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CN108291226B - 用于诱导父本ube3a表达的寡核苷酸 - Google Patents

用于诱导父本ube3a表达的寡核苷酸 Download PDF

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CN108291226B
CN108291226B CN201680066253.6A CN201680066253A CN108291226B CN 108291226 B CN108291226 B CN 108291226B CN 201680066253 A CN201680066253 A CN 201680066253A CN 108291226 B CN108291226 B CN 108291226B
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马伊·黑特耶恩
马里乌斯·赫纳
拉维·姚高希亚
马斯·奥波尔·詹森
克里斯托弗·帕奇
吕克·彼泽森
索伦·韦斯特高·拉斯穆森
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F Hoffmann La Roche AG
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F Hoffmann La Roche AG
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Abstract

本发明涉及能够在动物或人神经元中诱导由父本等位基因表达泛素‑蛋白连接酶E3A(UBE3A)的寡核苷酸。寡核苷酸通过与SNORD109B下游的SNHG14长非编码RNA杂交来靶向UBE3A父本等位基因的抑制物。本发明还涉及用于治疗安吉尔曼综合征(Angelman syndrome)的药物组合物和方法。

Description

用于诱导父本UBE3A表达的寡核苷酸
发明领域
本发明涉及与SNORD109B下游的SNHG14互补并杂交的寡核苷酸(寡聚物)，其导致诱导动物或人中泛素-蛋白连接酶E3A(UBE3A)的父本表达。本发明还涉及用于治疗安吉尔曼综合征(Angelman syndrome)的药物组合物和方法。
背景技术
安吉尔曼综合征是由母本遗传染色体15q11.2上的UBE3A基因的缺失或失活引起的神经遗传病。UBE3A基因的父本拷贝通过称为SNHG14(也称为UBE3A-ATS)的UBE3A内源性反义转录物在神经元中经受基因组印记和沉默(Meng等人2012Hum MolGenet.Vol.21pp.3001-12)。除神经元之外的其它细胞类型似乎表达来自母本和父本等位基因的UBE3A基因。
安吉尔曼综合征的特征在于严重的智力和发育障碍、睡眠障碍、发作(seizures)、急动性运动、脑电图(EEG)异常、频繁的笑声或微笑、以及深度的语言障碍。
WO 2012/064806公开了通过使用拓扑异构酶抑制剂在细胞中诱导UBE3A表达的方法。该方法可以用于治疗安吉尔曼综合征。其并未公开反义寡核苷酸。
WO 2014/004572公开了具有靶向小鼠UBE3A-ATS的2’-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)修饰的寡核苷酸。所述寡核苷酸仅在小鼠相关测定中进行测试。在MBII-52snoRNA(也称为SNORD115)下游和UBE3A前-mRNA上游的区域，小鼠和人之间不存在保守性。因此，靶向小鼠UBE3A-ATS的寡核苷酸不能转换成将在人中起作用的寡核苷酸。其并未公开靶向人UBE3A-ATS的寡核苷酸。
发明目的
本发明鉴定了新型寡核苷酸，其在神经元中诱导人类父本UBE3A表达而不显著影响父本SNORD115、SNORD116和SNRPN转录物的表达。
发明内容
本发明涉及寡核苷酸，其靶向能够抑制UBE3A表达的核酸并且治疗或预防与UBE3A活性降低有关的疾病(特别是在神经元细胞中)。
因此，在本发明的第一个方面提供了这样的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，其与人15号染色体版本GRCh38.p2上对应于位置25278410至25419462的人SNHG14长非编码RNA部分具有至少98％互补性。该区域也类似于SEQ ID NO:1。寡核苷酸可以是反义寡核苷酸，优选具有间隔聚体(gapmer)设计。优选地，寡核苷酸能够通过降解、减少或除去UBE3A抑制物(suppressor)(特别是通过减少SNORD109B下游的SNHG14长非编码RNA转录物)来诱导UBE3A的表达(特别是神经元中的父本UBE3A表达)。UBE3A再表达是在不显著影响SNORD115表达的情况下实现的。靶核酸的降解优选通过核酸酶募集实现。
在另外的方面，本发明提供了包含本发明的寡核苷酸和药用稀释剂、载体、盐和/或辅剂的药物组合物。
在另外的方面，本发明提供了通过将本发明的寡核苷酸或组合物以有效量施用至所述细胞以在体内或体外诱导其中父本UBE3A的表达被抑制的靶细胞中的UBE3A表达的方法。
在另外的方面，本发明提供了用于治疗或预防与UBE3A的体内活性相关的疾病、病症或功能障碍的方法，所述方法包括将治疗或预防有效量的本发明的寡核苷酸施用至患有或易感于所述疾病、病症或功能障碍的受试者。
在另外的方面，本发明的寡核苷酸或组合物用于治疗或预防安吉尔曼综合征。
附图简述
图1：上面的链举例说明了SNORD109B下游的SNHG14转录物(UBE3A-ATS)的区域，其中黑框表示测试的小鼠寡核苷酸的位置。下面的链举例说明了UBE3A编码区，其中黑框表示外显子。外显子1位于160kb左右。将寡核苷酸置于外显子9(位于～97kb)、外显子10(位于～92kb)、外显子13(位于～77kb)和外显子16的5’末端(位于～60kb)的反义区中。
图2：其显示实施例2中测试的寡核苷酸在人神经元细胞培养物中诱导UBE3A再表达的能力。与SNORT109B和UBE3A编码区上游的区域之间的人SNHG14长非编码RNA区域(SEQID NO:1的位置1至55318)互补的寡核苷酸用●非重叠表示。与反义于UBE3A前-mRNA的人SNHG14长非编码RNA区域(SEQ ID NO:1的位置55319至141053)互补的寡核苷酸用
Figure BDA0001658050150000033
重叠表示。对人和猕猴(rhesus monkey)保守的来自表3的寡核苷酸在各图的底部显示为
Figure BDA0001658050150000031
人:猕猴:小鼠之间的保守性用
Figure BDA0001658050150000032
表示。寡核苷酸浓度分别为0.2、1和5μM，如右手侧各图所示。
定义
寡核苷酸
如技术人员通常理解的，如本文所使用的术语“寡核苷酸”定义为包含两个以上共价连接的核苷的分子。这种共价结合的核苷也可以称为核酸分子或寡聚物。寡核苷酸通常通过固相化学合成、随后进行纯化而在实验室中制备。当提及寡核苷酸的序列时，参考共价连接的核苷酸或核苷的核碱基部分或其修饰的序列或顺序。本发明的寡核苷酸是人造的，并且是化学合成的，并且通常是纯化的或分离的。本发明的寡核苷酸可以包含一个或多个修饰的核苷或核苷酸。
反义寡核苷酸
如本文所使用的术语“反义寡核苷酸”定义为能够通过与靶核酸杂交(特别是与靶核酸上的连续序列杂交)来调节靶基因表达的寡核苷酸。反义寡核苷酸基本上不是双链的，并且因此不是siRNA。优选地，本发明的反义寡核苷酸是单链的。
连续核苷酸序列
术语“连续核苷酸序列”是指与靶核酸互补的寡核苷酸区域。该术语在本文中与术语“连续核碱基序列”和术语“寡核苷酸基序序列”可互换使用。在一些实施方案中，寡核苷酸的所有核苷酸都存在于连续核苷酸序列中。在一些实施方案中，寡核苷酸包含连续核苷酸序列，并且可以任选地包含另外的一个或多个核苷酸，例如可以用于将官能团连接至连续核苷酸序列的核苷酸接头区域。核苷酸接头区域可以与靶核酸互补或可以不与靶核酸互补。
核苷酸
核苷酸是寡核苷酸和多核苷酸的结构单元，并且为了本发明的目的，其包括天然存在的核苷酸和非天然存在的核苷酸两者。在自然界中，核苷酸(诸如DNA和RNA核苷酸)包含核糖部分、核碱基部分和一个或多个磷酸基团(其不存在于核苷中)。核苷和核苷酸也可以互换地称为“单元”或“单体”。
修饰的核苷
如本文所使用的术语“修饰的核苷”或“核苷修饰”是指与相当的DNA或RNA核苷相比，通过引入糖部分或(核)碱基部分的一个或多个修饰而被修饰的核苷。在优选的实施方案中，修饰的核苷包含修饰的糖部分。术语修饰的核苷在本文中也可以与术语“核苷类似物”或修饰的“单元”或修饰的“单体”可互换使用。
修饰的核苷间连接
如技术人员通常理解的，术语“修饰的核苷间连接”定义为本领域技术人员通常理解为除磷酸二酯(PO)连接以外的将两个核苷共价偶联在一起的连接。具有修饰的核苷间连接的核苷酸也称为“修饰的核苷酸”。在一些实施方案中，与磷酸二酯连接相比，修饰的核苷间连接增加了寡核苷酸的核酸酶抗性。对于天然存在的寡核苷酸，核苷间连接包括在相邻核苷之间产生磷酸二酯键的磷酸基团。修饰的核苷间连接对于稳定用于体内使用的寡核苷酸是特别有用的，并且可以用于防止本发明的寡核苷酸中的DNA或RNA核苷的区域处的核酸酶切割，例如在间隔聚体寡核苷酸的间隙区域内以及在修饰的核苷的区域中的核酸酶切割。
在一个实施方案中，寡核苷酸包含从天然磷酸二酯修饰成例如对核酸酶攻击更具抗性的连接的一个或多个核苷间连接。核酸酶抗性可以通过在血清中温育寡核苷酸或通过使用核酸酶抗性测定(例如蛇毒磷酸二酯酶(SVPD))来确定，这两者都是本领域熟知的。能够增强寡核苷酸的核酸酶抗性的核苷间连接被称为核酸酶抗性核苷间连接。在优选的实施方案中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列中至少50％的核苷间连接是被修饰的，寡核苷酸或其连续核苷酸序列中诸如至少60％、诸如至少70％、诸如至少80％或诸如至少90％的核苷间连接是被修饰的。在一些实施方案中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列的所有核苷间连接是修饰的。应当认识到，在一些实施方案中，将本发明的寡核苷酸连接至非核苷酸官能团(诸如缀合物)的核苷可以是磷酸二酯。在一些实施方案中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列的所有核苷间连接是核酸酶抗性核苷间连接。
修饰的核苷间连接可以选自硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯和硼代磷酸酯。在优选的实施方案中，修饰的核苷间连接与本发明的寡核苷酸的RNA酶H募集相容，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或硼代磷酸酯。
在一些实施方案中，核苷间连接包含硫(S)，诸如硫代磷酸酯核苷间连接。
由于核酸酶抗性、药代动力学和易于制备，硫代磷酸酯核苷间连接是特别有用的。在优选的实施方案中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列中至少50％的核苷间连接是硫代磷酸酯，寡核苷酸或其连续核苷酸序列中诸如至少60％、诸如至少70％、诸如至少80％或诸如至少90％的核苷间连接是硫代磷酸酯。在一些实施方案中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列的所有核苷间连接是硫代磷酸酯。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个中性核苷间连接，特别是选自磷酸三酯、甲基膦酸酯、MMI、酰胺-3、甲缩醛或硫代甲缩醛的核苷间连接。
