CN108601772A - 用于治疗tdp-43蛋白质病的他克莫司 - Google Patents

Abstract

本发明提供了他克莫司在治疗人类受试者的TDP‑43蛋白质病，比如肌萎缩侧索硬化(ALS)和额颞叶痴呆(FTDs)中的用途，其中所述他克莫司是以不造成所述受试者免疫抑制的治疗有效剂量施用。

Description

用于治疗TDP-43蛋白质病的他克莫司

技术领域

本发明涉及以低剂量他克莫司治疗与中枢神经系统中形成TDP-43聚集体相关的神经疾病和病症的用途。

背景技术

肌萎缩侧索硬化(ALS)，有时称为葛雷克氏症疾病，是进展快速、总是致命的神经疾病，其攻击负责控制自主肌肉(比如臂、腿以及面部中的那些)中的神经元。该疾病属于一组称为运动神经元疾病的病症，其特征在于运动神经元的逐渐退化和死亡。

来自脑中运动神经元(称为上运动神经元)的信号传递至脊髓中的运动神经元(称为下运动神经元)，然后从其前进至特定肌肉。在ALS中，上运动神经元和下运动神经元都退化或死亡，导致丧失刺激肌肉的能力。不能活动，肌肉逐渐变弱、日益衰弱(萎缩)并且具有非常微小的抽搐(称为自发性收缩)。最终，大脑开始和控制自主运动的能力丧失。

ALS造成衰弱以及大范围的无力。最终，自主控制下的所有肌肉都受到影响，并且个体丧失了移动他们的臂、腿以及身体的力气和能力。当隔膜和胸壁中的肌肉衰退时，在没有通气支持的情况下，人们丧失了呼吸的能力。大部分ALS患者死于呼吸衰竭，通常在出现症状后的3至5年内。但是，约10％的ALS患者存活10年或更久。

ALS是世界上最常见的神经肌肉病变之一，并且影响所有种族和民族背景的人。ALS的平均全球发病率为每100,000人中2至7例，而英国和美国比许多其它国家更高(估计英国约有5,000名ALS患者，这意味着发病率超过每100,000中8例)。除了ALS对受影响个体和其家庭的明确有害影响外，ALS也具有经济影响。这些成本可分成三部分：直接成本、间接成本以及无形成本。2010年，Lewin小组使用中等发病率模型估计了ALS对美国的经济影响为每年$10.3亿。估计每年每名患者的成本为$63,848并且生命末期护理成本约$200,000。

所有ALS病例的90至95％的中，疾病明显是随机出现，而没有明确的相关风险因素。患有该偶发性疾病的个体并没有ALS的家族史，并且他们的家族成员并不被视为具有增加的患病风险。

相反，所有ALS病例中的约5至10％是遗传性的。该家族性的ALS通常源自仅需要一位父母携带造成该疾病的基因的遗传模式。已经发现了十多个基因的突变造成家族ALS。

尽管该疾病的病因不同，97％的ALS患者在疾病影响的组织中表现出常见表型，即TAR-DNA结合蛋白质(TDP)-43的沉积。TDP-43的沉积也是某些额颞叶痴呆(FTD)、相关的额颞叶退化(FTLD)的主要特征，其显示出与ALS的临床重叠。

Scotter等人，2015，《神经病疗法(Neurotherapeutics)》12(2):352–363详细讨论了TDP-43在ALS中的作用(其内容通过引用并入本文)。

TDP-43的表达和功能

TARDBP编码的TDP-43是泛表达的DNA-/RNA-结合蛋白质。TDP-43包含两个RNA识别基序、细胞核定位序列(NLS)、细胞核输出信号以及介导蛋白质-蛋白质相互作用的富含甘氨酸的C末端。TDP-43主要位于细胞核中，但是能够进行核质穿梭。在细胞核中，TDP-43在调节RNA剪接，以及调节微RNA生物发生中起到关键作用。TDP-43可调节其自身mRNA的稳定性、提供用于自身调节TDP-43蛋白质水平的机制。除了TDP-43RNA，TDP-43调节许多其它转录体的剪接和稳定性，并且因此影响多种细胞过程。

尽管大部分是细胞核，仍有高达～30％的TDP-43蛋白质可在细胞质中形成，核流出通过活性和应激调节。TDP-43是神经元中树突和体细胞树突RNA转运颗粒的关键组分，并且通过调节树突中局部蛋白质合成而在神经元可塑性中起着重要的作用。TDP-43也涉及细胞质应激颗粒应答-为了生存而形成隔绝冗余mRNA的蛋白质复合物-意思是TDP-43功能在细胞应激的条件下尤其重要。

TDP-43蛋白质病

TDP-43蛋白质被鉴定为泛素化的神经元细胞质内含物的主要组分，沉积在FTD的皮质神经元中和ALS的脊髓运动神经元中。随后显示，TDP-43阳性内含物在97％的ALS病例中是常见的，无论是偶发性的或家族性的。主要例外是由于SOD1或FUS中的突变造成的。与TDP-43的沉积相关联的神经退行性病被称为“TDP-43蛋白质病”并且“TDP-43蛋白质病”也描述了在疾病中出现的TDP-43的特征性组织病理学转化。该转化由在细胞质中沉积为耐洗涤剂的、泛素化的和过度磷酸化的聚集体的全长和片段化的TDP-43蛋白质所证实，并且伴随TDP-43从细胞核的清除。TDP-43蛋白质病从脊髓和皮质运动神经元以及胶质至其它皮质区域的区域扩散可用于说明ALS进展的阶段，指示转化的TDP-43蛋白质与发病机理相关联的一些或所有特征。

