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CN108697067A - 嵌合胚胎-辅助的器官制备的组合物和方法 - Google Patents

嵌合胚胎-辅助的器官制备的组合物和方法 Download PDF

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CN108697067A CN201680074878.7A CN201680074878A CN108697067A CN 108697067 A CN108697067 A CN 108697067A CN 201680074878 A CN201680074878 A CN 201680074878A CN 108697067 A CN108697067 A CN 108697067A
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Abstract

本文公开了适用于移植的人类或人源化的组织和器官。对宿主动物的基因编辑提供了生态龛，用于通过供体干细胞来互补丢失的遗传信息。对宿主基因组编辑以敲除或破坏负责靶器官的生长和/或分化的基因，并且将供体干细胞注射到处于胚胎期的动物中，以互补丢失的用于该器官生长和发育的遗传信息。结果得到嵌合动物，其中经互补的组织(人类/人源化的器官)匹配供体的基因型和表型。这样的器官可在一代中制得，并且可以从患者自身中获取或生成干细胞。如本文所公开的，可以对细胞或胚胎中的多个基因同时进行编辑，来创建用于互补组织的“生态龛”。可以对多个基因进行打靶，使用靶向核酸酶和同源介导修复(HDR)模板在脊椎动物细胞或胚胎中进行编辑。

Description

嵌合胚胎-辅助的器官制备的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求序列号为62/246,926、62/246,927、62/246,929、62/246,947、62/247,092、62/947,096、62/247,115、62/247,117、62/247,118和62/247,122的美国临时专利申请的优选权，这些专利都于2015年10月27日递交。前述临时申请的全部内容通过引用并入本文中。
本申请的主题可能涉及在国际专利申请公开号WO2015/168125A1(于2015年11月5日公开)和WO 2016/141234(于2016年9月9日公开)，以及在国际申请号PCT/US2016/040378(于2016年6月30日递交)和PCT/US2016/040431(于2016年6月30日递交)中披露的主题。前述国际申请的全部内容均通过引用而并入本文中。
对在联邦资助下作出的发明的权利的声明
本发明根据国防部给予的批准号W81XWH-15-1-0393和国立卫生研究院给予的批准号1R43HL124781-01A1和1R43GM113525-01，在政府支持下作出。美国政府享有本发明的某些权利。
背景技术
过去100年，科学家和医生在维持人们的生命和健康方面卓有成效，至少在人们生命最后几十年各种老年疾病和障碍出现前是这样的。在美国，每年为了治疗这些疾病消耗超过1万亿美元。器官移植是一种有效的方法，但是可用的器官太少，而且许多情况下，免疫不匹配导致出现问题。例如，自2003年以来，超过7000名美国人在等待器官移植时死亡。
采用各种干细胞开展动物体细胞遗传互补，能够改造和制备用于治疗、移植和再生医学的人源化组织和器官。目前，移植用器官的来源有机械来源或生物来源，来自：人捐献者；尸体；在有限的情况下，来自于其它物种的哺乳动物，最特别地是猪的异种移植。遗憾的是，这些都会经历宿主体的排斥，和/或可能引发其它副作用。
发明内容
下述从1至92连续列举的段落描述了本发明的各个方面和相关实施方式。
1.一种包含非人类胚胎的嵌合胚胎，具有至少一种人类细胞，其中所述非人类胚胎中负责一种或多种内源器官或组织发育的一个或多个内源基因已经被破坏，其中所述人类细胞中负责相应的一种或多种人类器官或组织发育的一个或多个基因互补被破坏的一个或多个内源基因的功能，以便从所述嵌合胚胎发育的动物包括至少一种人类器官或组织。
2.一种包含非人类胚胎的嵌合胚胎，具有至少一种人类细胞，其中所述非人类胚胎中负责一种或多种内源器官或组织发育的一个或多个内源基因已经被破坏，其中所述人类细胞中负责相应的一种或多种人类器官或组织发育的一个或多个基因互补被破坏的一个或多个内源基因的功能，以便从所述嵌合胚胎发育的动物包括至少一种人类器官或组织，排除以下嵌合胚胎，其中：
所述内源基因包括MYF5、MYOD和/或MRF4，所述人类器官或组织包括骨骼肌细胞；
所述内源基因包括ETV2，所述人类器官或组织包括人血管细胞；和
所述内源基因包括NKX2-5、HANDII和/或TBX5，所述人类器官或组织包括心肌细胞。
3.一种包含非人类胚胎的嵌合胚胎，具有至少一种人类细胞，其中所述非人类胚胎中负责一种或多种内源器官或组织发育的一个或多个内源基因的两个等位基因被破坏，其中所述人类细胞中负责相应的一种或多种人类器官或组织发育的一个或多个基因互补被破坏的一个或多个内源基因的功能，以便从所述嵌合胚胎发育的动物包括至少一种人类器官或组织，其中：
所述内源基因包括NURR1、LMX1A和/或PITX3，所述人类器官或组织包括多巴胺神经元；
所述内源基因包括OLIG和/或OLIG2，所述人类器官或组织包括少突胶质细胞；
所述内源基因包括RAG2、IL2rg、C-KIT和/或ETV2，所述人类器官或组织包括年轻血液；
所述内源基因包括RUNX1、C-KIT和/或FLK1，所述人类器官或组织包括造血细胞；
所述内源基因包括ETV2，所述人类器官或组织包括人血管细胞；
所述内源基因包括MYF5、MYOD、MRF4和/或PAX3，所述人类器官或组织包括骨骼肌细胞；
所述内源基因包括NKX2-5、HANDII和/或TBX5，所述人类器官或组织包括心肌细胞；
所述内源基因包括Pdx和/或ETV2，所述人类器官或组织包括胰腺细胞；
所述内源基因包括HHEX和/或Ubc，所述人类器官或组织包括人肝脏细胞；或
所述内源基因包括Nkx2.1、Sox2、Id2和/或Tbx4，所述人类器官或组织包括肺细胞。
4.一种包含非人类胚胎的嵌合胚胎，具有至少一种人类细胞，其中所述非人类胚胎中负责一种或多种内源器官或组织发育的一个或多个内源基因的两个等位基因都被破坏，其中所述人类细胞中负责相应的一种或多种人类器官或组织发育的一个或多个基因互补被破坏的一个或多个内源基因的功能，以便从所述嵌合胚胎发育的动物包括至少一种人类器官或组织，其中：
所述内源基因包括NURR1、LMX1A和/或PITX3，所述人类器官或组织包括多巴胺神经元；
所述内源基因包括OLIG和/或OLIG2，所述人类器官或组织包括少突胶质细胞；
所述内源基因包括RAG2、IL2rg、C-KIT和/或ETV2，所述人类器官或组织包括年轻血液；
所述内源基因包括RUNX1、C-KIT和/或FLK1，所述人类器官或组织包括造血细胞；
所述内源基因包括PAX3，所述人类器官或组织包括骨骼肌细胞；
所述内源基因包括Pdx和/或ETV2，所述人类器官或组织包括胰腺细胞；
所述内源基因包括HHEX和/或Ubc，所述人类器官或组织包括人肝脏细胞；或
所述内源基因包括Nkx2.1、Sox2、Id2和/或Tbx4，所述人类器官或组织包括肺细胞。
5.一种包含非人类胚胎的嵌合胚胎，具有至少一种人类细胞，其中所述非人类胚胎中负责一种或多种内源器官或组织发育的一个或多个内源基因的两个等位基因都已经被破坏，其中所述人类细胞中负责相应的一种或多种人类器官或组织发育的一个或多个基因互补被破坏的一个或多个内源基因的功能，以便从所述嵌合胚胎发育的动物包括至少一种人类器官或组织，
其中：
所述内源基因是RAG2和IL2rg和/或ETV2，所述人类器官或组织包括年轻血液；
所述内源基因是MYF5、MYOD和MRF4和/或PAX3，所述人类器官或组织包括骨骼肌细胞；或
所述内源基因是NKX2-5、HANDII和/或TBX5，所述人类器官或组织包括心肌细胞。
6.一种包含非人类胚胎的嵌合胚胎，具有至少一种人类细胞，其中所述非人类胚胎中负责一种或多种内源器官或组织发育的一个或多个内源基因的两个等位基因都已经被破坏，其中所述人类细胞中负责相应的一种或多种人类器官或组织发育的一个或多个基因互补被破坏的一个或多个内源基因的功能，以便从所述嵌合胚胎发育的动物包括至少一种人类器官或组织，
其中：
所述内源基因是RAG2和IL2rg和/或ETV2，所述人类器官或组织包括年轻血液；
所述内源基因包括PAX3，所述人类器官和/或组织包括骨骼肌细胞；或
所述内源基因是NKX2-5、HANDII和/或TBX5，所述人类器官或组织包括心肌细胞。
7.根据段落1～3中任一段所述的嵌合胚胎，其中所述内源基因包括NURR1、LMX1A和/或PITX3，所述人类器官或组织包括多巴胺神经元。
8.根据段落1～3中任一段所述的嵌合胚胎，其中所述内源基因包括OLIG和/或OLIG2，所述人类器官或组织包括少突胶质细胞。
9.根据段落1～3中任一段所述的嵌合胚胎，其中所述内源基因包括RAG2、IL2rg、C-KIT和/或ETV2，所述人类器官或组织包括年轻血液。
10.根据段落1～3中任一段所述的嵌合胚胎，其中所述内源基因包括RUNX1、C-KIT和/或FLK1，所述人类器官或组织包括造血细胞。
11.根据段落1或3中任一段所述的嵌合胚胎，其中所述内源基因包括ETV2，所述人类器官或组织包括人血管细胞。
12.根据段落1或3中任一段所述的嵌合胚胎，其中所述内源基因包括MYF5、MYOD、MRF4和/或PAX3，所述人类器官或组织包括骨骼肌细胞。
13.根据段落1或3中任一段所述的嵌合胚胎，其中所述内源基因包括NKX2-5、HANDII和/或TBX5，所述人类器官或组织包括心肌细胞。
14.根据段落1～3中任一段所述的嵌合胚胎，其中所述内源基因包括Pdx和/或ETV2，所述人类器官或组织包括胰腺细胞。
15.根据段落1～3中任一段所述的嵌合胚胎，其中所述内源基因包括HHEX或Ubc，所述人类器官或组织包括人肝脏细胞。
16.根据段落1～3中任一项所述的嵌合胚胎，其中所述内源基因包括Nkx2.1、Sox2、Id2和/或Tbx4，所述人类器官或组织包括肺细胞。
17.根据段落1或2所述的嵌合胚胎，其中所述内源基因的两个等位基因都已经被破坏。
18.根据段落1～17中任一段所述的嵌合胚胎，其中所述非人类胚胎是非人类脊椎动物胚胎。
19.根据段落18所述的嵌合胚胎，其中所述非人类脊椎动物胚胎是偶蹄目动物胚胎或非人类灵长目动物胚胎。
20.根据段落18所述的嵌合胚胎，其中所述非人类脊椎动物胚胎选自由牛、马、猪、绵羊、鸡、鸟、兔、山羊、狗、猫、实验室动物、甲壳类动物和鱼组成的组。
21.根据段落20所述的嵌合胚胎，其中所述非人类脊椎动物胚胎是母牛、猪、绵羊、山羊、鸡或兔的胚胎。
22.根据段落1～21中任一段所述的嵌合胚胎，其中所述非人类胚胎中负责一种或多种内源器官或组织发育的一个或多个内源基因已经通过转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、成簇的规律性间隔短回文重复序列(CRISPR)、CRISPR相关蛋白9(Cas9)、锌指核酸酶(ZFN)、分子编码位点特异性核酸内切酶、人工合成染色体、RecA-gal4融合、RNAi、CRISPRi或它们的组合被破坏。
23.根据段落22所述的嵌合胚胎，其中所述一个或多个内源基因已经通过Cas9被破坏。
24.根据段落1～23中任一段所述的嵌合胚胎，其中所述人类细胞源自至少一种供体细胞，所述至少一种供体细胞是胚胎干细胞、组织特异性干细胞、间充质干细胞、多能干细胞或诱导多能干细胞。
25.根据段落1～24中任一段所述的嵌合胚胎，其中所述破坏包括基因编辑、敲除、一个或多个DNA残基的插入、一个或多个碱基的缺失，或一个或多个DNA残基的插入和缺失。
26.根据段落1～24中任一段所述的嵌合胚胎，其中所述破坏包括一个或多个DNA残基的取代。
27.根据段落26所述的嵌合胚胎，其中所述破坏由一个或多个DNA残基的取代组成。
28.一种从根据段落1～27中任一段所述的嵌合胚胎发育的动物。
29.一种从根据段落1～27中任一段所述的嵌合胚胎发育的动物收获的人体组织或器官。
30.一种产生嵌合胚胎的方法，包括：
a)破坏至少一个非人类细胞或非人类胚胎中负责一种或多种内源器官或组织发育的一个或多个内源基因；
b)如果步骤a)是对非人类细胞进行的，则克隆该细胞以产生胚胎；和
c)将至少一种人类细胞引入步骤a)或步骤b)的胚胎中，其中所述人类细胞携带负责一种或多种器官或组织发育的一个或多个基因，从而产生嵌合胚胎。
31.一种产生嵌合胚胎的方法，包括：
a)破坏至少一个非人类细胞或非人类胚胎中负责一种或多种内源器官或组织发育的一个或多个内源基因；
b)如果步骤a)是对非人类细胞进行的，则克隆该细胞以产生胚胎；和
c)将至少一种人类细胞引入步骤a)或步骤b)的胚胎中，其中所述人类细胞携带负责一种或多种器官或组织发育的一个或多个基因；
从而产生嵌合胚胎，排除以下嵌合胚胎，其中：
所述内源基因包括MYF5、MYOD和/或MRF4，所述人类器官或组织包括骨骼肌细胞；
所述内源基因包括ETV2，所述人类器官或组织包括人血管细胞；和
所述内源基因包括NKX2-5、HANDII和/或TBX5，所述人类器官或组织包括心肌细胞。
32.一种产生嵌合胚胎的方法，包括：
a)破坏至少一个非人类细胞或非人类胚胎中负责一种或多种器官或组织发育的一个或多个内源基因的两个等位基因；
b)如果步骤a)是对非人类细胞进行的，则克隆该细胞以产生胚胎；和
c)将至少一种人类细胞引入步骤a)或步骤b)的胚胎中，其中所述人类细胞携带负责一种或多种器官或组织发育的一个或多个基因，从而产生嵌合胚胎，其中：
所述内源基因包括NURR1、LMX1A和/或PITX3，所述人类器官或组织包括多巴胺神经元；
所述内源基因包括OLIG和/或OLIG2，所述人类器官或组织包括少突胶质细胞；
所述内源基因包括RAG2、IL2rg、C-KIT和/或ETV2，所述人类器官或组织包括年轻血液；
所述内源基因包括RUNX1、C-KIT和/或FLK1，所述人类器官或组织包括造血细胞；
所述内源基因包括ETV2，所述人类器官或组织包括人血管细胞；
所述内源基因包括MYF5、MYOD、MRF4和/或PAX3，所述人类器官或组织包括骨骼肌细胞；
所述内源基因包括NKX2-5、HANDII和/或TBX5，所述人类器官或组织包括心肌细胞；
所述内源基因包括Pdx和/或ETV2，所述人类器官或组织包括胰腺细胞；
所述内源基因包括HHEX和/或Ubc，所述人类器官或组织包括人肝脏细胞；或
所述内源基因包括Nkx2.1、Sox2、Id2和/或Tbx4，所述人类器官或组织包括肺细胞。
33.一种产生嵌合胚胎的方法，包括
a)破坏至少一个非人类细胞或非人类胚胎中负责一种或多种器官或组织发育的一个或多个内源基因的两个等位基因；
b)如果步骤a)是对非人类细胞进行的，则克隆该细胞以产生胚胎；和
c)将至少一种人类细胞引入步骤a)或步骤b)的胚胎中，其中所述人类细胞携带负责一种或多种器官或组织发育的一个或多个基因，从而产生嵌合胚胎，其中：
所述内源基因包括NURR1、LMX1A和/或PITX3，所述人类器官或组织包括多巴胺神经元；
所述内源基因包括OLIG和/或OLIG2，所述人类器官或组织包括少突胶质细胞；
所述内源基因包括RAG2、IL2rg、C-KIT和/或ETV2，所述人类器官或组织包括年轻血液；
所述内源基因包括RUNX1、C-KIT和/或FLK1，所述人类器官或组织包括造血细胞；
所述内源基因包括PAX3，所述人类器官或组织包括骨骼肌细胞；
所述内源基因包括Pdx和/或ETV2，所述人类器官或组织包括胰腺细胞；
所述内源基因包括HHEX和/或Ubc，所述人类器官或组织包括人肝脏细胞；或
所述内源基因包括Nkx2.1、Sox2、Id2和/或Tbx4，所述人类器官或组织包括肺细胞。
34.一种产生嵌合胚胎的方法，包括：
a)破坏至少一个非人类细胞或非人类胚胎中负责一种或多种器官或组织发育的一个或多个内源基因的两个等位基因；
b)如果步骤a)是对非人类细胞进行的，则克隆该细胞以产生胚胎；和
c)将至少一种人类细胞引入步骤a)或步骤b)的胚胎中，其中所述人类细胞携带负责一种或多种器官或组织发育的一个或多个基因，从而产生嵌合胚胎，其中：
所述内源基因是RAG2和IL2rg和/或ETV2，所述人类器官或组织包括年轻血液；
所述内源基因是MYF5、MYOD和MRF4和/或PAX3，所述人类器官或组织包括骨骼肌细胞；或
所述内源基因是NKX2-5、HANDII和/或TBX5，所述人类器官或组织包括心肌细胞。
35.一种产生嵌合胚胎的方法，包括：
a)破坏至少一个非人类细胞或非人类胚胎中负责一种或多种器官或组织发育的一个或多个内源基因的两个等位基因；
b)如果步骤a)是对非人类细胞进行的，则克隆该细胞以产生胚胎；和
c)将至少一种人类细胞引入步骤a)或步骤b)的胚胎中，其中所述人类细胞携带负责一种或多种器官或组织发育的一个或多个基因，从而产生嵌合胚胎，其中：
所述内源基因是RAG2和IL2rg和/或ETV2，所述人类器官或组织包括年轻血液；
所述内源基因是PAX3，所述人类器官或组织包括骨骼肌细胞；或
所述内源基因是NKX2-5、HANDII和/或TBX5，所述人类器官或组织包括心肌细胞。
36.根据段落30～32中任一段所述的方法，其中所述内源基因包括NURR1、LMX1A和/或PITX3，所述人类器官或组织包括多巴胺神经元。
37.根据段落30～32中任一段所述的方法，其中所述内源基因包括OLIG和/或OLIG2，所述人类器官或组织包括少突胶质细胞。
38.根据段落30～32中任一段所述的方法，其中所述内源基因包括RAG2、IL2rg、C-KIT和/或ETV2，所述人类器官或组织包括年轻血液。
39.根据段落30～32中任一段所述的方法，其中所述内源基因包括RUNX1、C-KIT和/或FLK1，所述人类器官或组织包括造血细胞。
40.根据段落30或32所述的方法，其中所述内源基因包括ETV2，所述人类器官或组织包括人血管细胞。
41.根据段落30或32所述的方法，其中所述内源基因包括MYF5、MYOD、MRF4和/或PAX3，所述人类器官或组织包括骨骼肌细胞。
42.根据段落30或32所述的方法，其中所述内源基因包括NKX2-5、HANDII和/或TBX5，所述人类器官或组织包括心肌细胞。
43.根据段落30～32中任一段所述的方法，其中所述内源基因包括Pdx和/或ETV2，所述人类器官或组织包括胰腺细胞。
44.根据段落30～32中任一段所述的方法，其中所述内源基因包括HHEX或Ubc，所述人类器官或组织包括人肝脏细胞。
45.根据段落30～32中任一段所述的方法，其中所述内源基因包括Nkx2.1、Sox2、Id2和/或Tbx4，所述人类器官或组织包括肺细胞。
46.根据段落30或31所述的方法，其中所述一个或多个内源基因的两个等位基因都被破坏。
47.根据段落30～46中任一段所述的方法，其中所述非人类胚胎是非人类脊椎动物胚胎。
48.根据段落47所述的方法，其中所述非人类脊椎动物胚胎是偶蹄目动物胚胎或非人类灵长目动物胚胎。
49.根据段落47所述的方法，其中所述非人类脊椎动物胚胎选自由牛、马、猪、绵羊、鸡、鸟、兔、山羊、狗、猫、实验室动物和鱼组成的组。
50.根据段落30～49中任一段所述的方法，其中所述至少一种人类供体细胞是胚胎干细胞、组织特异性干细胞、间充质干细胞、多能干细胞或诱导多能干细胞。
51.根据段落30～50中任一段所述的方法，进一步包括将所述嵌合胚胎移植到动物子宫内，其中所述嵌合胚胎发育成包括人类细胞的嵌合动物。
52.根据段落51所述的方法，进一步包括从所述嵌合动物收获人类细胞。
53.根据段落52所述的方法，进一步包括将所述人类细胞移植到有需要的人类患者中。
54.根据段落53所述的方法，其中所述至少一种人类细胞由人类患者提供。
55.根据段落30～54中任一段所述的方法，其中所述非人类胚胎中负责一种或多种内源器官或组织发育的一个或多个内源基因已经通过转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、成簇的规律性间隔短回文重复序列(CRISPR)、CRISPR相关蛋白9(Cas9)、锌指核酸酶(ZFN)、分子编码位点特异性核酸内切酶、人工合成染色体、RecA-gal4融合、RNAi、CRISPRi或它们的组合被破坏。
56.根据段落55所述的方法，其中所述方法是Cas9。
57.根据段落55～56中任一段所述的方法，进一步包括引入同源介导修复(HDR)模板，所述同源介导修复(HDR)模板具有与所述内源基因之一同源的模板序列，所述模板序列替代内源基因序列的至少一部分，以破坏所述内源基因。
58.根据段落57所述的方法，进一步包括引入多种同源介导修复(HDR)模板，所述同源介导修复(HDR)模板各自都具有与所述内源基因之一同源的模板序列，且各模板序列替代内源基因序列之一的至少一部分，以破坏所述内源基因。
59.根据段落57或58所述的方法，其中所述破坏包括内源基因的一个或多个DNA残基的取代。
60.根据段落57或58所述的方法，其中所述破坏由内源基因的一个或多个DNA残基的取代组成。
61.一种采用段落30～60中任一段所述的方法创建的嵌合胚胎或嵌合动物。
62.一种在非人类宿主动物中产生人类或人源化器官或组织的方法，包括：
a)破坏非人类胚胎的至少一个细胞中负责器官或组织发育的一个或多个内源基因；
b)如果步骤a)是对动物宿主的细胞进行的，则克隆该细胞以产生胚胎；和
c)通过将至少一种人类细胞引入步骤a)或步骤b)的胚胎中，产生嵌合宿主胚胎，其中所述人类细胞携带负责相应的人类器官或组织发育的一个或多个基因，
其中从所述嵌合宿主胚胎发育的动物包括人类或人源化的器官或组织，从而在非人类宿主动物中产生人类或人源化的器官或组织。
63.一种在非人类宿主动物中产生人类或人源化的器官或组织的方法，包括：
a)破坏至少一个非人类细胞或非人类胚胎中负责一种或多种内源器官或组织发育的一个或多个内源基因；
b)如果步骤a)是对非人类细胞进行的，则克隆该细胞以产生胚胎；和
c)将至少一种人类细胞引入步骤a)或步骤b)的胚胎中，
其中所述人类细胞携带负责一种或多种器官或组织发育的一个或多个基因，从而产生嵌合胚胎，排除以下嵌合胚胎，其中：
所述内源基因包括MYF5、MYOD和/或MRF4，所述人类器官或组织包括骨骼肌细胞；
所述内源基因包括ETV2，所述人类器官或组织包括人血管细胞；和
所述内源基因包括NKX2-5、HANDII和/或TBX5，所述人类器官或组织包括心肌细胞。
64.一种在非人类宿主动物中产生人类或人源化的器官或组织的方法，包括：
a)破坏非人类胚胎的至少一个细胞中负责器官或组织发育的一个或多个内源基因的两个等位基因；
b)如果步骤a)是对动物宿主的细胞进行的，则克隆该细胞以产生胚胎；和
c)通过将至少一种人类细胞引入步骤a)或步骤b)的胚胎中，产生嵌合宿主胚胎，其中所述人类细胞携带负责相应的人类器官或组织发育的一个或多个基因；
其中从所述嵌合宿主胚胎发育的动物包括人类或人源化的器官或组织，从而在非人类宿主动物中产生人类或人源化的器官或组织，其中：
所述内源基因包括NURR1、LMX1A和/或PITX3，所述人类器官或组织包括多巴胺神经元；
所述内源基因包括OLIG和/或OLIG2，所述人类器官或组织包括少突胶质细胞；
所述内源基因包括RAG2、IL2rg、C-KIT和/或ETV2，所述人类器官或组织包括年轻血液；
所述内源基因包括RUNX1、C-KIT和/或FLK1，所述人类器官或组织包括造血细胞；
所述内源基因包括ETV2，所述人类器官或组织包括人血管细胞；
所述内源基因包括MYF5、MYOD、MRF4和/或PAX3，所述人类器官或组织包括骨骼肌细胞；
所述内源基因包括NKX2-5、HANDII和/或TBX5，所述人类器官或组织包括心肌细胞；
所述内源基因包括Pdx和/或ETV2，所述人类器官或组织包括胰腺细胞；
所述内源基因包括HHEX和/或Ubc，所述人类器官或组织包括人肝脏细胞；或
所述内源基因包括Nkx2.1、Sox2、Id2和/或Tbx4，所述人类器官或组织包括肺细胞。
65.一种在非人类宿主动物中产生人类或人源化的器官或组织的方法，包括：
a)破坏非人类胚胎的至少一个细胞中负责器官或组织发育的一个或多个内源基因的两个等位基因；
b)如果步骤a)是对动物宿主的细胞进行的，则克隆该细胞以产生胚胎；和
c)通过将至少一种人类细胞引入步骤a)或步骤b)的胚胎中，产生嵌合宿主胚胎，其中所述人类细胞携带负责相应的人类器官或组织发育的一个或多个基因；
其中从所述嵌合宿主胚胎发育的动物包括人类或人源化的器官或组织，从而在非人类宿主动物中产生人类或人源化的器官或组织，其中：
所述内源基因包括NURR1、LMX1A和/或PITX3，所述人类器官或组织包括多巴胺神经元；
所述内源基因包括OLIG和/或OLIG2，所述人类器官或组织包括少突胶质细胞；
所述内源基因包括RAG2、IL2rg、C-KIT和/或ETV2，所述人类器官或组织包括年轻血液；
所述内源基因包括RUNX1、C-KIT和/或FLK1，所述人类器官或组织包括造血细胞；
所述内源基因包括PAX3，所述人类器官或组织包括骨骼肌细胞；
所述内源基因包括Pdx和/或ETV2，所述人类器官或组织包括胰腺细胞；
所述内源基因包括HHEX和/或Ubc，所述人类器官或组织包括人肝脏细胞；或
所述内源基因包括Nkx2.1、Sox2、Id2和/或Tbx4，所述人类器官或组织包括肺细胞。
66.一种在非人类宿主动物中产生人类或人源化的器官或组织的方法，包括：
a)破坏非人类胚胎的至少一个细胞中负责器官或组织发育的一个或多个内源基因的两个等位基因；
b)如果步骤a)是对动物宿主的细胞进行的，则克隆该细胞以产生胚胎；和
c)通过将至少一种人类细胞引入步骤a)或步骤b)的胚胎中，产生嵌合宿主胚胎，其中所述人类细胞携带负责相应的人类器官或组织发育的一个或多个基因；其中：
所述内源基因是RAG2和IL2rg或ETV2，所述人类器官或组织包括年轻血液；
所述内源基因是MYF5、MYOD和MRF4或PAX3，所述人类器官或组织包括骨骼肌细胞；或
所述内源基因包括NKX2-5、HANDII和/或TBX5，所述人类器官或组织包括心肌细胞。
67.一种在非人类宿主动物中产生人类或人源化的器官或组织的方法，包括：
a)破坏至少一个非人类细胞或非人类胚胎中负责一种或多种器官或组织发育的一个或多个内源基因的两个等位基因；
b)如果步骤a)是对非人类细胞进行的，则克隆该细胞以产生胚胎；和
c)将至少一种人类细胞引入步骤a)或步骤b)的胚胎中，其中所述人类细胞携带负责一种或多种器官或组织发育的一个或多个基因，从而产生嵌合胚胎，其中：
所述内源基因是RAG2和IL2rg和/或ETV2，所述人类器官或组织包括年轻血液；
所述内源基因是PAX3，所述人类器官或组织包括骨骼肌细胞；或
所述内源基因是NKX2-5、HANDII和/或TBX5，所述人类器官或组织包括心肌细胞。
68.根据段落62～64中任一段所述的方法，其中所述内源基因包括NURR1、LMX1A和/或PITX3，所述人类器官或组织包括多巴胺神经元。
69.根据段落62～64中任一段所述的方法，其中所述内源基因包括OLIG和/或OLIG2，所述人类器官或组织包括少突胶质细胞。
70.根据段落62～64中任一段所述的方法，其中所述内源基因包括RAG2、IL2rg、C-KIT和/或ETV2，所述人类器官或组织包括年轻血液。
71.根据段落62～64中任一段所述的方法，其中所述内源基因包括RUNX1、C-KIT和/或FLK1，所述人类器官或组织包括造血细胞。