另外的核苷间连接公开于WO2009/124238(通过引用结合于此)中。在一个实施方案中，核苷间连接选自WO2007/031091(通过引用结合于此)中公开的接头。特别地，核苷间连接可以选自-O-P(O)2-O-、-O-P(O,S)-O-、-O-P(S)2-O-、-S-P(O)2-O-、-S-P(O,S)-O-、-S-P(S)2-O-、-O-P(O)2-S-、-O-P(O,S)-S-、-S-P(O)2-S-、-O-PO(RH)-O-、0-PO(OCH3)-0-、-O-PO(NRH)-O-、-O-PO(OCH2CH2S-R)-O-、-O-PO(BH3)-O-、-O-PO(NHRH)-O-、-O-P(O)2-NRH-、-NRH-P(O)2-O-、-NRH-CO-O-、-NRH-CO-NRH-，和/或核苷间接头可以选自由以下组成的组：-O-CO-O-、-O-CO-NRH-、-NRH-CO-CH2-、-O-CH2-CO-NRH-、-O-CH2-CH2-NRH-、-CO-NRH-CH2-、-CH2-NRHCO-、-O-CH2-CH2-S-、-S-CH2-CH2-O-、-S-CH2-CH2-S-、-CH2-SO2-CH2-、-CH2-CO-NRH-、-O-CH2-CH2-NRH-CO-、-CH2-NCH3-O-CH2-，其中RH选自氢和C1-4-烷基。
核酸酶抗性连接，诸如硫代磷酸酯连接，特别可用于与靶核酸形成双链体时能够募集核酸酶的寡核苷酸区域中，诸如间隔聚体的区域G，或者头聚体(headmer)和尾聚体(tailmer)的未修饰的核苷区域。然而，硫代磷酸酯连接也可以用于不募集核酸酶的区域和/或增强亲和力的区域，诸如间隔聚体的区域F和F’，或者头聚体和尾聚体的修饰的核苷区域。
然而，每个设计区域都可以包含除硫代磷酸酯以外的核苷间连接，诸如磷酸二酯连接，特别是在其中修饰的核苷(诸如LNA)保护连接免受核酸酶降解的区域中。包含磷酸二酯连接(诸如一个或两个连接)，特别是在修饰的核苷单元之间或邻近修饰的核苷单元(通常在非核酸酶募区域中)包含磷酸二酯连接，可以修饰寡核苷酸的生物利用度和/或生物分布—参见WO2008/113832(通过引用结合于此)。
在一个实施方案中，寡核苷酸中的所有核苷间连接都是硫代磷酸酯和/或硼代磷酸酯连接。优选地，寡核苷酸中的所有核苷间连接都是硫代磷酸酯连接。
核碱基
术语核碱基包括在核酸杂交中形成氢键的核苷和核苷酸中存在的嘌呤(例如，腺嘌呤和鸟嘌呤)和嘧啶(例如，尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶)部分。在本发明的情形中，术语核碱基还涵盖修饰的核碱基，其可以与天然存在的核碱基不同，但是在核酸杂交期间起作用。在此情形中，“核碱基”是指天然存在的核碱基(诸如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸苷、尿嘧啶黄嘌呤和次黄嘌呤)，以及非天然存在的变体。这种变体例如描述于在Hirao等人(2012)Accounts of Chemical Research卷45第2055页和Bergstrom(2009)Current Protocolsin Nucleic Acid Chemistry Suppl.37 1.4.1中。
在一些实施方案中，核碱基部分通过将嘌呤或嘧啶变为修饰的嘌呤或嘧啶来进行修饰，诸如取代的嘌呤或取代的嘧啶，诸如选自以下的核碱基：异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑并-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-噻唑并-尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、2’硫代-胸腺嘧啶、肌苷、二氨基嘌呤、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤。
核碱基部分可以由每个相应核碱基的字母代码表示，例如A、T、G、C或U，其中每个字母可以任选地包括具有等同功能的修饰的核碱基。例如，在示例性寡核苷酸中，核碱基部分选自A、T、G、C和5-甲基胞嘧啶。任选地，对于LNA间隔聚体，可以使用5-甲基胞嘧啶LNA核苷。
修饰的寡核苷酸
术语修饰的寡核苷酸描述了包含一个或多个糖修饰的核苷和/或修饰的核苷间连接的寡核苷酸。术语“嵌合”寡核苷酸是在文献中用于描述具有修饰的核苷的寡核苷酸的术语。
互补性
术语互补性描述了核苷/核苷酸的沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对的能力。沃森-克里克碱基对是鸟嘌呤(G)-胞嘧啶(C)和腺嘌呤(A)-胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)。应当理解，寡核苷酸可以包含具有修饰的核碱基的核苷，例如经常使用5-甲基胞嘧啶代替胞嘧啶，并且因此术语互补性涵盖了未修饰和修饰的核碱基之间的沃森克里克碱基配对(参见例如Hirao等人(2012)Accounts of Chemical Research vol 45page 2055和Bergstrom(2009)Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl.37 1.4.1)。
如本文所使用的术语“％互补”是指在给定位置处与分离的核酸分子(例如靶核酸)的给定位置处的连续核苷酸序列互补(例如与其形成沃森克里克碱基对)的核酸分子(例如寡核苷酸)中连续核苷酸序列的核苷酸的百分比数。通过以下方式计算百分比：对形成两个序列间配对的比对的碱基的数量进行计数，除以寡核苷酸中核苷酸的总数，并且乘以100。在这种比较中，无法比对(形成碱基对)的碱基/核苷酸被称为错配。
术语“完全互补”是指100％互补性。
杂交
如本文所使用的术语“杂交”应理解为两条核酸链(例如寡核苷酸和靶核酸)在相对链上的碱基对之间形成氢键从而形成双链体。两条核酸链之间结合的亲和力是杂交的强度。其通常以解链温度(Tm)进行描述，所述解链温度定义为寡核苷酸的一半与靶核酸形成双链体时的温度。在生理条件下，Tm并不与亲和力严格地成比例(Mergny和Lacroix,2003,Oligonucleotides 13:515–537)。标准状态吉布斯自由能ΔG°是结合亲和力的更准确的表达，并且与反应的解离常数(Kd)相关，其中ΔG°＝-RTln(Kd)，其中R是气体常数并且T是绝对温度。因此，寡核苷酸与靶核酸之间反应的ΔG°非常低反映了寡核苷酸与靶核酸之间的强杂交。ΔG°是与其中水溶液浓度为1M、pH为7并且温度为37℃的反应相关的能量。寡核苷酸与靶核酸的杂交是自发反应，并且对于自发反应ΔG°小于零。ΔG°可以通过实验测量，例如通过使用如Hansen等人,1965,Chem.Comm.36–38和Holdgate等人,2005,Drug DiscovToday中描述的等温滴定量热法(ITC)。技术人员将知悉商业设备可用于ΔG°测量。ΔG°也可以通过使用如SantaLucia,1998，Proc Natl Acad Sci USA.95:1460–1465中描述的最近邻模式(使用如Sugimoto等人,1995,Biochemistry 34:11211–11216和McTigue等人,2004,Biochemistry 43:5388–5405中描述的适当衍生的热力学参数)进行数值上的估算。为了有可能通过杂交来调节其预期核酸靶标，本发明的寡核苷酸与靶核酸杂交，对于长度为10-30个核苷酸的寡核苷酸，估计的ΔG°值低于-10kcal。在一些实施方案中，杂交的程度或强度通过标准状态吉布斯自由能ΔG°测量。对于长度为8-30个核苷酸的寡核苷酸，寡核苷酸可以以低于-10kcal范围的估计ΔG°值与靶核酸杂交，诸如低于-15kcal、诸如低于-20kcal和诸如低于-25kcal。在一些实施方案中，寡核苷酸与靶核酸杂交，其估计的ΔG°值为-10至-60kcal，诸如-12至-40、诸如-15至-30kcal或-16至-27kcal、诸如-18至-25kcal。
靶标
靶标是指需要调节的蛋白质。
靶核酸
靶核酸是本发明的寡核苷酸与之杂交的预期靶标，并且可以例如是基因、RNA、非编码RNA、长非编码RNA、mRNA和前-mRNA、成熟mRNA或cDNA序列。在一些实施方案中，靶核酸是非编码RNA或长非编码RNA或其子序列。对于体内或体外应用，本发明的寡核苷酸能够降低SNORD109B下游的SNHG14转录物的水平，并且由此减轻预期靶细胞中父本UBE3A转录物的抑制。如跨越寡核苷酸长度所测量的，本发明寡核苷酸的核碱基的连续序列与靶核酸互补，任选地除一个或两个错配以外，并且任选地排除可以将寡核苷酸连接至任选官能团(诸如缀合物)的基于核苷酸的接头区域。
靶序列
寡核苷酸包含与靶核酸分子的子序列互补或杂交的连续核苷酸序列。如本文所使用的术语“靶序列”是指存在于靶核酸中的核苷酸序列，其包含与本发明的寡核苷酸互补的核碱基序列。在一些实施方案中，靶序列由靶核酸上与本发明寡核苷酸的连续核苷酸序列互补的区域组成。在一些实施方案中，靶序列比单个寡核苷酸的互补序列更长，并且可以例如表示可以被本发明的几种寡核苷酸靶向的靶核酸的优选区域。
本发明的寡核苷酸包含与靶核酸(诸如靶序列)互补的连续核苷酸序列。
寡核苷酸包含至少8个核苷酸的连续核苷酸序列，其与靶核酸分子中存在的靶序列互补或杂交。连续核苷酸序列(以及由此的靶序列)包含至少8个连续核苷酸，诸如9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个连续核苷酸，诸如12-25个连续核苷酸，诸如14-18个连续核苷酸。
靶细胞
如本文所使用的术语靶细胞是指表达靶核酸的细胞。在一些实施方案中，靶细胞可以在体内或体外。在一些实施方案中，靶细胞是哺乳动物细胞，诸如啮齿动物细胞，诸如小鼠细胞或大鼠细胞，或灵长类动物细胞(诸如猴细胞或人类细胞)。在优选的实施方案中，靶细胞是神经元细胞。
天然存在的变体
术语“天然存在的变体”是指SNORD109B基因下游的SNHG14转录物的变体或源自与靶核酸相同的遗传基因座的转录物，但是可以例如由于遗传密码的简并性引起长非编码RNA中的密码子的多重性而不同。因此，可以将本发明的寡核苷酸设计为靶向靶核酸及其天然存在的变体。
表达的调节
如本文所使用的术语“表达的调节”应理解为与施用寡核苷酸之前的UBE3A的量相比时寡核苷酸改变UBE3A蛋白的量的能力的总称。备选地，可以通过参照其中未施用本发明的寡核苷酸的对照实验来确定表达的调节。由寡核苷酸实现的调节与其减少、除去、阻止、减轻、降低或终止父本UBE3A转录物抑制的能力有关，例如通过SNORD109B下游的非编码SNHG14转录物的降解或除去，或者通过阻断或阻止与SNORD109B下游的SNHG14转录物相关的聚合酶活性。所述调节还可以视为寡核苷酸恢复、增加或增强父本UBE3A表达的能力，例如通过除去或阻断受SNORD109B下游的非编码SNHG14转录物影响的抑制机制。
高亲和力修饰的核苷
高亲和力修饰的核苷是这样的修饰的核苷酸，当并入寡核苷酸中时，其增强了寡核苷酸对其互补靶标的亲和力，例如通过解链温度(Tm)所测量的。本发明的高亲和力修饰的核苷优选导致解链温度增加+0.5至+12℃/修饰的核苷，更优选+1.5至+10℃/修饰的核苷，并且最优选+3至+8℃/修饰的核苷。许多高亲和力修饰的核苷是本领域已知的，并且包括例如许多2’取代的核苷以及锁核酸(LNA)(参见例如Freier&Altmann；Nucl.Acid Res.,1997,25,4429-4443和Uhlmann；Curr.Opinion in Drug Development,2000,3(2),293-213)。
糖修饰
本发明的寡聚物可以包含具有修饰的糖部分(即，与DNA和RNA中发现的核糖部分相比时的糖部分修饰)的一个或多个核苷。
已经制备了许多具有核糖部分修饰的核苷，主要目的是改善寡核苷酸的某些性质，诸如亲和力和/或核酸酶抗性。
这种修饰包括核糖环结构被修饰的那些修饰，例如，通过替代为己糖环(HNA)、或通常在核糖环上的C2与C4碳之间具有二基团桥的二环(LNA)、或通常在C2与C3碳之间缺少键的未连接的核糖环(例如UNA)。其它糖修饰的核苷包括例如双环己糖核酸(WO2011/017521)或三环核酸(WO2013/154798)。修饰的核苷还包括其中糖部分被非糖部分替代的核苷，例如在肽核酸(PNA)或吗啉代核酸的情况下。