许多研究已经检查了TDP-43在疾病中获得或丧失功能的作用。野生型TDP-43的过表达概括了TDP-43蛋白质病和一系列动物模型中的疾病表型，支持了在疾病中获得毒性功能的作用。初始研究测试了功能丧失假设使用的小鼠敲除TDP-43，其导致胚胎致死率。这表明了TDP-43在早期发展中起到关键作用，而不一定表明功能的丧失在成年期可能是退行性的。但是，条件性和局部敲除模型很快表明TDP-43功能的丧失的确可诱导运动神经元缺陷，人类疾病的进行性运动表型记忆，和甚至典型的TDP-43蛋白质病。而且，胶质或肌肉中TDP-43的选择性过表达或敲低也概括了ALS样表型。因此，TDP-43功能的获得和丧失在疾病中似乎是机械的，并且TDP-43错误折叠可将二者连接。

开发用于ALS的治疗剂的挑战

已经证实，开发用于ALS的治疗有效的疗法对于制药工业是相当大的挑战(参见Perrin，2014，《自然(Nature)》507:423-425，其内容通过引用并入本文)。

在过去十年内，约十几种不同的实验疗法已经进入ALS患者的临床试验。所有均已经显示在建立的动物模型中改善了疾病的症状或标记物。但是，在这些实验疗法中，除一个之外，其它所有的均未显示出对人类的治疗益处，并且在该之一疗法(利鲁唑)中，生存益处是微小的。

利鲁唑(Sanofi)是目前唯一批准用于ALS的疗法；其为阻断中枢神经系统中谷氨酸能神经传递的神经保护药物，从而防止运动神经元的细胞凋亡(程序性细胞死亡)。

因此，需要用于治疗TDP-43蛋白质病，比如ALS的改善疗法。开发有效疗法将不仅仅用于改善患有该疾病的那些人的生活质量和延长其寿命，而且也有助于降低这种疾病的成本负担。

发明内容

本发明的第一方面提供了他克莫司用于治疗人类受试者的TDP-43蛋白质病的用途。有利地，以不造成受试者的免疫抑制的治疗有效剂量施用他克莫司。

他克莫司(也称为藤霉素(fujimycin)或FK506)临床上用作免疫抑制剂，例如，用于进行了器官移植的患者，和用于治疗溃疡性结肠炎或某些皮肤病况。他克莫司的商业上可得的剂型包括含量为0.5mg、1mg、3mg和5mg的胶囊和用于皮肤病况的药膏，其中浓度为0.05％至0.19％。他克莫司最常见地一天施用两次，用于免疫抑制，以防止移植组织的排异。当试图防止排异时，一般调整临床使用剂量，以产生至少4ng/mL的全血谷浓度。这通过采用推荐的初始口服剂量(每12小时，两个分开剂量)实现，其范围为0.075mg/kg/天至0.2mg/kg/天，对于平均体重70kg的患者，需要约2.5mg至14mg的两个每日剂量。

他克莫司可以按商标名比如以及得到。

下面结合本发明的第二方面描述他克莫司的其它合适的配方。

下面式I中显示的他克莫司的化学结构为大环内酯类内酯。其首次于1987年从包含细菌链霉菌属(Streptomyces tsukubaensis)的日本土壤样品的发酵液中发现。

式I

提及“他克莫司”，不仅仅包括上述结构，还包括相关的差向异构体/异构体和保持上述化合物在治疗TDP-43蛋白质病中的治疗效果的其它相近的结构类似物和衍生物。

适当的差向异构体/异构体保持了他克莫司的治疗效果并且可使用常规的技术，例如色谱法或分步结晶分离。各种立体异构体可通过使用常规，例如分步结晶或HPLC技术分离化合物的外消旋或其它混合物而分离。可选地，期望的光学异构体可通过适当的光学活性起始材料在不造成外消旋作用或差向异构化的条件下的反应，或通过用例如纯手性酸衍生化后通过常规方式(例如HPLC、使用二氧化硅的色谱法)分离非对映体酯而制备。所有的立体异构体包括在本发明的范围内。

适当的类似物保持了他克莫司从C₁至C₁₇、C₁₉、C₂₀和C₂₂至C₃₄的结构，但是允许在C₁₈和/或C₂₁处进行修饰。这种修饰包括允许C₁₈或C₂₁任一个上的一个氢原子被C_1-4烷基、C_2-4烯基、羟基或甲氧基取代，并且也包括用氢原子、C_1-6烷基、其它C_2-6烯基、羟基或甲氧基取代C₂₁丙烯基。某些适当的化合物包括其中C₂₁位被修饰，例如C₂₁丙烯基被甲基、乙基或丙基取代的他克莫司的类似物。其它适当的化合物包括其中C₁₈氢原子被羟基取代的类似物。这些化合物中的某些的免疫抑制性比他克莫司弱，例如其中C₂₁丙烯基被甲基取代的类似物或其中C₁₈氢被羟基取代的类似物(例如其中C₂₁丙烯基不变或被甲基、乙基或丙基取代)。美国专利号5,376,663公开了制备他克莫司的类似物的工艺。他克莫司的C₂₁丙烯基也可被氟C_1-6烷基，比如2-氟乙基取代或被不同的丙烯基比如1-甲基乙烯基取代。

因此，在某些实施方式中，活性治疗剂可为子囊霉素(他克莫司的C21-乙基类似物)或二氢他克莫司(他克莫司的C21-丙基类似物)。

他克莫司的适当的衍生物可包括活性代谢分子，比如他克莫司的31-O-去甲基衍生物和13-O-去甲基衍生物(参见Iwasaki，2007，《药物代谢与药物动力学(DrugMetab.Pharmacokinet.)》22(5):328-335和Barbarino等人，2013，《药理遗传学及基因组学(Pharmacogenet.Genomics)》23(10):563-85，以及其中引用的参考文献；其内容通过引用并入本文)。