72.根据段落62或64所述的方法，其中所述内源基因包括ETV2，所述人类器官或组织包括人血管细胞。
73.根据段落62或64所述的方法，其中所述内源基因包括MYF5、MYOD、MRF4和/或PAX3，所述人类器官或组织包括骨骼肌细胞。
74.根据段落62或64所述的方法，其中所述内源基因包括NKX2-5、HANDII和/或TBX5，所述人类器官或组织包括心肌细胞。
75.根据段落62～64中任一段所述的方法，其中所述内源基因包括Pdx和/或ETV2，所述人类器官或组织包括胰腺细胞。
76.根据段落62～64中任一段所述的方法，其中所述内源基因包括HHEX和/或Ubc，所述人类器官或组织包括人肝脏细胞。
77.根据段落62～64中任一段所述的方法，其中所述内源基因包括Nkx2.1、Sox2、Id2和/或Tbx4，所述人类器官或组织包括肺细胞。
78.根据段落62或63所述的方法，其中所述一个或多个内源基因的两个等位基因都被破坏。
79.根据段落62～78中任一段所述的方法，其中所述非人类胚胎是非人类脊椎动物胚胎。
80.根据段落79所述的方法，其中所述非人类脊椎动物胚胎是偶蹄目动物胚胎或非人类灵长目动物胚胎。
81.根据段落79所述的方法，其中所述非人类脊椎动物胚胎选自由牛、马、猪、绵羊、鸡、鸟、兔、山羊、狗、猫、实验室动物和鱼组成的组。
82.根据段落62～81中任一项所述的方法，其中所述至少一种人类细胞是胚胎干细胞、组织特异性干细胞、间充质干细胞、多能干细胞或诱导多能干细胞。
83.根据段落62～82所述的方法，进一步包括从所述嵌合动物收获人类细胞。
84.根据段落83所述的方法，进一步包括将所述人类细胞移植到有需要的人类患者中。
85.根据段落84所述的方法，其中所述至少一种人类细胞由人类患者提供。
86.根据段落62～85中任一段所述的方法，进一步包括引入同源介导修复(HDR)模板，所述同源介导修复(HDR)模板具有与内源基因之一同源的模板序列，所述模板序列替代内源基因序列的至少一部分，以破坏所述内源基因。
87.根据段落86所述的方法，进一步包括引入多种同源介导修复(HDR)模板，所述同源介导修复(HDR)模板各自都具有与内源基因之一同源的模板序列，且各模板序列替代内源基因序列之一的至少一部分，以破坏所述内源基因。
88.根据段落86或87所述的方法，其中所述破坏包括内源基因的一个或多个DNA残基的取代。
89.根据段落86或87所述的方法，其中所述破坏由内源基因的一个或多个DNA残基的取代组成。
90.根据段落62～89中任一段所述的方法，其中所述非人类胚胎中负责一种或多种内源器官或组织发育的一个或多个内源基因已经通过转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、成簇的规律性间隔短回文重复序列(CRISPR)、CRISPR相关蛋白9(Cas9)、锌指核酸酶(ZFN)、分子编码位点特异性核酸内切酶、人工合成染色体、RecA-gal4融合、RNAi、CRISPRi或它们的组合被破坏。
91.根据段落90所述的方法，其中所述非人类胚胎中负责一种或多种内源器官或组织发育的一个或多个内源基因已经通过Cas9被破坏。
92.一种采用段落62～91中任一段所述方法创建的嵌合动物。
本发明上述任一方面和实施方式的特定要素可以与本发明其它方面和实施方式的要素组合或被本发明其它方面和实施方式的要素替代。此外，虽然与本发明某些方面和实施方式有关的优点是在这些方面和实施方式的背景条件下描述的，但是，本发明的其它方面和实施方式也可以具有这些优点，但是，并非所有其它方面和实施方式都一定要具有这些优点才属于本公开的范围。
附图说明
图1是组织/器官移植存在的问题及通过用于器官移植的人类细胞和动物基因组工程改造提供解决方案的示意图。
图2A描述了使用单编辑制备双敲除的纯合动物的方法。
图2B描述了多编辑来制备动物的假设方法，其中多编辑是通过一次进行一次单编辑实现的。
图3描述了用于在F0代建立原代(founder)动物的多重基因编辑。
图4A～4D描述了对猪RAG2和IL2Rγ(或IL2Rg)的多重基因编辑。图4A是SURVEYOR和限制性片段长度多态性(RFLP)分析图，用于确定转染后3天的细胞群的非同源末端连接(NHEJ)和同源依赖性修复HDR的效率。图4B是转染后11天的细胞群的同源依赖性修复的RFLP分析图。图4C是对于HDR，IL2Rγ、RAG2或它们两者呈阳性的克隆的百分比的示图。将来自图4A中以“C”表示的细胞群的细胞进行铺板。图4D是经转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)mRNA 30及HDR模板转染的细胞的集落分析图，其中对IL2Rγ和RAG2来说，转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)mRNA 30的量分别为2μg和1μg，HDR模板的量均为1μM。下方示出了集落基因型的分布。在本申请中，IL2Rγ和IL2Rg可互换使用。
图5A～5D描述了猪APC和p53的多重基因编辑。图5A是示出用于确定转染后3天对细胞群进行非同源末端连接(NHEJ)和同源依赖性修复(HDR)的效率的SURVEYOR和RFLP分析的图。图5B是示出转染后11天对细胞群进行同源依赖性修复的RFLP分析的图。图5C和5D是示出来源于所示细胞群(图5A中以“C”和“D”表示)对于HDR在APC、p53或它们两者呈阳性的集落的百分比的图。拥有3个或更多个HDR等位基因的克隆列出在下方。
图6A和6B描述了寡核苷酸HDR模板浓度对于五基因多重HDR的效率的影响。将靶向猪RAG2、IL2Rγ、p53、APC和LDLR的所示量的TALEN mRNA，与2μM(图6A)或1μM(图6B)各同种HDR模板一起共转染到猪成纤维细胞内。通过Surveyor和RFLP测定，测量NHEJ和HDR的百分比。
图7A和图7B是五基因多重数据集，示出了寡核苷酸HDR模板浓度对于5-基因多重HDR效率的影响的实验数据的图。将靶向猪RAG2、IL2Rγ、p53、APC和LDLR的所示量的TALENmRNA，与2μM或1μM各同种HDR模板一起共转染到猪成纤维细胞内。通过Surveyor和RFLP测定，测量NHEJ和HDR的百分比。5-基因多重HDR的集落基因型：通过RFLP分析对集落基因型进行评价。在图7A中，每条线代表一个集落在每个特定基因座处的基因型。可以鉴定出三种基因型；具有对于HDR是杂合或纯合的预期RFLP基因型的那些，以及具有RFLP阳性片段的那些，以及第二等位基因，其中第二等位基因具有指示插入或缺失(indel)等位基因的可见的尺寸变化。在每列下方示出了在特定基因座处存在编辑的集落的百分比。图7B提供了在0～5个基因座处被编辑的集落数量的得分。
图8A和图8B是另一个五基因多重数据集，示出了第二实验的实验数据的图，其中第二实验涉及寡核苷酸HDR模板浓度对于5-基因多重HDR效率的影响。第二个5-基因多重编辑试验的集落基因型。在图8A中，每条线代表一个集落在每个特定基因座处的基因型。可以鉴定出三种基因型；具有对于HDR是杂合或纯合的预期RFLP基因型的那些，以及具有RFLP阳性片段的那些，以及第二等位基因，其中第二等位基因具有指示插入或缺失(indel)等位基因的可见的尺寸变化。在每列下方示出了在特定基因座存在编辑的集落的百分比。图8B提供了在0～5基因座处被编辑的集落数量的总数。
图9A和9B是另一个示出集落基因型的五基因多重试验数据集。在图9A中，每条线代表一个集落在每个特定基因座处的基因型。可以鉴定出三种基因型；具有杂合或纯合HDR的预期RFLP基因型的那些，以及具有RFLP阳性片段，以及第二等位基因的那些，其中第二等位基因具有指示插入或缺失(indel)等位基因的可见的尺寸变化。在每列下方示出了在特定基因座存在编辑的集落的百分比。图9B提供了在0～5个基因座被编辑的集落数量的总数。
图10描述了一种采用靶向核酸酶，产生期望的基因敲除或等位基因选择，来制备F0代嵌合体的方法。
图11描述了具有正常表型的F0代动物及具有生长停滞(FTT)表型和基因型的子代的建立。
图12描述了制备嵌合动物的方法，该嵌合动物的配子具有供体胚胎遗传特征。
图13A～C描述了在NKX2-5、GATA4和MESP1的三个靶向基因座处的多重编辑。图13A是实验示意图，图13B示出了分别采用如SEQ ID NO:1～3所示的NKX2-5、GATA4和MESP1的基因打靶。图13C描述了这些实验的测定结果。每个靶基因的寡核苷酸序列。新的核苷酸以大写字母表示。PTC以框中浅色字母表示，新的HindIII RFLP位点加了下划线。
图14描述了采用TALEN和RGEN组合的多重基因编辑；采用RFLP进行评价的转染细胞测定表明在两个位点处都发生了HDR。
图15A～E是描述了在猪孤雌囊胚中加入人脐带血干细胞(hUCBSC)的图像。图15A是囊胚的相差显微镜图像。图15B是在囊胚内的细胞的DAPI图像。图15C是人核抗原(HNA)染色图。图15D是DAPI和HuNu的合并图像。图15E是图15A～15C的合并图像。图15F是示出在内细胞团(ICM)、滋养外胚层(TE)或囊胚腔(CA)中的HuNu细胞的量化的图。图15G是示出卵母细胞激活后第6天、第7天和第8天时HNA细胞增殖的图。在第6天注射hUCBSC。
图16A～16C是嵌合人-猪胎儿的图像。图16A是将hUCBSC注射到猪孤雌囊胚内后，妊娠期第28天时嵌合胎儿的图像。图16B是免疫组织化学图像，其中人核抗原(HNA)染色为红色，DAPI染色为蓝色。图16C是图16B中免疫组织化学染色的对照，在染色时未加入一级抗体。
图17A和17B描述了TALEN介导的猪基因敲除。图17A是LMXA1、NURRl和PITX3切割位点的示意图。图17B提供了表明TALEN切割产物(以双箭头指示)的电泳图像。
图18A～F是示出了采用人脐带血干细胞互补猪囊胚中PITX3敲除的眼部效果的图像。图18A～F的图像示出妊娠期62天时胎猪眼睛的总体形态。图18A和18B示出了野生型猪的眼睛。图18C和18D是PITX3敲除猪的小眼睛。图18E和18F是经人脐带血干细胞(hUCBSC)互补的PITX3敲除的大眼睛。图18A、18C和18E中的箭头指向各胎猪的眼睛位置。
图19A和19B描述了TALEN介导的ETV2敲除。图19A是示出用于检测基因编辑的三级PCR测定的示意图。引物a-d的扩增表明存在缺失等位基因。为了区分杂合和纯合的克隆，采用引物a-b和c-d对野生型等位基因进行扩增。仅当存在a-d产物，而不存在a-b、c-d产物时，该克隆才被视为对于缺失等位基因来说是纯合的。图19B提供了示出纯合性缺失证明的电泳图像。符合上述标准的克隆用绿框框住。
图20A～20H描述了猪ETV2丢失，重现了小鼠Etv2突变表型的情况。图20A示出了野生型E18.0猪胚胎，图20B示出了同一发育阶段的ETV2敲除胚胎。插图示出了尿囊的放大图。注意到在突变体中，缺乏脉管丛形成的整体形态异常(插图)。图20C～20H分别是穿过A和B中所示胚胎的尿囊(图20C和D)、心脏水平(图20E和F)及躯干水平(图20G和H)的截面，它们进行了内皮标记物Tie2；心脏谱系标记物Gata4；及核复染剂4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色。野生型尿囊高度血管化，具有Tie2阳性的内皮衬里，并且包含血液(图20C，箭头)，而突变体缺乏这些现象(图20D)。野生型胚胎(E、G)中的心内膜、主静脉(CV)和背主动脉(DA)明显可见。与此相比，无ETV2胚胎完全没有这些结构，但存在Gata4标记(绿色)的心脏祖细胞和肠(分别是F和H)。比例尺：1000μm(图20A和B)、200μm(图20A和B中的插图)、100μm(图20C～20H)。
图21A～21C描绘了人诱导多能干细胞(hiPSC)互补ETV2突变体猪胚胎的免疫组化图。采用SCNT制备ETV2突变体囊胚，并在桑椹胚期注入10个hiPSC，然后移植到激素同步的小母猪体内。图21A示出了采用人特异性Alu序列进行的原位杂交。图21B和21C是对人CD31(图21B)、HNA(图21C，红色)和人vWF(图21C，绿色)的免疫组化图。带框区在下面的图中进行了放大。箭头指向阳性细胞。请注意脉管类结构的信息。所有比例尺代表50微米，nt：神经管，noto：脊索，som：体节。
图22A～22D示出了Nkx2-5和HandII(亦称为dHand)双敲除缺少两个心室(rv和lv)，并且具有一个小的原始心房(dc)。图22A示出了野生型动物。图22B示出了Nkx 2.5-/-动物。图22C示出了dHand-/-动物。图22D示出了Nkx 2.5-/-和dHand-/-双敲除动物。
图23A和23B描述了在猪成纤维细胞中的NKX2-5和HANDII双敲除。图23A是所示各基因的编码序列的示意图；交替颜色表示外显子边界，蓝色区(下面)表示各转录因子的DNA结合结构域，三角表示TALEN结合位点的位置。图23B提供了对成纤维细胞集落的HANDII和NKX2-5双等位基因敲除进行RFLP分析的电泳图像。
图24A～24C描述了Nkx2-5/HANDII/TBX5三基因敲除的猪胚胎是无心畸形。图24A提供了Gata4蛋白的免疫组化染色图像。在E18.0时，野生型胚胎(上)呈阳性染色，而三基因敲除的猪胚胎(下)没有心脏，基本上没有Gata4免疫组化阳性细胞(标记心脏)(h，心脏；fg，前肠)。图24B提供了对野生型胚胎(上)和三基因敲除的胚胎(下)的DAPI染色图像。图24C提供了图24A和图24B的合并图像。
图25A和25B是描述Myod表达的图像。Myf5、Myod和Mrf4是骨骼肌的主要调控因子，限于发育和成年时的骨骼肌中。此处所示的是Myod-GFP转基因表达，其在E11.5时限于体节、隔膜和已有的骨骼肌(图25A)。在图25B中，采用35S-标记的MyoD核糖核酸探针，对E13.5(妊娠中期)的小鼠胚胎旁矢状面进行原位杂交。注意在背部、肋间和四肢肌肉群中的表达。
图26A～26C描述了猪MYOD、MYF5和MYF6基因的敲除。图26A是示出该敲除的示意图。设计用于猪MYOD、MYF5和MYF6(aka MRF4)基因的TALEN对。TALEN结合位点(以红色箭头表示)位于各基因重要的碱性(+)螺旋-环-螺旋(HLH)结构域的上游。TALEN结合位点示于下方(以红色箭头表示)，通过同源依赖性修复(HDR)由提前终止密码子靶向的氨基酸以黄色箭头表示。图26B提供了电泳图，示出了通过RFLP分析被证明的HDR事件。HDR模板经设计用于引入提前终止密码子和新的限制酶识别位点(HindIII)，以允许容易分析HDR事件。每个基因感兴趣的区域采用PCR扩增，对转染细胞群进行RFLP评价。闭口箭头表示未切割或野生型等位基因，而开口箭头表示HDR等位基因。对于MYOD、MYF5和MYF6，HDR阳性的等位基因的百分比分别是14％、31％和36％。图26C提供了证明三基因敲除的电泳图像和测序图。将这些细胞群进行铺板，得到独立的集落分离体。768个集落中有38个(4.9％)显示具有4个或更多个RFLP事件，并且通过测序进一步分析。通过并入提前终止密码子和/或会导致移码及随后提前终止密码子的in/del的HDR，鉴定出有5个克隆对全部三个基因都是纯合性敲除。示出了MYOD/MYF5/MYF6三基因敲除的克隆的RFLP分析和测序的实例。
图27A和27B描述了MYF5/MYOD/MRF4三基因敲除(KO)的表型。在E18.0时，野生型(Wt)胚胎拥有边界明显的体节、结蛋白(desmin)阳性(红色)的生肌节(m)和发育中的肌肉组织(图27A)。此外，发育中的心管表现出强烈的结蛋白信号(h)。与此相比，MYF5/MYOD/MRF4KO胚胎缺少生肌节形成，而心脏仍然保持为结蛋白阳性(图27B)。
图28A～28C描述了经GFP标记的卵裂球互补的MYF5/MYOD/MRF4无效的胚胎的互补。图28A是示出了经GFP标记的卵裂球互补的E20猪K4YF5/MYOD/MRF4无效的胚胎的图像。在胚胎的肝脏和卵黄囊中观察到原生的(native)GFP。图28B是示出了经GFP标记的卵裂球互补的MYF5/MYOD/MRF4无效的胚胎(E20)的猪肝脏的截面图像。在肝脏的血窦中可以看到原生的GFP。图28C是柱状图，示出了经GFP标记的卵裂球互补的E20猪MYF5/K4YOD/MRF4无效的胚胎的卵黄囊的PCR(胚胎1[图28A和28B中所示]、3、5)。GFP-标记的猪成纤维细胞是阳性对照，WT猪肝脏是阴性对照。
图29A至29E描述了PDX1-/-猪的制备。图29A是对猪PDX1座位进行TALEN基因编辑的示意图。图29B提供了电泳图像，表明了RFLP分析鉴定未经修饰、杂合敲除(开口箭头)或纯合敲除(闭口箭头)。41％的克隆是纯合的PDX1敲除。图29C和29D所示的图像表明与WTE30胚胎中的胰腺(图29C)相比，在克隆E32Pdx1-/-猪胚胎(图29D)中胰腺消失(Δ)。图29E是野生型胎儿和PDX1-/-突变体胎儿的新生β细胞的对比图像。P：胰腺，S：胃，D：十二指肠(Wt E30胎儿)。
图30A～30C描述了采用基因编辑制备HHEX敲除(KO)。图30A是HHEX基因敲除的示意图。HHEX基因由4个外显子构成。通过基因编辑，将HindIII KO等位基因插入到HHEX基因的外显子2内。图30B是电泳图像，示出了通过HindIII RFLP分析测定的转染群的基因编辑的效率。在凝胶中显示了具有新HindIII KO等位基因的染色体部分(以切割产物，空心三角形表示)。图30C是电泳图像，示出了采用HindIII RFLP分析还筛选了成纤维细胞克隆。纯合KO克隆以星号表示。
图31A和31B描述了野生型(图31A)和HHEX KO猪胚胎(图31B)在妊娠30天时肝脏的发育。注意到图31B中的HHEX KO样本中没有肝脏发育。相同胎龄的野生型对照在图31A中示出。
图32A～32F描述了NKX2.1的敲除导致胎儿没有肺。图32A～32C是野生型动物的肺发育的图像。图32D～32F是NKX2.1敲除动物的肺未发育的图像。
图33描述了示出内部器官的16.4T猪胎的MR成像。当顶臀长度是大约20mm时，猪胎龄是30天。
图34是说明PITX3在多巴胺神经元/眼睛晶状体发育中的作用的示意图。插图是同一凝胶电泳图像，示出了图17中PITX3基因的TALEN切割产物。
图35是示出在PITX3KO猪的桑葚胚中引入供体hiPSC或hUCBSC的图像。
图36提供了示出将嵌合PITX3敲除(KO)桑葚胚移植到代孕母猪体内的示意图。
图37是表明人类干细胞互补挽救PITX3敲除猪的眼睛缺陷的点状图。PITX3敲除基本上消除了张开的眼睑(open eyelid)。采用野生型干细胞(hiPSC或hUCBSC)互补，至少部分挽救了由于PITX3敲除所消除的开放眼睑。图37中的图是对图18A、18C和18E所示“眼睑”的定量分析。在图18A中，可以观察到野生型猪胎儿的眼睛。相比之下，因为皮肤重叠或眼睑不透明，看不到PITX3敲除猪胎儿的眼睛(图18C)。在经干细胞互补的一些PITX3敲除胎儿中，现在可以透过半透明或“张开的”眼睑看到眼睛(图18E)。这些定量发现是参加盲分析的9个人对每只眼睛评定为“张开”或“闭合”来量化的。每个数据点表示将每只眼睛评为“张开”的人的百分比，从而得到“张开的眼睑指数”。
图38A和B是免疫组织化学图像，表明因猪PITX3敲除导致胎儿黑质(SNc)多巴胺神经元丢失。图38A示出了妊娠62天时野生型胎猪的SNc中的酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元。图38B示出了PITX3敲除胎猪的SNc中的TH阳性神经元。注意到敲除猪的多巴胺神经元的丢失。VTA＝腹侧被盖区。
图39A～39D提供了示出嵌合胎儿中人神经元并入的图像。图39A示出了五只胎猪的HNA染色，以证明至少在一些嵌合胎中存在人神经元细胞。图39B示出了酪氨酸羟化酶染色，图39C示出了与图39A所示相同的五只胎猪的NeuN染色。图39D提供了图39A～39C的合并图像。HNA：人核抗原；TH：酪氨酸羟化酶。
图40提供了免疫组织化学图像，示出了采用TH(酪氨酸羟化酶)、DAPI和NeuN对黑质染色，以显示黑质多巴胺神经元。
图41提供了示出hiPSC互补诱导的黑质多巴胺神经元存活的柱状图。图41描述了在野生型猪(WT)、PITX3敲除猪(KO)、经hUCBSC互补的PITX3KO猪及经hiPSC互补的PITX3KO猪中，在全部黑质多巴胺神经元和中间黑质中的TH-免疫反应性(TH-IR)计数的估计值。
图42提供了LMX1A/PITX3和多巴胺神经元发育的示意图和图像。插图与图17的采用TALEN进行LMXA1和PITX3基因敲除的相同。
图43提供了示出具有多巴胺神经元敲除和GFP表达猪卵裂球互补的嵌合猪的制备的示意图。按照本文所述制备LMX1A/PITX3敲除的成纤维细胞。将野生型猪卵裂球引入到来源于敲除成纤维细胞的LMX1A/PITX3囊胚内，以创建嵌合囊胚。嵌合囊胚发育成拥有源自供体的免疫系统器官/细胞的嵌合猪。
图44A～44F提供了在PITX3/LMX1A中的猪-猪互补挽救胎儿发育的图像。图44A～44C例示出了基于妊娠期发育的正常尺寸，得到成功互补的PITX3/LMX1A敲除胎儿。图44D～44F示出了胚胎发育不良，表明互补差。
图45A示出了对野生型胎猪晶状体(L)的苏木精和伊红(H&E)染色。图45B例示了在PITX3敲除胎儿的晶状体(L)发育缺失。R＝视网膜，C＝角膜。
图46A～C提供了苏木精和伊红(H&E)染色，表明在采用猪卵裂球细胞进行干细胞互补后，PITX3/LMX1A敲除(KO)中的猪-猪互补恢复了晶状体发育。
图47A～47D描述了供体GFP+细胞贡献于胎猪脑的免疫组化图像。图47B～47D是图47A相应部分的详细放大图。
图48A～48C提供了酪氨酸羟化酶的免疫组化图，表明猪-猪互补导致PITX3/LMX1A敲除胎猪中的原始腹侧中脑(VM)内DA神经元发育。图48A～48C中所示的VM源自基于顶臀长度显示发育正常的胎儿。
图49提供了示出RAG2和IL2Rg对于T细胞、B细胞和NK细胞发育来说非常重要的示意图。
图50提供了示出RAG2和IL2Rg对于胸腺发育来说非常重要的示意图。
图51提供了造血系统敲除和经表达GFP的猪卵裂球互补的程序的示意图。按照本文所述制备IL2Rg/RAG2敲除的成纤维细胞。将野生型猪卵裂球引入到IL2RG/RAG2敲除的囊胚中，以创建嵌合囊胚。嵌合囊胚发育成拥有源自供体的免疫系统器官/细胞的嵌合猪。
图52A～52C提供了说明在IL2Rg/RAG2/C-KIT敲除中的互补导致胸腺产生的图像。野生型猪胎儿发育了胸腺(图52A)，但IL2Rg/RAG2敲除的猪胎儿中未发育出胸腺(图52B)。经来自野生型动物的卵裂球互补，导致在嵌合的IL2Rg/RAG2/C-KIT敲除猪体内的胸腺发育(图52C)。
图53提供了示出嵌合猪体内产生了GFP+免疫细胞的图。从脐带血、胸腺、脾、外周血单核细胞(PBMC)和肠系膜淋巴结(MLN)收集细胞。活细胞在不染色的情况下进行FACS分析。活细胞中的GFP+细胞的百分比示于各图中。
图54A～54F提供了示出胸腺中免疫细胞生成的图。收集来自野生型猪胚胎(图54A～54C)和嵌合猪(图54D～54F)的胸腺的细胞，并对T细胞、B细胞和NK细胞进行染色。对这些细胞进行FACS分析。嵌合猪胸腺中的免疫细胞组成与野生型猪的类似。
图55提供了示出在IL2Rg/RAG2/C-KIT敲除猪的互补在血液中产生了T细胞(CD172a-CD2+CD3+)的图。从野生型猪胚胎、嵌合猪胚胎和敲除猪胚胎的血液中收集细胞，并进行染色。对收集的细胞进行FACS分析，以对T细胞进行鉴定和计数。
图56提供了示出在IL2Rg/RAG2/C-KIT敲除猪中的互补在脾中产生了T细胞(CD172a-CD2+CD3+)的图。从野生型猪胚胎、嵌合猪胚胎和敲除猪胚胎的脾中收集细胞，并进行染色。对收集的细胞进行FACS分析，以对T细胞进行鉴定和计数。
图57提供了示出在IL2Rg/RAG2/C-KIT敲除猪中的互补在血液中产生了B细胞(CD3-CD79a+CD21+或CD21-)的图。从野生型猪胚胎、嵌合猪胚胎和敲除猪胚胎的血液中收集细胞，并进行染色。对收集的细胞进行FACS分析，以对B细胞进行鉴定和计数。
图58提供了示出在IL2Rg/RAG2/C-KIT敲除猪中的互补在脾中产生了B细胞(CD3-CD79a+CD21+或CD21-)的图。从野生型猪胚胎、嵌合猪胚胎和敲除猪胚胎的脾中收集细胞，并进行染色。对收集的细胞进行FACS分析，以对B细胞进行鉴定和计数。
图59提供了示出在IL2Rg/RAG2/C-KIT敲除猪中的互补在血液中产生了NK细胞(CD172a-CD16+CD2+)的图。从野生型猪胚胎、嵌合猪胚胎和敲除猪胚胎的血液中收集细胞，并进行染色。对收集的细胞进行FACS分析，以对NK细胞进行鉴定和计数。
图60提供了示出在IL2Rg/RAG2/C-KIT敲除猪中的互补在脾中产生了NK细胞(CD172a-CD16+CD2+)的图。从野生型猪胚胎、嵌合猪胚胎和敲除猪胚胎的脾中收集细胞，并进行染色。对收集的细胞进行FACS分析，以对NK细胞进行鉴定和计数。
图61提供了示出PAX3调控肌生成的示意图。
图62A和62B提供了示出小鼠的PAX3突变的图像。图62A描述了野生型小鼠和PAX3突变体小鼠之间的对比。斑点延迟(splotchdelayed)小鼠携带PAX3基因突变的等位基因。在P0，产后斑点延迟的动物显示出现脊柱裂(红色箭头)。四肢肌肉水平未发生肌生成(白色箭头)。图62B描述了采用PAX3突变体小鼠进行囊胚互补的效果。与野生型嵌合体相比，Act-GFP iPSC优先作用于PAX3突变嵌合体中的四肢骨骼肌。
图63提供了PDX1调控胰腺发育的示意图。
图64提供了NKX2.1调控肺发育的示意图。
图65提供了示出OLIG1/OLIG2对于少突胶质细胞发育重要的示意图。
图66A～66C提供了示意图、电泳图像和图，以示出OLIG1/OLIG2敲除的成纤维细胞制备。采用TALEN技术产生如本文所述的敲除。图66A说明了制备OLIG1/OLIG2敲除动物的策略。采用ssOLIGl CDS和OLIG2CDS，将终止密码子分别引入到OLIG1和OLIG2的开放阅读框内。这两种多核苷酸还引入Hind III限制位点用于RFLP分析。图66B是电泳图像，采用RFLP分析证明了在OLIG1和OLIG2基因中引入了终止密码子。图66C提供了野生型(WT)细胞和OLIG1/OLIG2敲除细胞的三个集落的测序结果，以证明在突变体基因组的OLIG1和OLIG2基因的开放阅读框内引入了终止密码子。
图67A和67B提供了经表达GFP的猪卵裂球互补的OLIG1/OLIG2敲除猪胎儿的图像。野生型卵裂球表达被引入到OLIG1/OLIG2敲除囊胚内。图69A示出了妊娠30天的猪胎儿。图69B示出了经GFP互补的猪胎儿的全身荧光成像图。
图68A和68B提供了示出表达GFP的猪卵裂球有助于OLIG1/OLIG2敲除胎猪脑的图像。图68A是胎猪脑的图像。图68B是示出在嵌合胎猪脑中的GFP表达的图像，表明在敲除胎猪脑中并入了野生型供体细胞。
图69A和69B提供了经GFP-卵裂球互补的OLIG1/OLIG2敲除(KO)猪脊髓中的GFP-标记的3-D重建图像。图71A是冠状位重建图像。图71B是侧面重建图像。
图70提供了HHEX调控肝脏发育的示意图。
图71提供了第100天(妊娠)Il2rg/Rag2(RG-KO)猪的FACS数据的点状图，示出了T细胞的百分比(CD172a-CD2+CD3+)。
图72提供了第100天(妊娠)Il2rg/Rag2(RG-KO)猪的FACS数据的点状图，示出了B细胞的百分比(CD3-CD79a+CD21+)。