糖修饰还包括通过将核糖环上的取代基变为除氢以外的基团或天然存在于DNA和RNA核苷中的2’-OH基团而进行的修饰。取代基可以例如在2’、3’、4’或5’位置处引入。具有修饰的糖部分的核苷还包括2’修饰的核苷，诸如2’取代的核苷。实际上，已经花费了大量精力来开发2’取代的核苷，并且以及发现许多2’取代的核苷在并入寡核苷酸时具有有益的性质，诸如增强的核苷抗性和增强的亲和力。
2’修饰的核苷
2’糖修饰的核苷是这样的核苷，其在2’位置具有除H或-OH以外的取代基(2’取代的核苷)或包含2’连接的二基团，并且包括2’取代的核苷和LNA(2’–4’二基团桥连的)核苷。例如，2’修饰的糖可以为寡核苷酸提供增强的结合亲和力和/或增加的核酸酶抗性。2’取代的修饰的核苷的实例是2’-O-烷基-RNA、2’-O-甲基-RNA、2’-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)、2’-氨基-DNA、2’-氟-RNA和2’-氟-ANA(F-ANA)。对于另外的实例，请参见例如Freier&Altmann；Nucl.Acid Res,1997,25,4429-4443和Uhlmann；Curr.Opinion in DrugDevelopment,2000,3(2),293-213；以及Deleavey和Damha,Chemistry and Biology 2012,19,937。下面举例说明了一些2’取代的修饰的核苷。
Figure BDA0001658050150000111
锁核酸核苷(LNA)
LNA核苷是修饰的核苷，其包含核苷酸的核糖环的C2’与C4’之间的接头基团(称为二基团(biradicle)或桥)。这些核苷在文献中也称为桥连核酸或双环核酸(BNA)。
在一些实施方案中，本发明的寡聚物的修饰的核苷或LNA核苷具有式I或II的通式结构：
Figure BDA0001658050150000121
其中W选自-O-、-S-、-N(Ra)-、-C(RaRb)-，诸如在一些实施方案中选自–O-；
B表示核碱基或修饰的核碱基部分；
Z表示与相邻核苷的核苷间连接，或5’-末端基团；
Z*表示与相邻核苷的核苷间连接，或3’-末端基团；
X表示选自由以下组成的列表的基团：-C(RaRb)-、-C(Ra)＝C(Rb)-、-C(Ra)＝N-、-O-、-Si(Ra)2-、-S-、-SO2-、-N(Ra)-和>C＝Z。
在一些实施方案中，X选自由以下组成的组：–O-、-S-、NH-、NRaRb、-CH2-、CRaRb、-C(＝CH2)-和-C(＝CRaRb)-。
在一些实施方案中，X是-O-。
Y表示选自由以下组成的组的基团：-C(RaRb)-、-C(Ra)＝C(Rb)-、-C(Ra)＝N-、-O-、-Si(Ra)2-、-S-、-SO2-、-N(Ra)-和>C＝Z。
在一些实施方案中，Y选自由以下组成的组：–CH2-、-C(RaRb)-、–CH2CH2-、-C(RaRb)-C(RaRb)-、–CH2CH2CH2-、-C(RaRb)C(RaRb)C(RaRb)-、-C(Ra)＝C(Rb)-和-C(Ra)＝N-。
在一些实施方案中，Y选自由以下组成的组：-CH2-、-CHRa-、-CHCH3-、CRaRb-。
或者-X-Y-一起表示二价接头基团(也称为基团)，一起表示由选自由以下组成的组的1、2、3或4个基团或原子组成的二价接头基团：-C(RaRb)-、-C(Ra)＝C(Rb)-、-C(Ra)＝N-、-O-、-Si(Ra)2-、-S-、-SO2-、-N(Ra)-和>C＝Z。
在一些实施方案中，-X-Y-表示选自由以下组成的组的二基团：-X-CH2-、-X-CRaRb-、-X-CHRa-、-X-C(HCH3)-、-O-Y-、-O-CH2-、-S-CH2-、-NH-CH2-、-O-CHCH3-、-CH2-O-CH2、-O-CH(CH3CH3)-、-O-CH2-CH2-、OCH2-CH2-CH2-、-O-CH2OCH2-、-O-NCH2-、-C(＝CH2)-CH2-、-NRa-CH2-、N-O-CH2、-S-CRaRb-和-S-CHRa-。
在一些实施方案中，-X-Y-表示–O-CH2-或–O-CH(CH3)-。
其中Z选自-O-、-S-和-N(Ra)-，
并且Ra和Rb(当存在时)各自独立地选自氢、任选取代的C1-6-烷基、任选取代的C2-6-烯基、任选取代的C2-6-炔基、羟基、任选取代的C1-6-烷氧基、C2-6-烷氧基烷基、C2-6-烯氧基、羧基、C1-6-烷氧基羰基、C1-6-烷基羰基、甲酰基、芳基、芳氧基羰基、芳氧基、芳基羰基、杂芳基、杂芳氧基羰基、杂芳氧基、杂芳基羰基、氨基、单和二(C1-6-烷基)氨基、氨甲酰基、单和二(C1-6-烷基)-氨基羰基、氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、单和二(C1-6-烷基)氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、C1-6-烷基-羰基氨基、脲基、C1-6-烷酰氧基、砜基、C1-6-烷基磺酰氧基、硝基、叠氮基、硫烷基、C1-6-烷硫基、卤素，其中芳基和杂芳基可以是任选取代的，并且其中两个成对的取代基Ra和Rb可以一起表示任选取代的亚甲基(＝CH2)，其中对于所有手性中心来说，可以发现非对称基团为R或S取向。
其中R1、R2、R3、R5和R5*独立地选自由以下组成的组：氢、任选取代的C1-6-烷基、任选取代的C2-6-烯基、任选取代的C2-6-炔基、羟基、C1-6-烷氧基、C2-6-烷氧基烷基、C2-6-烯氧基、羧基、C1-6-烷氧基羰基、C1-6-烷基羰基、甲酰基、芳基、芳氧基羰基、芳氧基、芳基羰基、杂芳基、杂芳氧基羰基、杂芳氧基、杂芳基羰基、氨基、单和二(C1-6-烷基)氨基、氨甲酰基、单和二(C1-6-烷基)-氨基羰基、氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、单和二(C1-6-烷基)氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、C1-6-烷基-羰基氨基、脲基、C1-6-烷酰氧基、砜基、C1-6-烷基磺酰氧基、硝基、叠氮基、硫烷基、C1-6-烷硫基、卤素，其中芳基和杂芳基可以是任选取代的，并且其中两个成对的取代基可以一起表示氧代、硫代、亚氨基或任选取代的亚甲基。
在一些实施方案中，R1、R2、R3、R5和R5*独立地选自C1-6烷基(诸如甲基)和氢。
在一些实施方案中，R1、R2、R3、R5和R5*全都是氢。
在一些实施方案中，R1、R2、R3全都是氢，并且R5和R5*中的任一者也是氢而R5和R5*中的另一者不是氢(诸如是C1-6烷基，诸如甲基)。
在一些实施方案中，Ra是氢或甲基。在一些实施方案中，当存在时，Rb是氢或甲基。
在一些实施方案中，Ra和Rb中的一者或两者是氢。
在一些实施方案中，Ra和Rb中的一者是氢，而另一者不是氢。
在一些实施方案中，Ra和Rb中的一者是甲基，而另一者是氢。
在一些实施方案中，Ra和Rb中的两者都是甲基。
在一些实施方案中，二基团–X-Y-是–O-CH2-，W是O，并且R1、R2、R3、R5和R5*全都是氢。这种LNA核苷公开于WO99/014226、WO00/66604、WO98/039352和WO2004/046160(全部通过引用结合于此)，并且包括通常称为β-D-氧基LNA和α-L-氧基LNA核苷的那些。
在一些实施方案中，二基团–X-Y-是–S-CH2-，W是O，并且R1、R2、R3、R5和R5*全都是氢。这种硫代LNA核苷公开于WO99/014226和WO2004/046160(其通过引用结合于此)。
在一些实施方案中，二基团–X-Y-是–NH-CH2-，W是O，并且R1、R2、R3、R5和R5*全都是氢。这种氨基LNA核苷公开于WO99/014226和WO2004/046160(其通过引用结合于此)。
在一些实施方案中，二基团–X-Y-是–O-CH2-CH2-或–O-CH2-CH2-CH2-，W是O，并且R1、R2、R3、R5和R5*全都是氢。这种LNA核苷公开于WO00/047599和Morita等人,Bioorganic&Med.Chem.Lett.12 73-76(其通过引用结合于此)，并且包括通常称为2’-O-4’C-乙烯桥连的核酸(ENA)的那些。
在一些实施方案中，二基团–X-Y-是–O-CH2-，W是O，并且所有R1、R2、R3以及R5和R5*中的一者是氢，而R5和R5*中的另一者不是氢(诸如是C1-6烷基，诸如甲基)。这种5’取代的LNA核苷公开于WO2007/134181(其通过引用结合于此)。
在一些实施方案中，二基团–X-Y-是–O-CRaRb-，其中Ra和Rb中的一者或两者不是氢(诸如是甲基)，W是O，并且所有R1、R2、R3以及R5和R5*中的一者是氢，而R5和R5*中的另一者不是氢(诸如是C1-6烷基，诸如甲基)。这种双修饰的LNA核苷公开于WO2010/077578(其通过引用结合于此)。
在一些实施方案中，二基团–X-Y-表示二价接头基团–O-CH(CH2OCH3)-(2’O-甲氧基乙基双环核酸-Seth等人,2010,J.Org.Chem.Vol 75(5)pp.1569-81)。在一些实施方案中，二基团–X-Y-表示二价接头基团–O-CH(CH2CH3)-(2’O-乙基双环核酸-Seth等人,2010,J.Org.Chem.Vol 75(5)pp.1569-81)。在一些实施方案中，二基团–X-Y-是–O-CHRa-，W是O，并且R1、R2、R3、R5和R5*全都是氢。这种6’取代的LNA核苷公开于WO10036698和WO07090071(这两者都通过引用结合于此)。
在一些实施方案中，二基团–X-Y-是–O-CH(CH2OCH3)-，W是O，并且R1、R2、R3、R5和R5*全都是氢。这种LNA核苷在本领域中也称为环状MOE(cMOE)并且公开于WO07090071。
在一些实施方案中，二基团–X-Y-表示二价接头基团–O-CH(CH3)-，其为R-或S-构型。在一些实施方案中，二基团–X-Y-一起表示二价接头基团–O-CH2-O-CH2-(Seth等人,2010,J.Org.Chem)。在一些实施方案中，二基团–X-Y-是–O-CH(CH3)-，W是O，并且R1、R2、R3、R5和R5*全都是氢。这种6’甲基LNA核苷在本领域中也称为cET核苷，并且可以是(S)cET或(R)cET立体异构体，如WO07090071(β-D)和WO2010/036698(α-L)(这两者都通过引用结合于此)中所公开的。
在一些实施方案中，二基团–X-Y-是–O-CRaRb-，其中Ra或Rb都不是氢，W是O，并且R1、R2、R3、R5和R5*全都是氢。在一些实施方案中，Ra和Rb都是甲基。这种6’二取代的LNA核苷公开于WO 2009006478(其通过引用结合于此)。
在一些实施方案中，二基团–X-Y-是–S-CHRa-，W是O，并且R1、R2、R3、R5和R5*全都是氢。这种6’取代的LNA核苷公开于WO11156202(其通过引用结合于此)。在6’取代的硫代LNA的一些实施方案中，Ra是甲基。
在一些实施方案中，二基团–X-Y-是–C(＝CH2)-C(RaRb)-(诸如–C(＝CH2)-CH2-或–C(＝CH2)-CH(CH3)-)，W是O，并且R1、R2、R3、R5和R5*全都是氢。这种乙烯基碳LNA核苷公开于WO08154401和WO09067647(这两者都通过引用结合于此)。
在一些实施方案中，二基团–X-Y-是–N(-ORa)-，W是O，并且R1、R2、R3、R5和R5*全都是氢。在一些实施方案中，Ra是C1-6烷基，诸如甲基。这种LNA核苷也称为N取代的LNA，并且公开于WO2008/150729(其通过引用结合于此)。在一些实施方案中，二基团–X-Y-一起表示二价接头基团–O-NRa-CH3-(Seth等人,2010,J.Org.Chem)。在一些实施方案中，二基团–X-Y-是–N(Ra)-，W是O，并且R1、R2、R3、R5和R5*全都是氢。在一些实施方案中，Ra是C1-6烷基，诸如甲基。