本领域技术人员将认识到，他克莫司化合物可通过抗衡阴离子来平衡。示例性抗衡阴离子包括但不限于卤化物(例如氟离子、氯离子以及溴离子)、硫酸根离子(例如癸基硫酸根)、硝酸根、高氯酸根、磺酸根(例如甲烷磺酸根)和三氟乙酸根。其它适当的抗衡阴离子是本领域技术人员熟知的。因此，式1的化合物的药学上可接受的衍生物，比如盐和溶剂化物也包括本发明的范围内。可能提到的盐包括：酸加成盐，例如，与无机酸比如盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸，以及羧酸或有机磺酸形成的盐；碱加成盐；与碱形成的金属盐，例如，钠盐和钾盐。适当的溶剂化物包括水合物和醇化物。

本领域技术人员将进一步认识到，他克莫司化合物可展示出互变异构现象。所有的互变异构形式和其混合物都包括在本发明的范围内。

通常，根据期望的施用路径和标准药物实践，选择适当的药学赋形剂稀释剂或载体与他克莫司化合物混合施用(例如，参见《雷明顿:药学技术与实践(Remington：TheScience and Practice of Pharmacy)》，第19版，1995，编辑Alfonso Gennaro，MackPublishing Company，宾夕法尼亚州，美国)。下面讨论适当的施用路径，其包括静脉内、ICV以及肠内(例如口服、胃和直肠)施用。

本发明源于发明人发现非常低剂量的他克莫司能够在TDP-43蛋白质病的新模型中产生治疗益处(参见下面的实施例和Mitchell等人，2015，《神经病理学报(ActaNeuropathol.Comm.)》3:36，其内容通过引用并入本文)。

术语“TDP-43蛋白质病”在本文用于描述与TDP-43的沉积相关联的神经退行性病，包括但不限于肌萎缩侧索硬化(ALS)、额颞叶痴呆(比如FTD-TDP-43和FTD-tau)、其它痴呆(比如阿尔茨海默氏病和路易体痴呆)、帕金森症(包括帕金森氏病、佩里综合症和关岛型ALS帕金森症-痴呆复合征)、多聚谷氨酰胺疾病(比如亨廷顿氏病)以及肌肉病变(比如偶发包涵体肌炎)，其中在每种情况下，至少一小群患者展示出TDP-43病理。TDP-43蛋白质病的进一步细节描述在Gendron等人，2010，《神经病理学与应用神经生物学(Neuropathol.Appl.Neurobiol.)》36:97-112和Lagier-Tourenne等人，2010，《人类分子遗传学(Hum.Mol.Gen.)》19(1):R46-R64中；其内容通过引用并入本文。

因此，在一个实施方式中，TDP-43蛋白质病为肌萎缩侧索硬化(ALS)。本领域技术人员将认识到，待治疗的受试者可具有家族性肌萎缩侧索硬化(fALS)或偶发性肌萎缩侧索硬化(sALS)。

在可选的实施方式中，TDP-43蛋白质病为额颞叶痴呆(比如FTD-TDP-43或其它非tau FTD)。

已知，在一部分患者中，TDP-43蛋白质病比如ALS与TDP-43(TARDBP)基因中的突变相关联。

根据肌萎缩侧索硬化在线基因数据库(ALSoD；http://alsod.iop.kcl.ac.uk；参见Abel等人，2012，《人类突变(Hum.Mutat.)》33:1345-1351)，在ALS患者中，已经鉴定出超过50种不同的TARDBP基因的突变(参见下表1，其中NCBI参考核苷酸序列为NM_007375.3)。

表1

与ALS相关联的TARDBP突变

之前的研究鉴定出TARDBP基因中29种不同的错义突变，除位于由TDP-43的外显子6编码的C末端富含甘氨酸的结构域的一个之外(D169G)，(例如，参见Pesiridis等人，2009，《人类分子遗传学(Hum.Mol.Gen.)》18(综述2期):R156-R162，其内容通过引用并入)。在Pesiridis等人的研究中，在临床上诊断患有运动神经元疾病的患者，包括18名fALS患者(n＝1167，在所有研究中调查的)和30名偶发性ALS患者(n＝2846，在所有研究中调查的)中观察到了所有的错义突变，在对照个体中未观察到(n＝8117，在所有研究中调查的)。所有TARDBP突变展示出遗传的常染色体显性模式并且似乎具有来自野生型(WT)和突变型等位基因的等同基因量。在患有tau阴性额颞叶痴呆的患者中也已经报道了TDP-43(TARDBP)基因中的突变(见Benajiba等人，2009，《神经学年报(Ann.Neurol.)》65:470-473，其内容通过引用并入)。

ALS和FTD患者中TARDBP突变的发现反映了这些疾病在大范围的神经退行性TDP-43蛋白质病中相关联的反复出现的主题。这种突变被认为通过许多不同的机制导致疾病病理，包括：

(a)TDP-43的细胞质错定位；

(b)TDP-43的片段化；

(c)TDP-43的错误折叠、聚集以及不溶性；和/或

(d)TDP-43的磷酸化和泛素化

(参见Scotter等人，2015，《神经治疗学(Neurotherapeutics)》12(2)：352–363，其内容通过引用并入)。

因此，在一个实施方式中，本发明提供了他克莫司用于治疗在TDP-43(TARDBP)基因中具有突变的受试者中的用途。例如，患者可携带选自表1中的那些和/或Pesiridis等人，2009(上文)鉴定的TDP-43(TARDBP)基因中的突变。这种患者包括患有家族性ALS和FTD的那些。

但是，还发现，即使TDP-43没有突变，异常TDP-43表达水平和细胞质积聚也可造成疾病，导致偶发性ALS。研究已经显示(非突变的)TDP-43的水平和定位可以决定性地确定神经毒性(参见Talbot，2014，《解剖学杂志(J Anat.)》224(1):45-51；其内容通过引用并入)。

因此，在可选的实施方式中，本发明提供了他克莫司用于治疗在TDP-43(TARDBP)基因中没有突变但是仍展示中枢神经系统中TDP-43积聚的受试者的用途。例如，治疗可用于患有偶发性ALS的患者。