图73提供了第100天(妊娠)Il2rg/Rag2(RG-KO)猪的FACS数据的点状图，示出了NK细胞的百分比(CD172a-CD16+CD2+)。
图74A～74C描述了囊胚互补后，在Pax3突变的嵌合小鼠中形成完整的后肢肌肉。图74A提供了向Pax3突变小鼠囊胚内引入野生型小鼠IPSC(诱导多能干细胞)的示意图。图74B是PAX3纯合的嵌合小鼠中存在后肢的图像。虚线指示对后肢下部进行组织学研究的断面(图74)。图74C提供了后肢下部断面的组织学图像。图74C的图例：TP：胫骨后肌；TA：胫骨前肌；EDL：趾长伸肌；FHL：拇长屈肌；FB/FL：腓骨短肌/长肌；Sol：腓骨长肌；M-Ga：内侧腓肠肌腱膜；L-GA：外侧腓肠肌腱膜。
图75A～75F描述了PAX3突变猪重现了PAX3突变小鼠的表型。图75A是采用如本文所述的TALEN方法敲除PAX3基因的示意图。图75B提供了电泳图像，表明使用如本文所述的RFLP分析证明了突变细胞。图75C～75F提供了野生型动物和突变动物对比的图像。图75C和75D分别是野生型和突变猪在E30时的图像。图75E和75F分别是野生型和突变小鼠在E12.5时的图像。在野生型动物中(猪和小鼠，图75C和75E)，存在后肢，而突变动物中(猪和小鼠，图75D和75F)后肢发育受到显著影响。
图76A～76D描述了PAXs突变猪出现四肢骨骼肌丢失。图76A是野生型猪胚胎在E30时的图像。图76B是突变猪胚胎在E30时的图像。在图76A和76B中，虚线都指示图76C和76D在免疫组织化学研究所进行的断面。图76C提供了野生型动物后肢的结蛋白、MHC和Pax7染色的图像。图76D提供了突变动物后肢的结蛋白、MHC和Pax7染色的图像。
图77提供了电泳图像，描述了妊娠第100天的仔猪中的IL2Rg/RAG2(RG-KO)敲除。分娩前两周收获仔猪，并进行基因分型。观察到IL2Rg/RAG2双等位基因敲除的预期RFLP条带图案。2号仔猪的细胞用于向C-Kit基因中增加另一突变。
图78A～78C描述了在IL2Rg/RAG2RG-KO细胞中并入V831M，以产生IL2Rg/RAG2/C-KIT(RGK)细胞。图78A提供了C-KIT基因中引入突变的位置的示意图和C-Kit V831M HDR的多核苷酸设计。图78B提供了猪C-KIT蛋白的一部分与要被替换的氨基酸残基的小鼠C-KIT蛋白的比对。图78A和78B表明鉴定了正确的残基。图78C提供了电泳图像，证明在基因组中引入了突变。克隆285和286是V-M RFLP纯合阳性的示例。
图79提供了测序图，证明细胞基因组中并入了C-Kit基因突变。克隆162、285和286包含V831M突变。这些克隆用于嵌合体的制备。
图80提供了IL2Rg/RAG2/C-KIT嵌合胎儿的基因分型分析的电泳图。红框所示的未被切割条带表明胎儿可能是嵌合型。
具体实施方式
本发明提供了改造和制备可存活且真正的人类器官，如心脏、肝脏、肾脏、肺、胰腺和骨骼肌；及细胞，如神经元和少突胶质细胞、免疫细胞及用于形成血管的内皮细胞的方法。实现这一目的的策略是破坏对于特定器官发育非常重要的关键基因。采用基因编辑技术敲除特定基因，来评价这些基因，以在敲除鼠和猪的囊胚中的这些基因时，确定哪些基因单独或组合可以产生特定的器官或细胞类型。囊胚中的这种基因敲除可以创建一生态龛(niche)，正常的同系或异系干细胞将占据该生态龛，以有助于期望的器官或细胞的发育(图1)。采用TALEN、CRISPR和人工合成猪染色体的新型基因编辑和基因调控技术，用于敲除期望的靶基因，并且用于增强其它基因的功能，可以最大程度地减少脱靶效应。审查人类干细胞，以确定哪类干细胞能够引起特定的人类器官和细胞的强有力的复制。这个问题通过评估各种人类干细胞对猪囊胚内细胞团和对发育嵌合胎的作用得到解决。这三种技术领域的相互作用对于成功创建真正的人类器官和细胞是非常重要的。
定义
在进一步描述本发明之前，为了方便起见，将说明书、实施例和所附权利要求书中使用的某些术语收集如下。
本文所使用的“人源化”指的是从非人类动物收获的器官或组织，其蛋白质序列和遗传互补与人类的相似度高于与非人类宿主的相似度。
本文所使用的“器官”指的是结合在一结构单元中以发挥常见功能的组织的集合。“组织”指的是一起执行特定功能的类似细胞的集合。
本文所使用的“大范围核酸酶”是另一种用于基因编辑的技术，并且是以大识别位点(12～40个碱基对的双链DNA序列)为特征的脱氧核糖核酸内切酶；因此，这种位点在任何给定基因组中通常仅出现一次。例如，I-Scel大范围核酸酶所识别的18-碱基对序列平均要求基因组的尺寸是人类基因组尺寸的20倍才能够偶尔被发现一次(尽管单错配序列发生大约三次/人类尺寸的基因组)。因此，大范围核酸酶被视为特异性最高的天然出现的限制性酶。
术语“靶向基因”指的是通过核酸内切酶系统(如TALEN或CRISPR)的设计，在染色体DNA上的经选择用于核酸内切酶攻击的位点。
基因编辑，作为本文所使用的术语，指的是选择一基因，并对其进行更改。随机插入、基因捕获等不是基因编辑。基因编辑的实例有：在靶向位点，进行基因敲除、添加核酸、移除核酸、消除所有功能、等位基因渗入、超等位基因更改、亚等位基因更改以及一个或多个等位基因的替换。
术语“敲除、失活和破坏”及其变化形式互换使用，指的是通过任何手段清除或极大减少基因表达产物，以使基因表达在整体上不再对动物具有显著影响。这些术语有时候在别的地方使用，指的是显著降低基因的作用，但基本上没有消除其作用。这些术语通常指的是防止形成功能性基因产物。基因产物仅在履行其正常(野生型)功能时才具有功能。基因的破坏防止由该基因编码的功能性因子的表达，包括基因在动物体内表达所必须的基因和/或启动子和/或操纵子编码的序列中插入、缺失或替换一个或多个碱基。被破坏的基因可以通过以下方式被破坏：例如，移除动物基因组的基因的至少一部分，更改基因以防止由该基因编码的功能性因子的表达、干扰RNA，或由外源基因表达显性负性因子。
除某些情况下的简并取代之外，术语等位基因的“替换”指的是从天然等位基因变为外源等位基因，且没有插入缺失或其它变化。
术语“简并取代”指的是密码子中的碱基改为另一碱基，但编码的氨基酸未发生变化。简并取代可以选择在外显子中或内含子中发生。简并取代的一个用途是建立限制性位点，从而能够简单地测试渗入序列的存在。内源等位基因亦称为天然等位基因。
术语“基因”是广义的，指的是染色体DNA，其经表达得到功能产物。
术语“选择”用于指鉴定和分离出细胞供进一步使用的能力；本方法的任何地方都没有可表达的报告子基因，这是区分本方法与其它许多方法的显著优点。
术语“囊胚”在本文中被广泛使用，指的是从两个细胞到大约三周的胚胎。
术语“胚胎”被广泛使用，指的是从受精卵至出生的动物。
术语“配子形成”指的是单倍体生殖细胞(卵子和精子)的产生，每个生殖细胞携带来源于各亲代生殖细胞系的亲代遗传互补的一半。精子的产生是精子发生。受精期间精子和卵子融合得到含二倍体基因组的受精卵细胞。
术语“配子形成细胞”指的是卵子或精子的祖代细胞，通常是生殖细胞或精原细胞。
术语“大型脊椎动物”指的是猿、牲畜、狗和猫。
术语“牲畜”指的是通常为了食物而饲养的动物，如牛(cattle)、绵羊、山羊、鸟(鸡、火鸡)、猪、水牛(buffalo)和鱼。
术语“同种的/同种物(cognate)”指的是通常相互作用的两个生物分子，例如，受体和其配体。在HDR方法的情况中，一个生物分子可能经设计以具有与预期(即同种的)DNA位点或蛋白质位点相结合的序列。
术语“插入”被广泛使用，指字面意义上的插入到染色体内，或指利用外源序列作为模板进行修复。
术语“外源核酸”指的是被添加到细胞或胚胎中的核酸，而不管该核酸与细胞中天然存在的核酸序列是相同或不同。术语“核酸片段”是广义的，包括染色体、表达盒、基因、DNA、RNA、mRNA或它们的一部分。细胞或胚胎可能，例如，选自包括非人类脊椎动物、非人类灵长目动物、牛、马、猪、绵羊、鸡、鸟、兔、山羊、狗、猫、实验室动物和鱼的组。
本文所使用的“可操作的连接”指的是调控区相对于核酸序列的定位，以便允许或方便靶核酸的转录。
本文所使用的“等位基因的替换”指的是以超过内源等位基因的方式拷贝外源等位基因的非-减数分裂过程。基因具有等位基因。如果特定基因座具有两个相同的等位基因，则基因型是纯合的，如果两个等位基因不同，则基因型是杂合的。等位基因是位于特定染色体上的特定位置处的基因的替代形式(一对的一个成员)。等位基因决定不同的性状。等位基因在其DNA序列的特定位置(有区别的位置或bp)具有碱基对(bp)差异，这导致不同的性状，并且使彼此区分开，这些有区别的位置起到等位基因标记物的作用。如果等位基因在有区别的位置上具有相同的碱基，则该等位基因通常被描述为，且在本文中被描述为是相同的；动物在其它位置的其它bp处天然具有某些变化。比较等位基因时，本领域技术人员常规纳入了这些变化。术语“完全相同”在本文中指的是在DNA比对中，绝对不存在任何bp差异或插入缺失。
遗传互补
传统上讲，遗传互补指的是两个不同的突变在二倍体或异核体中组合时产生野生型表型。但是，现代嵌合体制备技术现在可依赖干细胞互补，从而一种以上的胚胎来源的细胞组合，以得到一个遗传上混合的动物。在这种情况中，互补不涉及个别染色体基因型的任何改变；更确切地说，它表示基因产物的混合。互补在两种类型的细胞处于同一胚胎中且可以各自提供一种功能时发生。然后，各自的染色体保持不变。在嵌合体的情况中，互补在两组不同的染色体在同一胚胎中活化时发生。但是，这种互补得到的子代可能携带每种基因型的细胞。在胚胎互补中，宿主胚胎的基因被编辑，以产生敲除或者以其他方式得到非功能性基因。当将人类干细胞注入到经基因编辑的囊胚中时，它们可以挽救或“互补”宿主(经编辑的)基因组的缺陷。当被敲除的一个或多个基因支持特定器官或组织的生长时，经互补所产生的组织可以是非编辑的，例如，干细胞来源的基因型的生长和分化的结果。当人类干细胞用于互补宿主经编辑的基因组时，所得到的组织或器官可以由人类细胞构成。通过这种方式，可以采用其它动物作为用于通过互补产生器官的宿主，在体内产生完全为人类的器官。
由于多个基因可能负责任一特定器官或组织的生长和分化，因此，还描述了多重基因编辑方法。可以对细胞或胚胎中的多个基因进行修饰或敲除，这可用于研究或用于制备全嵌合动物。这些实施方式包括，通过选择性减少宿主生态龛(niche)来进行细胞或器官丢失的互补。这些发明快速创建了用作模型、食物，和用作工业和医药的细胞和细胞产物来源的动物。
图1示意描述了使用猪作为宿主动物，向有需要的人提供个性化的人类器官和组织时存在的问题和所提出的建议。本领域技术人员可以认识到，允许产生诱导多能干细胞(IPSC)的技术使得患者能够提供他或她的自身干细胞用于进行经编辑的基因的互补，制备人类或人源化的“自身”器官或组织。
采用多重基因编辑对于制备需要互补的具有多个经编辑的基因的宿主动物非常重要。图2A提供了一张时间表，例示了为什么采用单编辑来获得仅具有两个经编辑的等位基因的牲畜需要几年的时间，对于牛来说需要大约六年的时间。在本发明中，编辑指的是选择基因并改变它。首先，必须对培养的体细胞中感兴趣的基因进行编辑，例如敲除(KO)，该培养的体细胞经克隆以创建具有靶向KO的杂合小牛。这种杂合子饲养到发育成熟，牛大约是2岁大，生成第一代(F1)雄性和雌性杂合牛，这些杂合牛互相交配，得到纯合敲除的牛(F2)。在牛中采用传统方式得到多靶向突变的纯合子是不切实际的。如图2B所示，根据所采用的具体方案，用于进行进一步编辑的年数和动物的数量近似呈指数级增加。在脊椎动物中，即使那些牛相比，每一代具有更多子代且具有更短妊娠期的动物，实现多重编辑所需的时间也过长。例如，猪每次交配产下的子代数量比牛多，妊娠期比牛短约一半，但进行多重编辑也可能需要许多年。此外，对于多重编辑来说，通过强制的近亲交配最大程度的缩短时间可能并不合理可行。另外，从过程和结果的观点来看，连续克隆也并不理想，特别是在动物要用作牲畜或实验室模型的情况中。
图3中示出了本发明提出的一个机会，其中示出了在第一代动物(F0)中进行的多重编辑。直接制备胚胎，或通过独立选择为杂合子或纯合子的两次或多次编辑克隆来制备胚胎，然后将胚胎置于代孕雌性体内进行孕育。得到的动物是F0代原代动物。可以制备多个胚胎，将它们置于一个或多个代孕体内，制备两种性别的子代，或可以采用熟知的胚胎分割技术来获得多个克隆胚胎。牲畜(如猪)通常产下两种性别都有的幼仔，它们可以杂交和繁殖。
如本文所述，可以采用靶向核酸内切酶和同源介导修复(HDR)，来破坏或以其他方式编辑细胞或胚胎中的多个等位基因。一个实施方式是一种在脊椎动物细胞或胚胎中，在多个染色体DNA靶位点处进行基因编辑的方法，该方法包括向脊椎动物的细胞或胚胎中引入：定向于第一染色体DNA靶位点的第一靶向核酸内切酶，和与第一靶位点序列同源的第一同源介导修复(HDR)模板；以及，定向于第二染色体DNA靶位点的第二靶向核酸内切酶，和与第二靶位点序列同源的第二HDR模板，其中第一HDR模板序列替换第一靶位点处的天然染色体DNA序列，第二HDR模板序列替换第二靶位点序列处的天然染色体DNA序列。
结果出乎意料，令人吃惊，且无法预测地发现可以实现多重编辑，如敲除或替换。一种理论化的机制是，有少量细胞因为处于细胞周期的特定阶段而容易接受多重编辑。当暴露于核酸内切酶和HDR模板时，它们很容易做出响应。一种相关的操作理论是使用HDR模板的过程提供其自身用于多重取代，因为用于一个靶向位点的细胞修复机制的激活有利于修复，或HDR模板，其它位点情况也是如此。过去，HDR是一种低效的方法，因此人们显然未尝试、留意或认可多重HDR编辑。
到目前为止，以前的异种互补实验仅在单编辑基因组上进行。但是，所公开的用于多重基因编辑的平台现在提供了具有经多重编辑的基因的宿主囊胚，从而允许采用人类干细胞来互补这些编辑，并且产生由此得到的器官和组织。
本文的结果表明，过多或过少的核酸内切酶和/或HDR模板都会有不良影响，这可能会把本领域的现有研究难住。实际上，人们已经观察到，靶向核酸内切酶可以经设计并且正确获得，但仍然会失败，因为它们过于有效。此外，经成功修饰的细胞的群常常不会随时间而得到改善。修饰细胞的技术人员一般希望细胞的寿命长，并寻求作为成功克隆或其它用途的稳定性和健康指标的修饰。但是，这种期望常常对于本文的多重编辑过程没有帮助。此外，已经观察到，与单基因座渗入相比，同源重组(HR)的渗入效率在多重方式中是可变的。一些基因座非常敏感，但其它基因座的效率下降很大。核酸内切酶之间显然存在干扰，但是，不能例如通过假定核酸内切酶竞争共同的资源，来简单地解释净效应。
有各种熟知的技术，用于在染色体DNA的多个位点中随机或不准确地插入许多基因，或用于进行许多随机编辑，以破坏多个基因。显然，随机或不准确的过程并不能为需要编辑多个特定靶向基因从而实现某种效果的科学家提供帮助。因此，可以通过仅在预定的靶向位点处进行编辑及得到的有机体，而很容易地区分出本文教导的HDR过程。一个差异是，可以在不插入其它额外的基因拷贝，和/或在不破坏除核酸内切酶靶向的基因之外的其它基因的情况下，执行有创造性的HDR编辑实施方式。另外，特定编辑在一个位置进行，因为HDR模板序列不被拷贝到无适当同源性的位点内。实施方式包括有机体和方法，其中外源等位基因仅被拷贝到其同种等位基因位点处的染色体DNA内。
基于HDR的编辑的优点是可以选择编辑。相比之下，采用非同源末端连接(NHEJ)法进行的其它尝试会在多个位置导致插入缺失，由此这些插入缺失可相互抵消，不会造成移码。当涉及多重基因编辑时，这个问题变得非常明显。但是，成功使用HDR可以进行编辑，以确保(如果需要的话)靶基因具有预定的移码。此外，等位基因替换需要HDR，且不能通过NHEJ、载体驱动的核酸插入、转座子插入等来完成。此外，选择无不需要的编辑的有机体进一步增大了难度。
但是，通常认为，本文描述的多重编辑以前还未在与牲畜或大型脊椎动物有关的细胞或动物的靶向位点上实现。众所周知，从高代次细胞克隆动物所创建的动物很多的遗传损伤，以致于它们无法用作实验室模型或牲畜的F0原代动物。
另外，基因编辑是一个随机过程；因此，本领域传统上强调采用各种筛选技术，来鉴定出已经被成功编辑的很少百分之比的细胞。由于是随机过程，本领域技术人员可预期进行多个编辑的难度随预定编辑数量的增加而以指数级方式增加。
本发明的一个实施方式提供了在单细胞或胚胎中创建多靶向基因敲除或其它编辑的方法，一种在本文中被称为多重基因敲除或编辑的方法。
等位基因同一性的类似测试是将被更改的有机体中的染色体DNA与天然识别的外源等位基因的染色体DNA进行比对。外源等位基因可以具有一个或多个等位基因标记物。标记物上游和下游的DNA比对在一定距离上可以是相同的。根据期望的试验，这一距离可以是，例如，10至4000bp。虽然HDR模板预期可以创建完全相同的序列，但是，模板区任一侧的碱基当然可以具有某些自然变异。尽管存在自然变异，但本领域技术人员能够常规区分出等位基因。本领域技术人员能够立即认识到，以下述任一距离作为上限或下限，可以设想所示界限之间的所有范围和数值：15、25、50、100、200、300、400、500、600、800、1000、1200、1400、1600、1800、2000、4000。
本领域技术人员还能够区分对等位基因的基因编辑，其是与有性繁殖不同的基因编辑的结果。当等位基因来源于无法通过有性繁殖来混合等位基因的另一个物种时，是不重要的。而且，许多编辑在自然界中根本没有找到。当等位基因从一个品种迁移到下一品种时，甚至当替换准确复制另一个品种中天然存在的等位基因时，也可以很容易地区分编辑。等位基因大部分时间都稳定地位于DNA上。但是，配子形成期间的减数分裂导致雄性和雌性DNA偶尔互换等位基因，这一事件被称为交换(crossover)。交换频率和遗传图谱已经得到了广泛的研究和开发。在牲畜的情况下，动物的谱系可以非常详细地跟踪许多代。在遗传学中，厘摩(cM，亦称为图谱单位(m.u.))是衡量遗传联锁的单位。厘摩被定义为染色体位置(基因座或基因座标记物)之间的距离，对此，单代的介入染色体交换(interveningchromosomal crossover)的预期平均数是0.01。与染色体上彼此远离的基因相比，彼此靠近的基因发生交换的机会更低。当两个基因在染色体上彼此相邻时，很少发生交换。相对于其两个邻近的等位基因，单一等位基因的交换不太可能发生，因此，这种事件必须是遗传工程的产物。即使在涉及相同品种的动物的情况下，当亲代已知时，可以容易地确定是天然还是工程改造的等位基因替换。而且通过对可能的亲代进行基因分型，可以高准确性地确定系谱(parentage)。亲代确定对牲畜和人类来说都是常规的。
实施方式包括同时进行的多重基因编辑方法。术语同时与多次处理细胞从而实现多重编辑的假设方法形成对比，如在动物育种中的连续敲除或连续克隆或介入周期。同时意味着以有用的浓度同时存在，例如，存在多个靶向核酸内切酶。该方法可应用于受精卵和胚胎，以得到其中所有细胞或基本上所有细胞都具有经编辑的等位基因或敲除的有机体。例如，在敲除的情况中，基本上所有细胞指敲除了非常多的细胞的基因，以致于该基因实际上是缺失的，因为它的基因产物对于有机体的功能来说是不起作用的。这些过程在最少次数的细胞分裂，优选大约零至大约两次分裂期间，对细胞，和胚胎中的细胞进行修饰。实施方式包括快速法，或在不同时间期间发生的方法，或考虑到细胞分裂次数，例如：0至20次复制(细胞分裂)。本领域技术人员能够立即认识到，在此明确规定的限值范围之内的所有数值和范围都是可能的，例如，大约0至大约2次复制，大约0至大约3次复制，不超过大约4次复制，大约0至大约10次复制，10～17；低于大约7天，低于大约1、大约2、大约3、大约4、大约5或大约6天，大约0.5至大约18天，等等。术语低传代指的是进行了不超过大约20次的原代细胞。
在其它地方，已经表明，在单胚胎中，可以在牛和猪的胚胎中编辑母系、父系或它们两者的等位基因，因此，可以在胚胎中采用HDR，进行两个等位基因的模板编辑。这些编辑在相同基因座上进行。具体地，检测到来自姐妹染色单体的渗入。Carlson et al.,PNAS 43(109):17382-17387,2012。
实施例1，参见图4A～4D，描述了成功尝试了使用HDR编辑一次成功敲除两个基因，并且进一步，能够选择对于双基因敲除是纯合的或对于每一敲除是杂合的细胞的实验。对细胞进行处理，引入分别指向第一基因靶(重组激活基因2，RAG2)和第二基因靶(白细胞介素受体2，γ，IL2Rg或ILR2γ)的第一和第二靶向核酸内切酶(各自都为TALEN对)。TALEN必须被设计为靶向预定位点，并且获得足够的量。细胞处理时间少于5分钟。采用电穿孔法，但本文也描述了其它许多合适的蛋白质或DNA引入方法。然后，对细胞进行培养，以便使它们形成各细胞均起源于一个经处理的细胞的单一集落。3天或11天后对不同集落的细胞进行测试。RAG2的敲除率比IL2Rg的敲除率高大约6倍；显然，有些基因比其它基因更难敲除。这两个基因的敲除效率都很高，并且成功鉴定出了对于两个基因来说是杂合或纯合的敲除细胞。显然，TALEN mRNA的用量和HDR模板具有特异性和非特异性影响。IL2Rg的TALEN mRNA增加导致IL2Rg的NHEJ和HDR都增加，而RAG2的NHEJ水平不变。IL2Rg的HDR模板增加降低了RAG2基因座处的HDR，这表明寡核苷酸浓度的逐步增加非特异性抑制了同源介导修复。这种用量敏感性，特别是这些低用量时的敏感性，可能使其他人放弃对多重方法的追求。来自实施例1的细胞已经进行了克隆，在递交时，有两只动物怀上了源自这些细胞的胚胎。
实施例2，参见图5A～5D，描述了多重HDR编辑目标相同但基因不同的实验。第一基因靶是腺瘤性结肠息肉病基因(APC)。第二个基因靶是p53(TP53基因)。检测并分离了对于双敲除是纯合的细胞及双敲除是杂合的细胞。
实施例3，参见图6～9，描述了敲除2～5个基因的多重HDR编辑。有三个实验，每个实验用于测试基因型的细胞集落数是72～192个。对细胞进行处理，用于不同组合，基因APC、p53、RAG2、低密度脂蛋白受体(LDLR)、IL2Rg、Kisspeptin受体(KISSR或GPR54)和真核翻译起始因子4GI(EIF4GI)的多重敲除。基因LDLR一直比其它基因更不易被修饰。如从结果可以看出，采用TALEN-特异性同源介导修复(HDR)，可以同时破坏多个等位基因。五个TALEN对以三种组合进行共转染(表A)，其中五个TALEN对各自导致超过20％的HDR/位点及其同种HDR模板。来自各重复(replicate)的集落的一部分在至少四个基因中呈HDR事件阳性，来自重复-A的两个集落在五个基因中都具有HDR事件。虽然，在小鼠胚胎干细胞(ES或ESC，可互换使用)中，已经通过Cas9/CRISPR-刺激的NHEJ证明了在五个基因中同时发生插入缺失，但是，由靶向核酸酶刺激的HDR对5个基因(多达7个等位基因)的精确修饰是出乎意料、令人吃惊和无与伦比的。当重复的TALEN被替换为Cas9/CRISPR(载体被引入到细胞中进行表达)时，修饰水平检测不到(数据未示出)；但是，其它数据表明RGEN多重，例如下面的实施例9。发现有四个基因在所有实验中都进行了编辑，而在一个实验中五个基因都进行了编辑。
这种方法的速度和效率适于进行放大，从而可以在不改变方法性质的条件下，实现5个基因以上的多重敲除。参考表A，对大约72至192个细胞进行了测试；现在，已经建立了这种方法，将测试数量提高到数量非常多的细胞，以便可以预期实现更大数量的基因/等位基因的多重敲除并非是不合理的。多重基因或等位基因的数量可以是2～25个；本领域技术人员可以立即认识到，可以考虑在明显规定的界限之间的所有范围和数值，其中下述任一数值或其组合可以作为上限或下限：2、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、16、18、20、25。
显然，具有多重敲除的细胞和胚胎以及由此制备的动物是本发明的实施方式。
实施例4描述了制备各种动物的一些详细方法，并以举例的方式提到了某些基因。实施例5描述了CRISPR/Cas9设计和制备的实施例。
实施例6提供了采用靶向核酸酶驱动HDR方法进行多重基因编辑的进一步实施例。采用TALEN和HDR模板同时靶向GATA结合蛋白4(GATA4)，同源框蛋白NKX2-5(NKX2-5)和中胚层后方蛋白1(MESP1)，从而将移码突变和提前终止密码子导入各基因中。目的是创建每一基因的双等位基因敲除，用于互补研究中。该方法的效率是大约0.5％，因为2个克隆在每一基因处具有预定的双等位基因HDR。在没有实施互补时，给定基因的独立敲除或组合敲除会导致发育停滞基因型和早期胚胎死亡。本领域技术人员可以理解的是，在牲畜中，这些基因单独敲除和杂合子杂种繁殖以得到三敲除(大约1/66的可能性)用于FTT和互补研究是不可行的。
实施例7提供了TALEN和Cas9/CRISPR可联合使用来执行基因的多重编辑的数据。有些基因/等位基因更易于采用TALEN或Cas9/CRISPR来打靶，可能出现必须采用这些工具的组合进行多重编辑的情况。在此实施例中，采用TALEN打靶真核翻译起始因子4GI(EIF4GI)，采用Cas9/CRISPR打靶p65(RELA)基因。采用RFLP测定(指示HDR事件)来分析细胞，HDR在两个位点都很明显。因此，TALEN和RGEN可以联合或独立地用于多重编辑。在任一组合中，组合包括，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种TALEN与1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种RGEN试剂。
嵌合体
嵌合体可以通过制备宿主囊胚并且加入来源于供体动物的供体细胞来获得。得到的动物可以是拥有宿主和供体两者的细胞的嵌合体。有些基因对于胚胎创建特定种类的细胞和细胞系非常重要。当这样的基因在宿主细胞中被敲除时，引入拥有丢失基因的供体细胞，可以使这些细胞和细胞系在宿主胚胎内得到恢复；这些恢复的细胞具有供体的基因型。这一过程被称为互补过程。
Matsunari等人(PNAS 110:4557-4562,2013)描述了制造供体来源的猪胰腺的互补过程。他们制造了宿主猪囊胚，其经更改以防止形成功能性胰腺。他们通过体细胞克隆制造了宿主囊胚。体细胞已经经过了修饰，以在Pdxl启动子(胰腺和十二指肠同源框1)条件下过表达Hesl，它已知抑制胰腺的发育。向宿主囊胚中加入的供体细胞没有进行过这种修饰；供体细胞提供所需的细胞系来制造胰腺。他们已经在别处证明了，可以在无法形成器官的小鼠胚胎中通过囊胚互补，在体内由多能干细胞(PSC)生成功能器官。他们提出了采用异种多能干细胞(PSC)，包括人诱导PSC来开展未来的研究。实际上，40多年以来，异种移植一直被视为器官/组织短缺的可能解决方案。很明显，还没有敲除基因来阻止胰腺的形成。
采用传统方法时，在大型脊椎动物中即使敲除一个基因也是一项非常重大的资源投资。相比之下，采用现有技术，例如，采用质粒或载体将多个基因盒拷贝放置在基因组中，很容易在细胞中实现基因产物的过表达。添加基因表达比基因打靶和基因敲除简单。此时，人们认为，通过基因产物过表达来阻止器官形成的能力是不寻常的。事实上，改造大型动物基因组的能力非常受限制。尽管如此，猪由于其在大小和生理学上与人类相似，以及具有高繁殖力和生长速度而成为异种移植的优选的供体动物。
图10描述了本文采用的多重法，进行基因敲除和在嵌合体背景下应用于的其它基因编辑。通过基因敲除，制得低传代的原代体细胞。分离对于敲除正好具有所需的杂合性和纯合性分布的细胞。使用这些细胞进行克隆，制造能发育为宿主囊胚的胚胎。建立供体胚胎，并将其用作供体细胞来源，其中供体细胞提供基因以占据通过敲除创建的生态龛中。供体细胞被引入到宿主囊胚内，与宿主细胞一起繁殖，形成拥有宿主细胞和供体细胞两者的嵌合体。将胚胎转移到代孕雌性体内，并进行孕育。当宿主细胞形成配子时，嵌合体的子代拥有宿主基因型。嵌合体的性别由其宿主囊胚决定。