在一些实施方案中，R5和R5*中的一者或两者是氢，并且当被取代时，R5和R5*中的另一者是C1-6烷基，诸如甲基。在这种实施方案中，R1、R2、R3可以全都是氢，并且二基团–X-Y-可以选自–O-CH2-或–O-C(HCRa)-，诸如–O-C(HCH3)-。
在一些实施方案中，二基团是–CRaRb-O-CRaRb-(诸如CH2-O-CH2-)，W是O，并且R1、R2、R3、R5和R5*全都是氢。在一些实施方案中，Ra是C1-6烷基，诸如甲基。这种LNA核苷也称为构象受限的核苷酸(CRN)，并且公开于WO2013036868(其通过引用结合于此)。
在一些实施方案中，二基团是–O-CRaRb-O-CRaRb-(诸如O-CH2-O-CH2-)，W是O，并且R1、R2、R3、R5和R5*全都是氢。在一些实施方案中，Ra是C1-6烷基，诸如甲基。这种LNA核苷也称为COC核苷酸，并且公开于Mitsuoka等人,Nucleic Acids Research 2009 37(4),1225-1238(其通过引用结合于此)。
应当认识到，除非另有说明，否则LNA核苷可以处于β-D或α-L立体异构形式。
LNA核苷的某些实例显示于方案1中。
方案1
Figure BDA0001658050150000171
如实施例所示，在本发明的优选实施方案中，寡核苷酸中的LNA核苷是β-D-氧基-LNA核苷。
核酸酶介导的降解
核酸酶介导的降解是指当与该序列形成双链体时能够介导互补核苷酸序列降解的寡核苷酸。
在一些实施方案中，寡核苷酸可以通过核酸酶介导的靶核酸降解发挥作用，其中本发明的寡核苷酸能够募集核酸酶，特别是核酸内切酶，优选核糖核酸内切酶(RNA酶)，诸如RNA酶H。经由核酸酶介导的机制进行操作的寡核苷酸设计的实例是这样的寡核苷酸，其通常包含至少5或6个DNA核苷的区域，并且在一侧或两侧侧翼有增强亲和力的核苷，例如间隔聚体、头聚体或尾聚体。
RNA酶H活性和募集
反义寡核苷酸的RNA酶H活性是指其在与互补RNA分子的双链体中时募集RNA酶H的能力。WO01/23613提供了用于确定RNA酶H活性的体外方法，其可以用于确定募集RNA酶H的能力。通常，如果当与互补的靶核酸序列一起提供时，寡核苷酸具有的初始速率(如以pmol/l/min测量的)是使用具有与待测试的修饰的寡核苷酸具有相同碱基序列但是仅含有DNA单体的寡核苷酸(寡核苷酸中的全部单体之间具有硫代磷酸酯连接)并且使用WO01/23613(通过引用结合于此)实施例91-95所提供的方法论时所确定的初始速率的至少10％或大于20％，则认为该寡核苷酸能够募集RNA酶H。
间隔聚体
如本文所使用的术语间隔聚体是指这样的反义寡核苷酸，其包含募集RNA酶H的寡核苷酸的区域(间隔)，所述区域在5’和3’侧翼有一个或多个增强亲和力的修饰的核苷(侧翼)。本文中描述了各种间隔聚体设计。头聚体和尾聚体是能够募集RNA酶H的寡核苷酸，其中两个侧翼中的一者缺失，即寡核苷酸的仅一个末端包含增强亲和力的修饰的核苷。对于头聚体，缺失3’侧翼(即，5’侧翼包含增强亲和力的修饰的核苷)，并且对于尾聚体，缺失5’侧翼(即，3’侧翼包含增强亲和力的修饰的核苷)。
LNA间隔聚体
术语LNA间隔聚体是其中至少一个增强亲和力的修饰的核苷为LNA核苷的间隔聚体寡核苷酸。
混合侧翼(wing)间隔聚体
术语混合侧翼间隔聚体是指这样的LNA间隔聚体，其中侧翼区域包含至少一个LNA核苷和至少一个非LNA修饰的核苷，诸如至少一个2’取代的修饰的核苷，诸如例如2’-O-烷基-RNA、2’-O-甲基-RNA、2’-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)、2’-氨基-DNA、2’-氟-RNA和2’-F-ANA核苷。在一些实施方案中，混合侧翼间隔聚体具有包含LNA核苷(例如5’或3’)的一侧以及包含2’取代的一个或多个修饰的核苷的另一侧(分别为3’或5’)。
缀合物
如本文所使用的术语缀合物是指共价连接至非核苷酸部分(缀合物部分或区域C或第三区域)的寡核苷酸。
将本发明的寡核苷酸缀合至一个或多个非核苷酸部分可以改善寡核苷酸的药理学，例如通过影响寡核苷酸的活性、细胞分布、细胞摄取或稳定性。在一些实施方案中，缀合物部分通过改善寡核苷酸的细胞分布、生物利用度、代谢、排泄、渗透性和/或细胞摄取来改变或增强寡核苷酸的药代动力学性质。特别地，缀合物可以将寡核苷酸靶向至特定器官、组织或细胞类型，并且由此增强寡核苷酸在该器官、组织或细胞类型中的效力。同时，缀合物可以用于降低非靶标细胞类型、组织或器官中的寡核苷酸的活性，例如，在非靶标细胞类型、组织或器官中的脱靶活性或活性。WO 93/07883和WO 2013/033230提供了合适的缀合物部分，其通过引用结合于此。WO 2012/143379提供了通过缀合至与转铁蛋白受体具有亲和力的抗体片段来递送药物穿过血脑屏障的方法，其通过引用结合于此。
在Manoharan的Antisense Drug Technology,Principles,Strategies,andApplications,S.T.Crooke,ed.,Ch.16,Marcel Dekker,Inc.,2001和Manoharan,Antisense and Nucleic Acid Drug Development,2002,12,103的综合性综述中也已经报道了寡核苷酸缀合物及其合成，其每一个通过引用整体结合于此。
在一个实施方案中，非核苷酸部分(缀合物部分)选自由以下组成的组：碳水化合物、细胞表面受体配体、药物物质、激素、亲脂性物质、聚合物、蛋白质、肽、毒素(例如细菌毒素)、维生素、病毒蛋白(例如衣壳)或其组合。在一些实施方案中，非核苷酸部分是抗体或抗体片段，诸如促进递送穿过血脑屏障的抗体或抗体片段，特别是靶向转铁蛋白受体的抗体或抗体片段。
接头
连接或接头是将一个目标化学基团或区段经由一个或多个共价键与另一个目标化学基团或区段连接的两个原子之间的连接。缀合物部分可以与寡核苷酸直接连接或通过连接部分(例如接头或系绳(tether))连接。接头用于将第三区域(例如缀合物部分(区域C))共价连接至第一区域(例如寡核苷酸(区域A))。
在本发明的一些实施方案中，本发明的缀合物或寡核苷酸缀合物可以任选地包含位于寡核苷酸(区域A或第一区域)与缀合物部分(区域C或第三区域)之间的接头区域(第二区域或区域B和/或区域Y)。
区域B是指包含生理学上不稳定的键或由其组成的生物可切割接头，所述生理学上不稳定的键在哺乳动物体内通常所遇见的或与所遇见的那些相似的条件下是可切割的。生理学上不稳定的接头进行化学转化(例如切割)的条件包括在哺乳动物细胞中发现的或者与在哺乳动物细胞中所遇到的那些相似的化学条件，诸如pH、温度、氧化或还原条件或试剂、和盐浓度。哺乳动物细胞内条件还包括通常在哺乳动物细胞中存在的酶活性的存在，诸如来自蛋白水解酶或水解酶或核酸酶。在一个实施方案中，生物可切割接头对S1核酸酶切割敏感。在优选的实施方案中，对核酸酶敏感的接头包含1至10个核苷，诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷，更优选2至6个核苷，并且最优选2至4个包含至少两个连续磷酸二酯连接(诸如至少3或4或5个连续磷酸二酯连接)的核苷。优选地，核苷是DNA或RNA。WO 2014/076195(通过引用结合于此)中更详细地描述了含有磷酸二酯的生物可切割接头。
区域Y是指不必需是生物可切割的但是主要用于将缀合物部分(区域C或第三区域)共价连接至寡核苷酸(区域A或第一区域)的接头。区域Y接头可以包含重复单元(诸如乙二醇、氨基酸单元或氨基烷基基团)的链结构或寡聚物。本发明的寡核苷酸缀合物可以由以下区域性元件A-C、A-B-C、A-B-Y-C、A-Y-B-C或A-Y-C构建。在一些实施方案中，接头(区域Y)是氨基烷基，诸如C2-C36氨基烷基基团，包括例如C6至C12氨基烷基基团。在优选的实施方案中，接头(区域Y)是C6氨基烷基基团。
对照
术语“对照”当用于测量寡核苷酸的作用时，通常应当理解为对照是未治疗的个体或靶细胞或用非靶向寡核苷酸(模拟物)治疗的个体或靶细胞。然而，还可以是用护理标准治疗的个体。
治疗
如本文所使用的术语“治疗”是指治疗现有疾病(例如本文中提及的疾病或病症)或预防疾病(即预防)两者。因此，应当认识到，在一些实施方案中，本文中提及的治疗可以是预防性的。
发明详述
靶标
本发明的一个方面是调节猪、灵长类动物或人UBE3A蛋白表达的水平，特别是增加神经元细胞中(特别是人神经元细胞中)的父本UBE3A表达的表达。人UBE3A蛋白存在于Uniprot号Q05086所列出的若干同种型中。母本UBE3A基因中的几个突变可以导致安吉尔曼综合征。
用于本发明寡核苷酸的靶核酸是RNA，特别是长非编码RNA。由本发明寡核苷酸靶向的长非编码RNA是人SNHG14(也称为UBE3A-ATS，Ensembl索引号ENSG00000224078，版本GRCh38.p2)。特别地，靶核酸是SNORD109B下游的区域，其对应于15号染色体上的位置25278410至25419462(SEQ ID NO:1)。在猕猴(Macaca mulatta)中，UBE3A抑制物定义为SNORD109A下游的区域，其对应于7号染色体上的位置4222848至4373084(正向链)(使用Ensembl组件MMUL 1.0)(SEQ ID NO：2)。
在一些实施方案中，靶核酸是SEQ ID NO:1，或其天然存在的变体。
在某些实施方案中，靶核酸对应于人(SEQ ID NO:1)与猕猴(SEQ ID NO:2)之间保守的区域。在某些实施方案中，靶核酸对应于人(SEQ ID NO:1)、猕猴(SEQ ID NO:2)和小鼠(SEQ ID NO:3)之间保守的区域。
在某些实施方案中，靶核酸是与UBE3A前-mRNA反义的区域，该区域对应于SEQ IDNO:1的位置55319至141053。
在某些实施方案中，靶核酸是SNORD109B下游的和与UBE3A前-mRNA反义的区域的上游的区域，该区域对应于SEQ ID NO:1的位置1至55319。
在一些实施方案中，靶核酸存在于细胞中，诸如哺乳动物细胞，特别是体外或体内的人细胞(靶细胞)。在某些实施方案中，靶细胞是神经元细胞，优选人神经元细胞。
靶序列可以是靶核酸的子序列。在某些实施方案中，寡核苷酸靶向选自由以下组成的组的子序列：UBE3A的外显子9、外显子10、外显子13、外显子14、内含子14、外显子15、内含子15和外显子16。在某些实施方案中，寡核苷酸或连续核苷酸序列与单链核酸分子杂交或互补，所述单链核酸分子选自由以下组成的组：SEQ ID NO:1的位置55319-76274、77483-77573、92157-93403和97056-97354。在某些实施方案中，寡核苷酸或连续核苷酸序列与单链核酸分子杂交或互补，所述单链核酸分子选自由以下组成的组：SEQ ID NO:1的位置60821-60849、77567-77583、92323-92339和97156-97172。
在一些实施方案中，靶核酸是对应于SEQ ID NO:1的位置9200-9250的区域。
在一些实施方案中，靶核酸是对应于SEQ ID NO:1的位置11505-11555的区域。
在一些实施方案中，靶核酸是对应于SEQ ID NO:1的位置15100-15150的区域。
在一些实施方案中，靶核酸是对应于SEQ ID NO:1的位置30590-30740的区域。
在一些实施方案中，靶核酸是对应于SEQ ID NO:1的位置46380-46430的区域。
本发明的寡核苷酸
本发明涉及能够调节父本UBE3A表达(特别是诱导或上调神经元细胞中父本表达的UBE3A)的寡核苷酸。所述调节通过与位于SNORD109B下游的长非编码RNA SNHG14转录物的靶核酸杂交来实现。在某些实施方案中，本发明的寡核苷酸与SEQ ID NO:1的靶核酸的子序列杂交，其中ΔG°低于-10kcal，诸如ΔG°为-10至-60kcal，诸如-12至-40kcal，诸如-15至-30kcal或-16至-27kcal，诸如-18至-25kcal。