本领域技术人员将认识到，出现TDP-43蛋白质病，比如ALS症状的患者可被测试，以确定他们在TDP-43(TARDBP)基因中是否具有突变，然后开始使用根据本发明的他克莫司进行治疗。用于进行这种基因分型测试的适当的方法是本领域熟知的，例如使用寡核苷酸探针的体外杂交试验和/或扩增和测序TDP-43(TARDBP)基因的基于PCR的方法。

本发明的方法的关键特征是使用非常低剂量的他克莫司来治疗患有TDP-43蛋白质病的患者。具体而言，以不造成受试者的免疫抑制的治疗有效剂量将他克莫司施用至患者。本领域技术人员将认识到，这种剂量的他克莫司可通过不同的路径施用，包括但不限于口服、外用、眼睛、鼻、肺、含服、肠胃外(静脉内、皮下和肌内)、阴道以及直肠。

不希望被理论限制，据信，他克莫司在本发明中提供疗效的机制与实现免疫抑制的机制不相关(即，不同)。的确，以常规的免疫抑制剂的剂量(即以实现免疫抑制的治疗有效的水平的剂量)治疗患有TDP-43蛋白质病的患者的效果并不佳。已经发现，在本发明中，他克莫司在剂量远低于常规的免疫抑制剂的剂量的情况下具有疗效。

术语“不造成免疫抑制”指示在患者中不出现免疫抑制的主要副作用。该结果源自用于基本上不抑制患者的TNFα水平的他克莫司的剂量。据信，体重70kg的成人中，低于约每天1.3mg他克莫司的剂量(对于其它体重按此比例)可视为不导致免疫抑制。但是，因为个体变化，本领域技术人员将以获得的血液水平为指导(如下所指示)。

在一个实施方式中，以不超过0.020mg/kg，例如不超过0.019mg/kg、0.018mg/kg、0.017mg/kg、0.016mg/kg、0.015mg/kg、0.014mg/kg、0.013mg/kg、0.012mg/kg、0.011mg/kg、0.010mg/kg、0.009mg/kg、0.008mg/kg、0.007mg/kg、0.006mg/kg、0.005mg/kg、0.004mg/kg、0.003mg/kg、0.002mg/kg或0.001mg/kg的每日剂量施用(例如，口服)他克莫司。

在相关的实施方式中，以至少0.0005mg/kg，例如至少0.001mg/kg、0.002mg/kg、0.003mg/kg、0.004mg/kg、0.005mg/kg、0.006mg/kg、0.007mg/kg、0.008mg/kg、0.009mg/kg、0.010mg/kg、0.011mg/kg、0.012mg/kg、0.013mg/kg、0.014mg/kg、0.015mg/kg、0.016mg/kg、0.017mg/kg、0.018mg/kg或0.019mg/kg的每日剂量施用(例如，口服)他克莫司。

本领域技术人员将认识到，他克莫司的剂量必须足够为患者提供治疗益处。尽管患者与患者所需要的处方剂量可能不同，例如由于诸如体重和代谢速度等因素，但是一般认为他克莫司应以足够在受试者中产生至少0.05ng/ml的全血谷含量的他克莫司的剂量来施用。在一个实施方式中，他克莫司可以以足够在受试者中产生至少0.075ng/ml，例如至少0.2ng/ml或至少0.3ng/ml的全血谷含量的他克莫司的剂量来施用。

在相关的实施方式中，他克莫司应以足够在受试者中产生低于1.2ng/ml，例如低于1.1ng/ml或低于1.0ng/ml的全血谷含量的他克莫司的剂量来施用。

有利地，他克莫司被配制用于肠施用，即口服、胃和/或直肠施用。例如，他克莫司可被配制用于口服施用，比如片剂、胶囊或其它分开的单位剂量。

通常，他克莫司用于每日施用，例如一天一次、两次或三次(即每天仅仅一个剂量、每天仅仅两个剂量等)。但是，也可通过以小于每天一次的频率给药来获得治疗有益的结果，例如每2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天或更长时间一次。为了方便患者使用，除了每天，特别合适的间隔可包括隔天、每周一次、每10天一次、每月三次、两周一次或每月一次。

本发明的第二方面提供了包括他克莫司和药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂的单位剂型，其中单位剂型包含0.05mg至1.3mg的他克莫司。

在一个实施方式中，单位剂型包含的他克莫司的量不超过1.2mg，例如不超过0.75mg、0.6mg或0.4mg的他克莫司。

在相关的实施方式中，单位剂型包含的他克莫司的量等于或超过0.06mg，例如等于或超过0.10mg，或0.15mg的他克莫司。

他克莫司可提供为溶剂化物，比如水合物或醇化物。例如，他克莫司可用作水合物，比如一水化物(本文提及的重量不包括溶剂分子的重量)。

如果需要，可购买现有的产品比如并将其内容物分开，以产生需要的剂量，然后置入硬胶囊用于口服施用。

单位剂型可为液体，例如在容器中的溶液或悬液，但是认为优选单位剂量为非液体。适当的固体单位剂型包括片剂和胶囊，其中胶囊更合适。

方便地，单位剂型适于口服施用，例如片剂或胶囊。

在一些情况下，单位剂型可包括适当媒剂中的他克莫司的悬液。用于口服施用的媒剂的的非限制性例子包括磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)、5％的右旋糖水溶液(D5W)以及糖浆剂。单位剂型可配制为在储存和施用期间稳定剂量的一致性。在一些情况下，单位剂型可包含溶于稀释剂，比如水、生理盐水以及任选地包含可接受的增溶剂的缓冲液，中的他克莫司的溶液。在优选形式中，组合物包括固体剂型。在一些情况下，固体剂型包括胶囊、囊片、锭剂、小袋或片剂。在一些情况下，固体剂型是填充液体的剂型。在一些情况下，固体剂型是填充固体的剂型。在一些情况下，固体剂型是填充固体的片剂、胶囊或囊片。在一些情况下，填充固体的剂型是填充粉末的剂型。在一些情况下，固体剂型包括微粒、颗粒或微封装剂形式的化合物。在一些情况下，组合物包括可包含表面活性剂的乳液。在一些情况下，固体剂型包括下述中的一种或多种：乳糖、山梨糖醇、麦芽糖醇、甘露醇、玉蜀黍淀粉、马铃薯淀粉、微晶纤维素、羟丙基纤维素、阿拉伯胶、明胶、胶体二氧化硅、交联羧甲基纤维素钠、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸、药学上可接受的赋形剂、着色剂、稀释剂、缓冲剂、湿润剂、防腐剂、风味剂、载体以及粘合剂。在一些情况下，固体剂型包括利于固体剂型或风味剂的制造、加工或稳定性的一种或多种材料。

