疫苗株：甲型/加利福尼亚/07/2009(H1N1)样病毒、甲型流感/维多利亚/361/2011(H3N2)样病毒和乙型流感/马萨诸塞州/2/2012-样病毒(乙型/山形谱系)。在除去血清中的非特异性抑制剂之后通过标准微滴定技术执行HI抗体分析，该去除通过对于甲型(H1N1)抗体测试利用火鸡红细胞预吸收或者对于甲型(H3N2)&B抗体测试利用豚鼠红细胞预吸收，并且接着在37℃下培育过夜之后受体破坏酶(RDE)(1:3)，然后在56℃下热灭活持续30分钟。平行测试来自每个对象的所有血清样品中的每个的测试抗原。使用0.5％火鸡或0.75％豚鼠红细胞针对4血凝素单位的参考抗原，滴定从1:10的RDE治疗的血清的连续两倍稀释液。

中和抗体分析

在接种有Madin Darby犬肾细胞的96孔微孔板中进行中和抗体分析(NT)。通过接种100TCID₅₀的甲型/HK/485197/14(H3N2瑞士谱系)、甲型/HK/408027/09(大流行前季节性H1N1)、甲型/WSN/33(H1N1)、乙型/HK/418078/11(维多利亚谱系)病毒一式两份测试成对血清(接种疫苗前和后)的两倍连续稀释液。含有血清但是没有病毒接种的相应组的细胞对照被用作对照。在接种后72小时，对细胞的细胞病变效应(CPE)的抑制进行评分。中和抗体的效价被限定为血清的最大稀释，在该稀释下CPE的百分数小于或等于50％。

统计学分析

基于对患有慢性病的老年患者的先前皮肤内流感接种疫苗研究(12)，测定该研究的样品大小。IQ组的血清转化率呈现为优于对照IM组，并且通过皮肤内和肌肉内季节性流感接种疫苗的甲型(H1N1)毒株的血清转化率分别为35％和20％。利用80％的幂(power)和5％的双边1型误差，每种治疗组群(treatment arm)将需要40名参与者，其还允许5％的随访率损失。ANOVA被用于比较四个不同组中的人口参数和免疫原性。IBM SPSS Statistics20.0^TM被用于统计学计算。P值<0.05被视为呈现显著差异。

结果

登记总计160名对象并完成研究。在4个组中随机平分四十名对象。所有招募的对象是没有任何既往病史的健康志愿者并且没有服用任何定期服药。所有招募对象在过去的5年中均未接受流感接种疫苗。中值年龄为20岁(四分位数范围19-21岁)并且50％的招募对象是男性。在四个组之间不存在年龄(p＝0.875)和性别(p＝0.5)的差异。

安全性

没有与接种疫苗相关的严重不良事件被报道(参见表1)。局部或全身不良事件的发生是罕见的和自限制的。虽然1级发红或肿胀在IQ和ID组中更通常地被发现，但是在四个组中不存在差异。没有对象具有可见的从注射部位的疫苗渗漏。