图11例示了生长停滞表型(FTT)的互补过程。FTT指的是预期活不到性成熟年龄的动物。宿主胚胎具有FTT基因型和表型。多重法是理想的，因为仅敲除一个基因可获得的FTT是有限的，而且对于一些器官和组织是未知的。供体细胞提供在FTT中丢失的基因，并提供丢失的细胞类型。胚胎可以是大型脊椎动物，敲除可以是多重敲除，例如，2～25个基因敲除。此外，靶向核酸内切酶可用于实现敲除。在免疫缺陷的实施方式中，IL2Rg-/y RAG2-/-敲除是FTT，因为宿主基本上丧失了免疫功能。但是，供体细胞不丢失这些基因，得到的嵌合体具有基本上正常的表型，用于能够饲养和维持动物。但子代具有FTT表型。因此，这些动物可以维持，方便地产生FTT动物。嵌合体可以是杂合敲除和纯合敲除的任意组合。因此，描述了制造嵌合体的方法，其中F0代动物产生生长停滞(FTT)表型，而其它方法需要额外的一代或更多代。
嵌合体正常传递宿主细胞的遗传特征。但是，本文公开的是将供体细胞的遗传特征，而非宿主细胞的遗传特征，传递给其子代的替代嵌合体。结果发现，基因遗传的转换可以创造一些有用的机会。参考图12，图中描述了标记为G-宿主的胚胎。胚胎采用非功能性配子制备。制备供体囊胚，并将其作为供体细胞的来源。供体细胞提供制造供体配子所需的基因和细胞系。所得嵌合体具有供体细胞的配子，并且创建具有供体细胞遗传特征的子代。在示例中，宿主胚胎是雄性婆罗门公牛(Brahman bull)。供体细胞来源于双肌公牛。嵌合体具有婆罗门公牛的表型，而其子代是双肌公牛的表型。宿主和供体可以来源于相同或不同的品种或来源于相同或不同的物种。宿主经制备是不育的，意味其无法有性繁殖。可采用某些不育的动物来制造非功能性配子，例如，不活动的精子，或者根本不产生配子，例如，早期配子形成被破坏。供体细胞可以是，例如，野生型细胞，来源于具有所需性状的动物品种的细胞，或经基因修饰的细胞。
本发明的实施方式包括染色体经基因修饰以阻止配子形成或精子生成的嵌合不育动物，如嵌合牲畜。染色体可以是X染色体、Y染色体或常染色体。修饰可能包括现有基因的破坏。可通过改变现有染色体基因使其不能被表达，或通过遗传表达可抑制基因转录或翻译的因子，来造成这种破坏。一个实施方式是敲除宿主中的精原干细胞(SSC)。动物可以采用具有所需遗传特征的供体细胞制造，并且提供SSC细胞来制造具有供体基因型的配子。有些基因被组合破坏，以产生导致不育的一种或多种影响，例如，以下组合：Acr/H1.1/Smcp、Acr/Tnp2/Smcp、Tnp2/H1.1/Smcp、Acr/Hlt/Smcp、Tnp2/Hlt/Smcp(Nayernia K；Drabent B；Meinhardt A；Adham IM；Schwandt I；Muller C；Sancken U；Kleene KC；EngelW Triple knockouts reveal gene interactions affecting fertility of malemice.Mol.Reprod.Dev 70(4):406-5 16,2005)。实施方式包括敲除了一个或多个第一基因的第一谱系动物，和敲除了一个或多个第二基因的第二谱系动物，以便这些谱系的雄性子代是不育的。
采用基因工程来创建经基因修饰的大型脊椎动物可以加快具有所需性状的动物的创建。传统的牲畜育种是一种价格昂贵且耗时长的过程，涉及仔细选择遗传性状，及漫长等待世代繁殖。即使对遗传性状进行了仔细选择，有性繁殖的变异也给所需性状组合的培育和传递带来了极大的挑战。而创建传递供体性状的嵌合体开创了能快速传递所需遗传性状，且保护对性状的专有控制的动物繁殖方法。实施方式包括产生在遗传上和基因上不育的动物，这些动物可作为供给遗传物质的宿主。宿主交配可导致供体遗传物质的复制。通过有性繁殖，一组遗传上不育的动物可通过有性繁殖用于传递来源于单一供体的相同基因，从而可以迅速生成许多供体子代。实施方式包括经修饰仅产生一种性别的动物，以便接收该动物的使用者无法简单地培育出具有这些性状的动物。
实施方式包括对细胞或胚胎进行基因修饰，以使对配子形成或精子活性具有选择性的一个基因或多个基因失活。一种基因修饰的方法涉及引入靶向核酸酶，例如，与基因特异性结合的Cas9/CRISPR或TALEN对的mRNA。从细胞克隆出动物，或直接在代孕雌性体内孕育经修饰的胚胎。动物可以是牲畜或其它动物。配子形成可以在早期被阻断。或者可以破坏精子活性，精子活性对生育力非常重要，但对于动物来说并不那么重要。动物因此是不育的，因为它不能有性繁殖：但是，ART可用于从经修饰的精子来创建子代。选择拥有所需遗传性状(作为育种和/或基因工程的结果)的供体动物。
快速建立具有两个或多个敲除的F0代原代动物品系
采用多重编辑，可以同时敲除两个、三个或更多个基因(2～25)，以产生具有所需等位基因组合的F0代。如果对于所有敲除的纯合性导致FTT，则一种选择是使原代除一个敲除之外对于其他所有敲除都是纯合的，或者，对这种情况的最低杂合性。一个杂合子基因允许有非-FTT表型。或者，多重敲除可以与互补组合使用，以制造具有FTT子代的强壮的嵌合体。这种方法可以在创建多敲除动物中消除传代。
在任一种情况中，优点都很多，使许多方法进入到实际可实现的范围。采用传统育种产生具有两个基因座敲除的动物在成本上是不可行的，因为仅约6％的子代在F2代中具有所需的表型(表B)。与此相比，多重编辑方式能够在F0代中得到所需的基因型，与传统敲除和育种相比优势较大。应该强调的是，节省时间和动物并非只是理论上的：这是一种进步，使得一些类型的修饰成为可能，因为预期会成功而不是失败。进一步地，为了继续该实施例，一个或两个嵌合RG-KO亲代之间的繁育将分别使RG-KO子代的生产率显著提高到25％和100％(表B)。
免疫缺陷动物
一组实施方式涉及免疫缺陷的猪或其它牲畜及它们的制造方法。这些实施方式是多重编辑，例如敲除的实施例，其利用了对选择纯合性和杂合性敲除基因型的管理的机会。这些证明了多重编辑快速建立原代谱系的能力。它们还包括本发明的涉及制造嵌合体的其它方面。
猪是在大小和生理学上与人类相似的最相关的非灵长目动物模型。遗憾的是，无法广泛获得完全免疫缺陷的猪，因为(1)单基因敲除(KO)通常不充分，(2)杂交来创建多座位缺失的动物的成本非常高，依赖于Kos的数量也许是可能的，及(3)仅可获得猪的小规模的无菌设施。在此处，实施方式包括具有RAG2和IL2Rg(即RG-KO)双敲除的大型脊椎动物。可以敲除掉体细胞中的这些基因，然后用于克隆以产生完整的动物。或者，对胚胎进行处理以敲除基因，动物直接来源于胚胎。多重基因打靶平台可以同时破坏猪中T、B和NK细胞的发育。因此，可以采用本文所述的方法直接制造不含这些细胞的动物作为F0原代，但表型是FTT。
用于多重编辑的农业靶
通过同时编辑多个基因座，可以极大地加快对食用动物基因组的编辑，节省了将等位基因(一次生成一个)放到一起要进行的多代动物育种。此外，有些农业性状比较复杂，意味着它们显然受不止一个基因(2个至数百个)的等位基因影响。例如，DGAT、ABCG2处的多态性，及染色体18上的多态性很大程度上共同导致了奶牛乳制品净价值的变化。牲畜的细胞或胚胎可以进行多基因的多重编辑，包括各种农业靶标：ACAN、AMELY、BLG、BMP IB(FecB)、DAZL、DGAT、Eif4GI、GDF8、Horn-poll基因座、IGF2、CWC15、KissR/GRP54、OFD1Y、p65、PRLR、Prmdl4、PRNP、Rosa、Socs2、SRY、ZFY、P-乳球蛋白、CLPG中的一个或多个。
多重编辑的疾病成模靶标
有些性状，如癌症，是在多基因突变的基础上导致的(参见APC/p53)。此外，许多疾病性状是所谓的复杂性状，显然是在一个以上的基因上的等位基因影响的结果。例如，糖尿病、代谢、心脏病和神经系统疾病被视为复杂性状。实施方式包括等位基因杂合和纯合的动物模型，或在不同的组合中与其它基因上的等位基因组合。例如，青少年的成人发病型糖尿病(MODY)基因座独立和附加地导致糖尿病，包括MODY 1(HNF4a)、MODY 2(GCK)、MODY 3(HNFlα)、MODY 4(Pdxl)、MODY 5(HNF-ip)、MODY 6(神经源性分化1)、MODY 7(KLF11)、MODY8(CEL)、MODY 9(PAX4)、MODY 10(INS)、MODY 11(BLK)。牲畜的细胞或胚胎可以进行用于动物成模的多基因的多重编辑，包括各种疾病成模靶标：APC、ApoE、DMD、GHRHR、HR、HSD11B2、LDLR、NF1、NPPA、NR3C2、p53、PKD1、Rbm20、SCNN1G、tP53、DAZL、FAH、HBB、IL2RG、PDX1、PITX3、Runxl、RAG2、GGTA。实施方式包括细胞、胚胎和动物，具有经编辑的上述一个或多个靶标，如KO。
一个物种的基因一直拥有其它物种的直系同源序列。人类和小鼠的基因一直拥有牲畜，特别是母牛、猪、绵羊、山羊、鸡和兔子的直系同源序列。这些物种与鱼之间的基因直系同源通常是一致的，这取决于基因的功能。生物学家熟悉发现直系同源基因的方法，因此，本文中可以描述其中一个物种的基因，而不需要列出其它物种的直系同源序列。因此，描述一个基因破坏的实施方式包括破坏其它物种中名称相同或不同的同源序列。有通用基因数据库及专门鉴定直系同源基因的数据库。此外，本领域技术人员熟悉基因的常用缩略语，在一个基因有不止一个缩略语或同一缩略语用于称呼两个基因时，可以根据上下文，确定指的是哪一个基因。
精原干细胞提供了第二种牲畜基因修饰方法。基因修饰或基因编辑可以在分离自供体睾丸的精原干细胞中体外执行。经修饰的细胞被移植到受体的生殖细胞被清除的睾丸内。植入的精原干细胞产生携带基因修饰的精子，可用于经由人工授精或体外授精(IVF)进行育种，以得到原代动物。
通过选择性减少宿主的生态龛，互补零形态(nullmorphic)细胞或器官丢失
多重编辑可用于有目的地从特定胚胎或动物的生态龛中去除细胞或器官，创建有助于供体细胞更好整合、增殖和分化的环境，通过互补胚胎、胎儿或动物的同源细胞、组织或器官来增强其贡献。拥有空生态龛的动物是有缺陷的承载体，因为这些动物创建时即具有缺陷，这些缺陷可以通过供体细胞和基因来填补。具体实例包括受体-消除，及配子形成细胞系(DAZL、VASA、MIWI、PIWI等)的供体-挽救。
在另一个实施方式中，多重基因编辑可用于诱导先天性脱发，为供体源细胞提供了参与毛囊形成的机会。多重基因编辑考虑的引起脱发的基因包括在OMIM和人类表型本体数据库中鉴定的基因；DCAF17、VDR、PNPLA1、HRAS、端粒酶-vert、DSP、SNRPE、RPL21、LAMA3、UROD、EDAR、OFD1、PEX7、COL3A1、ALOX12B、HLCS、NIPAL4、CERS3、ANTXR1、B3GALT6、DSG4、UBR1、CTC1、MBTPS2、UROS、ABHD5、NOP 10、ALMS1、LAMB3、EOGT、SAT1、RBPJ、ARHGAP31、ACVR1、IKBKG、LPAR6、HR、ATR、HTRA1、AIRE、BCS1L、MCCC2、DKC1、PORCN、EBP、SLITRK1、BTK、DOCK6、APCDD1、ZIP4、CASR、TERT、EDARADD、ATP6V0A2、PVRL1、MGP、KRT85、RAG2、RAG-1、ROR2、CLAUDIN1、ABCA12、SLA-DRA1、B4GALT7、COL7A1、NHP2、GNA11、WNT5A、USB1、LMNA、EPS8L3、NSDHL、TRPV3、KRAS、TINF2、TGM1、DCLRE1C、PKP1、WRAP53、KDM5C、ECM1、TP63、KRT14、RIPK4。具有卵泡形成潜力的供体细胞的嵌合性可用于使人类毛囊生长。猪或其它脊椎动物中的器官或组织的去除及人类来源的器官或组织的生长尤其可用于医用器官或组织的来源。
多重编辑的其它互补靶标有：PRKDC、BCL11a、BMI1、CCR5、CXCR4、DKK1、ETV2、FLU、FLK1、GATA2、GATA4、HHEX、C-KIT、LMX1A、MYF5、MYOD1、MYOG、NKX2-5、NR4A2、PAX3、PDX1、PITX3、Runxl、RAG2、GGTA、HR、HANDII、TBX5。
实施方式包括以多重编辑方法或其它方法对上述靶标中的一个、两个或更多个(2～25)个靶标进行打靶。
经编辑的基因
此处相对于具体靶标和靶向核酸内切酶所描述的方法和发明是广泛适用的。通过对下述所有基因进行编辑，制备了适于克隆的原代牲畜细胞。
经基因修饰的动物
可以采用将可遗传表达的标记物留在适当地方，允许其在人工繁殖过程中从动物体内消除的方法，或采用不在动物体内放置这样的标记物的方法，来制造对于染色修饰的单-等位基因或双-等位基因的动物。例如，已经采用了同源依赖性重组(HDR)的方法，来改变动物的染色体，或将外源基因插入到动物染色体内。TALEN和重组酶融合蛋白等工具，以及传统方法在本文的其它地方进行讨论。支持本文公开的基因修饰的一些实验数据总结如下。已经证明了，从经修饰的细胞的多基因群体进行克隆时具有出色的克隆效率，提倡采用本方式，以避免用于分离集落的体细胞核移植(SCNT)的克隆效率的变化(Carlson et al.,2011)。但是，此外，TALEN-介导的基因组修饰，以及重组酶融合分子进行的修饰，能够在一代中完成双-等位基因的更改。例如，对于敲除基因是纯合的动物可以通过SCNT来制造，而不需要采用近亲交配来实现纯合性。猪和牛等牲畜的妊娠时长和至繁殖年龄的成熟是研究和生产的重大障碍。例如，通过克隆和育种，从杂合的突变细胞(两种性别)产生纯合敲除，猪需要16个月，牛需要30个月。有人称通过基因修饰和SCNT的顺序循环，已经减轻了这种负担(Kuroiwa et al.,2004)，但是，这在技术上具有挑战性，而且因成本太高而受到限制，此外，有许多原因妨碍了用于制造F0动物的系列克隆，其中F0动物是实际用于制造大型脊椎动物实验室模型或牲畜的动物。在SCNT之前，常规产生双-等位基因KO细胞的能力是大型动物基因工程的一项重大进展。采用其它方法，如ZFN和稀释克隆，已经在永生细胞系中实现了双-等位基因敲除(Liu et al.,2010)。另一团体最近证明了采用商业ZFN试剂，得到猪GGTA1的双-等位基因KO(Hauschild et al.,2011)，其中双等位基因无效的细胞可通过FACS，筛选GGTA1-依赖性表面表位的缺失进行富集。虽然这些研究证明了某些有用的概念，但是，它们并未表明动物或牲畜可以被修饰，因为简单的克隆稀释对于原代成纤维细胞分离体来说通常是不可行的(成纤维细胞在低密度时生长极差)，而且对大多数基因来说，无法进行裸细胞(null cell)的生物富集。
可以采用靶向核酸酶诱导的同源重组，从而不需要连接选择标记物。通过同源依赖性修复(HDR)，TALEN可用于将特定等位基因精确转移到牲畜基因组内。在初步研究中，将特定的11bp缺失(比利时蓝牛等位基因)(Grobet et al.,1997；Kambadur et al.,1997)引入到牛GDF8座位中(参见U.S.2012/0222143)。当单独转染时，btGDF8.1TALEN对在靶座位处切割高达16％的染色体。与包含11bp缺失的超螺旋同源DNA修复模板共转染，第3天的基因转换频率(HDR)高达5％，且不需要对所需事件进行选择。在1.4％的经筛选的分离集落中鉴定出基因转换。这些结果表明，TALEN无需借助连接选择标记物，就可用于有效诱导HDR。
同源介导修复(HDR)
同源介导修复(HDR)是细胞中修复ssDNA和双链DNA(dsDNA)损伤的机制。当存在具有与损伤位点明显同源的序列的HDR模板时，细胞可以采用这种修复机制。特异性结合，正如该术语在生物学领域通常使用的那样，指的是分子以比非靶向组织高的亲和力，与靶标结合，通常涉及多种非共价相互作用，如静电相互作用、范德瓦耳斯相互作用、氢键结合等。特异性杂交是具有互补序列的核酸之间的特异性结合形式。蛋白质还与DNA，例如TALEN或CRISPR/Cas9体系中的DNA特异性结合，或通过Gal4基序与DNA特异性结合。等位基因渗入指的是采用模板-导向法，在内源等位基因上复制外源等位基因的一种过程。在某些情况下，内源等位基因可能实际上被外源核酸等位基因切除和替换，但是，目前的理论认为这一过程是一种复制的机制。由于等位基因是基因对，它们之间具有明显的同源性。等位基因可以是编码蛋白质的基因，或可以具有其它功能，如编码生物活性RNA链或提供接收调控蛋白或RNA的位点。
HDR模板是包含被渗入的等位基因的核酸。模板可以是dsDNA或单链DNA(ssDNA)。ssDNA模板优选为大约20至大约5000个残基，但也可以使用其它长度。本领域技术人员可以立即认识到的是，可以考虑在明确规定范围以内的所有范围和数值；例如，500至1500个残基，20至100个残基等。模板可以进一步包含侧翼序列，提供与内源等位基因或要被替换的DNA邻近的DNA的同源性。模板还包括与靶向核酸酶系统结合的序列，因此是系统的DNA-结合成员的同种结合位点。
靶向核酸内切酶系统
基因组编辑工具，如转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)和锌指核酸酶(ZFN)影响了生物技术、基因治疗和许多生物体内的功能性基因组研究的领域。最近，通过互补RNA分子，将RNA-导向核酸内切酶(RGEN)引导到它们的靶位点。Cas9/CRISPR系统是REGEN。tracrRNA是另一种此类的工具。这些是靶向核酸酶系统的实例：这些系统具有将核酸酶定位到靶位点的DNA-结合成员。然后，所述位点被核酸酶切割。TALEN和ZFN具有与DNA-结合成员融合的核酸酶。Cas9/CRISPR是在靶DNA上找到彼此的同种物。DNA-结合成员在染色体DNA中具有同种序列。DNA-结合成员通常根据指定的同种序列进行设计，从而在指定位点处或其附近获得溶核作用。有些实施方式不受限制地适用于所有这些系统；包括，使核酸酶-重新切割最小化的实施方式，在指定残基处高精度进行SNP的实施方式，及将渗入的等位基因置于DNA-结合位点。
TALEN
本文所使用的术语TALEN是广义的，包括可以在不需要另一TALEN帮助的情况下切割双链DNA的单体TALEN。术语TALEN还用于指经工程改造以共同作用，在同一位点切割DNA的一对TALEN中的一个或两个成员。共同作用的TALEN可被称为左-TALEN和右-TALEN，这参考了DNA或TALEN对的手性。
已经报道了TAL的密码(PCT公开WO 2011/072246)，其中每个DNA结合重复序列负责识别DNA靶序列中的一个碱基对。残基可经组装，以靶向DNA序列。简而言之，确定TALEN结合的靶位点，创建包含核酸酶和识别靶位点的一系列RVD的融合分子。结合后，核酸酶切割DNA，以便细胞修复机构可以操作，以在切割端进行基因修饰。术语TALEN指的是包含转录激活因子样(TAL)效应物结合结构域和核酸酶结构域的蛋白质，包括本身具有功能的单体TALEN以及需要与另一单体TALEN二聚化的其它TALEN。当两个单体TALEN相同时，二聚化可得到同型二聚体TALEN，或者，当两个单体TALEN不同时，二聚化可得到异型二聚体TALEN。已经表明，TALEN利用两个主要的真核DNA修复通路，非同源末端连接(NHEJ)和同源介导修复，在永生人类细胞中诱导基因修饰。TALEN通常成对使用，但也已知有单体TALEN。采用TALEN(及其它基因工具)处理的细胞包括培养细胞、永生细胞、原代细胞、原代体细胞、受精卵、生殖细胞、原始生殖细胞、囊胚或干细胞。在一些实施方式中，TAL效应物可用于将其它蛋白结构域(例如，非核酸酶蛋白结构域)靶向特定的核苷酸序列。例如，TAL效应物可以不受限制地从DNA 20相互作用酶(例如，甲基酶、拓扑异构酶、整合酶、转座酶或连接酶)、转录激活因子或抑制因子，或与其它蛋白(如组织蛋白)相互作用或修饰其它蛋白的蛋白质连接到蛋白域。这种TAL效应物融合蛋白的应用包括，例如，创建或修饰表观遗传调控元件，进行DNA中的位点-特异性插入、缺失或修复、控制基因表达，及修饰染色质结构。
术语核酸酶包括核酸外切酶和核酸内切酶。术语核酸内切酶指的是能够催化DNA或RNA分子，优选DNA分子内核酸之间的键的水解(切割)的任何野生型或变体型酶。核酸内切酶的非限制性实例包括II型限制核酸内切酶，如FokI、HhaI、HindlII、NotI、BbvCl、EcoRI、BglII和AlwI。核酸内切酶还包括稀切核酸内切酶，其多核苷酸识别位点的典型长度是12～45个碱基对(bp)，更优选是14～45个bp。稀切核酸内切酶在规定位点诱导DNA双链断裂(DSB)。稀切核酸内切酶可以是，例如靶向核酸内切酶，由经工程改造的锌指结构域与限制酶(如FokI)融合得到的嵌合锌指核酸酶(ZFN)，或化学核酸内切酶。在化学核酸内切酶中，化学或肽切割剂与核酸聚合物结合缀合或与识别特异性靶序列的另一DNA缀合，从而将切割活性靶向到特异性序列。化学核酸内切酶还涵盖已知与特异性DNA序列结合的合成的核酸酶，如邻二氮杂菲缀合物、DNA切割分子及三螺旋形成寡核苷酸(TFO)。这些化学核酸内切酶包括在根据本发明的术语“核酸内切酶”中。
这些核酸内切酶的实例包括I-See I、I-Chu L I-Cre I、I-Csm I、PI-See L PI-Tti L PI-Mtu I、I-Ceu I、I-See IL I-See III、HO、Pi-Civ I、PI-Ctr L PI-Aae I、PI-Bsu I、PI-Dha I、PI-Dra L PI-Mav L PI-Meh I、PI-Mfu L PI-Mfl I、PI-Mga L PI-MgoI、PI-Min L PI-Mka L PI-Mle I、PI-Mma I、PI-30Msh L PI-Msm I、PI-Mth I、PI-Mtu I、PI-Mxe I、PI-Npu I、Pl-Pfu L PI-Rma I、PI-Spb I、PI-Ssp L PI-Fae L PI-Mja I、PI-Pho L Pi-Tag L PI-Thy I、PI-Tko I、PI-Tsp I、I-Msol。
采用TALEN或其它工具开展的基因修饰可以，例如，选自由插入，缺失，外源核酸片段的插入，和取代组成的组。一般说来，鉴定处DNA靶位点，并创建能够与该位点特异性结合的TALEN对。例如，作为蛋白质、mRNA，或通过编码TALEN的载体，将TALEN递送到细胞或胚胎内。TALEN切割DNA以形成双链断裂，然后对该双链断裂进行修复，这通常导致形成插入缺失，或并入在伴随的外源核酸中所包含的序列或多态性，该外源核酸被插入到染色体中，或起到使用经修饰的序列修复断裂的模板的作用。这种模板驱动的修复是改变染色体的有用的方法，为细胞染色体提供有效的改变。
一些实施方式涉及制造经基因修饰的牲畜和/或偶蹄目动物的组合物或方法，包括将TALEN对引入到牲畜和/或偶蹄目动物的细胞或胚胎内，其在TALEN对特异性结合的位点处对细胞或胚胎的DNA进行基因修饰，并且从所述细胞产生牲畜动物/偶蹄目动物。细胞或胚胎可以被直接注射到，例如，受精卵、囊胚或胚胎内。或者，可以采用任意熟知的用于引入蛋白质、RNA、mRNA、DNA或载体的技术，将TALEN和/或其它因子引入到细胞内。可以按照已知的方法，例如，将胚胎植入到受孕宿主体内，或各种克隆方法，从胚胎或细胞制造经基因修饰的动物。术语“在TALEN特异性结合的位点处对细胞的DNA进行基因修饰”等，指的是在TALEN与其靶位点特异性结合时，被TALEN上的核酸酶切割的位点处进行基因修饰。核酸酶并非在TALEN对结合处准确切割，而是在两个结合位点之间的确定位点处切割。
一些实施方式涉及细胞的组合物或处理，该细胞用于克隆动物。该细胞可以是牲畜和/或偶蹄目动物的细胞、培养的细胞、原代细胞、原代体细胞、受精卵、生殖细胞、原始生殖细胞或干细胞。例如，一个实施方式是创建基因修饰的组合物或方法，包括将培养物中的多个原代细胞暴露于TALEN蛋白质或编码一种TALEN或多种TALEN的核酸。TALEN可作为蛋白质或核酸片段的方式引入，例如，由mRNA或载体中的DNA序列编码。
锌指核酸酶
锌指核酸酶(ZFN)是通过锌指DNA-结合结构域与DNA-切割结构域融合产生的人工限制酶。锌指结构域可以经工程改造，以靶向期望的DNA序列，这样使锌指核酸酶能够靶向复杂基因组内的唯一序列。利用内源DNA修复机构，这些试剂可用于改变高级有机体的基因组。ZFN可在基因失活方法中使用。
锌指DNA结合结构域具有大约30个氨基酸，并折叠成稳定的结构。每个锌指主要与DNA底物内的三联体结合。关键位置处的氨基酸残基有助于与DNA位点的大多数序列-特异性相互作用。这些氨基酸可以发生改变，同时使剩余氨基酸保持必要的结构。通过几个结构域串联，可以与更长的DNA序列结合。其它功能，如非特异性FokI切割结构域(N)、转录激活因子结构域(A)、转录抑制因子结构域(R)和甲基酶(M)可以与ZFP融合，以分别形成ZFN、锌指转录激活因子(ZFA)、锌指转录抑制因子(ZFR)和锌指甲基酶(ZFM)。采用锌指和锌指核酸酶制造基因修饰的动物的材料和方法在，例如，专利U.S.8,106,255；U.S.2012/0192298；U.S.2011/0023159和U.S.2011/0281306中进行了公开。
载体和核酸
可以将各种核酸引入到细胞内，用于敲除目的，用于基因失活，获得基因表达，或用于其它目的。本文所使用的术语核酸包括DNA、RNA和核酸类似物，及双链或单链核酸(即正义或反义单链)。核酸类似物可以在碱基部分、糖部分或磷酸骨架处进行修饰，以例如，改善核酸的稳定性、杂交性或溶解性。脱氧核糖磷酸骨架可以经修饰，以产生吗啉核酸或肽核酸，在吗啉核酸中，每个碱基部分与六元吗啉环连接，在肽核酸中，脱氧磷酸骨架被替换成假肽骨架并且保留了四个碱基。
靶核酸序列可与调控区，如启动子可操作地连接。调控区可以是猪的调控区或可以是其它物种的调控区。
一般说来，启动子类型可与靶核酸序列可操作地连接。启动子的实例包括但不限于组织-特异性启动子、组成型启动子、诱导型启动子，及对特定刺激响应或不响应的启动子。在一些实施方式中，可以采用促进核酸分子表达且不具有明显的组织-或时间-特异性的启动子(即组成型启动子)。例如，可以使用β-肌动蛋白启动子(如鸡β-肌动蛋白基因启动子)、泛素启动子、miniCAGs启动子、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)启动子或3-磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子，以及使用病毒启动子，如单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)启动子、SV40启动子，或细胞巨化病毒(CMV)启动子。在一些实施方式中，可以使用鸡β-肌动蛋白基因启动子和CMV增强子的融合物作为启动子。参见，例如，Xu et al.,Hum.Gene Ther.12:563,2001；和Kiwaki et al.,Hum.Gene Ther.7:821,1996。
其它可用于核酸构建体的调控区包括但不限于多聚腺苷酸序列、翻译控制序列(例如，内部核糖体进入位点，IRES)、增强子、诱导元件或内含子。这些调控区虽然可以通过影响转录、mRNA稳定性、翻译效率等而增加表达，但是，它们可能并非是必需的。这些调控区可以根据需要被包括在核酸构建体中，以在细胞中获得最佳的核酸表达。但是，有时候在没有这些附加元件的情况下，也可以获得充分表达。