适当的他克莫司制剂的例子公开在WO2005/020993、WO2005/020994、WO2008/0145143以及WO2010/005980中，其内容通过引用并入本文。

在一个实施方式中，单位剂型包括分散介质(包括媒剂和稳定化合物(也称为稳定剂))中的他克莫司的固体分散体。

本领域技术人员将认识到，本发明的单位剂型可配制用于不同的施用路径，包括但不限于口服、外用、眼睛、鼻、肺、含服、肠胃外(静脉内、皮下和肌内)、阴道以及直肠。另外，从植入物的施用是可能的。适当的制剂形式包括例如颗粒、粉末、片剂、包衣片剂、(微)胶囊、栓剂、糖浆剂、乳液、微乳液(定义为由水、油以及表面活性剂组成的光学各向同性的热力学稳定体系)、液晶相(定义为特征在于长程有序而短程无序的体系；例子包括薄层状、六边形以及立方相，水或油连续的)，或它们的分散等同体、凝胶、药膏、分散体、悬液、乳剂、气溶胶、液滴或安瓿形式的可注射溶液以及具有缓释活性化合物的制剂，在其制备中，通常使用赋形剂、稀释剂、佐剂或载体。

用于他克莫司的药物递送的制剂策略详见Patel等人，2012，《国际药剂学杂志(Int.J.Pharm.Investig.)》2(4):169-175(其内容通过引用并入本文)。

在一个实施方式中，单位剂型的pH小于7(例如，通过组合物在水中的再分散测量)，例如pH可在3.0至3.6的范围内。pH可通过稳定剂提供和/或通过无机或有机酸或其混合物进行调节。

用于本发明的组合物的适当的稳定化合物和稳定试剂包括但不限于无机酸、无机碱、无机盐、有机酸、有机碱以及其药学上可接受的盐。

有机酸优选为单羧酸、二羧酸、寡羧酸或多元羧酸。有用的有机酸的非限制性例子为乙酸、琥珀酸、柠檬酸、酒石酸、丙烯酸、苯甲酸、苹果酸、马来酸、草酸以及山梨酸；和其混合物。优选的有机酸选自由草酸、酒石酸和柠檬酸组成的组。

有机酸或无机酸的药学上可接受的盐优选地为碱金属盐或碱土金属盐。优选的这种盐的例子为磷酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钾、磷酸二氢钾、磷酸氢钾、磷酸钙、磷酸二钙、硫酸钠、硫酸钾、硫酸钙、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸钙、碳酸镁、乙酸钠、乙酸钾、乙酸钙、琥珀酸钠、琥珀酸钾、琥珀酸钙、柠檬酸钠、柠檬酸钾、柠檬酸钙、酒石酸钠、酒石酸钾、酒石酸钙、葡萄糖酸锌以及硫酸锌。

适当的无机盐包括但不限于氯化钠、氯化钾、氯化钙以及氯化镁。

他克莫司的稳定制剂描述在WO 2011/100975中，其内容通过引用并入本文。

本发明相关的第三方面提供了他克莫司在制备用于治疗人类受试者的TDP-43蛋白质病(比如ALS)的药物中的用途，其中以不造成受试者的免疫抑制的治疗有效剂量施用他克莫司。

本发明相关的第四方面提供了用于治疗人类受试者的TDP-43蛋白质病(比如ALS)的方法，包括以不造成受试者的免疫抑制的治疗有效剂量施用他克莫司。

“治疗TDP-43蛋白质病”包括整体或部分缓解TDP-43蛋白质病的症状。例如，在ALS的情况下，治疗可使得患者运动功能的下降缓解或终止。相应地解释了术语“治疗有效的”。

本发明的第三方面和第四方面的优选实施方式如上面结合本发明的第一方面和第二方面所描述。

对于本发明的给定方面、特征或参数的优选和选择，除非上下文另外指出，否则应视为已经结合用于本发明的所有其它方面、特征以及参数的任何和所有优选和选择而被公开。

本说明书中之前公开的文档的列表或讨论不一定被视为承认该文档是现有技术的一部分或是公知常识。

附图说明

优选的，现将参考下图描述使本发明的某些方面具体化的非限制性例子：

图1(A)显示了身体壁肌肉中表达GFP或GFP-TDP-43(CTF)的秀丽隐杆线虫品种的生存。相对于对照品种，人TDP-43的C末端片段的表达造成寿命显著下降(p<0.005)。(n＝258GFP，n＝241GFP-TDP-43(CTF))

图1(B)显示了在存在或不存在他克莫司的情况下，对照和表达TDP-43的秀丽隐杆线虫品种的生存。相对于每个品种的媒剂处理的对照，NGM琼脂中浓度为10μg/ml的他克莫司使得对照(表达GFP的)蠕虫和表达TDP-43C末端片段的蠕虫的寿命显著延长。(p<0.005，GFP-TDP-43(CTF)DMSO对他克莫司，p<0.01，GFP DMSO对他克莫司)(n＝258GFP DMSO，n＝253GFP他克莫司，n＝241GFP-TDP-43(CTF)DMSO，n＝227GFP-TDP-43(CTF)他克莫司)。