IQ：咪喹莫特药膏+皮肤内疫苗；ID：水性乳膏+皮肤内疫苗；IM：水性乳膏+肌肉内疫苗；

NS：咪喹莫特药膏+皮肤内生理盐水疫苗

发烧：体温≥37.5℃，发红、肿胀、硬结和瘀斑基于大小分级：1级，<20mm；2级，20-50mm

如下对疼痛进行分级：1级，触摸疼痛；2级，胳膊被移动时疼痛。NA：没有适用的。

表1

通过HI和NT分析的疫苗株的免疫原性

甲型/加利福尼亚/H1N1毒株的所有3种参数(血清保护、血清转化和GMT倍数增加)的第7和21天免疫原性测量被测定为在IQ组中比三个对照组中显著地更高(p<0.0001)。出人意料地，在IQ组中在第7和21天时针对甲型/加利福尼亚/H1N1毒株97.5％和100％分别实现了血清转化和血清保护；其中第7天时GMT 631[95％置信区间(C.I.)：441.4-902]和18倍的GMT倍数增加[95％C.I.：9.9-26.2]并且第14天时GMT 687.9[95％C.I.：476-994]和19.8倍的GMT倍数增加[95％C.I.：11.4-28.3](参见表2)。对于甲型/维多利亚/H3N2(其具有相对低的免疫原性)和乙型/马萨诸塞州毒株二者的第7和21天血清转化率和GMT倍数增加在IQ中也显著地高于三个对照(p<0.0001)。对于NT分析(参见表4)发现了类似结果，当与3个对照：甲型/加利福尼亚/H1N1毒株[248.3(95％CI：132-465.6)；322.1(95％CI：176.6-568.1)]、甲型/维多利亚/H3N2毒株[140.6(95％CI：81.8-241)；201.8(95％CI：119.7-340.4)]和乙型/马萨诸塞州毒株[198.6(95％CI：133.7-294.4)；285.1(95％CI:193.2-420.7)]相比时，对于所有3种疫苗株在第7和21天时实现了显著更高的GMT(p<0.0001)。

IQ：咪喹莫特药膏+皮肤内疫苗；ID：水性乳膏+皮肤内疫苗；IM：水性乳膏+肌肉内疫苗；NS：咪喹莫特药膏+皮肤内生理盐水疫苗；GMT：几何平均效价；CPMP：专卖医药产品委员会；CPMP指南：疫苗中病毒株必需满足下列标准中的至少一种：GMT倍数增加>2.5，血清转化率>40％和血清保护率>70％。[显著的P值以粗体表示]

表2

交叉保护

出人意料地，通过在IQ组中对甲型/HK/4851970/14(H3N2瑞士谱系)、甲型/HK/408027/09(季节性H1N1)、甲型/WSN/33(H1N1)和乙型/HK/418078/11(维多利亚谱系)的HI(参见表3)和NT(参见表5)分析证明所有四种非疫苗株的有效交叉保护。通过HI分析，在IQ组中在第7天时针对甲型/HK/485197/14(H3N2瑞士谱系)70％和97.5％分别实现了血清转化和血清保护，其中在第7天时GMT 86.7(95％C.I.70.8-105.9)和4.8倍的GMT倍数增加[95％C.I.：3.7-5.9]。通过NT分析证明类似结果，其中在第7和21天时分别具有GMT 40(95％C.I.28.6-55.5)和GMT 42(95％C.I.30.1-58.3)，其中IQ组为仅有的实现根据CPMP指南的满意抗体应答的组。所有4种非疫苗株的所有三种参数(血清转化、血清保护和GMT倍数增加)的免疫原性测量值在IQ组中显著地高于三个对照(p<0.0001)。

IQ：咪喹莫特药膏+皮肤内疫苗；ID：水性乳膏+皮肤内疫苗；IM：水性乳膏+肌肉内疫苗；NS：咪喹莫特药膏+皮肤内生理盐水疫苗

GMT：几何平均效价；CPMP：专卖医药产品委员会；CPMP指南：疫苗中病毒株必需满足下列标准中的至少一种：GMT倍数增加>2.5，血清转化率>40％和血清保护率>70％。[显著的P值以粗体表示]