可以使用核酸构建体编码信号肽或可选择性表达的标记物。可以使用信号肽，从而将编码的多肽导入到特定的细胞位置(例如，细胞表面)。可选择性标记物的非限制性实例包括嘌呤霉素、更昔洛韦、腺苷脱氨酶(ADA)、氨基糖苷磷酸转移酶(neo，G418，APH)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、潮霉素-B-磷酸转移酶、胸苷激酶(TK)和黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(XGPRT)。这些标记物用于选择培养物中的稳定的转化体。其它可选择性标记物包括荧光多肽，如绿色荧光蛋白或黄色荧光蛋白。
在一些实施方式中，编码可选择性标记物的序列可以在两侧连接重组酶，例如Cre或Flp识别序列。例如，可选择性标记物可以在两侧连接loxP识别位点(Cre重组酶识别的34-bp识别位点)或FRT识别位点，从而可以从构建体中切除可选择性标记物。Cre/lox技术综述参见Orban et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,89:6861,1992，及Brand and Dymecki,Dev.Cell,6:7,2004。包含被可选择性标记物基因中断的Cre-或Flp-激活性转基因的转座子还可用于获得具有转基因条件性表达的转基因动物。例如，驱动标记物/转基因表达的启动子可以是普遍性的或组织特异性的，这导致标记物在F0动物(例如猪)中普遍性或组织特异性表达。转基因的组织特异性激活可以通过以下方式来实现：例如，通过将普遍性表达被标记物中断的转基因的猪与以组织特异性方式表达Cre或Flp的猪杂交，或通过将以组织特异性方式表达被标记物中断的转基因的猪与普遍性表达Cre或Flp重组酶的猪杂交。转基因的受控表达或标记物的受控切除允许转基因的表达。
在一些实施方式中，外源核酸编码多肽。编码多肽的核酸序列可以包括编码“标签”的标签序列，该标签经设计用于方便对编码多肽的后续操作(例如，方便定位或检测)。标签序列可以插入到编码多肽的核酸序列中，以便编码的标签位于多肽的羧基端或氨基端。编码的标签的非限制性实例包括谷胱甘肽S-转移酶(GST)和FLAGTM标签(美国康涅狄格州纽黑文Kodak公司)。
核酸构建体可以采用各种技术被引入到任意类型的胚胎、胎儿或成年偶蹄目动物/牲畜的细胞内，包括，例如，生殖细胞(如卵母细胞或卵子)、祖细胞、成年或胚胎干细胞、原始生殖细胞、肾脏细胞(如PK-15细胞)、小岛细胞、β细胞、肝细胞或成纤维细胞(如皮肤成纤维细胞)中。技术的非限制性实例包括采用转座子系统，可以感染细胞的重组病毒，或脂质体，或其它能够将核酸递送到细胞内的非病毒方法，如电穿孔法、显微注射法或磷酸钙沉淀法。
在转座子系统中，核酸构建体的转录单位，即与外源核酸序列可操作地连接的调控区，两侧连接转座子的反向重复序列。已经开发了几种转座子系统，包括，例如睡美人(Sleeping Beaut)(参见U.S.6,613,752和U.S.2005/0003542)；青蛙王子(Frog Prince)(Miskey et al.,Nucleic Acids Res.31:6873,2003)；Tol2(Kawakami,Genome Biology 8(Suppl.l):S7,2007)；Minos(Pavlopoulos et al.,Genome Biology,8(Suppl.l):S2,2007)；Hsmarl(Miskey et al.,Mol Cell Biol,27:4589,2007)；及通行证(Passport)，以将核酸引入到细胞内，包括小鼠、人类和猪的细胞。睡美人(Sleeping Beauty)转座子特别有用。转座酶可以作为在与外源核酸相同的核酸构建体上编码的蛋白质来递送，可以在独立的核酸构建体上被引入，或作为mRNA提供(例如，体外-转录和带帽mRNA)。
核酸可以并入到载体中。载体是广义的，包括经设计从载体移动到靶DNA中的任何特定DNA片段。载体可以称为表达载体，或载体系统，是将DNA插入物带入到基因组或其它靶向DNA序列中所需的一组组件，如附加体、质粒或甚至病毒/噬菌体DNA片段。用于在动物中进行基因递送的载体系统，如病毒载体(例如，逆转录病毒、腺-相关病毒和整合噬菌体病毒)，及非病毒载体(如转座子)拥有两个基本的组件：1)由DNA(或逆转录成cDNA的的RNA)构成的载体，和2)识别载体和DNA靶序列并将载体插入到DNA靶序列中的转座酶、重组酶或其它整合酶。载体最经常包含一个或多个表达盒，其包含一个或多个表达控制序列，其中表达控制序列是分别控制和调控另一DNA序列或mRNA的转录和/或翻译的DNA序列。
已知有许多不同类型的载体。例如，已知有质粒和病毒载体，例如，逆转录病毒载体。哺乳动物表达质粒通常具有复制起点、合适的启动子及可选的增强子，还有任何必要的核糖体结合位点、多聚腺苷酸位点、剪接供体位点和接受位点、转录终止序列，及5'侧翼非-转录序列。载体的实例包括：质粒(其也可以是另一类型的载体的运载者)、腺病毒、腺-相关病毒(AAV)、慢病毒(例如，经修饰的HIV-1、SIV或FIV)、逆转录病毒(例如，ASV、ALV或MoMLV)，及转座子(例如，睡美人(Sleeping Beauty)、P-元件、Tol-2、青蛙王子(FrogPrince)、piggyBac)。
本文所使用的术语核酸指的是RNA和DNA，包括，例如，cDNA、基因组DNA、合成(例如，化学合成)的DNA，以及天然存在的和经化学修饰的核酸，例如，合成碱基或替代骨架。核酸分子可以是双链或单链的(即正义或反义单链)。术语转基因在此处是广义的，指的是经基因修饰的有机体或经基因工程改造的生物体，其基因材料已经采用基因工程技术进行了改变。因此，经敲除的偶蹄目动物是转基因的，不管动物或其子代中是否表达外源基因或核酸。
经基因修饰的动物
动物可以采用TALEN或其它基因工程工具，包括重组酶融合蛋白，或已知的各种载体进行修饰。采用此类工具进行的基因修饰可能包括基因的破坏。对动物进行基因修饰的材料和方法进一步在U.S.8,518,701；U.S.2010/0251395；和U.S.2012/0222143中进行了详细描述，这些专利通过引用而并入本文中；若有冲突时，以本说明书为准。术语反式作用指的是从不同分子(即分子间)作用于靶基因的过程。反式作用元件通常是包含基因的DNA序列。该基因编码用于调控靶基因的蛋白质(或微小RNA(microRNA)或其它可扩散的分子)。反式作用基因可以位于与靶基因相同的染色体上，但是，经由其编码的中间蛋白质或RNA来发挥活性。反式作用基因的实施方式有，例如，编码靶向核酸内切酶的基因。利用显性负性的基因的失活通常涉及反式作用元件。术语顺式调控或顺式作用指的是不编码蛋白质或RNA的一种作用；在基因失活的情况中，这通常意味着功能性基因表达所必需的基因编码部分，或启动子和/或操纵子的失活。
可以采用本领域熟悉的各种技术使基因失活，以制造敲除动物，和/或将核酸构建体引入到动物体内，以产生其中敲除或核酸构建体被整合到基因组内的原代动物和动物品系。这些技术包括但不限于原核显微注射法(U.S.4,873,191)、逆转录病毒介导基因导入生殖细胞系法(Van derPutten et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:6148-6152,1985)、基因靶向胚胎干细胞法(Thompson et al.Cell,56:313-321,1989)、胚胎电穿孔法(Lo.Mol.Cell.Biol,3:1803-1814,1983)、精子介导的基因转移法(Lavitrano et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99:14230-14235,2002；Lavitrano et al,Reprod.Fert.Develop,18:19-23,2006)、体细胞(如卵丘细胞或乳腺细胞)，或成年、胎儿或胚胎干细胞的体外转化，然后进行核移植(Wilmut et al.Nature,385:810-813,1997；及Wakayama et al.Nature,394:369-374,1998)。原核显微注射法、精子介导的基因转移法及体细胞核移植法是特别有用的技术。经基因组修饰的动物是其所有细胞，包括其生殖系细胞都有基因修饰的动物。当采用产生其基因修饰为嵌合型的动物的方法时，动物可以近亲繁殖，并且可以选择经基因修饰的子代。例如，如果其细胞在囊胚期时被修饰，则可以采用克隆来制备嵌合动物，或者在单细胞被修饰时，可以发生基因组修饰。根据采用的具体方式，经修饰从而没有性成熟的动物对于修饰来说可以是纯合或杂合的。如果特定基因通过敲除修饰被失活，纯合性一般不够。如果特定基因通过RNA干扰或显性负性策略被失活，那么杂合性通常是足够的。
通常，在原核显微注射中，核酸构建体被引入到受精卵内；1或2个受精卵细胞用作包含精子头遗传物质的原核，可以看到在原生质内的卵子。原核阶段受精卵可以在体外或体内(即通过手术从供体动物输卵管)得到。受精卵可以按照下述方法在体外产生。例如，可以在屠宰场收集猪卵巢，并在运输期间保持在22～28℃。卵巢可以经洗涤，并分离出来进行卵泡穿刺，可以在真空条件下采用18号针头将4～8mm的卵泡抽到50mL锥形离心管内。卵泡液和吸取的卵母细胞可以用商业TL-HEPES(Minitube,Verona,WI)通过预过滤器进行冲洗。可以选择出被紧实卵丘质包围的卵母细胞，并置于补充有0.1mg/mL半胱氨酸、10ng/mL上皮生长因子、10％猪卵泡液、50μM 2-巯基乙醇、0.5mg/ml cAMP、10IU/mL孕马血清促性腺激素(PMSG)和10IU/mL人绒毛膜促性腺激素(hCG)的TCM-199卵母细胞成熟培养基(Minitube,Verona,WI)中，在38.7℃的潮湿空气和5％CO2中孵育22小时。然后，将卵母细胞移到不包含cAMP、PMSG或hCG的新鲜TCM-199成熟培养基中，再孵育22小时。成熟的卵母细胞可以通过在0.1％透明质酸酶中涡旋1分钟去除它们的卵丘细胞。
对猪来说，成熟的卵母细胞可以在Minitube 5孔受精皿中的500μl MinitubePORCPRO IVF培养基系统(美国威斯康星州维罗纳市Minitube公司)中受精。准备体外授精(IVF)时，将新鲜收集或冷冻的猪精液进行洗涤，并重悬浮在PORCPRO IVF培养基中，至4×105的浓度。精子浓度可以采用计算机辅助精液分析(美国威斯康星州维罗纳市Minitube公司的SPERMVISION)进行分析。取决于公猪，最终体外授精可以在10μl体积中，以大约40个活动精子/卵母细胞的最终浓度来进行。将所有正在受精的卵母细胞在38.7℃、5.0％CO2气氛中孵育6小时。授精6小时后，假定的受精卵在NCSU-23中洗涤两次，并转移到0.5mL相同的培养基中。对大多数公猪来说，这种系统常规可以产生20～30％的囊胚，多精受精率是10～30％。
可以将线性核酸构建体注射到其中一个原核内。然后，将经注射的卵子转移到受体雌性的体内(例如，受体雌性的输卵管内)，让其在受体雌性体内发育以产生转基因动物。特别是，体外授精的胚胎可以以15,000×g离心分离5分钟，让脂质沉淀，以能够查看原核。可以采用Eppendorf FEMTOJET注射器注射胚胎，并且可以培养直至囊胚形成。可以记录卵裂率、囊胚形成和质量。
胚胎可以通过手术转移到非同步受体的子宫内。通常，可以采用5.5-英寸导管将100～200(例如，150～200)个胚胎放置于输卵管的壶腹部和峡部连接处。手术后，可以进行妊娠实时超声检查。
在体外细胞核移植中，可以将包含上述核酸构建体的转基因的偶蹄目动物细胞(例如，转基因的猪细胞或牛细胞)，如胚胎卵裂球、胎儿成纤维细胞、成年耳成纤维细胞或颗粒细胞引入到无核卵母细胞中，以建立组合细胞。卵母细胞可以通过在极体附近的部分透明带解剖，然后在解剖区压出细胞质而摘除细胞核。通常，采用带锐利斜尖端的注射微针，将转基因细胞注射到阻滞在第2次减数分裂的无核卵母细胞中。在一些惯例中，阻滞在第2次减数分裂的卵母细胞被称为卵子。在产生了猪或牛的胚胎后(例如，通过融合和活化卵母细胞)，在活化后大约20至24小时，将胚胎移植到受体雌性的输卵管内。参见，例如Cibelli et al,Science 280:1256-1258,1998和U.S.6,548,741。对猪来说，可以在胚胎移植后大约20～21天，检查受体雌性的妊娠情况。
可以采用标准育种方法，从初始杂合的原代动物创建对于外源核酸是纯合的动物。但是，纯合性可能不是必需的。本文所述的转基因猪可以与其它感兴趣的猪交配。
在一些实施方式中，可以将感兴趣的核酸和可选择性标记物提供在独立的转座子上，并且以不等的量提供给胚胎或细胞，其中含可选择性标记物的转座子的数量远远超过(超过5～10倍)含感兴趣核酸的转座子的数量。表达感兴趣核酸的转基因细胞或动物可以根据可选择性标记物的存在和表达进行分离。由于转座子可以以精确的且非连锁的方式(独立转座事件)整合到基因组内，因此感兴趣的核酸和可选择性标记物并非基因连锁的，容易通过标准育种经遗传分离而被分离。因此，可以产生不局限于在后代中保留可选择性标记物的转基因动物，这从公共安全方面来看是一个值得关注的问题。
一旦生成了转基因动物，就可以采用标准技术对外源核酸的表达进行评价。可以采用Southern印迹分析来完成初步筛选，以确定是否发生了构建体的整合。关于Southern印迹分析的说明，参见Sambrook等人的《分子克隆，实验指南(Molecular Cloning,ALaboratory Manual)》(第二版，冷泉港出版社，Plainview；NY,1989)的9.37～9.52节。初步筛选中也可以使用聚合酶链反应(PCR)技术。PCR指的是一种扩增靶核酸的方法或技术。通常，采用来自感兴趣的区域或超出该区域的区域的端部的序列信息，来设计在序列上与要扩增的模板的相对链相同或类似的寡核苷酸引物。PCR可用于扩增DNA及RNA，包括全基因组DNA或全细胞RNA序列的特定序列。引物长度通常是14至40个核苷酸，但长度可以是10个核苷酸至数百个核苷酸。PCR在，例如，《PCR引物：实验指南(PCR Primer:ALaboratoryManual)》(ed.Dieffenbach和Dveksler,冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press),1995)中进行了描述。核酸还可以通过连接酶链反应、链替代扩增、自我持续序列复制或基于核酸序列的扩增进行扩增。参见，例如，Lewis,GeneticEngineering News 12:1,1992；Guatelli et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:1874,1990；及Weiss,Science 254:1292,1991。在囊胚阶段，胚胎可以经单独处理用于通过PCR、Southern杂交和Splinkerette PCR进行分析(参见，例如Dupuy et al.Proc Natl AcadSci USA,99:4495,2002)。
可以采用包括，例如，动物组织标本Northern印迹分析、原位杂交分析、Western印迹分析、免疫分析(如酶联免疫吸附测定)及逆转录酶PCR(RT-PCR)的技术，对转基因猪的组织中编码多肽的核酸序列的表达进行评价。
干扰RNA
各种干扰RNA(RNAi)是已知的。双链RNA(dsRNA)诱导同源基因转录本发生序列特异性降解。RNA诱导沉默复合物(RISC)将dsRNA代谢为较小的21～23个核苷酸的小干扰RNA(siRNA)。RISC包含双链RNAse(dsRNase，例如Dicer)和ssRNase(例如，Argonaut 2或Ago2)。RISC利用反义链作为引导来发现可切割的靶点。siRNA和microRNA(miRNA)都是已知的。在经基因修饰的动物中破坏基因的方法包括诱导针对靶基因和/或核酸的RNA干扰，从而减少该靶基因和/或核酸的表达。
例如，外源核酸序列可以诱导针对编码多肽的核酸的RNA干扰。例如，可以采用与靶DNA同源的双链小干扰RNA(siRNA)或小发夹RNA(shRNA)来减少该DNA的表达。可以如，例如，Fire et al.,Nature 391:806,1998；Romano and Masino,Mol.Microbiol.6:3343,1992；Cogoni et al.,EMBO J.15:3153,1996；Cogoni and Masino,Nature,399:166,1999；Misquitta and Paterson Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96:1451,1999；及Kennerdell andCarthew,Cell,95:1017,1998中所述，来制备siRNA的构建体。shRNA构建体可以根据Mclntyre and Fanning(2006)BMC Biotechnology 6:1中所述来制备。通常，shRNA被转录为包含互补区的单链RNA分子，其可以退火并形成短发夹。
发现导向特定基因的单一单功能siRNA或miRNA的几率非常高。siRNA的特异性序列的可预测性是，例如，大约50％，但是可以制备大量干扰RNA，而且对它们中至少有一个是有效的有很好的信息。
实施方式包括体外细胞、体内细胞及经基因修饰的动物如牲畜，它们表达导向基因，例如对发育阶段有选择性的基因的RNAi。RNAi可以，例如，选自由siRNA、shRNA、dsRNA、RISC和miRNA组成的组。
诱导系统
诱导系统可用于控制基因的表达。已知对基因表达进行时空控制的各种诱导系统。已经证明了有几种系统在转基因动物体内是有功能的。术语诱导系统包括传统的启动子和诱导基因表达元件。诱导系统的一个实例是四环素(tet)-on启动子系统，可用于调控核酸的转录。在该系统中，突变的Tet抑制因子(TetR)与单纯疱疹病毒VP16的反式-激活蛋白的激活结构域融合，创建了四环素-控制的转录激活因子(tTA)，其受到tet或强力霉素(dox)的调控。在缺乏抗生素时，转录非常低，而在tet或dox存在时，转录被诱导。可选的诱导系统包括蜕皮激素或雷帕霉素系统。蜕皮激素是一种昆虫蜕皮激素，其产生受到蜕皮激素受体与超气门蛋白(ultraspiracle)基因(USP)产物的异种二聚体的控制。通过蜕皮激素或蜕皮激素类似物，如幕黎甾酮(muristerone)A处理来诱导表达。施用于动物以引发诱导系统的试剂被称为诱导剂。
四环素-诱导系统和Cre/loxP重组酶系统(组成型或诱导型)是其中更常用的诱导系统。四环素诱导系统涉及四环素-控制的反式激活因子(tTA)/反式tTA(rtTA)。体内使用这些系统的方法涉及生成两个品系的经基因修饰的动物。一个动物品系表达在选定的启动子控制下的激活因子(tTA、rtTA或Cre重组酶)。另一组转基因动物表达受体，其中感兴趣基因(或要被修饰的基因)的表达在tTA/rtTA反式激活因子的靶序列(或侧接loxP序列)的控制下。两个种类的小鼠交配提供对基因表达的控制。
四环素-依赖性调控系统(tet系统)以四环素-依赖的方式依赖于两个组件，即四环素-控制的反式激活因子(tTA或rtTA)及控制下游cDNA表达的tTA/rtTA-依赖性启动子。在缺乏四环素或其衍生物(如强力霉素)时，tTA与tetO序列结合，转录激活tTA-依赖性启动子。但是，在强力霉素存在下，tTA不会与其靶标相互作用，也不会发生转录。采用tTA的tet系统被称为tet-OFF，因为四环素或强力霉素使转录下调。施用四环素或其衍生物能够对体内的转基因表达进行时间上的控制。rtTA是tTA的变体，在缺乏强力霉素时不会作用，而反式激活要求配体存在。因此，这种tet系统被称为tet-ON。这些tet系统已经在体内用于几种转基因的诱导表达，编码在信号级联中涉及的，例如，报告子基因、致癌基因，或蛋白质。
Cre/lox系统采用Cre重组酶，其催化通过在两个相距较远的Cre识别序列(即loxP位点)之间交换所进行的位点特异性重组。通过Cre-介导的重组，切除引入到两个loxP序列之间的DNA序列(称为敲入的DNA(floxed DNA))。在转基因动物中，采用空间控制(通过组织-或细胞特异性启动子)或时间控制(通过诱导系统)来控制Cre的表达，结果造成对两个loxP位点之间的DNA切除的控制。一种应用是用于条件性基因失活(条件性敲除)。另一种应用是用于蛋白质过表达，其中敲入的终止密码子被插在启动子序列和感兴趣的DNA之间。经基因修饰的动物直到表达了Cre才表达转基因，导致敲入的终止密码子的切除。这种系统已经应用于组织-特异性肿瘤发生和在B淋巴细胞中抗原受体的受控表达。还开发了诱导Cre重组酶。诱导型Cre重组酶仅通过施用外源配体来激活。诱导型Cre重组酶是包含原始Cre重组酶和特异性配体-结合结构域的融合蛋白。Cre重组酶的功能活性取决于能够与融合蛋白中的该特异性结构域结合的外来配体。
实施方式包括体外细胞、体内细胞及经基因修饰的动物，如牲畜，其包含在诱导型系统控制下的基因。动物的基因修饰可以是基因组修饰或嵌合修饰。诱导型系统可以，例如，选自由Tet-On、Tet-Off、Cre-lox和Hiflα组成的组。一个实施方式是本文提出的一个基因。
显性负性(Dominant Negative)
基因不仅可以通过清除或RNAi抑制进行破坏，而且还可以通过创建/表达对该基因产物正常功能具有抑制影响的蛋白质的显性负性变体进行破坏。显性负性(DN)基因的表达可以导致表型更改，这通过以下效应来实现：a)滴定效应；DN被动地与内源基因产物竞争协调因子或内源基因的正常靶标，但不发挥相同的活性，b)毒丸(或活扳手)效应，其中显性负性基因产物主动干扰对于正常基因功能非常重要的过程，c)反馈效应，其中DN主动刺激基因功能的负调控因子。
原代动物、动物品系、性状和繁殖
原代动物(F0代)可以通过本文描述的克隆和其它方法制备。原代动物对于基因修饰来说是纯合的，如在受精卵或原代细胞进行纯合修饰的情况中。类似地，原代动物还可以制成杂合的。原代动物可以是经基因组修饰的，这意味着细胞在它们的基因组中进行了修饰。原代动物对于修饰可以是嵌合的，如当载体被引入到胚胎，尤其是被引入到囊胚阶段的胚胎的多个细胞之一中时，可能发生这种情况。可以对嵌合动物的子代进行测试，以鉴定出经基因组修饰的子代。当创建了可以有性繁殖或采用辅助繁殖技术进行繁殖动物的动物池时，就建立了动物品系，同时杂合或纯合的子代一致地表达这种修饰。
已知，在牲畜中，许多等位基因与不同的性状有关，如生产性状、类型性状(typetrait)、可使用性状和其它功能性状。本领域技术人员习惯于对这些性状进行监测和定量，例如，Visscher et al.,Livestock Production Science,40:123-137,1994，U.S.7,709,206，U.S.2001/0016315，U.S.2011/0023140，和U.S.2005/0153317。动物品系可能包括选自由生产性状、类型性状、可使用性状、繁殖力性状、母性性状和抗病性状所组成的组中的性状。其它性状包括重组基因产物的表达。
重组酶
本发明的实施方式包括施用靶向核酸酶系统，其具有重组酶(例如，RecA蛋白、Rad51)或与DNA重组有关的其它DNA-结合蛋白。重组酶与核酸片段构成丝状物，实际上，搜索细胞DNA，以发现与该序列基本上同源的DNA序列。例如，重组酶可以与充当HDR模板的核酸序列组合。然后，重组酶与HDR模板组合，形成丝状物，并被置于细胞内。重组酶和/或与重组酶组合的HDR模板可以作为蛋白质、mRNA或与编码重组酶的载体一起，被置于细胞或胚胎内。U.S.2011/0059160(美国专利申请号12/869,232)公开的内容通过引用而并入本文中，若有冲突时，以本说明书为准。术语重组酶指的是基因重组酶，其在细胞内酶促催化两个相对较长DNA链之间的DNA相对较短部分的连接。重组酶包括Cre重组酶、Hin重组酶、RecA、RAD51、Cre和FLP。Cre重组酶是来源于P1噬菌体的I型拓扑异构酶，催化loxP位点之间的DNA位点特异性重组。Hin重组酶是一种由198个氨基酸构成的21kD蛋白质，发现于沙门氏菌(Salmonella)中。Hin属于DNA转化酶的丝氨酸重组酶家族，其中它依赖于激活位点丝氨酸来启动DNA切割和重组。RAD51是人类基因。由该基因编码的蛋白质是帮助修复DNA双链断裂的RAD51蛋白质家族的成员。RAD51家族成员与细菌RecA和酵母Rad51同源。Cre重组酶是一种酶，在实验中用于缺失两侧为loxP位点的特定序列。FLP指的是源自发面酵母(Saccharomyces cerevisiae)的2μ质粒的翻转酶(Flippase)重组酶(FLP或Flp)。
在本文，“RecA”或“RecA蛋白”指的是基本上具有全部或大部分相同功能的RecA-类重组蛋白质家族，特别是：(i)将寡核苷酸或多核苷酸正确定位在其同源靶标上，以用于后续通过DNA聚合酶进行延伸的能力；(ii)拓扑制备双核酸用于DNA合成的能力；(iii)RecA/寡核苷酸或RecA/多核苷酸复合物有效发现互补序列并与其结合的能力。表征最好的RecA蛋白质来源于大肠杆菌；除蛋白质原来的等位基因形式之外，还鉴定出了许多突变的RecA-类蛋白质，例如，RecA803。此外，许多生物体具有RecA-类链转移蛋白质，包括，例如，酵母、果蝇、哺乳动物(包括人类)及植物。这些蛋白质包括，例如，Recl、Rec2、Rad51、Rad51B、Rad51C、Rad51D、Rad51E、XRCC2和DMC1。重组蛋白质的实施方式是大肠杆菌的RecA蛋白质。或者，RecA蛋白质可以是大肠杆菌的突变RecA-803蛋白质，一种来自另一细菌来源的RecA蛋白质或来自另一生物体的同源重组蛋白质。
组合物和试剂盒
本发明还提供了组合物和试剂盒，包含，例如，编码位点特异性核酸内切酶、CRISPR、Cas9、ZNF、TALEN、RecA-gal4融合蛋白的核酸分子，相同的多肽，包含所述核酸分子或多肽的组合物，或经工程改造的细胞系。还提供了有效渗入所示等位基因的HDR。这些项目可例如用作研究工具或用于治疗。
实施例
除非另外声明，方法如下文所述。
组织培养和转染
将猪保持在37℃、5％CO2条件下，在补充有10％胎牛血清、100I.U./ml青霉素和链霉素及2mM L-谷氨酰胺的DMEM中。为了进行转染，采用NEON转染系统(LifeTechnologies)，通过转染递送所有的TALEN和HDR模板。简而言之，将达到100％细胞覆盖的低传代的奥萨博猪(Ossabaw)、长白猪(Landrace)按1:2分开，并在第二天70～80％细胞覆盖时收获。每次转染包括500,000～600,000个细胞，将这些细胞重悬在混合有TALEN mRNA和寡核苷酸(oligo)的缓冲液“R”中，并采用提供100μl工作体积的100μl末端(tip)，按照下述参数，进行电穿孔：输入电压：1800V；脉冲宽度：20ms；脉冲数：1。通常，每次转染加入对感兴趣基因具有特异性的1～2μg TALEN mRNA和1～4μM HDR模板(单链寡核苷酸)。偏离这些用量在图中和图例中说明。转染后，将细胞铺在6-孔板的孔中保持3天，并在30℃培养。三天后，细胞群进行铺板，用于集落分析和/或扩增，在37℃培养至少10天，对编辑的稳定性进行评价。
Surveyor突变检测和RFLP分析
采用PLATINUM Taq DNA聚合酶HiFi(Life Technologies)，及1μl细胞裂解物，按照生产商的建议，进行预定位点两侧的PCR。采用SURVEYOR突变检测试剂盒(Transgenomic)，按照生产商的建议，采用10μl上述PCR产物，对细胞群中的突变频率进行分析。采用所示限制酶，对10μl上述PCR反应进行RFLP分析。将Surveyor和RFLP反应在10％TBE聚丙烯酰胺凝胶上进行解析，并通过溴化乙锭染色使其可视化。采用IMAGEJ进行条带密度测定；并按照Guschin et al.,2010(1)所述计算Surveyor反应的突变率。RFLP片段的总强度除以亲本条带+RFLP片段的总强度，计算得到同源介导修复(DHR)的百分比。除PCR产物通过1×MYTAQ RED MIX(Bioline)扩增并在2.5％琼脂糖凝胶上解析外，对集落的RFLP分析进行类似的处理。