图2显示了在60周内(从3周龄开始)，与非转基因对照小鼠(NTg)相比的，TDP-43(Q331K)小鼠(用水处理的阴性对照组)的转棒时间(rotarod latency)。整个研究过程期间，只有表达突变型(Q331K)人TDP-43的小鼠在转棒时间出现中等但是进行性下降。相反，非转基因对照小鼠的转棒表现保持稳定。(n＝15，TDP-43(Q331K)水处理的对照(“水”)，达周49(此后由于交错饲养轮，数量下降)，n＝16，非转基因对照(“非Tg”)达周60)。

图3显示了相对于媒剂处理的对照组，以0.25mg/kg每天(口服)、1.25mg/kg每天(口服)或2.5mg/kg每天(口服)他克莫司处理60周(从3周龄开始)的TDP-43(Q331K)小鼠的转棒时间。在所有三个测试的剂量下，他克莫司治疗延迟了转棒表现下降的进展。在两个较高剂量下效果更好。期中统计分析(通过双因素方差分析，时间和疗效作为变量)指示该作用是显著的。(n＝21，媒剂，n＝27，0.25mg/kg他克莫司，n＝27，1.25mg/kg他克莫司，n＝19，2.5mg/kg他克莫司，均达60周)

图4显示了相对于仅仅用水处理的对照组的，用10mg/kg利鲁唑(每天口服)处理达60周的TDP-43(Q331K)小鼠的转棒时间。用10mg/kg利鲁唑处理延迟了转棒表现下降的进展。期中统计分析(通过双因素方差分析，时间和疗效作为变量)指示利鲁唑的作用是显著的。(n＝30，10mg/kg利鲁唑，达49周，n＝15，水处理的对照，达49周(其后由于交错饲养轮，数量下降))

具体实施方式

实施例

实施例1–他克莫司在表达TDP-43C末端片段的秀丽隐杆线虫中的作用

材料和方法

秀丽隐杆线虫品种

TDP-43的C末端片段与ALS和FTD患者的病理学相关。具体而言，已经报道了在Arg208处的蛋白水解切割产生了病原性C末端片段(参见，Wang等人，2013，《生物化学杂志(J.Biol.Chme.)》288(13):9049-57和lgaz等人，2009，《生物化学杂志(J.Biol.Chem.》284(13):8516-24；其内容通过引用并入本文)。所以，在体臂肌肉中表达人TDP-43的C末端片段(CTF)(aa 208-414)的转基因秀丽隐杆线虫品种，经短的连接区域与C末端GFP标签融合。表达在myo-3启动子的控制下。

在相同背景下产生对照秀丽隐杆线虫品种，其中GFP报告子仅在myo-3启动子的控制下表达。

这些品种与在bus-5基因中携带突变的蠕虫杂交，其赋予药物敏感性，以产生仅表达GFP(“GFP”)或表达GFP-TDP-43CTF融合蛋白质(“GFP-TDP-43(CTF)”)的药物敏感品种。

秀丽隐杆线虫寿命试验

通过在碱性次氯酸钠溶液中温育不同步的培养物，将秀丽隐杆线虫培养物进行同步，以杀死抗漂白剂的成熟卵之外的所有物质。将约300个卵添加在琼脂平板上，然后在测试化合物(或媒剂)和细菌食品源存在情况下，孵化和发育(以产生约200个蠕虫)。当蠕虫达到倒数第二幼体阶段(L4；就在出现下一代成熟的卵之前)，将约150个蠕虫转移至包含5-氟-2'-脱氧尿苷(FUDR)和测试化合物(或媒剂)以及细菌食品源的新鲜生长板上。添加FUDR，以防止进一步卵成熟和孵化，从而避免出现下一代蠕虫的干扰。其后，在存在测试化合物/媒剂和FUDR的情况下，使蠕虫成熟。从此开始，每天研究每个老化群体并且通过计数死亡蠕虫来评估活力。

将每个群体的累积的死亡蠕虫的数量用于生成生存/活力图，以确定时序寿命(CLS)。使用卡普兰-梅尔分析时序检验(Kaplan-Meierlog-rank)生存分析方法分析生存，使用生存的在线应用(OASIS；http://sbi.postech.ac.kr/oasis)。分析方法的原理是每天死蠕虫的比例与‘处在风险中’的群体范围(即剩余的存活蠕虫的数量)相关，其随着研究中存在蠕虫的数量而下降。通过比较治疗组中‘观察到的’死蠕虫的数量与‘处在风险中’组的‘预期的’死蠕虫的数量(治疗+对照组组合为‘处在风险中’组的最佳评估)，使用卡方(Chi-Squared)检验，可能确定‘观察到的’和‘预期的’死亡数之间任何差别的显著性。在所有研究的天数中，累积卡方概率指示对照组和治疗组之间是否存在显著性差异(卡方p值<0.05是可接受的显著效果)。卡普兰-梅尔分析方法的预测精确度取决于在治疗和对照组中具有至少100个受试者(蠕虫)。约150个蠕虫转移至每个双重酶联板，以确保满足该条件。此外，一旦已经比较了个体酶联板，将来自双重酶联板的数据组合，以提高检验的预测精确度。

结果和结论

TDP-43C末端片段的表达降低了秀丽隐杆线虫的寿命

仅表达GFP(“GFP”)或与人TDP-43的C末端片段的N末端(aa 208-414)融合的GFP(“GFP-TDP-43(CTF)”)的秀丽隐杆线虫品种的生存曲线显示在图1(A)中。相对于单独GFP标签的表达，人TDP-43的C末端片段的表达造成了寿命的显著下降。

TDP-43的C末端片段与ALS和FTD患者的病理学相关。对表达TDP-43的病原性C末端片段的蠕虫的寿命下降的观察与对线虫模型的毒性作用的转化一致，并且提供了用于鉴定和测试可减轻C末端片段的毒性的药物的平台。

他克莫司增加表达TDP-43的秀丽隐杆线虫的寿命

图1(B)显示了对照(表达GFP的)蠕虫和表达TDP-43的C末端片段(GFP-TDP-43(CTF))的蠕虫在存在或不存在10μg/ml他克莫司的情况下的生存曲线。在该浓度下，他克莫司对于两个品种都有显著的作用，增加了对照品种和表达病原性TDP-43片段的品种的寿命。