表3

IQ：咪喹莫特药膏+皮肤内疫苗；ID：水性乳膏+皮肤内疫苗；IM：水性乳膏+肌肉内疫苗；NS：咪喹莫特药膏+皮肤内生理盐水疫苗

表4

IQ:咪喹莫特药膏+皮肤内疫苗；ID：水性乳膏+皮肤内疫苗；IM：水性乳膏+肌肉内疫苗；NS：咪喹莫特药膏+皮肤内生理盐水疫苗

表5

总的来说，在皮肤内流感接种疫苗之前的外用咪喹莫特预处理显著地加快并且增加疫苗株的免疫原性，其中在第7天时针对疫苗株的抗体增加至少10倍。发明人发现这样的处理可以通过提供重要的和显著的针对非疫苗流感毒株的交叉保护增加以其他方式常规配制的季节性流感接种疫苗的有效宽度，其中抗体效价增加至少大约4倍。这对于迄今不包含的抗原性漂移的流感毒株是尤其值得注意的，该流感毒株仅在WHO关于即将到来的季节的季节性流感疫苗的成分的推荐后之后出现。出人意料地，该新型途径也诱导针对83年以前分离的存档的原型甲型(H1N1)病毒的良好免疫，对于其将预期相当大的遗传性漂移。本发明构思的组合物和方法可以形成接种疫苗策略的一部分，其可以具有重要的全球健康护理影响并且应当通过降低年轻和老年对象二者中病假、门诊量、住院治疗和死亡率的季节性流感负担转化为更好的临床保护。针对由于遗传性漂移引起的迄今不包含的流感病毒，该途径在7天内生成足够高的GMT和血清转化率的能力可以提供高度灵活的、安全的和廉价的方式以在血清学上幼稚(serologically)的个体中诱导针对这些新出现的病毒的快速和持久免疫。

HI抗体分析结果还证明了疫苗株甲型/维多利亚/H3N2病毒与甲型(H1N1)和乙型流感疫苗病毒相比出现了较低的免疫原性。然而，对四种非疫苗株通过HI分析的GMT是类似的。也进行NT分析以确认在研究组中发现交叉保护。根据CPMP指南，利用外用咪喹莫特预处理的皮肤内接种疫苗是仅有的实现利用NT分析的满意抗体应答(≥40)的组。对照组都不能够实现足够高的血清保护GMT。利用外用咪喹莫特药膏然后假皮肤内生理盐水注射的第三对照组使得我们排除咪喹莫特预处理的可能免疫原性作用。

常规的季节性流感接种疫苗依赖针对病毒血凝素的球状头诱导中和抗体。抗体是短暂的并且每年的再接种疫苗对于维持中和抗体水平是必需的。不希望受到理论的束缚，发明人推测针对季节性抗原性漂移或大流行抗原性漂移的流感疫苗的宽度可以通过靶向高度保守的蛋白表位的新型疫苗发展或通过添加佐剂实现。两种途径将诱导交叉保护性体液应答。

对于本领域技术人员应当显而易见的是除了那些已经描述的之外的更多修改是可能的，而不背离本文的发明构思。因此，除了所附权利要求的精神之外，本发明主题将不被限制。而且，在解释说明书和权利要求书二者中，所有术语应当以与上下文一致的尽可能宽的方式解释。具体地，术语“包括(comprise,comprising)”应当被解释为指非排他方式的元件、成分或步骤，这表明提及的元件、成分或步骤可以与没有明确提及的其它元件、成分或步骤一起存在、利用或组合。在权利要求书提及选自A、B、C……和N的某事物中的至少一种时，文本应当被解释为要求保护选自该组的仅一个要素，而不是A+N，或B+N等。

Claims (27)

1.用于提高对接种疫苗的免疫应答的方法，其包括：

在接种疫苗时或就在接种疫苗之前施加外用制剂至接种疫苗部位，所述外用制剂包括toll样受体7激动剂或toll样受体9激动剂；

在所述接种疫苗部位引入疫苗，所述疫苗包括接种疫苗种类；和

在时间间隔之后从所述接种疫苗部位去除所述外用制剂，

其中所述外用制剂被选择以提供所述toll样受体7激动剂，其量足以针对不存在于所述疫苗中的非接种疫苗种类提供有效保护。

2.权利要求1所述的方法，其中所述toll样受体7激动剂包括咪喹莫特。

3.权利要求1或2所述的方法，其中所述接种疫苗种类包括第一流感病毒或第一冠状病毒并且所述非接种疫苗种类包括第二流感病毒或第二冠状病毒。

4.权利要求1-3中任一项所述的方法，进一步包括在所述接种疫苗部位之上施加屏障的步骤。

5.权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述时间间隔是1至6小时。

6.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述外用制剂在引入所述疫苗的5分钟内被施加。

7.权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述外用制剂在施加时提供2mg至20mg的所述toll样受体7激动剂或所述toll样受体9激动剂。