本发明的寡核苷酸是靶向SNORD109B下游的猪、猕猴和/或人SNHG14转录物的反义寡核苷酸。
在一些实施方案中，本发明的反义寡核苷酸能够通过除去、干扰或降低靶标的抑制物来调节靶标的表达。优选地，本发明的寡核苷酸通过降解或除去SNORD109B下游的SNHG14转录物来诱导细胞中的UBE3A表达，特别是神经元中的父本UBE3A表达。在一些实施方案中，与用盐水或非靶向寡核苷酸处理的神经元细胞中的UBE3A表达水平相比，本发明的寡核苷酸能够使UBE3A的表达增加至少20％，更优选地，与用盐水或非靶向寡核苷酸处理的神经元细胞中的UBE3A表达水平相比增加至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、80％、100％、120％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％或250％。在另外的实施方案中，与用盐水或非靶向寡核苷酸处理的神经元细胞中的SNORD109B下游SNHG14转录物水平相比，本发明的寡核苷酸能够使SNORD109B下游的SNHG14转录物(特别是与UBE3A前-mRNA区域反义的转录物部分)的水平降低至少20％，更优选地与用盐水或非靶向寡核苷酸处理的神经元细胞中的SNORD109B下游SNHG14转录物水平相比降低至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％，而与用盐水或非靶向寡核苷酸处理的细胞中的SNORD115水平相比，SNORD115水平减少不大于0％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、25％或30％。SNRPN和SNORD116转录物位于SNORD115转录物的上游，因此如果SNORD115转录物不被寡核苷酸减少，则SNRPN和SNORD116转录物很可能也不会减少。在另外的实施方案中，与用盐水或非靶向寡核苷酸处理的细胞中的SNRPN和SNORD116的水平相比，SNRPN和SNORD116转录物水平减少不大于0％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、25％或30％。
靶标调节由寡核苷酸的连续核苷酸序列与靶核酸之间的杂交触发。在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸包含寡核苷酸与靶核酸之间的错配。尽管存在错配，但是与靶核酸的杂交仍足以显示UBE3A表达的所需调节。由错配引起的结合亲和力降低可以有利地通过增加寡核苷酸中的核苷酸的数量和/或增加寡核苷酸序列中存在的修饰的核苷(所述修饰的核苷增加与靶标的结合亲和力，诸如2’修饰的核苷，包括LNA)的数量进行补偿。
本发明的一个方面涉及包含长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列的反义寡核苷酸，其与人15号染色体上的位置25278410至25419462具有至少90％、诸如95％、诸如98％、诸如100％的互补性。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含与如SEQ ID NO:1、2或3所示的靶核酸的区域至少90％互补(诸如至少91％、诸如至少92％、诸如至少93％、诸如至少94％、诸如至少95％、诸如至少96％、诸如至少97％、诸如至少98％或100％互补)的连续序列。
在优选的实施方案中，本发明的寡核苷酸或其连续核苷酸序列与如SEQ ID NO:1所示的靶核酸的区域完全互补(100％互补)，或者在一些实施方案中可以包含寡核苷酸与靶核酸之间的一个或两个错配。
在一些实施方案中，寡核苷酸序列与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中存在的对应靶核酸区域100％互补。在一些实施方案中，寡核苷酸序列与SEQ ID NO:1、2和3中存在的对应靶核酸区域100％互补。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，其与SEQ ID NO:1中存在的对应靶核酸区域具有至少90％(诸如100％)互补性，其中所述靶核酸区域选自由表1中的区域A1至A3649组成的组。
表1：可以使用本发明的寡核苷酸进行靶向的SEQ ID NO 1的区域
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在一些实施方案中，寡核苷酸包含长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，其与SEQ ID NO:1中存在的对应靶核酸区域具有至少90％(诸如100％)互补性，其中所述靶核酸区域选自由表2中的区域B1至B400组成的组。
表2：可以使用本发明的寡核苷酸进行靶向的SEQ ID NO 1的区域
Figure BDA0001658050150000561
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在某些实施方案中，寡核苷酸或连续核苷酸序列与靶核酸的区域(或子序列)(或子序列)互补，其中靶核酸区域选自由以下组成的组：SEQ ID NO:1的位置1589-10889、46089-53989和60789-62489。
在一个实施方案中，寡核苷酸包含长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，其与SEQ ID NO:1的位置55319至141053的靶核酸序列具有至少90％(诸如100％)互补性。
在一个实施方案中，寡核苷酸包含长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，其与SEQ ID NO:1的位置1至55318的靶核酸序列具有至少90％(诸如100％)互补性。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，其与选自下组的靶核酸的子序列具有至少90％互补性，所述组对应于SEQ ID NO:1的位置55319-76274、77483-77573、92157-93403和97056-97354。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，其与选自下组的靶核酸的子序列具有至少90％互补性，所述组对应于SEQ ID NO:1的位置60821-60849、77567-77583、92323-92339和97156-97172。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，其与对应于SEQ ID NO:1的位置5218-5240的靶核酸的子序列具有至少90％互补性。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，其与对应于SEQ ID NO:1的位置5782-5803的靶核酸的子序列具有至少90％互补性。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，其与对应于SEQ ID NO:1的位置8113-8139的靶核酸的子序列具有至少90％互补性。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，其与对应于SEQ ID NO:1的位置9200-9250的靶核酸的子序列具有至少90％互补性。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，其与对应于SEQ ID NO:1的位置11505-11555的靶核酸的子序列具有至少90％互补性。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，其与对应于SEQ ID NO:1的位置13223-13242的靶核酸的子序列具有至少90％互补性。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，其与对应于SEQ ID NO:1的位置15100-15150的靶核酸的子序列具有至少90％互补性。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，其与对应于SEQ ID NO:1的位置15113-15180的靶核酸的子序列具有至少90％互补性。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，其与对应于SEQ ID NO:1的位置29635-29705的靶核酸的子序列具有至少90％互补性。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，其与对应于SEQ ID NO:1的位置30590-30740的靶核酸的子序列具有至少90％互补性。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，其与对应于SEQ ID NO:1的位置39800-39855的靶核酸的子序列具有至少90％互补性。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，其与对应于SEQ ID NO:1的位置44435-44460的靶核酸的子序列具有至少90％互补性。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，其与对应于SEQ ID NO:1的位置45245-45270的靶核酸的子序列具有至少90％互补性。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，其与对应于SEQ ID NO:1的位置46380-46430的靶核酸的子序列具有至少90％互补性。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，其与对应于SEQ ID NO:1的位置68915-68940的靶核酸的子序列具有至少90％互补性。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含长度为8至35的核苷酸或由其组成，诸如长度为10至30、诸如11至22、诸如12至18、诸如13至17或14至16的连续核苷酸。在优选的实施方案中，寡核苷酸包含长度为15至20的核苷酸或由其组成。
在一些实施方案中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含22个以下的核苷酸或由其组成，诸如20个以下的核苷酸，诸如18个以下的核苷酸，诸如14、15、16或17个核苷酸。应当理解，本文给出的任何范围包括范围端点。因此，如果说寡核苷酸包括10至30个核苷酸，则包括10个核苷酸和30个核苷酸两者。