所以，他克莫司能够减轻TDP-43C末端片段的寿命缩短效应，部分客服了这些蠕虫的寿命缺陷。

实施例2–他克莫司在表达WT和/或Q331K TDP-43的小鼠中的效果

材料和方法

小鼠

已经开发了表达野生型人TDP-43或携带点突变(Q331K)的人TDP-43的转基因小鼠并且由Shaw实验室(参见Arnold等人，2013，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)》110(8):E736-45和Mitchell等人，2015，《神经病理学报(Acta.Neuropathol.Commun.)》3(1):36；其内容通过引用并入本文)进行描述。在小鼠朊病毒启动子的控制下，插入的构建体放置用于N末端myc标记的野生型或突变型TDP-43的cDNA，使得在CNS中表达。因为构建体不包含人TDP-43基因的3'UTR，TDP-43mRNA水平不是自体调节，所以转基因品种中的TDP-43水平比内源水平高2至3倍。

建立了每个构建体的半合子系的(分别为TDP-43(WT)和TDP-43(Q331K))，并且将这些系杂交产生了化合物半合子动物(TDP-43(WTxQ331K))。

为了该研究，从现有小鼠系产生单个转基因小鼠并且在达到3周龄之前，进行基因分型(通过对从尾端样品提取的DNA的PCR)。建立年幼饲养对(约6置8周龄)TDP-43(WT)和TDP-43(Q331K)，以产生共表达转基因(TDP-43(WTxQ331K)以及单个WT、Q331K和非转基因(NTg)同窝仔畜的小鼠。为了该研究，仅需要单个TDP-43(Q331K)和双(TDP-43(WTxQ331K))转基因动物。但是，双(TDP-43(WTxQ331K))转基因动物快速出现了疾病表型(如先前描述：见Mitchell等人，2015，《神经病理学报(Acta.Neuropatholl.Commun.)》3(1):36)并且未存活足够长的时间用于开始给药。所以，仅使用单个(TDP-43(Q331K))转基因动物检测他克莫司或利鲁唑的效力。

需要进行多轮饲养，以实现每个治疗组足够数量的动物并且相应地错开给药/测试。所有动物进行尾端基因分型并且进行耳朵标记，用于在2周龄鉴定。在可能的情况下(见下文)，将同窝仔畜随机分到每个治疗组，目的是在各治疗组中实现相同数量的雄性和雌性。

因为需要错开给药/测试和研究的长度，注意到当前数据组包含所有动物的数据仅达49周。从第50周开始，一些组中的n数值下降，因为来自稍后饲养轮中的动物通过研究继续进行。

药物治疗

尾部2天恢复期之后，每天早上采用聚丙烯口服强饲法(仅递送水)，持续5天，使小鼠适应。从3周龄(5天适应期之后)开始给药。通过下述治疗组的口服强饲法，每周6天进行给药：

●水，阴性对照

●媒剂(20％氢化蓖麻油RH40；80％脱水乙醇(w/v))，阴性对照

●他克莫司(2.5mg/kg)

●他克莫司(1.25mg/kg)

●他克莫司(0.25mg/kg)

●利鲁唑(水中10mg/kg)，阳性对照

给药至少60周。

基于药物代谢动力学分析，认为小鼠中2mg/kg/天的他克莫司剂量相当于体重70kg人，口服约0.33至0.44mg/天的人口服剂量。

利鲁唑是目前唯一FDA批准的用于治疗ALS的药物，所以用作阳性对照，以确认模型的有效性。

行为和表型试验

3天口服强饲法适应之后(开始给药之前2天)称重小鼠，并且其后，从第0天开始(开始给药之前的一天)，按周给药。

按周计，通过转棒测试评估小鼠。使每个动物适应并且在开始给药之前2天在转棒上训练，首先以5rpm进行基本的2分钟适应，然后使用2至20rpm加速方案，进行2×5分钟的训练。在第二天中(在开始给药前一天，第0天)，使用5分钟2至30rpm方案测试每个动物，以给出基线读数。其后，使用单个5分钟2至30rpm方案，按周进行测试(在第7天、14天等)。每天下午，在相同时间进行测试。

在整个给药期间监测一般的动物健康状况和福利，并且记录任何异常表型或行为。

结果和结论

他克莫司延迟了TDP-43(Q331K)小鼠运动功能的下降

仅表达TDP-43(Q331K)的小鼠出现了运动功能的中等但是进行性下降，以及异常的后肢展开和震颤。但是，相对于非转基因或TDP-43(WT)动物，该突变似乎不会造成过早死亡(参见，Mitchell等人上文)。在该研究中，该表型表现为转棒时间的进行性下降(图2)。与非转基因对照的保持稳定达至少一年的转棒表现相比，该下降从研究开始时就持续出现(图2)。

用0.25mg/kg、1.25mg/kg以及2.5mg/kg的他克莫司的治疗延迟了运动下降的进展(图3)。1.25mg/kg和2.5mg/kg的效果比0.25mg/kg更显著。期中统计分析(通过双因素方差分析，时间和疗效作为变量)指示该效果是显著的。

用10mg/kg利鲁唑治疗产生了运动功能丧失的类似的延迟(图4)。(注意，利鲁唑在水中而不是在用于他克莫司的氢化蓖麻油/乙醇媒剂中施用，所以适当的对照是仅用水处理的组。)所以目前唯一FDA批准的用于ALS的疗法在该模型中也有效。