8.权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述外用制剂构成施加设备的一部分。

9.权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述外用制剂包括所述toll样受体7激动剂的纳米乳液。

10.权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述外用制剂被选择以提供所述toll样受体7激动剂或所述toll样受体9激动剂，其量足以相对于在没有所述外用制剂的情况下接种疫苗时生成的抗体效价，提供对所述接种疫苗种类的提高的抗体效价。

11.权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述疫苗包括三价流感疫苗、多价流感疫苗或冠状病毒疫苗。

12.包括toll样受体7激动剂或toll样受体9激动剂的外用制剂在提供对疫苗的增强应答的外用制剂中的用途，其中所述增强包括在利用所述外用制剂治疗的接种疫苗的对象中对不存在于所述疫苗中的种类发展保护性免疫应答。

13.权利要求12所述的用途，其中所述toll样受体7激动剂是咪喹莫特。

14.权利要求12或13所述的用途，其中所述疫苗包括第一流感病毒或第一冠状病毒。

15.权利要求14所述的用途，其中所述不存在于所述疫苗中的种类包括第二流感病毒或第二冠状病毒。

16.权利要求12-15中任一项所述的用途，其中所述外用制剂被配制以在施加时提供2mg至20mg之间的所述toll样受体7激动剂或所述toll样受体9激动剂。

17.权利要求12-16中任一项所述的用途，其中所述外用制剂被供给为器械的一部分。

18.权利要求12-17中任一项所述的用途，其中所述增强应答另外地包括相对于没有利用所述外用制剂治疗的接种疫苗的对象中实现的接种疫苗应答，对存在于所述疫苗中的种类的提高的抗体效价。

19.权利要求12-18中任一项所述的用途，其中所述疫苗包括三价流感疫苗、多价流感疫苗或冠状病毒疫苗。

20.Toll样受体7激动剂或toll样受体9激动剂在用于增强对疫苗的应答的试剂盒中的用途，其中所述试剂盒包括作为外用制剂的所述toll样受体7激动剂或所述toll样受体9激动剂，和配制为与所述外用制剂一起使用的施用器，其中所述增强包括在利用所述toll样受体7激动剂或所述toll样受体9激动剂治疗的接种疫苗的对象中针对不存在于所述疫苗中的种类发展保护性免疫应答。

21.权利要求20所述的用途，其中所述增强进一步包括对在利用所述toll样受体7激动剂治疗的所述接种疫苗的对象中存在的种类发展第一抗体效价，其中所述第一抗体效价指示相对于在不利用所述toll样受体7激动剂或所述toll样受体9激动剂治疗的接种疫苗的对象中的第二抗体效价的提高的应答。

22.权利要求20或21所述的用途，其中所述疫苗包括第一流感病毒或第一冠状病毒。

23.权利要求22所述的用途，其中不存在于所述疫苗中的所述种类包括第二流感病毒或第二冠状病毒。

24.权利要求20所述的用途，其中所述试剂盒进一步包括屏障、膜或微针设备。

25.权利要求20-24中任一项所述的用途，其中所述试剂盒，其中所述施用器是粘附至皮肤的器械。

26.权利要求25所述的用途，其中所述疫苗包括三价流感疫苗、多价流感疫苗或冠状病毒疫苗。

27.权利要求20-26中任一项所述的用途，其中所述外用制剂被配制以在施加时提供在2mg和20mg之间的toll样受体。