在一些实施方案中，连续核苷酸包含长度为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个的连续核苷酸或由其组成。在优选的实施方案中，寡核苷酸包含长度为16、17、18或19的核苷酸或由其组成。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸或连续核苷酸序列包含长度为10至30个的核苷酸或由其组成，所述核苷酸与选自由以下组成的组的序列具有至少90％同一性(优选100％同一性)：SEQ ID NO:4至150(参见实施例部分中的表3中列出的基序序列)。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸或连续核苷酸序列包含长度为10至30个的核苷酸或由其组成，所述核苷酸与选自由以下组成的组的序列具有至少90％同一性(优选100％同一性)：SEQ ID NO:4至818(参见实施例部分中的表3中列出的基序序列)。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸或连续核苷酸序列包含长度为10至30个的核苷酸或由其组成，所述核苷酸与选自由以下组成的组的序列具有至少90％同一性(优选100％同一性)：SEQ ID NO:4至678(参见实施例部分中的表3中列出的基序序列)。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸或连续核苷酸序列包含长度为10至30个的核苷酸或由其组成，所述核苷酸与选自由以下组成的组的序列具有至少90％同一性(优选100％同一性)：SEQ ID NO:166、167、167或169(参见实施例部分中的表3中列出的基序序列)。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸或连续核苷酸序列包含长度为10至30个的核苷酸或由其组成，所述核苷酸与选自由以下组成的组的序列具有至少90％同一性(优选100％同一性)：SEQ ID NO:570、571、572、679、680、681、682和683(参见实施例部分中的表3中列出的基序序列)。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸或连续核苷酸序列包含长度为10至30个的核苷酸或由其组成，所述核苷酸与选自由以下组成的组的序列具有至少90％同一性(优选100％同一性)：SEQ ID NO:34、186、187、188、573、574、575、576、572、684、685、686、687、688、689、690、691、692、963、964、965和696(参见实施例部分中的表3中列出的基序序列)。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸或连续核苷酸序列包含长度为10至30个的核苷酸或由其组成，所述核苷酸与选自由以下组成的组的序列具有至少90％同一性(优选100％同一性)：SEQ ID NO:35、199、200、201、202、203、204、205、206、207、209和210或者SEQ IDNO:582、583和584(参见实施例部分中的表3中列出的基序序列)。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸或连续核苷酸序列包含长度为10至30个的核苷酸或由其组成，所述核苷酸与选自由以下组成的组的序列具有至少90％同一性(优选100％同一性)：SEQ ID NO:221、222、223、224、225、585、586、587、588、589、698、699、700、701、702、703、704、705、706、707、708、709、710、711、712、713、714、715、716、717和718(参见实施例部分中的表3中列出的基序序列)。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸或连续核苷酸序列包含长度为10至30个的核苷酸或由其组成，所述核苷酸与选自由以下组成的组的序列具有至少90％同一性(优选100％同一性)：SEQ ID NO:236、237、238、239、240和590。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸或连续核苷酸序列包含长度为10至30个的核苷酸或由其组成，所述核苷酸与选自由以下组成的组的序列具有至少90％同一性(优选100％同一性)：SEQ ID NO:241、591或719(参见实施例部分中的表3中列出的基序序列)。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸或连续核苷酸序列包含长度为10至30个的核苷酸或由其组成，所述核苷酸与选自由以下组成的组的序列具有至少90％同一性(优选100％同一性)：SEQ ID NO:46、47、48、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、721、722、723、724、725、726、727、728、729、730、731、732、734、735、736、737、738、739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、756、757、758、759、760、761、762、763、764、765、766、767、768、769、770、771、772、773、774、775、776、777、778、779、780、781、782、783、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、794、795、796、797、798、799、800、800、800、800、800、801、801、802、803、804、805、806和807(参见实施例部分中的表3中列出的基序序列)。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸或连续核苷酸序列包含长度为10至30个的核苷酸或由其组成，所述核苷酸与选自由以下组成的组的序列具有至少90％同一性(优选100％同一性)：SEQ ID NO:331、332、638、639、640、808、809、810、811、812、813、814和815(参见实施例部分中的表3中列出的基序序列)。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸或连续核苷酸序列包含长度为10至30个的核苷酸或由其组成，所述核苷酸与选自由以下组成的组的序列具有至少90％同一性(优选100％同一性)：SEQ ID NO:409、410、411、642、643、644、645、646、816、818和818(参见实施例部分中的表3中列出的基序序列)。
应当理解，连续核碱基序列(基序序列)可以被修饰以例如增加核酸酶抗性和/或与靶核酸的结合亲和力。在定义中和在“寡核苷酸设计”部分中描述了所述修饰。表3列出了各基序序列的优选设计。
寡核苷酸设计
寡核苷酸设计是指寡核苷酸序列中核苷糖修饰的模式。本发明的寡核苷酸包含糖修饰的核苷并且还可以包含DNA或RNA核苷。在一些实施方案中，寡核苷酸包含糖修饰的核苷和DNA核苷。将修饰的核苷并入本发明的寡核苷酸中可以增强寡核苷酸对靶核酸的亲和力。在那种情况下，修饰的核苷可以称为增强亲和力的修饰的核苷酸。
在一个实施方案中，寡核苷酸包含至少1个修饰的核苷，诸如至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个或至少16个修饰的核苷。在一个实施方案中，寡核苷酸包含1至10个修饰的核苷，诸如2至9个修饰的核苷，诸如3至8个修饰的核苷，诸如4至7个修饰的核苷，诸如6或7个修饰的核苷。在一些实施方案中，至少1个修饰的核苷是锁核酸(LNA)，诸如至少2个、诸如至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或至少8个修饰的核苷是LNA。在又一个实施方案中，所有修饰的核苷都是LNA。
在一个实施方案中，本发明的寡核苷酸可以包含独立地选自这三种类型的修饰(修饰的糖、修饰的核碱基和修饰的核苷间连接)或其组合的修饰。优选地，寡核苷酸包含一个或多个糖修饰的核苷，诸如2’糖修饰的核苷。优选地，本发明的寡核苷酸包含独立地选自由以下组成的组的一种或多种2’糖修饰的核苷：2’-O-烷基-RNA、2’-O-甲基-RNA、2’-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧基乙基-RNA、2’-氨基-DNA、2’-氟-DNA、阿糖基核酸(ANA)、2’-氟-ANA和LNA核苷。甚至更优选地，一个或多个修饰的核苷是LNA。
在另外的实施方案中，寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷间连接。在优选的实施方案中，连续核苷酸序列内的核苷间连接是硫代磷酸酯或硼代磷酸酯核苷间连接。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷(其为2’-MOE-RNA)，诸如2、3、4、5、6、7、8、9或10个2’-MOE-RNA核苷单元。在一些实施方案中，所述修饰的核苷中的至少一个是2’-氟代DNA，诸如2、3、4、5、6、7、8、9或10个2’-氟-DNA核苷单元。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸包含至少一个LNA单元，诸如1、2、3、4、5、6、7或8个LNA单元，诸如2至6个LNA单元，诸如3至7个LNA单元、4至8个LNA单元或者3、4、5、6或7个LNA单元。在一些实施方案中，所有修饰的核苷都是LNA核苷。在另外的实施方案中，寡核苷酸可以包含β-D-氧基-LNA以及以下LNA单元中的一种或多种：硫代-LNA、氨基-LNA、氧基-LNA和/或β-D或α-L构型的ENA或它们的组合。在另外的实施方案中，所有LNA胞嘧啶单元都是5-甲基-胞嘧啶。在优选实施方案中，寡核苷酸或连续核苷酸序列在核苷酸序列的5’末端具有至少1个LNA单元并且在核苷酸序列的3’末端具有至少2个LNA单元。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸包含至少一个LNA单元和至少一个2’取代的修饰的核苷。
在本发明的一些实施方案中，寡核苷酸包含2’糖修饰的核苷和DNA单元。优选地，寡核苷酸包含LNA和DNA单元两者。优选地，LNA和DNA单元的相加的总和是8-30，诸如10-25，优选12-22，诸如12-18，甚至更优选11-16。在本发明的一些实施方案中，寡核苷酸的核苷酸序列(诸如连续核苷酸序列)由至少一个或两个LNA单元组成，并且其余的核苷酸单元是DNA单元。在一些实施方案中，寡核苷酸仅包含任选地具有修饰的核苷间连接(诸如硫代磷酸酯)的LNA核苷和天然存在的核苷(例如RNA或DNA，最优选DNA核苷)。
在本发明的实施方案中，本发明的寡核苷酸能够募集RNA酶H。
间隔聚体设计
在优选的实施方案中，本发明的寡核苷酸具有间隔聚体设计或结构(在本文中也简称为“间隔聚体”)。在间隔聚体结构中，寡核苷酸以‘5->3’取向包含至少三个不同的结构区域：5’侧、间隔和3’侧(F-G-F’)。在该设计中，侧翼区域F和F’(也称为侧翼区域)包含一段连续的修饰的核苷，其与UBE3A靶核酸互补，而间隔区域G包含一段连续的核苷酸，当寡核苷酸处于与靶核酸的双链体中时，所述一段连续的核苷酸能够募集核酸酶(优选核酸内切酶，诸如RNA酶，例如RNA酶H)。能够募集核酸酶(特别是RNA酶H)的核苷可以选自由DNA、α-L-氧基-LNA、2’-氟-ANA和UNA组成的组。区域F和F’位于区域G的5’和3’末端的侧翼，优选包含不募集核酸酶的核苷(具有3’内部(endo)结构的核苷)，更优选一个或多个增强亲和力的修饰的核苷。在一些实施方案中，3’侧翼包含至少一个LNA核苷，优选至少2个LNA核苷。在一些实施方案中，5’侧翼包含至少一个LNA核苷。在一些实施方案中，5’和3’侧翼区域均包含LNA核苷。在一些实施方案中，侧翼区域中的所有核苷都是LNA核苷。在其它实施方案中，侧翼区域可以包含LNA核苷和其它核苷(混合侧翼)，诸如DNA核苷和/或非LNA修饰的核苷，诸如2’取代的核苷。在这种情形下，间隔被定义为至少5个募集RNA酶H的核苷(具有2’内部结构的核苷，优选DNA)的连续序列，其在5’和3’末端侧翼有增强亲和力的修饰的核苷，优选LNA，诸如β-D-氧基-LNA。因此，与间隔区域相邻的5’侧翼区域和3’侧翼区域的核苷是修饰的核苷，优选不募集核酸酶的核苷。在具有其中侧翼包含DNA的混合侧翼的寡核苷酸中，5’和3’核苷是修饰的核苷。
区域F