稀释克隆：
转染三天后，将50至250个细胞接种在10cm培养皿上并进行培养，直到各集落直径达到大约5mm。此时，加入6ml按1:5(vol/vol)稀释在PBS中的TRYPLE(Life Technologies)，吸出集落，并转移到24孔板的孔内，并在同样条件下培养。收集达到细胞覆盖的集落，并分成若干部分用于低温储存和基因分型。
样品制备：
从6-孔板的孔中收集第3天和第10天的转染细胞群，并将10～30％重悬在50μl 1×PCR相容的裂解缓冲液中：10mM Tris-Cl pH 8.0，2mM EDTA，0.45％TRYTON X-100(vol/vol)，0.45％TWEEN-20(vol/vol)且新鲜补充有200μg/ml蛋白酶K。按照下述程序，将裂解物在热循环仪中进行处理：55℃保持60分钟，95℃保持15分钟。采用20～30μl裂解缓冲液，按照上述方式对来自稀释克隆的集落样品进行处理。
实施例1：猪RAG2和IL2Rγ的多重基因编辑
将导向猪RAG2和IL2Rγ的六种条件的TALEN mRNA和HDR模板共转染到猪成纤维细胞中。如所示，每次转染采用固定量的RAG2mRNA和模板，而对于所示的每种条件，IL2RgTALEN mRNA和HDR模板的量是不同的。TALEN mRNA和HDR模板的用量都有在靶和脱靶效应。IL2Rγ的TALEN mRNA增加，导致IL2Rγ的NHEJ和HDR增加，而RAG2的NHEJ水平保持不变。IL2Rγ的HDR模板增加，降低了RAG2基因座处的HDR，表明寡核苷酸浓度逐步增加非特异性抑制同源介导修复。在两种条件下(图4C和4D)，以4％和2％的频率获得在RAG2和IL2Rγ处具有双等位基因HDR的集落，这与预期的2％频率相同或超过预期的2％频率。预期的频率是通过第3天的HDR水平相乘来计算的，其将每个DHR等位基因作为独立事件进行处理。参考图4A～4D，猪RAG2和IL2Rγ的多重基因编辑。图4A，用于确定转染3天后对细胞群的非同源末端连接(NHEJ)和同源依赖性修复HDR的效率的SURVEYOR和RFLP分析。图4B，对转染11天后的细胞群的同源依赖性修复的RFLP分析。图4C，在IL2Rγ、RAG2或它们两者对HDR阳性的集落的百分比。将来自图4A中“C”所指示的群体的细胞进行铺板。集落基因型的分布示于下方。图4D，对经TALEN mRNA和HDR模板转染的细胞的集落分析，其中对IL2Rγ和RAG2来说，TALENmRNA的量分别为2和1μg，HDR模板为1μM。集落基因型的分布示于下方。
实施例2：猪RAG2和IL2Rγ的多重基因编辑
将导向猪APC和p53的四种条件的TALEN mRNA和HDR模板共转染到猪成纤维细胞中。APC mRNA的量从左至右顺序减少(图5B)；如所示，其它的量保持不变。HDR的百分比随APC mRNA的减少而线性减少。APC TALEN用量的变化对p53HDR的影响很小。与第11天的数值相比，集落的基因分型揭示了高于预期的在APC和p53两者中都具有HDR等位基因的克隆的联合；图5C和图5D分别是18％和20％对13.7％和7.1％。参考图5A～5D，猪APC和p53的多重基因编辑。图5A，SURVEYOR和RFLP分析，以测定转染3天后对细胞群进行非同源末端连接(NHEJ)和同源依赖性修复HDR的效率。图5B，转染11天后对细胞群进行同源依赖性修复的RFLP分析。图5C和5D，对于在APC、p53或它们两者处的HDR，来源自所示细胞群(图5A中以“C”和“D”表示)的呈阳性的集落的百分比。拥有3个或更多个HDR等位基因的集落列出在下方。
实施例3：至少三个基因的多重基因编辑
在实施例1中，在高浓度HDR寡核苷酸时，观察到HDR的非特异性减少，因此，无法知道在没有HDR的非特异性抑制时，2+HDR寡核苷酸是否有效。每个靶向位点测试了两种浓度：1μM和2μM。虽然在这两种条件下，TALEN活性未发生明显改变，但是，在2μM的浓度时，HDR对于每一模板都出现显著钝化。来源于1μM条件的克隆具有各种基因型，其中一些克隆在每一基因和高达7个等位基因中具有编辑(图7A和7B)。如果座位独立事件进行处理，以“a”表示的、具有7个经编辑的等位基因的基因型的预期频率是0.001％。正如此处所示，二项分布预测了，在72的样本量中，鉴定出具有此类基因型的2+集落的可能性小于0.000026％。没有预期到成功率这么高，这是出乎意料且让人吃惊的。这一结果使用两种额外的TALEN/HDR模板(图8A和8B，及图9A和9B)组合得到了重复。与第一次试验的结果一样，得到在高达七个等位基因和高达四个基因中具有HDR编辑的集落(表A)。以远远高于意外预期的频率，恢复了几种基因型。尽管几个基因座同时发生双链断裂的关系诱导非预期的染色体重排，但从试验的3个细胞中测试50种核型中的50种是正常的(数据未示出)。
参考图6A和6B：寡核苷酸HDR模板浓度对5-基因多重HDR效率的影响。将靶向猪RAG2、IL2Rg、p53、APC和LDLR的所示量的TALEN mRNA，与2μM(图6A)或1μM(图6B)各同种HDR模板一起共转染到猪成纤维细胞内。通过Surveyor和RFLP测定法，测量NHEJ和HDR的百分比。参考图7A和7B：来自5-基因多重HDR的集落基因型。通过RFLP分析对集落基因型进行评价。在图7A中，每条线代表一个集落在每个特定基因座处的基因型。可以鉴定出三种基因型；具有对于HDR是杂合或纯合的预期RFLP基因型的那些，以及具有RFLP阳性片段的那些，加上第二等位基因，其中第二等位基因具有指示插入或缺失(indel)等位基因的可见的尺寸变化。在每列下方示出了在特定基因座处存在编辑的集落的百分比。图7B提供了在0～5个基因座处被编辑的集落数量的总数。参考图8A～8B：第二个5-基因多重编辑试验的集落基因型。图8A：每条线代表一个集落在每个特定基因座处的基因型。可以鉴定出三种基因型；具有对于HDR是杂合或纯合的预期RFLP基因型的那些，以及具有RFLP阳性片段的那些，以及第二等位基因，其中第二等位基因具有指示插入或缺失(indel)等位基因的可见的尺寸变化。在每列下方示出了在特定基因座存在编辑的集落的百分比。图8B：提供了在0～5基因座处被编辑的集落数量的总数。参考图9A和9B：第三个5-基因多重编辑试验的集落基因型。图9A：每条线代表一个集落在每个特定基因座处的基因型。可以鉴定出三种基因型；具有对于HDR是杂合或纯合的预期RFLP基因型的那些，以及具有RFLP阳性片段的那些，以及第二等位基因，其中第二等位基因具有指示插入或缺失(indel)等位基因的可见的尺寸变化。在每列下方示出了在特定基因座存在编辑的集落的百分比。图9B提供了在0～5个基因座被编辑的集落数量的总数。
实施例4A～4D
实施例4A：通过多重基因编辑开发无RAG2/IL2Rg(RG-KO)的猪成纤维细胞。采用前面规定的方法(Tan,W.,et al.,Efficient nonmeiotic allele introgression inlivestock using custom endonucleases.PNAS,110(41):16526-16531,2013)，采用TALEN和寡核苷酸模板转染雄性猪胎儿成纤维细胞，来破坏RAG2和IL2Rg。如通过测序证实一样，采用例如RFLP，鉴定RG-KO候选者。将至少大约5个得到验证的RG-KO集落合并起来，作为克隆和嵌合制备的资源。
实施例4B：采用RG-KO宿主囊胚制备嵌合胚胎
采用染色质转移技术，然后体外培养到囊胚阶段，来制备宿主RG-KO胚胎和雌性EGFP-标记的供体细胞。可以采用实施例1的RG-KO细胞。将来自EGFP囊胚的第7天的内细胞团注射到第6天的RG-KO胚胎内，然后将胚胎转移到同步母猪体内。采用这种方式，Nagashima和同事观察到嵌合性>50％的活产猪仔(Nagashima H.et al.,Sexdifferentiation and germ cell production in chimeric pigs produced by innercell mass injection into blastocysts.Biol Reprod,70(3):702-707,2004)。对小鼠和猪来说，注射嵌合体中雄性表型都是显性的。因此，使用雌性供体细胞注射的XY RG-KO宿主独占地传递雄性宿主遗传特征。在适当的时候，例如25天、50天和100天时，进行妊娠检查。在大约100天的妊娠期，每4天对怀孕母猪进行一次监测，直到怀孕大约114天，剖腹产取出猪仔。
实施例4C：测定非嵌合后代是否缺乏T、B和NK细胞
对非-嵌合后代进行测试，以确定它们是否缺乏T、B和NK细胞。下述方法是一种用于此类用途的技术。对怀有假定嵌合体的每只母猪和怀有野生型猪仔的一只孕猪进行剖腹产。剖腹产后，立即分离出每只猪仔的脐带血。采用荧光激活细胞分选法(FACS)，对脐带血的白细胞中的T、B和NK细胞群以及源于供体的EGFP的表达进行评价。此外，采用PCR，对脐带血、耳和尾部的活组织检查，对嵌合情况进行评价。初步分析在出生6小时内完成，从而可以对非-嵌合猪仔进行密切监测，对出现感染迹象的猪仔实施人工安乐死。部分非嵌合动物，或那些缺乏免疫细胞的动物，被实施安乐死进行尸检。
实施例4D：鉴定嵌合猪和确定T、B和NK细胞的来源
对嵌合猪进行测试，以确定T、B和NK细胞的来源。下述方法是一种用于此类用途的技术。采用上述方法对嵌合猪仔进行鉴定。在2个月期间，对循环的淋巴细胞和血清免疫球蛋白每周一次的评价在嵌合猪仔、非嵌合猪仔和野生型猪仔之间进行比较。评价分选出的T、B和NK细胞群的EGFP表达和微卫星分析，以确定供体来源。嵌合猪的样品保持和精子采集得到RCI的支持，直到II期资金到位。
实施例A～D的取样程序：
脐带血和外周血FACS。
按照前面(2)所述，经修改用于猪标本，开展血液淋巴细胞和EGFP嵌合性的评价。剖腹产后，立即采集每只猪仔的脐带血。部分脐带血进行处理和低温保存用于可能的同种异体移植处理，而其它脐带血用于淋巴细胞的FACS分析。采用标准方法，在2、4、6和8周时采集外周血样品。去除RBC，并将大约1-2E+5个细胞分配到管内。用抗猪的抗体对等分的样品进行标记，用于鉴定T细胞(CD4和CD8)、B细胞(CD45RA和CD3)、NK细胞(CD16和CD3)及骨髓细胞(CD3)。在LS RII流式细胞仪(BD Biosciences)上，对抗原表达进行定量。仔细选择荧光团，以与表面抗原一起对供体来源的EGFP细胞进行多重评价。采用同样的方法，对脾的单细胞悬浮液进行分析。
检查
全面检查所有重要器官和组织的解剖学发育是否适当，并采集所有重要器官和组织，包括胰腺、肝、心脏、肾脏、肺、肠胃、免疫系统(周围和粘膜淋巴结及脾)，及CNS的合适样品用于DNA分离。制备脾的单细胞悬浮液用于FACS分析。准备组织用于组织学检查，从而对嵌合性进一步进行评价，可能与嵌合状态有关的任何更改，及是否存在任何隐含的疾病。
嵌合性评价
采用对EGFP转基因具有特异性的引物，对脐带血、耳和尾部活检进行定量PCR，并与EGFP-野生型细胞的已知比率的标准曲线进行对比。还经由前面描述的RFLP测定法对标本的RG-KO等位基因进行评价。在尸体解剖期间，宏观上对整个动物和器官的EGFP+细胞的植入进行评价。对来自重要器官的组织进行切片，以用于EGFP免疫组织化学分析，并采用DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)复染，以测定供体细胞与宿主细胞的比率。
微卫星分析
从实验室常规使用的那些动物中筛选为宿主和供体遗传特征提供微卫星信息的动物。对组织和血液样品(分选的淋巴细胞或髓系，EGFP阳性和阴性)进行评价。采用复合扩增子测序法，在MISEQ仪器(Illumina)上对供体细胞对宿主细胞的相对数量进行评价。
动物
制备的非嵌合猪在脐带血和外周血中缺乏T、B和NK细胞。嵌合猪具有与接近野生型猪水平的基本上类似的水平。此外，在标准条件下饲养时，T、B和NK细胞阳性嵌合体具有基本正常的免疫功能，并且保持健康。
实施例5：CRISPR/Cas9设计和制备。
按照他们的方法，将基因特异性gRNA序列克隆到Church实验室的gRNA载体(Addgene ID：41824)内。通过hCas9质粒(Addgene ID：41815)共转染或由RCIScript-hCas9合成的mRNA提供Cas9核酸酶。通过将来自hCas9质粒(包含hCas9cDNA)的XbaI-AgeI片段亚克隆到RCIScript质粒中，来构建这种RCIScript-hCas9。除线性化采用KpnI进行外，如上所述进行mRNA合成。
实施例6：使用靶向核酸内切酶和HDR的多重基因编辑
图13A是多重编辑实验中每个基因(描绘为以交替阴影表示的cDNA-外显子)的示意图，并且指示了TALEN靶向的位点。下方指示了每一基因的编码DNA结合结构域的序列。采用1ug的各TALEN mRNA和0.1纳摩尔(nMol)的各HDR寡核苷酸(图13B)对猪成纤维细胞进行共转染，靶向各基因，经设计插入提前终止密码子及新的HindIII RFLP位点用于基因分型。共分离出384个集落用于基因分型。进行GATA4和Nkx2-5RFLP测定(图13C)，并采用测序对MESP1进行评价(未示出)。两个集落(2/384，0.52％)对于全部三个基因是纯合的HDR敲除。三基因敲除以星号标记(图13C)。图13C中可以观察到其它基因型，实例集落49没有HDR编辑；集落52和63具有NKX2-5的杂合编辑；集落59具有NKX2-5和GATA4的杂合编辑，等等。
实施例7：采用TALEN和RGEN组合进行多重基因编辑
参见图14。对每一基因，使用TALEN(1ug EIF4G 14.1mRNA)+Cas9/CRISPR组分(2ugCas9mRNA+2ug p65Gls向导RNA)和02nMol HDR寡核苷酸，对猪成纤维细胞进行共转染。采用RFLP分析对转染的细胞进行评价，从而揭示在两个位点处的HDR。将该群的细胞进行铺板，用于集落分离，并且鉴定出在两个基因中存在编辑的分离物。
实施例8：人-猪嵌合囊胚
采用囊胚互补，在猪体内创建人类器官/细胞的非常重要的第一步是，确定人类干细胞是否能够并入到与滋养外胚层和囊胚腔相对的内细胞团内。为了确定人类干细胞是否能够并入到内细胞团内，而采用孤雌囊胚开发了一种测定系统。通过电激活猪的卵母细胞，导致从母系原核和极性体的DNA组合来形成二倍体细胞，从而创建孤雌囊胚。然后，单个二倍体细胞分裂，在激活后第6天成为适合注入人类干细胞的结构良好的囊胚。在电激活后第6天，将hUCBSC注入到单个猪孤雌囊胚内。然后，在第7天和第8天检查hUCBSC的分布，并且采用识别人类核抗原以使各个hUCBSC可视化的抗体，对每一时间点的人类干细胞的数量进行定量。发现，大多数hUCBSC被并入到内细胞团(图15A～15G和15F)中。此外，在注射到囊胚内之后的两天中，hUCBSC继续增殖(图15G)。
实施例9：人-猪嵌合胎儿
在经由囊胚互补来创建人类器官/细胞的另一个重要步骤是，证明注射有人类干细胞的猪囊胚可以得到含人类细胞的猪胎儿。为了解决这个问题，将hUCBSC注射到孤雌囊胚中，并将嵌合囊胚移植到激素同步的母猪体内。妊娠28天时收获胎儿(图16A)。对组织切片的组织学分析揭示了，在嵌合胎儿内部器官内的HNA-阳性细胞(图B)。这些结果证明hUCBSC有助于猪胎儿发育的能力。
人-猪嵌合胎儿来源于互补的PITX3敲除囊胚。还在猪-猪嵌合体中创建了猪黑质多巴胺神经元，并对其进行了表征；在人-猪嵌合体中创建了人黑质多巴胺神经元。采用了在成纤维细胞中的TALEN技术和克隆，生成了NURR1、LMX1A和PITX3敲除囊胚。通过采用经标记的猪卵裂球作为干细胞源，确定敲除囊胚是否能够生成互补型黑质多巴胺神经元。这种方法以前用于生成外源猪-猪胰腺(Matsunari et al,2013)。胎猪在胎龄34～35天，胎儿顶臀长度达到大约17mm时被处死。在发育的这一阶段，VM和其它脑部结构与E15天的胎鼠及处于第一孕期中期的人类胎儿的尺寸相当，并将它们用于细胞移植。证实了在胎儿VM中，猪-猪外源性多巴胺神经元来自NURR1、LMX1A或PITX3囊胚，这是一个里程碑，使我们能够继续制备人-猪嵌合体。
猪成纤维细胞中的LMXlA、PITX3和NURRl的TALEN敲除。TALEN经开发，用于分别切割LMXA1、PITX3和NURR1的外显子1、2和3，其中NURR1是在多巴胺神经元发育中起重要作用的另一基因(参见图17A，黑三角)。TALEN与同源依赖性修复模板共转染，以确保破坏靶向等位基因，其中同源依赖性修复模板经设计用于引入新的终止密码子、HindIII位点，以及在该新的终止密码子后的移码。分析经转染的细胞群的通过PCR-限制性片段多态性测定所产生的HindIII依赖性切割(图17B)。在凝胶上指示出具有新的HindIII-敲除等位基因的染色体部分(以切割产物，空心三角形示出)。单个克隆来源自群体，将那些经RFLP和测序证明为双等位基因敲除的克隆低温贮存用于互补实验。
实施例10：使用人类干细胞互补PITX3敲除的猪囊胚来挽救眼部表型。
为了确定人类干细胞是否能够互补猪中的PITX3缺失，而将hUCBSC注射到PITX3敲除的猪囊胚中，并将囊胚移植到激素同步的小母猪体内。在妊娠62天时收获嵌合胎儿，并检查眼睑的状态(图18A、18C和18E)。部分嵌合胎儿显现出与野生型猪胎儿类似的开放眼睑，而其它嵌合胎儿显示出闭合的眼睑。这些结果表明，猪囊胚中的PITX3敲除是考察人类干细胞对外胚层谱系贡献的合适模型。
实施例11：ETV2敲除的猪胚胎
Etv2是血管和造血谱系的主要调控基因，是基因编辑研究的理想候选基因。出于几个原因，Etv2基因座位经突变以产生血管和造血缺陷的猪胚胎。首先，已经全面证明了Etv2是小鼠中血管和造血发育的主要调控基因(Ferdous 2009,Rasmussen 2011,Koyano-Nakagawa 2012,Rasmussen 2012,Chan 2013,Rasmussen 2013,Behrens 2014,Shi 2014)。采用遗传谱系跟踪策略，证明了表达Etv2的细胞形成血管/内皮和造血谱系(Rasmussen2011,Koyano-Nakagawa 2012,Rasmussen 2012)。其次，开展全局基因缺失策略，证明了Etv2突变小鼠胚胎因缺乏血管和造血谱系而无法存活(Ferdous 2009,Koyano-Nakagawa2012,Rasmussen 2012,Rasmussen 2013)。利用转录组分析，确定了在缺乏Etv2时Tie2明显调节异常(Ferdous 2009,Koyano-Nakagawa 2012)。此外，采用转基因技术和分子生物学技术(转录测定、EMSA、ChIP和突变形成)，证明了Spil、Tie2和Lmo2是Etv2的直接下游靶标(Ferdous 2009,Koyano-Nakagawa 2012,Shi 2014)。第三，Etv2在分化的ES/EB系统中的强制过表达显著增加了内皮和造血谱系的群体，表明Etv2是一种单因子，能够支配这两个谱系的分子级联(Koyano-Nakagawa 2012)。
实施例12：ETV2敲除的猪胚胎缺乏血管和造血谱系
以前的研究表明，Etv2对小鼠的血管形成和造血功能非常重要，因为缺乏Etv2的胚胎由于缺乏脉管系统和血液，会在大约E9.5时死亡(Ferdous 2009,Rasmussen 2011,Koyano-Nakagawa 2012)。在不旨于受任何理论束缚的情况下，假设ETV2是哺乳动物中的脉管系统和血液的关键调控因子，因此，猪中的ETV2敲除在表型上模拟了小鼠。为了考察ETV2在猪中的作用，采用在猪成纤维细胞中的基因侧接的两个TALEN对去除整个ETV2编码序列(图19A和19B)。该过程的全基因去除效率是15％；528个经基因分型的克隆中有79个对于ETV2基因缺失是纯合的。ETV2纯合敲除的成纤维细胞克隆用于核克隆(Somatic CellNuclear Transfer；SCNT)，以产生无ETV2的胚胎，将其移植到代孕母猪体内。克隆效率是29％，高于平均成功率20％。
在E18.0时收获胚胎，并进行分析(图20A～20H)。在E18.0时，野生型(Wt)胚胎形成血管，且尿囊中脉管丛发育良好(图20A)，并且存在血液发育的证据(图20C)。与此相比，ETV2KO胚胎表现出明显的发育缺陷。虽然这两种胚胎都处于24-体节阶段(图20B)，但与Wt胚胎相比，ETV2KO生长迟缓，并且缺乏血液和血管谱系(图20C～20H)。ETV2KO胚胎缺少主静脉、背主动脉和心内膜，而这些在Wt胚胎中得到了明显发育(图20E～20H)。这些结果反映了类似的表型，暗示了ETV2的功能在小鼠和猪中是保守的。此外，这些数据强烈支持这一假设：可以将多突变导入到猪基因组内，以支持不止一种细胞类型被人源化的嵌合器官的生长。
实施例13：使用人iPSC互补ETV2敲除的猪囊胚
进一步开展研究，以确定hiPSC是否能够在猪体内互补ETV2缺失。将hiPSC注射到ETV2敲除的猪囊胚内，并将囊胚移植到激素同步的小母猪体内。在妊娠18天时收获嵌合胎儿，并通过免疫组化考察hiPSC的状态(图21A～21C)。采用针对Alu重复序列的探针，通过基因组原位杂交，以及通过对人核抗原(HNA)染色，来鉴定人类细胞。观察到存在表达人CD31和人vWF(血管/内皮标记物)的人类细胞，这支持了猪囊胚中的ETV2敲除是考察人类干细胞对血管和造血谱系作用的优秀模型的观点。
实施例14：作为心脏发生重要调控因子的Nkx2-5和HandII
心脏发育是复杂的、高度协调结合的事件，包括心脏祖细胞的特异化、增殖、迁移和分化，电耦合在一起，最终形成功能合胞体。心脏发生的这些阶段通过转录网络控制，采用基因破坏技术，已经示出该转录网络对于心脏的形成和存活非常重要(Lyons 1995,Srivastava 1997,Tanaka 1999,Bruneau 2001,Yamagishi 2001,Garry 2006,Ferdous2009,Caprioli 2011)(表1)。Nkx2-5是果蝇同源结构域(homeodomain)蛋白Tinman(Csx)的脊椎动物同源物。Tinman突变导致在果蝇中缺乏心脏形成(Bodmer 1993)。Nkx2-5是心脏谱系中最早表达的转录因子之一。对Nkx2-5的靶向破坏扰乱心脏形态发生、严重的生长迟缓，且胚胎在大约E9.5时死亡(Lyons 1995,Tanaka 1999)。HandII(dHand)是一种bHLH转录因子，也已经示出对心脏形态发生非常重要。HandII突变胚胎在胚胎形成早期死亡，并具有严重的右心室发育不全和主动脉弓缺陷(Srivastava 1997)。此外，同时缺乏Nkx2-5和HandII的小鼠表现出心室发育不全，且仅有一个心房腔(图22A～22D)(Yamagishi 2001)。在小鼠模型中的这些基因破坏研究表明了猪模型中使用基因编辑策略的有效性。
实施例15：猪NKX2-5和HANDII基因的多重敲除
采用TALEN刺激的HDR的组合产生NKX2-5/HANDII突变猪成纤维细胞。每一基因在其保守的转录因子/DNA结合结构域之内或仅接的前方被打靶(图23A)。这种策略优于在转录起始位点附近对基因进行打靶，以降低通过下游AUG处启动，产生功能肽的机会。对NKX2-5来说，提供同源模板，以产生新的框内终止密码子，用于RFLP筛选的限制性位点，和在终止密码子后的额外的五碱基插入，以防止功能性通读蛋白。对双突变体进行鉴定(图23B)。在单射击中可靠地产生双无效(null)猪成纤维细胞系的能力是独特且对互补非常重要的变革性技术。
实施例16：三敲除的猪胚胎中被扰乱的心脏发生
初步研究针对的是多个扰乱心脏发生的重要转录因子(即MESP1、GATA4、NKX2-5、HANDII、TBX5等)，并将提供重要的新研究模型和猪先天性心脏病的可能治疗方法。在此，作为概念验证，证明了成功打靶和对于NKX2-5/HANDII/TBX5基因缺失是纯合的克隆的生成。三敲除的成纤维细胞克隆用于核克隆(SCNT)，以产生NKX2-5/HANDII/TBX5无效的猪胚胎，并将该猪胚胎移植到代孕母猪体内。在E18(相当于小鼠的E11)时收获胚胎并进行分析。在E18时，与野生型对照猪胚胎相比，三基因敲除的猪胚胎具备了脉管系统、骨骼肌和血液，但基本上没有心脏(最小GATA4免疫组化阳性的心肌细胞)(图24A～24C)。这些数据支持了利用NKX2-5/HANDII双敲除猪模型来限制其它谱系(即TBX5KO中的神经元谱系)参与的合理性和可行性，是更好反映先天性心脏病(即右心和左心脏发育不全缺陷)的模型。这种方式可以在猪模型中设计人源化的两心室心脏。
实施例17：肌生成的重要调控因子Myf5、Myod和Mrf4
包括Myod、Myf5、Mrf4和Myog在内的Myod家族的发现为了解骨骼肌肌生成的调控机理提供了基础平台(图25A和25B)。
已经采用多种策略研究了肌生成期间Myod家族的调控网络，例如，转录组分析、启动子分析和ChIP-seq。Myod家族成员是主要的生肌调控因子，因为它们反式激活广泛的基因家族，包括肌肉特异性基因、转录因子、细胞周期基因等，来促进生肌细胞的命运。以前的基因破坏研究已经表明，缺乏Myf5/Myod/MRF4的小鼠没有骨骼肌，在出生后不久就死亡，推测是由于它们无法呼吸(由于缺少隔膜)。在小鼠中进行的这些基因破坏研究表明了在猪中使用基因编辑策略的有效性。
利用TALEN和同源依赖性修复(HDR)来敲除MYOD、MYF5和MRF4。为了考察MYF5/MYOD/MRF4(aka MYF6)在猪中的作用，采用TALEN刺激的HDR来破坏各编码序列(图26A～26C)。
MYF5/MYOD/MRF4敲除的猪胚胎缺乏骨骼肌谱系。在E18.0时收获胚胎，并进行分析(图27A和27B)。小鼠和猪中的结果反映出类似的表型，并且由于突变胚胎缺乏骨骼肌，支持了MYF5/MYOD/MRF4的功能在小鼠和猪之间是保守的观点。此外，这些数据强烈支持这一假设：多突变导入到猪基因组内，以支持不止一种细胞类型被人源化的嵌合器官的生长。
实施例18：使用GFP WT猪卵裂球互补MYF5/MYOD/MRF4敲除表型
采用SCNT得到猪的MYF5/MYOD/MRF4无效囊胚，并注入GFP-标记的猪卵裂球(由于没有可用的经验证的猪ES细胞，所以在本实验中利用了卵裂球)。将得到的嵌合体植入到假孕母猪体内，并在E20时检查。由于肝脏和卵黄囊呈GFP阳性，因此证明了互补的可行性。此外，估计大约10％的猪MYF5/MYOD/MRF4无效囊胚是经GFP标记的(图28A～28C)。这些数据支持了在这种猪突变宿主中的猪；猪互补。这些数据进一步支持了在缺乏骨骼肌的猪模型中创建三敲除，这最终创建了用于形成互补组织的生态龛。这在研究一直都用于在猪体内创建人源化的骨骼肌。
实施例19：在无胰胎猪中进行PDX1敲除的结果
Pdx1-/-小鼠是无胰的，出生后不久由于不具备从胰芽发育成熟器官的能力而死亡(Offield et al.,1996)。通过囊胚互补挽救小鼠Pdx1-/-表型已经得到了证明：将野生型小鼠或大鼠的iPSC注射到Pdx1-/-小鼠囊胚内，得到了具有正常发挥功能的胰腺的小鼠，其中正常发挥功能的胰腺来源于供体细胞(Kobayashi et al.,2010)。最近亦描述了猪中进行的Pdx1缺失的囊胚互补，其中，将经标记的WT卵裂球细胞注射到表达显性Pdx1:hes1转基因的猪囊胚内之后，在转基因的无胰猪中产生了功能性胰腺(Matsunaria et al,2013)。克隆的Pdx1敲除猪对采用转基因时的位置影响或表达水平的不可预测性并不敏感，并为胰腺去除的猪的产生提供了更一致的平台。TALEN技术已经被广泛用于在猪成纤维细胞中对PDX1基因进行双等位基因敲除(图29A)，该技术采用靶向PDX1基因的重要同源框结构域的TALEN对，和HDR构建体，以引入终止密码子、移码和新的限制性酶位点。纯合PDX1敲除的获得率是41％(76/184克隆)(图29B)。这些PDX1-/-成纤维细胞和染色质转移克隆技术已经用于产生PDX1-/-囊胚，并且证明了E30时收获的PDX1-/-猪胚胎中没有胰腺(图29C和29D)。在E32时收获的野生型胚胎中，猪胰腺中存在表达Pdx1和胰岛素的新生β-细胞(图29E)。