之前的表达突变型TDP-43的小鼠模型的在表型的要素与人疾病病理学上有很大不同(参见Perrin，2014，《自然(Nature)》507(7493):423-5和Scotter等人，2015，《神经治疗学Neurotherapeutics)》12(2):352–63；其内容通过引用并入)。但是在当前研究中使用的模型，更真实重现了人类疾病的关键方面，包括：晚发型、年龄相关的运动功能的进行性下降；不溶解的TDP-43内含物的细胞质积聚；运动神经元和皮质神经元丧失，伴随着微星形神经胶质瘤和星形神经胶质瘤；肌肉纤维的混乱和神经肌肉关节的退化(参见，Mitchell等人，上文)。据我们了解，这是唯一批准用于ALS治疗的利鲁唑在TDP-43小鼠模型中显示显著效果的首次研究。这进一步支持了该模型的有效性，并且指示了观察到的他克莫司的积极效果可外推至人类疾病病况。

实施例3–本发明的示例性单位剂型

硬质明胶胶囊填充下述组合物：

每天将上述一个包含0.3mg他克莫司的胶囊施用至健康的人类志愿者，持续三天。血液TNF-α水平并未因该施用而出现显著改变。类似地，TNF-α水平并未因每天施用0.6mg他克莫司至健康的志愿者而出现改变。观察到的他克莫司的平均谷含量(施用每个剂量24小时之后的水平)为约220pg/mL。观察到的他克莫司的平均峰水平为约3700pg/mL并且曲线下的平均面积为约AUC O_t＝23500(h*pg/mL)。

上述胶囊可用于提供本文前面所述的治疗。

同时使用两个这种胶囊提供0.6mg的单个剂量预期产生约440pg/mL的谷含量。

Claims (21)

1.他克莫司在治疗人类受试者的TDP-43蛋白质病中的用途，其中所述他克莫司是以不造成所述受试者免疫抑制的治疗有效剂量施用。

2.根据权利要求1所述的他克莫司的治疗用途，其中所述TDP-43蛋白质病选自由以下组成的组：肌萎缩侧索硬化(ALS)、额颞叶痴呆(比如FTD-TDP-43和FTD-tau)、其它痴呆(比如阿尔茨海默氏病和路易体痴呆)、帕金森症(包括帕金森氏病、佩里综合症和关岛型ALS帕金森症-痴呆复合征)、多聚谷氨酰胺疾病(比如亨廷顿氏病)和肌肉病变(比如偶发包涵体肌炎)。

3.根据权利要求2所述的他克莫司的治疗用途，其中所述TDP-43蛋白质病是肌萎缩侧索硬化(ALS)。

4.根据前述权利要求中任一项所述的他克莫司的治疗用途，其中所述受试者在TDP-43(TARDBP)基因中具有突变。

5.根据权利要求1至3中任一项所述的他克莫司的治疗用途，其中所述受试者在TDP-43(TARDBP)基因中没有突变。

6.根据前述权利要求中任一项所述的他克莫司的治疗用途，其中所述他克莫司是以不超过0.020mg/kg，例如不超过0.019mg/kg、0.018mg/kg、0.017mg/kg、0.016mg/kg、0.015mg/kg、0.014mg/kg、0.013mg/kg、0.012mg/kg、0.011mg/kg、0.010mg/kg、0.009mg/kg、0.008mg/kg、0.007mg/kg、0.006mg/kg、0.005mg/kg、0.004mg/kg、0.003mg/kg、0.002mg/kg或0.001mg/kg的每日剂量施用。

7.根据权利要求6所述的他克莫司的治疗用途，其中所述他克莫司是以至少0.0005mg/kg，例如至少0.001mg/kg、0.002mg/kg、0.003mg/kg、0.004mg/kg、0.005mg/kg、0.006mg/kg、0.007mg/kg、0.008mg/kg、0.009mg/kg、0.010mg/kg、0.011mg/kg、0.012mg/kg、0.013mg/kg、0.014mg/kg、0.015mg/kg、0.016mg/kg、0.017mg/kg、0.018mg/kg或0.019mg/kg的每日剂量施用。

8.根据前述权利要求中任一项所述的他克莫司的治疗用途，其中所述他克莫司是以足以在所述受试者体内产生至少0.05ng/ml的他克莫司全血谷含量的剂量施用。

9.根据权利要求8所述的他克莫司的治疗用途，其中所述全血谷含量是至少0.075ng/ml，例如至少0.2ng/ml或至少0.3ng/ml。

10.根据权利要求8或9所述的他克莫司的治疗用途，其中所述全血谷含量低于1.2ng/ml，例如低于1.1ng/ml或低于1.0ng/ml。

11.根据前述权利要求中任一项所述的他克莫司的治疗用途，其中所述他克莫司是用于肠施用，例如用于口服、胃或直肠施用。

12.根据权利要求11所述的他克莫司的治疗用途，其中所述他克莫司是用于口服施用，例如呈片剂或胶囊的形式。

13.根据前述权利要求中任一项所述的他克莫司的治疗用途，其中所述他克莫司是用于每日施用。

14.一种单位剂型，包括他克莫司和药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂，其中所述单位剂型包含0.05mg至1.3mg的他克莫司。

15.根据权利要求14所述的单位剂型，其中所述单位剂型包含的他克莫司量不超过1.2mg，例如不超过0.75mg、0.6mg或0.4mg的他克莫司。

16.根据权利要求14或15所述的单位剂型，其中所述单位剂型包含的他克莫司量等于或超过0.06mg，例如等于或超过0.10mg，或0.15mg的他克莫司。

17.根据权利要求14至16中任一项所述的单位剂型，所述单位剂型适于口服施用，例如片剂或胶囊。

18.他克莫司在制备用于治疗人类受试者的TDP-43蛋白质病的药物中的用途，其中所述他克莫司是以不造成所述受试者免疫抑制的治疗有效剂量施用。

19.根据权利要求18所述的他克莫司在制备药物中的用途，其中所述TDP-43蛋白质病是肌萎缩侧索硬化(ALS)。

20.一种用于治疗人类受试者的TDP-43蛋白质病的方法，包括施用不造成所述受试者免疫抑制的治疗有效剂量的他克莫司。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述TDP-43蛋白质病是肌萎缩侧索硬化(ALS)。