与区域G的5’末端相连的区域F(5’侧或5’侧翼)包含至少一个修饰的核苷、含有至少一个修饰的核苷或由至少一个修饰的核苷组成，诸如至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个修饰的核苷。在一个实施方案中，区域F包含1至7个修饰的核苷，诸如2至6个修饰的核苷、诸如2至5个修饰的核苷、诸如2至4个修饰的核苷、诸如1至3个修饰的核苷、诸如1、2、3或4个修饰的核苷，或者由其组成。在另外的实施方案中，其它另外的核苷可以与区域F的5’末端(代表优选包含1、2或3个核苷单元(诸如DNA核苷)的区域D)连接。区域D可以发挥“接头”定义中描述的生物可切割(B)接头的作用。
在一些实施方案中，区域F中的修饰的核苷具有3’内部结构。
在一个实施方案中，区域F中的修饰的核苷中的一个或多个是2’修饰的核苷。
在另外的实施方案中，区域F中的2’修饰的核苷中的一个或多个选自2’-O-烷基-RNA单元、2’-O-甲基-RNA、2’-氨基-DNA单元、2’-氟-DNA单元、2’-烷氧基-RNA、MOE单元、LNA单元、阿糖基核酸(ANA)单元和2’-氟-ANA单元。
在本发明的一个实施方案中，区域F中的所有修饰的核苷都是LNA核苷。在另外的实施方案中，区域F中的LNA核苷独立地选自由以下组成的组：氧基-LNA、硫代-LNA、氨基-LNA、cET、和/或β-D或α-L构型的ENA或它们的组合。在优选的实施方案中，区域F在连续序列的5’末端具有至少1个β-D-氧基LNA单元。
区域G
区域G(间隔区域)优选包含、含有或由以下组成：至少4个，诸如至少5个、诸如至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个或至少16个连续核苷，所述连续核苷能够募集前述核酸酶(特别是RNA酶H)。在另外的实施方案中，区域G包含、含有或由以下组成：5至12个、或6至10个、或7至9个(诸如8个)连续核苷酸单元，所述连续核苷酸单元能够募集前述核酸酶。
在一些实施方案中，能够募集核酸酶的区域G中的核苷单元选自由以下组成的组：DNA、α-L-LNA、C4’烷基化的DNA(如PCT/EP2009/050349和Vester等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.18(2008)2296–2300中描述的，二者都通过引用结合于此)、来源于阿拉伯糖的核苷(如ANA)和2’F-ANA(Mangos等人2003J.AM.CHEM.SOC.125,654-661)、UNA(解锁核酸)(如Fluiter等人,Mol.Biosyst.，2009，10，1039中描述的，其通过引用结合于此)。UNA是解锁核酸，通常其中已经移除了核糖的C2与C3之间的键，形成解锁的“糖”残基。
在又一个实施方案中，区域G中的至少一个核苷单元是DNA核苷单元，诸如1至16个DNA单元，诸如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个DNA单元，优选2至13个DNA单元，诸如4至12个DNA单元，更优选5至11个或者10至16个、11至15个或12至14个DNA单元。在一些实施方案中，区域G由100％DNA单元组成。在优选的实施方案中，G由最优选10、11、12、13、14或15个DNA单元组成。
在另外的实施方案中，区域G可以由DNA和能够介导RNA酶H切割的其它核苷的混合物组成。区域G可以由至少50％DNA、更优选60％、70％或80％DNA、甚至更优选90％或95％DNA组成。
在又一个实施方案中，区域G中的至少一个核苷单元是α-L-LNA核苷单元，诸如至少一个α-L-LNA单元，诸如2、3、4、5、6、7、8或9个α-L-LNA单元。在另外的实施方案中，区域G包含至少一个α-L-LNA，其为α-L-氧基-LNA单元。在另外的实施方案中，区域G包含DNA和α-L-LNA核苷单元的组合。
在一些实施方案中，区域G中的连续序列的大小可以更长，诸如15、16、17、18、19或20个核苷单元。
在一些实施方案中，区域G中的核苷具有2’内部结构。
区域F’
与区域G的3’末端相连的区域F’(3’侧或3’侧翼)包含至少一个修饰的核苷、含有至少一个修饰的核苷或由至少一个修饰的核苷组成，诸如至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个修饰的核苷。在一个实施方案中，区域F’包含1至7个修饰的核苷，诸如2至6个修饰的核苷、诸如2至4个修饰的核苷、诸如1至3个修饰的核苷、诸如1、2、3或4个修饰的核苷，或者由其组成。在另外的实施方案中，其它另外的核苷可以与区域F’的3’末端(代表优选包含1、2或3个核苷单元(诸如DNA核苷)的区域D’)连接。区域D’可以发挥“接头”部分中描述的生物可切割(B)接头的作用。
在一些实施方案中，区域F’中的修饰的核苷具有3’内部结构。
在优选的实施方案中，区域F’中的修饰的核苷是LNA。
在另外的实施方案中，区域F’中的修饰的核苷选自2’-O-烷基-RNA单元、2’-O-甲基-RNA、2’-氨基-DNA单元、2’-氟-DNA单元、2’-烷氧基-RNA、MOE单元、LNA单元、阿糖基核酸(ANA)单元和2’-氟-ANA单元。
在本发明的一个实施方案中，区域F’中的所有修饰的核苷都是LNA核苷。在另外的实施方案中，区域F’中的LNA核苷独立地选自由以下组成的组：氧基-LNA、硫代-LNA、氨基-LNA、cET、和/或β-D或α-L构型的ENA或它们的组合。在优选的实施方案中，区域F’在连续序列的3’末端具有至少2个β-D-氧基LNA单元。
区域D和D’
区域D和D’可以分别连接至区域F的5’末端或区域F’的3’末端。
区域D或D’可以独立地包含1、2、3、4或5个额外的核苷酸，其可以与靶核酸互补或非互补。在此方面，本发明的寡核苷酸在一些实施方案中可以包含能够调节靶标的连续核苷酸序列，所述靶标在5’和/或3’末端侧翼有另外的核苷酸。这些额外的核苷酸可以充当核酸酶敏感的生物可切割接头(参见接头的定义)。在一些实施方案中，另外的5’和/或3’末端核苷酸与磷酸二酯连接相连，并且可以是DNA或RNA。在另一个实施方案中，另外的5’和/或3’末端核苷酸是修饰的核苷酸，其可以例如被包括以增强核酸酶稳定性或易于合成。在本发明的寡核苷酸的实施方案中，除连续核苷酸序列以外，还包含区域D和/或D’。
本发明的间隔聚体寡核苷酸可以由下式表示：
F-G-F’；特别是F1-7-G4-12-F’1-7
D-F-G-F’，特别是D1-3-F1-7-G4-12-F’1-7
F-G-F’-D’，特别是F1-7-G4-12-F’1-7-D’1-3
D-F-G-F’-D’，特别是D1-3-F1-7-G4-12-F’1-7-D’1-3
上面已经描述了区域F、G和F’、D和D’中的核苷的优选数量和类型。个别寡核苷酸的设计也可能对寡核苷酸在其用于调节UBE3A表达中的性质具有深远影响。
在一些实施方案中，寡核苷酸是由长度为14、15、16、17、18、19或20个的核苷酸组成的间隔聚体，其中区域F和F’中的每一个独立地由互补于与UBE3A前-mRNA反义的人SNHG14长非编码RNA的部分(靶核酸)的2、3或4个修饰的核苷单元组成，并且区域G由在处于与靶核酸的双链体中时能够募集核酸酶的10、11、12、13、14或15个核苷单元组成。
在另外的实施方案中，寡核苷酸是间隔聚体，其中区域F和F’中的每一个独立地由2、3、4或5个修饰的核苷单元(诸如含有2’-O-甲氧基乙基-核糖(2’-MOE)的核苷单元或含有2’-氟-脱氧核糖的核苷单元和/或LNA单元)组成，并且区域G由9、10、11、12、13、14或15个核苷单元(诸如DNA单元或其它募集核酸酶的核苷(诸如α-L-LNA)或DNA和募集核酸酶的核苷的混合物)组成。
在另外的具体实施方案中，寡核苷酸是间隔聚体，其中区域F和F’中的每一个各自由两个LNA单元组成，并且区域G由10、11、12、13、14或15个核苷单元(优选DNA单元)组成。此种的具体间隔聚体设计包括2-10-2、2-11-2、2-12-2、2-13-2、2-14-2和2-15-2。
在另外的具体实施方案中，寡核苷酸是间隔聚体，其中区域F和F’中的每一个独立地由三个LNA单元组成，并且区域G由10、11、12、13、14或15个核苷单元(优选DNA单元)组成。此种的具体间隔聚体设计包括3-10-3、3-11-3、3-12-3、3-13-3、3-14-3和3-15-3。
在另外的具体实施方案中，寡核苷酸是间隔聚体，其中区域F和F’中的每一个各自由四个LNA单元组成，并且区域G由10、11、12、13、14或15个核苷单元(优选DNA单元)组成。此种的具体间隔聚体设计包括4-10-4、4-11-4、4-12-4、4-13-4、4-14-4和4-15-4。
此种的具体间隔聚体设计包括选自由以下组成的组的F-G-F’设计：具有10个核苷的间隔以及侧翼中的独立地1至4个修饰的核苷，包括1-10-1、2-10-1、1-10-2、1-10-3、3-10-1、1-10-4、4-10-1、2-10-2、2-10-3、3-10-2、2-10-4、4-10-2、3-10-3、3-10-4、4-10-3和4-10-4间隔聚体。
此种的具体间隔聚体设计包括选自由以下组成的组的F-G-F’设计：具有11个核苷的间隔以及侧翼中的独立地1至4个修饰的核苷，包括1-11-1、2-11-1、1-11-2、1-11-3、3-11-1、1-11-4、4-11-1、2-11-2、2-11-3、3-11-2、2-11-4、4-11-2、3-11-3、3-11-4、4-11-3和4-11-4间隔聚体。
此种的具体间隔聚体设计包括选自由以下组成的组的F-G-F’设计：具有12个核苷的间隔，包括1-12-1、2-12-1、1-12-2、1-12-3、3-12-1、1-12-4、4-12-1、2-12-2、2-12-3、3-12-2、2-12-4、4-12-2、3-12-3、3-12-4、4-12-3和4-12-4间隔聚体。
此种的具体间隔聚体设计包括选自由以下组成的组的F-G-F’设计：具有13个核苷的间隔以及侧翼中的独立地1至4个修饰的核苷，包括1-13-1、1-13-2、1-13-3、3-13-1、1-13-4、4-13-1、2-13-1、2-13-2、2-13-3、3-13-2、2-13-4、4-13-2、3-13-3、3-13-4、4-13-3和4-13-4间隔聚体。
此种的具体间隔聚体设计包括选自由以下组成的组的F-G-F’设计：具有14个核苷的间隔以及侧翼中的独立地1至4个修饰的核苷，包括1-14-1、1-14-2、2-14-1、1-14-3、3-14-1、1-14-4、4-14-1、2-14-2、2-14-3、3-14-2、2-14-4、4-14-2、3-14-3、3-14-4、和4-14-3间隔聚体。
此种的具体间隔聚体设计包括选自由以下组成的组的F-G-F’设计：具有15个核苷的间隔以及侧翼中的独立地1至4个修饰的核苷，包括1-15-1、1-15-2、2-15-1、1-15-3、3-15-1、1-15-4、4-15-1、2-15-2、2-15-3、3-15-2、2-15-4、4-15-2、3-15-3、3-15-4、和4-15-3间隔聚体。
此种的具体间隔聚体设计包括选自由以下组成的组的F-G-F’设计：具有16个核苷的间隔以及侧翼中的独立地1至4个修饰的核苷，包括1-16-1、1-16-2、2-16-1、1-15-3、3-16-1、1-16-4、4-16-1、2-16-2、2-16-3、3-16-2、2-16-4、4-16-2、3-16-3、3-16-4、和4-16-3间隔聚体。
在一些实施方案中，F-G-F’设计选自2-10-4、3-10-3和4-10-2。
在一些实施方案中，F-G-F’设计选自2-11-4、3-11-2、3-11-3和4-11-2。
在一些实施方案中，F-G-F’设计选自2-12-2、2-12-3、2-12-4、3-12-2、3-12-3和4-12-2。
在一些实施方案中，F-G-F’设计选自2-13-2、2-13-3、2-13-4、3-13-3和4-13-2。
在一些实施方案中，F-G-F’设计选自2-14-2、2-14-4、3-14-3和4-14-2。
在一些实施方案中，F-G-F’设计选自2-15-2和2-16-2。
在一些实施方案中，F-G-F’设计选自表3所示的设计。