实施例20：HHEX敲除导致胎猪中的肝脏丢失
HHEX KO克隆的制备。在不旨于受任何理论限制的情况下，假设HHEX调控肝脏发育(图70)。在初步研究中，制备HHEX KO克隆，用于测试这种基因编辑方法的效率。开发出构建体，以在对DNA结合非常重要的同源结构域样区域的N-端内，切割HHEX基因的外显子2(参见图30A的黑三角)。成纤维细胞采用载体构建体和同源依赖性修复模板转染，其中同源依赖性修复模板经设计用于引入新的终止密码子、HindIII位点以及在新终止密码子之后的移码突变，以确保破坏靶向等位基因。采用PCR-限制性片段多态性测定，表明50％以上经转染的细胞群呈HindIII KO等位基因阳性(图30B)，若干独立的源自该细胞群的克隆对于KO等位基因是杂合或纯合的(图30C)。将总共22个经序列验证具有KO等位基因的克隆低温贮存。相同的载体构建体用于产生HHEX和Ubc双KO囊胚。
HHEX KO在猪中是胚胎致死的。为了确定HHEX KO在猪中的影响，采用SCNT克隆HHEX-/-成纤维细胞，并移植到同步受体内。在妊娠30～32天时，收获胚胎，并对肝脏的发育情况进行评价。对所有胚胎进行基因分型，证明了HHEX的敲除。所有样本都呈现发育迟缓，同时明显缺少肝脏(图31B)。从每个样本中采集样品，以使成纤维细胞生长为HHEX敲除细胞的来源，用于在未来的实验中，使该敲除与其它靶向基因如ETV2的编辑相结合，创建具有人脉管系统的人肝脏。
实施例21：对猪基因敲除和在胎猪中并入人干细胞的初步研究总结
初步研究表明了在猪中的靶向基因敲除，具有破坏了眼睛、心脏、肺、肝脏、骨骼肌、胰腺、脉管系统、造血细胞及多巴胺神经元的发育的能力。还证明了人类干细胞注入到猪桑葚胚/囊胚中导致它们在内细胞团内整合，并有助于胎猪的发育。重要的是，还观察到在囊胚互补的环境下，人类干细胞在胎猪中的贡献。这些结果为在猪中设计制造人类器官和细胞的可能性提供了强有力的证据。
实施例22：胎猪器官在16.4T时的MR成像
采用高场MRI，便于对经囊胚互补在猪中生成的器官进行成像。UMN磁共振研究中心的16.4T磁铁是目前世界上用于成像的最强大的磁铁。图33示出了妊娠期30天时的胎猪(顶臀长度20mm)，其中所有内部器官都相当清晰可见。对用于该图的脉冲序列进行优化，以察看肝脏。制定出其它脉冲序列，以优化其它器官的对比，用于除3D形态之外，量化各种参数，例如器官体积，以提供与互补器官的解剖学特征有关的信息。这提供了一种在靶基因敲除以生成特定器官之后，确定互补是否成功的快速定量的方式。
实施例23：工程改造多巴胺神经元以恢复运动功能
帕金森氏病是由脑黑质区多巴胺神经元的逐步丧失所引起的运动障碍。目前的治疗方法包括药物治疗，如L-DOPA，一种用于合成多巴胺的前体。L-DOPA疗法在一段时间内有效，但是，最终会发生药物诱发的运动障碍，导致该疗法是不理想的。临床试验证明，采用人类胎儿多巴胺细胞移植治疗帕金森氏病可以改善运动缺陷(Lindvall et al.,1989；Freedet al.,2001；Olanow et al.,2003)。此外，对移植受者在移植后长达18年的长期跟踪研究，报道了中断对其帕金森氏病的药物治疗(Kefalopoulou et al.,2014)。这种形式的细胞疗法广泛用于治疗帕金森氏病的主要障碍是作为供体多巴胺能神经元来源的人类胎儿脑组织有限。目前的iPSC方式无法生成完全真正的黑质多巴胺神经元。已经鉴定出对黑质中多巴胺神经元发育非常重要的基因，这些基因可以被靶向敲除，用于经由囊胚互补生成真正的神经元。
从各类型基因敲除的小鼠生成囊胚。将GFP-标记的小鼠iPSC细胞注射到囊胚内，并移植到代孕雌性动物体内。分析后代脑中存在GFP-阳性细胞的组织学证据。对猪的研究来说，从各类型基因敲除制备猪囊胚。将GFP-标记的猪卵裂球细胞注射到囊胚内，并移植到代孕母猪(sow)/小母猪(gilt)体内。在妊娠60天时分析胎儿脑中存在GFP-阳性细胞的组织学证据。将人类干细胞注射到囊胚内，以评价人-猪互补。
在不旨于受到任何理论限制的情况下，假设PITX3在多巴胺神经元/眼睛晶状体发育中发挥作用(图34)。采用TALEN成功去除了PITX3基因(图17和34)。图35示出了向PITX3KO的猪桑葚胚内引入供体hiPSC或人脐带血干细胞的程序。如图36所示，制备嵌合胎儿。采用人类干细胞互补猪囊胚中的PITX3敲除挽救了眼睛发育缺陷(图18和图37)。猪PITX3敲除还导致胎儿黑质中多巴胺神经元的丢失(图38A和38B)。使用人源神经元进行互补导致人源神经元并入到嵌合胎儿中，挽救了因PITX3敲除而引起的多巴胺神经元的丢失(图39A～39D)。hiPSC互补还诱导嵌合胎儿中黑质多巴胺神经元的存活水平达到与野生型猪类似的水平，而PITX3敲除导致多巴胺神经元的丢失(图40和41)。
在不旨于受到任何理论限制的情况下，假设LMX1A和PITX3基因对多巴胺神经元发育非常重要(图42)。为了调查互补是否能挽救由LMX1A/PITX3敲除所导致的表型，将表达GFP的野生型卵裂球引入到LMX1A-/-/PITX3-/-囊胚内(图43)。在PITX3/LMX1A敲除的胎儿中，猪-猪互补挽救了胎儿发育(图44A～44F)。在PITX3敲除的动物中，晶状体被去除(图45A和45B)。在PITX3/LMX1A敲除的动物中，猪-猪互补恢复了晶状体发育(图46A～46C)。在嵌合胎猪的脑中，发现了来自供体的细胞(GFP阳性细胞)(图47A～47D)。在嵌合猪的原始腹侧中脑内发现了DA神经元(多巴胺神经元)，表明猪-猪互补导致原始腹侧中脑内的DA神经元的发育(图48A～48C)。
表E列出了经编辑的承载体(宿主)的基因型、用于互补(挽救)动物的供体的基因型。
绿色＝进行了TALEN，并验证了功能。
黄色＝制备了细胞。
红色＝表型得到了验证
实施例24：工程改造用于脊髓修复的少突胶质祖细胞
神经障碍，如多发性硬化、脑白质营养不良和创伤性脊髓损伤导致髓鞘形成丢失。这些障碍可以得益于基于细胞的疗法，该疗法抑制髓磷脂的进一步丢失或恢复丢失的髓磷脂。脊髓移植后，高纯的少突胶质祖细胞(OPC)在体外从人胚胎干细胞分化为有髓鞘神经元(Nistor et al.,2005)。这一直被视为所观察到的功能恢复的可能的作用机理(Keirsteadet al.,2005；Sharp et al.,2010)。因此，一种可能的治疗策略是制备少突胶质祖细胞(OPC)。目前基于iPSC的方式收率低，OPC重编程不完全。鉴定了参与OPC发育的基因，这些基因可以经靶向敲除，用于在猪脑中大规模制备真正的人OPC。
对小鼠中组合敲除OLIG1和OLIG2进行了调查，以确定在小鼠-小鼠互补后，敲除的囊胚是否产生鼠源OPC。i)创建OLIG1和OLIG2敲除的小鼠，并考察OPC的缺失；ii)经由OLIG1/OLIG2敲除的囊胚互补(或作为选择，NKX2.1、NKX2.2和/或SOX10)，在幼鼠中创建小鼠的少突胶质祖细胞(OPC)；iii)将其移植到先天脱髓鞘小鼠体内，并证明髓鞘形成，从而确证OPC的功能性。
在不旨于受到任何理论限制的情况下，假设OLIG1/OLIG2对少突胶质细胞发育非常重要(图65)。为了研究OLIG1/OLIG2的功能，制备了OLIG1/OLIG2敲除的成纤维细胞(图66A～66C)。将表达GFP的野生型卵裂球引入到OLIG1/OLIG2敲除的囊胚内，以制备嵌合猪。对经野生型细胞互补的猪胎儿的整体荧光成像中，观察到GFP表达(图67A和67B)。表达GFP的细胞页被并入嵌合猪的中枢神经系统内(图68A和68B，及69A和69B)。特别是，在嵌合猪的脑(图68A和68B)和脊髓(图69A和69B)内都存在表达GFP的细胞。
表F列出了经编辑的承载者(宿主)的基因型、用于互补(挽救)动物的供体的基因型。
表F：
绿色＝进行了TALEN，并证明了功能。
黄色＝制备了细胞。
红色＝表型得到了验证
实施例25：工程改造年轻血液以使衰老的脑恢复活力
近期研究表明，幼龄小鼠和老龄小鼠的联体结合(parabiotic coupling)可以使老龄小鼠的脑功能恢复活力。但是，这种用于治疗脑衰老/退化的患者的方式在临床转化为，需要各患者接受来自年轻供体的血液。年轻血液的可得性有限，阻止了这种方式应用于绝大多数患者。通过对参与造血作用的关键基因进行编辑，得到自体的年轻血液源。敲除的囊胚可用于互补研究，用于在小鼠和猪中产生年轻血液。将来自幼龄小鼠的血液施用于老龄的患阿尔茨海默病的小鼠，以使脑功能恢复活力。并行地，作为“概念验证”，通过联体手术，将生成的幼龄小鼠与老龄的患阿尔茨海默病的小鼠结合，证明通过直接分享血液循环，使大脑功能恢复活力。此外，对在猪体内产生年轻的人血液进行评价，以挽救与年龄有关的神经退行性疾病，包括阿尔茨海默症(AD)、帕金森氏症(PD)、亨廷顿氏舞蹈病(HD)和肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)的小鼠模型中的感知和运动功能。成功将导致可以获得无限的自体年轻血液，用于使衰老和/或退化的脑恢复活力。
具有RAG2、IL2rg、C-KIT和ETV2单独敲除或组合敲除的囊胚可使用经GFP-标记的鼠源iPSC进行互补，来用于产生鼠源的造血作用。免疫细胞可通过一系列抗体组来鉴定，该抗体组经设计用于区分鼠源细胞和人细胞。T-细胞组采用CD3来分离T细胞群，CD4用于对辅助性T细胞进行染色，CD8a用于细胞毒性T细胞，并且CD25用作这些T细胞亚型各自的激活标记物。在独立的组中，FoxP3可用于鉴定调节性T细胞，CD25用于鉴定激活的调节性T细胞。小胶质细胞通过CD45和CD11b染色进行分析。此外，此组中还有小胶质细胞休眠标记物CD200；及交替激活的M2-样小胶质细胞标记物CD163。显示稳健互补的幼龄小鼠用作用于循环结合的年轻联体伙伴。采用联体和血浆输注方式，向老龄小鼠和阿尔茨海默症小鼠提供年轻的血液/血浆。通过联体手术，将经工程改造以产生人血液的幼龄小鼠与老龄小鼠或阿尔茨海默症小鼠连接。并行地，将来自幼龄小鼠的血浆合并，并静脉输注到老龄或阿尔茨海默症小鼠体内。在手术/血浆输注三至六个月之后，对小鼠(分开的联体对)进行一系列行为测试用于评价认知功能，包括开场试验、高架十字迷宫试验、新奇物体识别试验及Morris水迷宫试验。非联体和未接受治疗的年龄相仿的小鼠作为对照。
对猪的研究，采用经标记的猪卵裂球，评估了RAG2、IL2rg、C-KIT和ETV2单独敲除或组合敲除，产生猪造血细胞。参见图71～73。与小鼠研究相同，采用一组抗体来确定猪中的细胞表型，包括(CD45、CD3、δ-链TCR、CD8、CD4，用于鉴定αβ和γδT细胞；CD3、CD21和CD79a，用于B细胞；CD16、CD172a、CD2和CD8，用于NK细胞和巨噬细胞；及FoxP3用Treg)。猪-猪嵌合体的结果提供了对于哪些敲除适合在猪中产生人造血作用的信息。在猪-猪嵌合体研究完成时，鉴定了来自Technical Aim III的候选人类干细胞，用于开始在猪中对人类血液进行工程改造的研究。在无法得到物种特异性抗体时，采用多色流式细胞术和层次分析，使用一组特异性识别人类血细胞的抗体(如CD45、CD3、CD4、CD8和CD19)来分析细胞的表型。
所采用的宿主细胞(承载者)的基因型是：RAG2-/-/IL2rg-/-/C-KIT-/-/ETV2-/-；RAG2-/-/IL2rg-/-/C-KIT-/-；RAG2-/-/IL2rg-/-/ETV2-/-；IL2rg-/-/C-KIT-/-/ETV2-/-；RAG2-/-/IL2rg-/-；RAG2-/-/C-KIT-/-；RAG2-/-/ETV2-/-；IL2rg-/-/C-KIT-/-；IL2rg-/-/ETV2-/-；C-KIT-/-/ETV2-/-；RAG2-/-；IL2rg-/-；C-KIT-/-；ETV2-/-；C-KIT-/-。
在不旨于受到任何理论限制的情况下，假设RAG2/IL2Rg对T细胞、B细胞和NK细胞发育和胸腺发育是非常重要的(图49和图50)。还假设C-KIT基因对T细胞、B细胞和NK细胞发育和胸腺发育是非常重要的。为了在IL2Rg/RAG2敲除的动物中研究互补的影响，通过将表达GFP的野生型卵裂球并入IL2Rg/RAG2敲除的囊胚内，来制备嵌合动物(图51)。进一步地，制备IL2Rg/RAG2/C-KIT动物(图77～79)。收获经野生型细胞互补的IL2Rg/RAG2/C-KIT猪仔(Recip ID 6035)，并开展进一步研究。表型分型的分析表明，经互补的动物可能具有野生型基因组和突变体基因组(图80)。IL2Rg/RAG2/C-KIT敲除中的互补挽救了基因破坏，导致产生胸腺(图52A～52B)。在从脐带血、胸腺、脾、外周血单核细胞(PBMC)和肠系膜淋巴结(MLN)收集的细胞中，观察到了GFP+免疫细胞(图53)。在嵌合动物的胸腺中产生了免疫细胞(图54A～54F)。在血液和脾中，嵌合猪的胚胎包含数量与野生型猪胚胎类似的T细胞，而T细胞在IL2Rg/RAG2/C-KIT敲除的猪胚胎中显著减少(图55&56)。B细胞和NK细胞观察到类似的表型(图57～60)。总之，嵌合猪胚胎具有与野生型猪胚胎类似的免疫细胞分布情况，而敲除的猪胚胎中免疫细胞显著减少。
表G列出了经编辑的承载者(宿主)的基因型、用于互补(挽救)动物的供体的基因型。
绿色＝进行了TALEN，并验证了功能。
黄色＝制备了细胞。
红色＝表型得到验证
实施例26：工程改造造血细胞以修复皮肤
所采用的承载体(宿主)的基因型包括：RUNX1-/-/C-KIT-/-/FLKl-/-；RUNXl-/-/FLKl-/-；RUNXl-/-/C-KIT-/-；C-KIT-/-/FLKl-/-；RUNX1-/-；C-KIT-/-；FLK1-/-。
从每种类型的基因敲除的小鼠制备囊胚。将经GFP-标记的小鼠iPSC细胞注射到囊胚内，并移植到代孕雌性动物体内。分析后代在血液、骨髓、胸腺、淋巴结和皮肤中的GFP-阳性细胞的组织学证据。
在鼠源血液、骨髓、胸腺、淋巴结和皮肤中经GFP标记的，且表达中胚层和造血标记物CD45、CD3和PDGFR1α的细胞的组织学证明，指示实现了成功互补。
示出在小鼠血液、骨髓、胸腺、淋巴结和皮肤中的经GFP、CD45、CD3和PDGFR1α标记的细胞的组织学证据的FACS图和显微照片，指示实现了成功互补。
从每种类型的基因敲除的猪制备囊胚。将经GFP标记的猪卵裂球细胞注射到囊胚内，并移植到代孕母猪(sow)/小母猪(gilt)体内。在妊娠60天时分析胎儿的血液、骨髓、胸腺、淋巴结和皮肤中的GFP阳性细胞的组织学证据。
在猪胎儿的血液、骨髓、胸腺、淋巴结和皮肤中的经GFP标记的，且表达中胚层和造血标记物CD45、CD3和PDGFR1α的细胞的组织学证明。
表H列出了经编辑的承载体(宿主)的基因型、用于互补(挽救)动物的供体的基因型。
绿色＝进行了TALEN，并验证了功能。
黄色＝制备了细胞。
红色＝表型得到验证
实施例27：工程改造血管以修复脉管系统
血管疾病极为常见，如外周动脉疾病在美国每年影响1000万人，造成超过15万人截肢(Hirsch 2013)。此外，超过30万名患者接受了冠状动脉旁路移植(血管重建手术)。这些疾病因糖尿病、肥胖症和心血管疾病患病率的不断上升而总体剧增。重要的是，这些并发症导致相当高的发病率和死亡率。目前用于血管疾病的医学疗法包括截肢、血管旁路移植(采用患者患病的脉管系统)或人造血管(vascular graft)，所有这些治疗干预都具有明显的局限性。以前，人们发现Etv2是血管和造血系统发育的主要调控因子，Etv2无效的胚胎是致死的，且缺少血液内皮(hematoendothelial)系(Ferdous 2009,Rasmussen 2011,Koyano-Nakagawa 2012,Rasmussen 2012,Rasmussen 2013,Behrens 2014,Shi 2014)。采用基因编辑技术，证明了ETV2突变猪胚胎也缺少血液-内皮系。在ETV2突变猪模型中产生人源化的脉管系统。这不仅提供无限的人源化人造血管源，而且用作与其它基因编辑策略联用的，和工程改造具有人源化脉管系统的各器官的平台。这对移植医学的影响非常巨大，因为已知，猪内皮细胞上存在的细胞表面抗原(半乳糖-α(l,3)半乳糖)是异种器官移植时发生超急性排斥和血管内凝固的主要原因。
ETV2突变猪胚胎采用SCNT来制备，并进行全面分析。在ETV2突变桑葚胚内注入经GFP标记的猪卵裂球。这些经GFP标记的卵裂球也采用SCNT制备。将注射的桑葚胚移植到母猪体内，在E18、E24时收集胚胎，并在产后第7天(P7)收集新生猪仔。考察GFP阳性细胞对胚胎的贡献。在ETV2突变桑葚胚中注入人类干细胞(分析四条独立的线)。将经注射的桑葚胚移植到母猪体内，在E18、E24时收集胚胎。制备了猪-或人类干细胞-互补的ETV2无效的猪胚胎，并分别通过MRI和经胸壁超声心动图考察心脏和脉管功能。在E18、E24和P7时分析猪-猪嵌合体；在E18和E24时分析人-猪嵌合体。
宿主基因型包括：ETV2-/-。
表I列出了经编辑的承载体(宿主)的基因型、用于互补(挽救)动物的供体的基因型。
实施例28：工程改造血液心脏以修复心脏功能
先天性心血管畸形是最常见的先天缺陷，导致在小儿和成人中出现晚期或终末期心力衰竭。先天性心脏病在所有活产婴儿中的患病率是大约1％，并且具有相当高的发病率和死亡率(Garry 2006,Hoffman 1995,Kang 2000,Kramarow 2012,Rasmussen 2011)。先天性心脏病诱发的心力衰竭的唯一治愈性疗法是原位心脏移植。由于缺乏用于移植的器官，只有不到2％的患者接受此种救命的治疗。接受心脏移植的人需要终身接受免疫抑制，这同样具有有害的副作用并且限制存活。因此，需要开发一种人类心脏组织的替代来源。制备了人源化双心室心脏，其作为用于移植的器官的无限来源，并提供治疗先天性心脏病和终末期心力衰竭的范式转移平台(paradigm shifting platform)。以前公开的研究证明了Nkx2-5和Hand2对心室肌特化的重要作用(Yamagishi 2001)。因此，可以采用基因编辑技术，工程改造缺乏心室肌的NKX2-5/HANDII双敲除的猪胚胎。采用人类干细胞、SCNT和囊胚互补，来产生人源化双心室心脏。除作为治疗心血管疾病的人类心室肌的新来源之外，人源化猪还用作大型动物模型，来研究人类谱系再生或对药剂的反应，改善对于心血管疾病，包括先天性右心和左心发育不全和心力衰竭疾病的疗法。
采用SCNT制备NKX2-5/HandII突变桑葚胚，并在E18和E24时进行全面表征。在NKX2-5/HandII突变桑葚胚内注入经GFP标记的猪卵裂球。这些经GFP标记的卵裂球也采用SCNT制备。将经注射的桑葚胚移植到母猪体内，在E18、E24时收集胚胎，并在产后第7天(P7)收集新生猪仔。考察GFP阳性细胞对胚胎的贡献。在NKX2-5/HandII突变桑葚胚内注入人类干细胞(分析四条独立的线，并进行选择)。将经注射的桑葚胚移植到母猪体内，在E18、E24时收集胚胎。对子任务I-9.4，制备猪-或人类干细胞-互补的NKX2-5/HandII双敲除的猪胚胎，通过MRI和经胸壁超声心动图考察心脏和脉管功能。在E18、E24和P7时分析猪-猪嵌合体；在E18和E24时分析人-猪嵌合体。
采用的宿主细胞和供体细胞的基因型包括：NKX2-5-/-/HANDII-/-/TBX5-/-；NKX2-5-/-/HANDII-/-；HANDII-/-/TBX5-/-；NKX2-5-/-/TBX5-/-；HANDII-/-；TBX5-/-；NKX2-5-/-。
表J列出了经编辑的承载体(宿主)的基因型、用于互补(挽救)动物的供体的基因型。
绿色＝进行了TALEN，并验证了功能。
黄色＝制备了细胞。
红色＝表型得到验证。
实施例29：工程改造骨骼肌以恢复四肢功能
肌源性疾病，如肌肉萎缩症和衰老是比较常见而且致命的。虽然骨骼肌拥有非常强大的再生能力，但是这种潜能最终会因疾病和衰老而丧失。肌肉疾病晚期目前没有可用的治疗方法，老年人中50％的跌倒会导致他们死亡。此外，美国陆军战士，甚至轻步兵，由于肌肉骨骼损伤而损失大量的训练时间。这些损伤的发生率占全部伤员诊断的56％。由于需要长期物理治疗，因此恢复时间通常较长(Smith and Cashman,2002)。猪细胞外基质的异种移植被证明对外伤性损伤后肌肉的再生很有益处(Sicari et al.,2014)。这种提议的长远目标和临床意义是采用MYF5/MYOD/MRF4(aka Myf6)敲除的猪来制备人源化骨骼肌。这些人源化猪用作大型动物模型，用于研究人骨骼肌的再生，和/或对药剂的反应。采用这种方使改造的骨骼肌有望成为未来肌肉移植的来源。以前已经制备了经基因工程改造的小鼠模型，来定义肌生成和再生所必须且足够的网络。
MYF5/MYOD/MRF4三突变的猪胚胎采用SCNT制备，并进行全面分析。在MYF5/MYOD/MRF4三突变的桑葚胚内注入经GFP标记的猪卵裂球。这些经GFP标记的卵裂球也采用SCNT制备。将经注射的桑葚胚移植到母猪体内，在E24、E50时收集胚胎，并在产后第7天(P7)收集新生猪仔。考察GFP阳性细胞对胚胎的贡献。对于子任务I-10.3，向MYF5/MYOD/MRF4三突变的桑葚胚内注射人类干细胞(分析四条独立的线，它们根据技术区III所述进行选择)。将经注射的桑葚胚移植到母猪体内，在E24、E50时收集胚胎。对于子任务I-10.4，制备猪-或人类干细胞互补的MYF5/MYOD/MRF4无效猪胚胎，并通过MRI、收缩性分析和跛行试验，考察骨骼肌的功能。在E24、E50和P7时分析猪-猪嵌合体；在E24和E50时分析人-猪嵌合体。
所采用的宿主细胞和供体细胞的基因型包括：MYF5-/-/MYOD-/-/MRF4-/-；MYF5-/-/MYOD-/-；MYF5-/-/MRF4-/-；MYOD-/-/7MRF4-/-；MYF5-/-；MYOD-/-；MRF4-/-；PAX3-/-。
在不旨于受任何理论束缚的情况下，假设PAX3调控肌生成(图61)。为了调查互补是否挽救由PAX3敲除导致的表型，制备了嵌合小鼠(图62A、62B和74A)。在经表达GFP的野生型iPSC互补的Pax3突变小鼠中，GFP阳性细胞优先分布在四肢骨骼肌中(图62B)。互补小鼠还发育了后肢的肌肉组织/器官结构(图74B和74C)。还制备了Pax3敲除的猪(图75A～75B)。突变猪显示出与突变小鼠类似的表型(图75C～75F)。PAX3突变猪没有四肢骨骼肌。
表K列出了经编辑的承载体(宿主)的基因型、用于互补(挽救)动物的供体的基因型。
绿色＝进行了TALEN，并证明了功能。
黄色＝制备了细胞。
红色＝表型得到了验证。
实施例30：工程改造肝脏以恢复肝脏功能
酒精、肥胖、II型糖尿病、代谢综合征和病毒感染是慢性肝病的主要原因。非酒精性脂肪肝(NAFLD)和肝细胞癌的发病率即将成为世界范围的流行病。例如，在美国NAFLD的患病率估计占总人口的20～30％，占肥胖人口数(BMI>30)和中度肥胖人口(BMI>40)的比例高达75～100％(Farrell and Larter,2006)。虽然这些疾病的治疗选择很多，但是肝移植在许多情况下仍然是最可行的选择。虽然从1988至2009年，这种程序增加了3.7倍(Wertheim et al.,2011)，但是，对于用于原位肝移植的供体肝的需求和可得性之间不断增加的差距仍然是一个令人望而却步的问题。
HHEX和Ubc敲除的囊胚的制备–人们发现对早期肝发育非常重要的基因有同源框基因HHEX和多聚泛素基因Ubc。(i)采用TALEN和CRISPR基因编辑技术，敲除小鼠受精卵中这些基因中的任一基因；(ii)对KO受精卵的基因组进行测序，以确定缺少全长HHEX和Ubc基因；和，(iii)体外培养产生的HHEX-KO和Ubc-KO受精卵，直到它们达到囊胚阶段，并对它们进行广泛表征。
通过囊胚互补来创建人-小鼠肝嵌合体–源自从健康人类肝脏活检分离的肝脏细胞的hLDPC可用于创建人-小鼠嵌合体。在初步研究中，hLDPC已经分化为肝脏细胞，并发现它们可以有效植入在小鼠肝脏中。将hLDPC注射到HHEX-KO和Ubc-KO鼠源囊胚中进行囊胚互补，并将它们移植到C57BL/6雌性小鼠体内。在注射到小鼠胚胎内后，研究LDPC的植入。对囊胚的雌性受体所产的幼鼠的肝脏进行分析。值得注意的是，HHEX和Ubc小鼠都在胚胎期死亡，仅通过植入的hLPDC来互补肝脏细胞和肝上皮祖细胞的增殖时，这些小鼠胚胎才能存活超过E14.5阶段。
制备人-猪肝脏嵌合体-如在小鼠中一样，在猪体内制备嵌合肝脏，并测试猪体内制备的人源化肝脏的功能，以评价：
·它们在体内和体外的肝功能；
·从发育的肝脏中分离的肝脏细胞的人细胞嵌合性；
·植入的人LDPC对肝脏脉管系统形成的贡献；及
·分离的肝脏细胞的酶功能，并将它们与原代人肝脏细胞进行比较。
所采用的宿主细胞和供体细胞的基因型包括：HHEX-/-/Ubc-/-；HHEX-/-；Ubc-/-。
表L列出了经编辑的承载体(宿主)的基因型、用于互补(挽救)动物的供体的基因型。
绿色＝进行了TALEN，并验证了功能。
黄色＝制备了细胞。
红色＝表型得到了验证。
实施例31：工程改造胰腺用于移植和治疗糖尿病
胰腺疾病和障碍(包括糖尿病)的治疗目前因可用于整体器官或胰岛移植的人类胰腺的稀缺而受到严重限制。已经通过在Pdx1-/-小鼠中的外源大鼠iPSC和在Pdx1:Hes1猪中的同系细胞(syngenic cell)，证明了无胰表型的囊胚互补(Kobayashi et al.,2010,Matsunaria et al,2013)。在这两种情况下，在经互补的动物中形成的胰腺完全来自供体细胞的子代。制备了克隆Pdx1-/-猪，并用于在猪-人嵌合体中制备源自人类干细胞子代的完整的人类胰腺，这实现了数量不受限地生产用于移植的人类胰腺器官和胰岛，并且是产生用于自体移植的患者-特异性胰腺的技术平台。
通过将WT，GFP+ve猪卵裂球注入到Pdx1-/-猪囊胚内，并且在妊娠早期和中期及产后初期分析经互补的仔畜的嵌合胚胎内是否存在表达GFP的细胞，首先证明了在Pdx1-/-猪中的可用的胰腺生态龛(niche)互补。调查了人类干细胞在猪中，对Pdxl基因敲除(及Pdx1和ETV2基因双敲除)的互补。向克隆的Pdx1-/-或Pdx1-/-Etv2-/-猪囊胚内注射最佳互补的人类干细胞。制备妊娠中期的嵌合胚胎、产后初期的幼崽和经互补的成年猪，以提供人类胰腺组织和胰岛用于进行体外和体内测试，包括测试在猪中产生的人类胰岛恢复糖尿病的啮齿动物和非人类灵长目动物模型中的血糖稳态的能力。
所采用的宿主细胞和供体细胞的基因型包括：Pdx1-/-/Etv2-/-；Pdxl-/-；Etv2-/-。
在不旨于受任何理论束缚的情况下，假设PDX1调控胰腺发育(图63)。为了研究PDX1基因的影响，制备了PDX1基因敲除的猪。在PDX1敲除的猪中，没有发生胰腺发育(图29A～29E)。
表M列出了经编辑的承载体(宿主)的基因型、用于互补(挽救)动物的供体的基因型。
绿色＝进行了TALEN，并验证了功能。
黄色＝制备了细胞。
红色＝表型得到了验证。
实施例32：工程改造肺以恢复肺功能
在美国，肺病每年造成40万人死亡，对许多晚期肺病，如慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺气肿、急特发性肺纤维化、原发性肺动脉高压和囊肿性纤维化来说，移植是唯一“治愈”方法。但是，每年仅开展2000例肺移植。对于我们的军事人员特别重要的是，最近报道从伊拉克和阿富汗返回的美国士兵中14％的人患有吸入性肺损伤。这些损伤，包括慢性细支气管炎和肺脉管重构的长期影响，肯定会增加需进行移植的不可逆肺病在这些退伍军人中的发病率。肺移植的重大障碍包括可用的供体肺缺乏、因肺通常是非HLA-匹配而造成的慢性排斥、需要终生进行免疫抑制及高死亡率。因此，需要保证不发生排斥的可移植肺组织的新来源的安全。测试参与肺发育的基因，以确定哪些基因可以被靶向敲除，用于开展囊胚互补研究，最终制备人肺。
测试敲除中在肺发育的不同阶段和细胞系(上皮Nkx2.1、Sox2、Id2、间叶细胞Tbx4)中有活性的转录因子，以确定相应的囊胚是否具有互补的不同能力。通过使MMRRC提供的Nkx2.1+/-杂交，来制备Nkx2.1-/-。采用TALEN基因编辑，制备其它KO成纤维细胞。向KO小鼠囊胚内注射野生型小鼠GFP+ES细胞。采用小鼠iPS细胞，重复了成功互补。测试了敲除中在肺发育的不同阶段和细胞系(上皮Nkx2.1、Sox2、Id2、间叶细胞Tbx4)中有活性的转录因子，以确定得到的猪胎儿是否缺少肺。采用TALEN基因编辑得到的KO猪的成纤维细胞，重新创建了得到成功囊胚互补的敲除。采用孤雌生殖猪的囊胚克隆KO猪，以评价肺缺失表型的产生。对于那些被证明具有肺发育缺陷的KO，将表达GFP的猪卵裂球注射到KO囊胚胚胎内。在妊娠30天和60天时，测定嵌合胎猪中供体细胞的植入和肺表型互补情况，检查KO的互补能力。为了确定人多能干细胞是否能够互补肺缺陷的猪囊胚，将表达GFP的人iPS细胞、原始态iPS细胞、UCBSC或MAPC注射到KO猪囊胚内。在妊娠30天和60天时对肺的嵌合情况及互补情况进行评价。采用所鉴定的最高植入的人类干细胞系，进行在子任务I-13.3中所鉴定的最有前景的敲除的囊胚互补。采用免疫组化技术和流式细胞术，评价了肺的形态发生，并鉴定了人类细胞。在接近分娩期的妊娠后期，进一步探索成功的组合，用于评价肺的功能(肺功能测试)、表面活性物质和粘蛋白产生，以评价肺的成熟度。
所采用的宿主细胞和供体细胞的基因型包括：Nkx2.1-/-/Sox2-/-/Id2-/-/Tbx4-/-；Nkx2.1-/-/Sox2-/-/Id2-/-；Nkx2.1-/-/Sox2-/-/Tbx4-/-；Nkx2.1-/-/Id2-/-/Tbx4-/-；Sox2-/-/Id2-/-/Tbx4-/-；Nkx2.1-/-/Sox2-/-；Nkx2.1-/-/Id2-/-；Nkx2.1/Tbx4-/-；Sox2-/-/Id2-/-；Sox2-/-/Tbx4-/-；Id2-/-/Tbx4-/-；Nkx2.1-/-；Sox2-/-；Id2-/-；Tbx4-/-。
在不旨于受任何理论束缚的情况下，假设NKX2.1调控肺发育(图64)。为了研究NKX2.1基因对肺发育的影响，制备了NKX2.1敲除的猪。敲除(TALEN基因编辑)了猪成纤维细胞的转录因子Nkx2.1，对肺发育非常重要的基因。在第30天的猪胚胎显示在初期假腺阶段的肺生长迟缓(图32A～32F)。因此，在囊胚期，采用人类干细胞进行互补可以是产生用于移植或肺病研究的人肺的来源。NKX2.1敲除的猪可用于解决移植用供体肺短缺和缺乏合适的人肺疾病体内模型的问题。
表N列出了经编辑的承载体(宿主)的基因型、用于互补(挽救)动物的供体的基因型。
绿色＝进行了TALEN，并验证了功能。
黄色＝制备了细胞。
红色＝表型得到验证。
进一步公开
此处提到的专利、专利申请、公开及文章都通过引用而并入本文中；若有冲突，以本说明书为准。实施方式具有各种特征；根据需要，这些特征可以混合和配合，从而构成有功能的实施方式。标题和副标题只是为了方便，并非实质性意思，并不限制所描述的范围。

Claims (83)

1.一种包含非人类胚胎的嵌合胚胎，具有至少一种人类细胞，其中所述非人类胚胎中负责一种或多种内源器官或组织发育的一个或多个内源基因的两个等位基因都是被破坏的，其中所述人类细胞中负责相应的一种或多种人类器官或组织发育的一个或多个基因互补被破坏的一个或多个内源基因的功能，以便从所述嵌合胚胎发育的动物包括至少一种人类器官或组织，其中：
所述内源基因包括NURR1、LMX1A和/或PITX3，且所述人类器官或组织包括多巴胺神经元；
所述内源基因包括OLIG和/或OLIG2，且所述人类器官或组织包括少突胶质细胞；所述内源基因包括RAG2、IL2rg、C-KIT和/或ETV2，且所述人类器官或组织包括年轻血液；
所述内源基因包括RUNX1、C-KIT和/或FLK1，且所述人类器官或组织包括造血细胞；
所述内源基因包括ETV2，且所述人类器官或组织包括人血管细胞；
所述内源基因包括MYF5、MYOD、MRF4和/或PAX3，且所述人类器官或组织包括骨骼肌细胞；
所述内源基因包括NKX2-5、HANDII和/或TBX5，所述人类器官或组织包括心肌细胞；
所述内源基因包括Pdx和/或ETV2，所述人类器官或组织包括胰腺细胞；
所述内源基因包括HHEX和/或Ubc，所述人类器官或组织包括人肝脏细胞；或
所述内源基因包括Nkx2.1、Sox2、Id2和/或Tbx4，所述人类器官或组织包括肺细胞。
2.一种包含非人类胚胎的嵌合胚胎，具有至少一种人类细胞，其中所述非人类胚胎中负责一种或多种内源器官或组织发育的一个或多个内源基因的两个等位基因都是被破坏的，其中所述人类细胞中负责相应的一种或多种人类器官或组织发育的一个或多个基因互补被破坏的一个或多个内源基因的功能，以便从所述嵌合胚胎发育的动物包括至少一种人类器官或组织，其中：
所述内源基因包括NURR1、LMX1A和/或PITX3，所述人类器官或组织包括多巴胺神经元；
所述内源基因包括OLIG和/或OLIG2，所述人类器官或组织包括少突胶质细胞；
所述内源基因包括RAG2、IL2rg、C-KIT和/或ETV2，所述人类器官或组织包括年轻血液；
所述内源基因包括RUNX1、C-KIT和/或FLK1，所述人类器官或组织包括造血细胞；
所述内源基因包括PAX3，所述人类器官或组织包括骨骼肌细胞；
所述内源基因包括Pdx和/或ETV2，所述人类器官或组织包括胰腺细胞；
所述内源基因包括HHEX和/或Ubc，所述人类器官或组织包括人肝脏细胞；或
所述内源基因包括Nkx2.1、Sox2、Id2和/或Tbx4，所述人类器官或组织包括肺细胞。
3.一种包含非人类胚胎的嵌合胚胎，具有至少一种人类细胞，其中所述非人类胚胎中负责一种或多种内源器官或组织发育的一个或多个内源基因的两个等位基因都已经被破坏，其中所述人类细胞中负责相应的一种或多种人类器官或组织发育的一个或多个基因互补被破坏的一个或多个内源基因的功能，以便从所述嵌合胚胎发育的动物包括至少一种人类器官或组织，
其中：
所述内源基因是RAG2和IL2rg和/或ETV2，所述人类器官或组织包括年轻血液；
所述内源基因是MYF5、MYOD和MRF4和/或PAX3，所述人类器官或组织包括骨骼肌细胞；或
所述内源基因是NKX2-5、HANDII和/或TBX5，所述人类器官或组织包括心肌细胞。
4.一种包含非人类胚胎的嵌合胚胎，具有至少一种人类细胞，其中所述非人类胚胎中负责一种或多种内源器官或组织发育的一个或多个内源基因的两个等位基因都已经被破坏，其中所述人类细胞中负责相应的一种或多种人类器官或组织发育的一个或多个基因互补被破坏的一个或多个内源基因的功能，以便从所述嵌合胚胎发育的动物包括至少一种人类器官或组织，
其中：
所述内源基因是RAG2和IL2rg和/或ETV2，所述人类器官或组织包括年轻血液；
所述内源基因包括PAX3，所述人类器官和/或组织包括骨骼肌细胞；或
所述内源基因是NKX2-5、HANDII和/或TBX5，所述人类器官或组织包括心肌细胞。
5.根据权利要求1所述的嵌合胚胎，其中所述内源基因包括NURR1、LMX1A和/或PITX3，所述人类器官或组织包括多巴胺神经元。
6.根据权利要求1所述的嵌合胚胎，其中所述内源基因包括OLIG和/或OLIG2，所述人类器官或组织包括少突胶质细胞。
7.根据权利要求1所述的嵌合胚胎，其中所述内源基因包括RAG2、IL2rg、C-KIT和/或ETV2，所述人类器官或组织包括年轻血液。
8.根据权利要求1所述的嵌合胚胎，其中所述内源基因包括RUNX1、C-KIT和/或FLK1，所述人类器官或组织包括造血细胞。
9.根据权利要求1所述的嵌合胚胎，其中所述内源基因包括ETV2，所述人类器官或组织包括人血管细胞。
10.根据权利要求1所述的嵌合胚胎，其中所述内源基因包括MYF5、MYOD、MRF4和/或PAX3，所述人类器官或组织包括骨骼肌细胞。
11.根据权利要求1所述的嵌合胚胎，其中所述内源基因包括NKX2-5、HANDII和/或TBX5，所述人类器官或组织包括心肌细胞。
12.根据权利要求1所述的嵌合胚胎，其中所述内源基因包括Pdx和/或ETV2，所述人类器官或组织包括胰腺细胞。
13.根据权利要求1所述的嵌合胚胎，其中所述内源基因包括HHEX或Ubc，所述人类器官或组织包括人肝脏细胞。
14.根据权利要求1所述的嵌合胚胎，其中所述内源基因包括Nkx2.1、Sox2、Id2和/或Tbx4，所述人类器官或组织包括肺细胞。
15.根据权利要求1～14中任一项所述的嵌合胚胎，其中所述非人类胚胎是非人类脊椎动物胚胎。
16.根据权利要求15所述的嵌合胚胎，其中所述非人类脊椎动物胚胎是偶蹄目动物胚胎或非人类灵长目动物胚胎。
17.根据权利要求15所述的嵌合胚胎，其中所述非人类脊椎动物胚胎选自由牛、马、猪、绵羊、鸡、鸟、兔、山羊、狗、猫、实验室动物、甲壳类动物和鱼组成的组。
18.根据权利要求16所述的嵌合胚胎，其中所述非人类脊椎动物胚胎是母牛、猪、绵羊、山羊、鸡或兔的胚胎。
19.根据权利要求1～18中任一项所述的嵌合胚胎，其中非人类胚胎中负责一种或多种内源器官或组织发育的一个或多个内源基因已经通过转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、成簇的规律性间隔短回文重复序列(CRISPR)、CRISPR相关蛋白9(Cas9)、锌指核酸酶(ZFN)、分子编码位点特异性内切酶、人工合成染色体、RecA-gal4融合、RNAi、CRISPRi或它们的组合被破坏。
20.根据权利要求19所述的嵌合胚胎，其中所述一个或多个内源基因已经通过Cas9被破坏。
21.根据权利要求1～20中任一项所述的嵌合胚胎，其中所述人类细胞源自至少一种供体细胞，所述至少一种供体细胞是胚胎干细胞、组织特异性干细胞、间充质干细胞、多能干细胞或诱导多能干细胞。
22.根据权利要求1～21中任一项所述的嵌合胚胎，其中所述破坏包括基因编辑，敲除，一个或多个DNA残基的插入，一个或多个碱基的缺失，或一个或多个DNA残基的插入和缺失。
23.根据权利要求1～21中任一项所述的嵌合胚胎，其中所述破坏包括一个或多个DNA残基的取代。
24.根据权利要求23所述的嵌合胚胎，其中所述破坏由一个或多个DNA残基的取代组成。
25.一种从根据权利要求1～24中任一项所述的嵌合胚胎发育的动物。
26.一种从根据权利要求1～25任一项所述的嵌合胚胎发育的动物收获的人类组织或器官。
27.一种产生嵌合胚胎的方法，包括：
a)破坏至少一个非人类细胞或非人类胚胎中负责一种或多种器官或组织发育的一个或多个内源基因的两个等位基因；
b)如果步骤a)是对非人类细胞进行的，则克隆该细胞以产生胚胎；和
c)将至少一种人类细胞引入步骤a)或步骤b)的胚胎中，其中所述人类细胞携带负责所述一种或多种器官或组织发育的一个或多个基因，从而产生嵌合胚胎，其中：
所述内源基因包括NURR1、LMX1A和/或PITX3，所述人类器官或组织包括多巴胺神经元；
所述内源基因包括OLIG和/或OLIG2，所述人类器官或组织包括少突胶质细胞；
所述内源基因包括RAG2、IL2rg、C-KIT和/或ETV2，所述人类器官或组织包括年轻血液；
所述内源基因包括RUNX1、C-KIT和/或FLK1，所述人类器官或组织包括造血细胞；
所述内源基因包括ETV2，所述人类器官或组织包括人血管细胞；
所述内源基因包括MYF5、MYOD、MRF4和/或PAX3，所述人类器官或组织包括骨骼肌细胞；
所述内源基因包括NKX2-5、HANDII和/或TBX5，所述人类器官或组织包括心肌细胞；
所述内源基因包括Pdx和/或ETV2，所述人类器官或组织包括胰腺细胞；
所述内源基因包括HHEX和/或Ubc，所述人类器官或组织包括人肝脏细胞；或
所述内源基因包括Nkx2.1、Sox2、Id2和/或Tbx4，所述人类器官或组织包括肺细胞。
28.一种产生嵌合胚胎的方法，包括：
a)破坏至少一个非人类细胞或非人类胚胎中负责一种或多种器官或组织发育的一个或多个内源基因的两个等位基因；
b)如果步骤a)是对非人类细胞进行的，则克隆该细胞以产生胚胎；和
c)将至少一种人类细胞引入向步骤a)或步骤b)的胚胎中，其中所述人类细胞携带负责所述一种或多种器官或组织发育的一个或多个基因，从而产生嵌合胚胎，其中：
所述内源基因包括NURR1、LMX1A和/或PITX3，所述人类器官或组织包括多巴胺神经元；
所述内源基因包括OLIG和/或OLIG2，所述人类器官或组织包括少突胶质细胞；
所述内源基因包括RAG2、IL2rg、C-KIT和/或ETV2，所述人类器官或组织包括年轻血液；
所述内源基因包括RUNX1、C-KIT和/或FLK1，所述人类器官或组织包括造血细胞；
所述内源基因包括PAX3，所述人类器官或组织包括骨骼肌细胞；
所述内源基因包括Pdx和/或ETV2，所述人类器官或组织包括胰腺细胞；
所述内源基因包括HHEX和/或Ubc，所述人类器官或组织包括人肝脏细胞；或
所述内源基因包括Nkx2.1、Sox2、Id2和/或Tbx4，所述人类器官或组织包括肺细胞。
29.一种产生嵌合胚胎的方法，包括：
a)破坏至少一个非人类细胞或非人类胚胎中负责一种或多种器官或组织发育的一个或多个内源基因的两个等位基因；
b)如果步骤a)是对非人类细胞进行的，则克隆该细胞以产生胚胎；和
c)将至少一种人类细胞引入步骤a)或步骤b)的胚胎中，其中所述人类细胞携带负责所述一种或多种器官或组织发育的一个或多个基因，从而产生嵌合胚胎，其中：
所述内源基因是RAG2和IL2rg和/或ETV2，所述人类器官或组织包括年轻血液；
所述内源基因是MYF5、MYOD和MRF4和/或PAX3，所述人类器官或组织包括骨骼肌细胞；或
所述内源基因是NKX2-5、HANDII和TBX5，所述人类器官或组织包括心肌细胞。
30.一种产生嵌合胚胎的方法，包括：
a)破坏至少一个非人类细胞或非人类胚胎中负责一种或多种器官或组织发育的一个或多个内源基因的两个等位基因；
b)如果步骤a)是对非人类细胞进行的，则克隆该细胞以产生胚胎；和
c)将至少一种人类细胞引入步骤a)或步骤b)的胚胎中，其中所述人类细胞携带负责所述一种或多种器官或组织发育的一个或多个基因，从而产生嵌合胚胎，其中：
所述内源基因是RAG2和IL2rg和/或ETV2，所述人类器官或组织包括年轻血液；
所述内源基因是PAX3，所述人类器官或组织包括骨骼肌细胞；或
所述内源基因是NKX2-5、HANDII和TBX5，所述人类器官或组织包括心肌细胞。
31.根据权利要求30～32中任一项所述的方法，其中所述内源基因包括NURR1、LMX1A和/或PITX3，所述人类器官或组织包括多巴胺神经元。
32.根据权利要求27所述的方法，其中所述内源基因包括OLIG和/或OLIG2，所述人类器官或组织包括少突胶质细胞。
33.根据权利要求27所述的方法，其中所述内源基因包括RAG2、IL2rg、C-KIT和/或ETV2，所述人类器官或组织包括年轻血液。
34.根据权利要求27所述的方法，其中所述内源基因包括RUNX1、C-KIT和/或FLK1，所述人类器官或组织包括造血细胞。
35.根据权利要求27所述的方法，其中所述内源基因包括ETV2，所述人类器官或组织包括人血管细胞。
36.根据权利要求27所述的方法，其中所述内源基因包括MYF5、MYOD、MRF4和/或PAX3，所述人类器官或组织包括骨骼肌细胞。
37.根据权利要求27所述的方法，其中所述内源基因包括NKX2-5、HANDII和/或TBX5，所述人类器官或组织包括心肌细胞。
38.根据权利要求27所述的方法，其中所述内源基因包括Pdx和/或ETV2，所述人类器官或组织包括胰腺细胞。
39.根据权利要求27所述的方法，其中所述内源基因包括HHEX和/或Ubc，所述人类器官或组织包括人肝脏细胞。
40.根据权利要求27所述的方法，其中所述内源基因包括Nkx2.1、Sox2、Id2和/或Tbx4，所述人类器官或组织包括肺细胞。
41.根据权利要求27～40中任一项所述的方法，其中所述非人类胚胎是非人类脊椎动物胚胎。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述非人类脊椎动物胚胎是偶蹄目动物胚胎或非人类灵长目动物胚胎。
43.根据权利要求41所述的方法，其中所述非人类脊椎动物胚胎选自由牛、马、猪、绵羊、鸡、鸟、兔、山羊、狗、猫、实验室动物和鱼组成的组。
44.根据权利要求27～43中任一项所述的方法，其中至少一种人类供体细胞是胚胎干细胞、组织特异性干细胞、间充质干细胞、多能干细胞或诱导多能干细胞。
45.根据权利要求27～44中任一项所述的方法，进一步包括将所述嵌合胚胎移植到动物的子宫内，其中所述嵌合胚胎发育成包含人类细胞的嵌合动物。
46.根据权利要求45所述的方法，进一步包括从所述嵌合动物收获人类细胞。
47.根据权利要求46所述的方法，进一步包括将所述人类细胞移植到有需要的人类患者中。
48.根据权利要求47所述的方法，其中至少一种所述人类细胞由人类患者提供。
49.根据权利要求27～48中任一项所述的方法，其中非人类胚胎中负责一种或多种内源器官或组织发育的一个或多个内源基因已经通过转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、成簇的规律性间隔短回文重复序列(CRISPR)、CRISPR相关蛋白9(Cas9)、锌指核酸酶(ZFN)、分子编码位点特异性内切酶、人工合成染色体、RecA-gal4融合、RNAi、CRISPRi或它们的组合被破坏。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述方法是Cas9。
51.根据权利要求49～50中任一项所述的方法，进一步包括引入同源介导修复(HDR)模板，所述同源介导修复(HDR)模板具有与所述内源基因之一同源的模板序列，且所述模板序列替代内源基因序列的至少一部分，以破坏所述内源基因。
52.根据权利要求51所述的方法，进一步包括引入多种同源介导修复(HDR)模板，所述同源介导修复(HDR)模板各自都具有与所述内源基因之一同源的模板序列，且各模板序列替代内源基因序列之一的至少一部分，以破坏所述内源基因。
53.根据权利要求51或52所述的方法，其中所述破坏包括所述内源基因的一个或多个DNA残基的取代。
54.根据权利要求51或52所述的方法，其中所述破坏由所述内源基因的一个或多个DNA残基的取代组成。
55.一种采用权利要求27～54中任一项所述的方法创建的嵌合胚胎或嵌合动物。
56.一种在非人类宿主动物中产生人类或人源化的器官或组织的方法，包括：
a)破坏非人类胚胎的至少一个细胞中负责器官或组织发育的一个或多个内源基因的两个等位基因；
b)如果步骤a)是对动物宿主的细胞进行的，则克隆该细胞以产生胚胎；和
c)通过将至少一种人类细胞引入步骤a)或步骤b)的胚胎中，产生嵌合宿主胚胎，其中所述人类细胞携带负责相应的人类器官或组织发育的一个或多个基因；
其中从所述嵌合宿主胚胎发育的动物包括人类或人源化的器官或组织，从而在非人类宿主动物中产生人类或人源化的器官或组织，并且其中：
所述内源基因包括NURR1、LMX1A和/或PITX3，所述人类器官或组织包括多巴胺神经元；
所述内源基因包括OLIG和/或OLIG2，所述人类器官或组织包括少突胶质细胞；
所述内源基因包括RAG2、IL2rg、C-KIT和/或ETV2，所述人类器官或组织包括年轻血液；
所述内源基因包括RUNX1、C-KIT和/或FLK1，所述人类器官或组织包括造血细胞；
所述内源基因包括ETV2，所述人类器官或组织包括人血管细胞；
所述内源基因包括MYF5、MYOD、MRF4和/或PAX3，所述人类器官或组织包括骨骼肌细胞；
所述内源基因包括NKX2-5、HANDII和/或TBX5，所述人类器官或组织包括心肌细胞；
所述内源基因包括Pdx和/或ETV2，所述人类器官或组织包括胰腺细胞；
所述内源基因包括HHEX和/或Ubc，所述人类器官或组织包括人肝脏细胞；或
所述内源基因包括Nkx2.1、Sox2、Id2和/或Tbx4，所述人类器官或组织包括肺细胞。
57.一种在非人类宿主动物中产生人类或人源化的器官或组织的方法，包括：
a)破坏非人类胚胎的至少一个细胞中负责器官或组织发育的一个或多个内源基因的两个等位基因；
b)如果步骤a)是对动物宿主的细胞进行的，则克隆该细胞以产生胚胎；和
c)通过将至少一种人类细胞引入步骤a)或步骤b)的胚胎中，产生嵌合宿主胚胎，其中所述人类细胞携带负责相应的人类器官或组织发育的一个或多个基因；
其中从所述嵌合宿主胚胎发育的动物包括人类或人源化的器官或组织，从而在非人类宿主动物中产生人类或人源化的器官或组织，其中：
所述内源基因包括NURR1、LMX1A和/或PITX3，所述人类器官或组织包括多巴胺神经元；
所述内源基因包括OLIG和/或OLIG2，所述人类器官或组织包括少突胶质细胞；
所述内源基因包括RAG2、IL2rg、C-KIT和/或ETV2，所述人类器官或组织包括年轻血液；
所述内源基因包括RUNX1、C-KIT和/或FLK1，所述人类器官或组织包括造血细胞；
所述内源基因包括PAX3，所述人类器官或组织包括骨骼肌细胞；
所述内源基因包括Pdx和/或ETV2，所述人类器官或组织包括胰腺细胞；
所述内源基因包括HHEX和/或Ubc，所述人类器官或组织包括人肝脏细胞；或
所述内源基因包括Nkx2.1、Sox2、Id2和/或Tbx4，所述人类器官或组织包括肺细胞。
58.一种在非人类宿主动物中产生人类或人源化的器官或组织的方法，包括：
a)破坏非人类胚胎的至少一个细胞中负责器官或组织发育的一个或多个内源基因的两个等位基因；
b)如果步骤a)是对动物宿主的细胞进行的，则克隆该细胞以产生胚胎；和
c)通过将至少一种人类细胞引入步骤a)或步骤b)的胚胎中，产生嵌合宿主胚胎，其中所述人类细胞携带负责相应的人类器官或组织发育的一个或多个基因；其中：
所述内源基因是RAG2和IL2rg或ETV2，所述人类器官或组织包括年轻血液；
所述内源基因是MYF5、MYOD和MRF4或PAX3，所述人类器官或组织包括骨骼肌细胞；或
所述内源基因包括NKX2-5、HANDII和/或TBX5，所述人类器官或组织包括心肌细胞。
59.一种在非人类宿主动物中产生人类或人源化的器官或组织的方法，包括：
a)破坏至少一个非人类细胞或非人类胚胎中的负责一种或多种器官或组织发育的一个或多个内源基因的两个等位基因；
b)如果步骤a)是对非人类细胞进行的，则克隆该细胞以产生胚胎；和
c)将至少一种人类细胞引入步骤a)或步骤b)的胚胎中，其中所述人类细胞携带负责所述一种或多种器官或组织发育的一个或多个基因，从而产生嵌合胚胎，其中：
所述内源基因是RAG2和IL2rg和/或ETV2，所述人类器官或组织包括年轻血液；
所述内源基因是PAX3，所述人类器官或组织包括骨骼肌细胞；或
所述内源基因是NKX2-5、HANDII和/或TBX5，所述人类器官或组织包括心肌细胞。
60.根据权利要求56所述的方法，其中所述内源基因包括NURR1、LMX1A和/或PITX3，所述人类器官或组织包括多巴胺神经元。
61.根据权利要求56所述的方法，其中所述内源基因包括OLIG和/或OLIG2，所述人类器官或组织包括少突胶质细胞。
62.根据权利要求56所述的方法，其中所述内源基因包括RAG2、IL2rg、C-KIT和/或ETV2，所述人类器官或组织包括年轻血液。
63.根据权利要求56所述的方法，其中所述内源基因包括RUNX1、C-KIT和/或FLK1，所述人类器官或组织包括造血细胞。
64.根据权利要求56所述的方法，其中所述内源基因包括ETV2，所述人类器官或组织包括人血管细胞。
65.根据权利要求56所述的方法，其中所述内源基因包括MYF5、MYOD、MRF4和/或PAX3，所述人类器官或组织包括骨骼肌细胞。
66.根据权利要求56所述的方法，其中所述内源基因包括NKX2-5、HANDII和/或TBX5，所述人类器官或组织包括心肌细胞。
67.根据权利要求56所述的方法，其中所述内源基因包括Pdx和/或ETV2，所述人类器官或组织包括胰腺细胞。
68.根据权利要求56所述的方法，其中所述内源基因包括HHEX和/或Ubc，所述人类器官或组织包括人肝脏细胞。
69.根据权利要求56所述的方法，其中所述内源基因包括Nkx2.1、Sox2、Id2和/或Tbx4，所述人类器官或组织包括肺细胞。
70.根据权利要求56～69中任一项所述的方法，其中所述非人类胚胎是非人类脊椎动物胚胎。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述非人类脊椎动物胚胎是偶蹄目动物胚胎或非人类灵长目动物胚胎。
72.根据权利要求70所述的方法，其中所述非人类脊椎动物胚胎选自由牛、马、猪、绵羊、鸡、鸟、兔、山羊、狗、猫、实验室动物和鱼组成的组。
73.根据权利要求56～72中任一项所述的方法，其中所述至少一种人类细胞是胚胎干细胞、组织特异性干细胞、间充质干细胞、多能干细胞或诱导多能干细胞。
74.根据权利要求56～73中所述的方法，进一步包括从所述嵌合动物收获人类细胞。
75.根据权利要求74所述的方法，进一步包括将所述人类细胞移植到有需要的人类患者中。
76.根据权利要求75所述的方法，其中所述至少一种人类细胞由人类患者提供。
77.根据权利要求56～76中任一项所述的方法，进一步包括引入同源介导修复(HDR)模板，所述同源介导修复(HDR)模板具有与所述内源基因之一同源的模板序列，且所述模板序列替代内源基因序列的至少一部分，以破坏所述内源基因。
78.根据权利要求77所述的方法，进一步包括引入多种同源介导修复(HDR)模板，所述同源介导修复(HDR)模板各自都具有与所述内源基因之一同源的模板序列，且各模板序列替代内源基因序列之一的至少一部分，以破坏所述内源基因。
79.根据权利要求77或78所述的方法，其中所述破坏包括所述内源基因的一个或多个DNA残基的取代。
80.根据权利要求77或78所述的方法，其中所述破坏由所述内源基因的一个或多个DNA残基的取代组成。
81.根据权利要求56～80中任一项所述的方法，其中所述非人类胚胎中负责一种或多种内源器官或组织发育的一个或多个内源基因已经通过转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、成簇的规律性间隔短回文重复序列(CRISPR)、CRISPR相关蛋白9(Cas9)、锌指核酸酶(ZFN)、分子编码位点特异性内切酶、人工合成染色体、RecA-gal4融合、RNAi、CRISPRi或它们的组合被破坏。
82.根据权利要求81所述的方法，其中所述非人类胚胎中负责一种或多种内源器官或组织发育的一个或多个内源基因已经通过Cas9被破坏。
83.一种采用根据权利要求56～82中任一项所述的方法创建的嵌合动物。
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