在所有情况中，F-G-F’设计还可以包括区域D和/或D’，其可以具有1、2或3个核苷单元(诸如DNA单元)。优选地，区域F和F’中的核苷是修饰的核苷，而区域G中的核苷优选是未修饰的核苷。
在每个设计中，优选的修饰的核苷是LNA。
在另一个实施方案中，间隔聚体中的间隔中的所有核苷间连接都是硫代磷酸酯和/或硼代磷酸酯连接。在另一个实施方案中，间隔聚体中的侧翼(区域F和F’)中的所有核苷间连接都是硫代磷酸酯和/或硼代磷酸酯连接。在另一个优选实施方案中，间隔聚体中的区域D和D’中的所有核苷间连接都是磷酸二酯连接。
对于本文公开的具体间隔聚体，当胞嘧啶(C)残基标注为5-甲基-胞嘧啶时，在各种实施方案中，寡核苷酸中存在的C中的一个或多个可以是未修饰的C残基。
另外的间隔聚体设计公开于WO2004/046160、WO2007/146511，并且通过引用结合于此。
对于本发明的某些实施方案，寡核苷酸选自表3中的寡核苷酸化合物的组。
对于本发明的某些实施方案，寡核苷酸选自具有CMP-ID-NO:4_1至150_2的寡核苷酸化合物的组。
对于本发明的某些实施方案，寡核苷酸选自具有CMP-ID-NO:4_1至678_1的寡核苷酸化合物的组。
对于本发明的某些实施方案，寡核苷酸选自具有CMP-ID-NO:4_1至818_1的寡核苷酸化合物的组(参见实施例部分中的表3中列出的寡核苷酸序列)。
对于本发明的某些实施方案，寡核苷酸是具有CMP-ID-NO:155_1或165_1的寡核苷酸化合物。
对于本发明的某些实施方案，寡核苷酸选自具有CMP-ID-NO:169_52、169_50或169_56的寡核苷酸化合物的组。
对于本发明的某些实施方案，寡核苷酸选自具有CMP-ID-NO:172_1、272_1、572_7、572_6或572_5的寡核苷酸化合物的组。
对于本发明的某些实施方案，寡核苷酸是具有CMP-ID-NO:175_1的寡核苷酸化合物。
对于本发明的某些实施方案，寡核苷酸是具有CMP-ID-NO:178_1的寡核苷酸化合物。
对于本发明的某些实施方案，寡核苷酸选自具有CMP-ID-NO:573_8、186_1或187_1的寡核苷酸化合物的组。
对于本发明的某些实施方案，寡核苷酸是具有CMP-ID-NO:186_1的寡核苷酸化合物。
对于本发明的某些实施方案，寡核苷酸选自具有CMP-ID-NO:200_1、204_1、206_1、35_2或209_1的寡核苷酸化合物的组。
对于本发明的某些实施方案，寡核苷酸选自具有CMP-ID-NO:585_1、585_8、586_9、586_5、586_8、586_4或586_6的寡核苷酸化合物的组。
对于本发明的某些实施方案，寡核苷酸是具有CMP-ID-NO:233_1的寡核苷酸化合物。
对于本发明的某些实施方案，寡核苷酸是具有CMP-ID-NO:237_8或590_13的寡核苷酸化合物。
对于本发明的某些实施方案，寡核苷酸是具有CMP-ID-NO:220_1的寡核苷酸化合物。
对于本发明的某些实施方案，寡核苷酸选自具有CMP-ID-NO:591_1、592_2、592_4或241_9的寡核苷酸化合物的组。
对于本发明的某些实施方案，寡核苷酸选自具有CMP-ID-NO:597_4、598_4、39_1或602_1的寡核苷酸化合物的组。
对于本发明的某些实施方案，寡核苷酸是具有CMP-ID-NO:39_1的寡核苷酸化合物。
对于本发明的某些实施方案，寡核苷酸是具有CMP-ID-NO:611_7的寡核苷酸化合物。
对于本发明的某些实施方案，寡核苷酸是具有CMP-ID-NO:271_1或278_1的寡核苷酸化合物。
对于本发明的某些实施方案，寡核苷酸选自具有CMP-ID-NO:616_4、621_2、621_1、622_3、622_5、622_4、624_3、624_5、287_1、625_6、626_7、626_8、626_9、48_1、631_6、631_1、303_1、304_6或304_10的寡核苷酸化合物的组。
对于本发明的某些实施方案，寡核苷酸是具有CMP-ID-NO:636_8的寡核苷酸化合物。
对于本发明的某些实施方案，寡核苷酸选自具有CMP-ID-NO:638_8、639_5、331_1或640_4的寡核苷酸化合物的组。
对于本发明的某些实施方案，寡核苷酸选自具有CMP-ID-NO:359_1、361_1、361_5、362_1或641_5的寡核苷酸化合物的组。
对于本发明的某些实施方案，寡核苷酸选自具有CMP-ID-NO:378_1、379_1、399_1的寡核苷酸化合物的组。
对于本发明的某些实施方案，寡核苷酸选自具有CMP-ID-NO:403_1、405_1、642_12、642_13、644_3或646_16的寡核苷酸化合物的组。
对于本发明的某些实施方案，寡核苷酸是具有CMP-ID-NO:85_1或425_5的寡核苷酸化合物。
对于本发明的某些实施方案，寡核苷酸是具有CMP-ID-NO:116_1的寡核苷酸化合物。
对于本发明的某些实施方案，寡核苷酸是具有CMP-ID-NO:123_1或124_1的寡核苷酸化合物。
对于本发明的某些实施方案，寡核苷酸是具有CMP-ID-NO:126_2的寡核苷酸化合物。
制备方法
在另外的方面，本发明提供了用于制备本发明寡核苷酸的方法，所述方法包括使核苷酸单元反应并且由此形成包含在寡核苷酸中的共价连接的连续核苷酸单元。优选地，所述方法使用亚磷酰胺化学(参见例如Caruthers等人,1987,Methods in Enzymologyvol.154,第287-313页)。在另外的实施方案中，所述方法还包括使连续核苷酸序列与缀合部分(配体)反应。在另外的方面，提供了用于制造本发明组合物的方法，所述方法包括将本发明的寡核苷酸或缀合的寡核苷酸与药用稀释剂、溶剂、载体、盐和/或辅剂混合。
药物组合物
在另外的方面，本发明提供了包含前述寡核苷酸和/或寡核苷酸缀合物中的任一者和药用稀释剂、载体、盐和/或辅剂的药物组合物。药用稀释剂包括磷酸盐缓冲盐水(PBS)，并且药用盐包括但不限于钠盐和钾盐。
WO 2007/031091提供了药用稀释剂、载体和辅剂的合适且优选的实例(通过引用结合于此)。WO2007/031091中也提供了合适的剂量、制剂、施用途径、组合物、剂型、与其它治疗剂的组合、前药制剂。
本发明的寡核苷酸或寡核苷酸缀合物可以与药用活性或惰性物质混合用于制备药物组合物或制剂。用于配制药物组合物的组合物和方法取决于许多标准，包括但不限于施用途径、疾病程度或待施用的剂量。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸或寡核苷酸缀合物是前药。特别是关于寡核苷酸缀合物，一旦将前药递送至作用位点(例如，靶细胞)，缀合物部分就被从寡核苷酸切割。
应用
本发明的寡核苷酸可以用作例如用于治疗和预防的研究试剂。
在研究中，这种寡核苷酸可以用于特异性调节细胞(例如体外细胞培养物)和实验动物中的UBE3A蛋白的合成，从而促进靶标的功能性分析或评价其作为治疗性干预靶标的有用性。靶标调节通过降解或抑制产生蛋白质的基因或mRNA的调节剂来实现。
对于治疗，疑似患有疾病或病症的动物或人可以通过调节UBE3A的表达来治疗。
本发明提供了用于治疗或预防疾病的方法，所述方法包括将治疗或预防有效量的本发明寡核苷酸、寡核苷酸缀合物或药物组合物施用至患有或易患所述疾病的受试者。
本发明还涉及如本文所定义的寡核苷酸、组合物或缀合物，其用于用作药物。
通常以有效量施用根据本发明的寡核苷酸、寡核苷酸缀合物或药物组合物。
本发明还提供了所描述的本发明寡核苷酸或寡核苷酸缀合物用于制备药物的用途，所述药物用于治疗本文提及的病症，或者用于治疗本文提及的病症的方法的用途。
如本文所提及的疾病或病症与UBE3A的表达有关。在一些实施方案中，疾病或病症可能与母本UBE3A基因中的突变有关。在一些实施方案中，靶核酸是父本UBE3A基因的调节剂。
本发明的方法优选用于治疗或预防由UBE3A的异常水平和/或活性引起的疾病。所述疾病可以特别是由UBE3A蛋白的水平和/或活性降低引起的。
本发明还涉及如本文所定义的寡核苷酸、寡核苷酸缀合物或药物组合物用于制备药物中的用途，所述药物用于治疗UBE3A的异常水平和/或活性，特别是UBE3A的低水平和/或活性。
在一个实施方案中，本发明涉及用于治疗安吉尔曼综合征的寡核苷酸、寡核苷酸缀合物或药物组合物。
施用
本发明的寡核苷酸或药物组合物可以局部施用(诸如，到皮肤、吸入、眼部或耳部)或肠内施用(诸如，经口或通过胃肠道)或肠胃外施用(诸如，静脉内、皮下、肌内、脑内、脑室内或鞘内)。
在优选的实施方案中，本发明的寡核苷酸或药物组合物通过肠胃外途径施用，包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或输注、鞘内或颅内(例如脑内)或心室内施用。在一个实施方案中，脑内或脑室内施用活性寡核苷酸或寡核苷酸缀合物。在另一个实施方案中，鞘内施用活性寡核苷酸或寡核苷酸缀合物。
本发明还提供了所描述的本发明寡核苷酸或寡核苷酸缀合物用于制备药物的用途，其中所述药物是用于鞘内施用的剂型。
本发明还提供了所描述的本发明寡核苷酸或寡核苷酸缀合物用于制备药物的用途，其中所述药物是用于脑内或心室内施用的剂型。
本发明还提供了所描述的本发明寡核苷酸或寡核苷酸缀合物用于制备药物的用途，其中所述药物是用于脑室内施用的剂型。
组合疗法
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸、寡核苷酸缀合物或药物组合物用于在与另一种治疗剂的组合治疗中使用。治疗剂可以是例如抗惊厥药物。
实施方案
本发明的以下实施方案可以与本文描述的任何其它实施方案组合使用。
1.一种反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸包含长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列或由其组成，所述连续核苷酸序列能够诱导人父本UBE3A表达，特别是神经元细胞中的人父本UBE3A表达。
2.根据实施方案1所述的寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列与SNORD109B下游的人SNHG14长非编码RNA的部分具有至少95％的互补性，所述人SNHG14长非编码RNA的部分对应于15号染色体上的位置25278410至25419462。
3.根据实施方案1或2所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸能够以低于-10kcal的ΔG°与SEQ ID NO:1的靶核酸杂交。
4.根据实施方案1-3所述的寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列与SEQ ID NO:1和/或2的靶核酸的区域具有至少95％、诸如98％、诸如100％的互补性。
5.根据实施方案1-3所述的寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列与SEQ ID NO:1的位置1至55318的靶核酸的区域具有100％的互补性。
6.根据实施方案1-4所述的寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列与靶核酸的子序列互补，其中所述子序列选自由表1或2所示的区域组成的组。
7.根据实施方案1-4所述的寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列与与UBE3A前-mRNA反义的人SNHG14长非编码RNA的部分具有至少98％的互补性。
8.根据实施方案1-4或7所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸能够以低于-10kcal的ΔG°与对应于SEQ ID NO:1的位置55319至141053的靶核酸杂交。
9.根据实施方案1-4或7-8所述的寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列与SEQ IDNO:1的位置55319至141053的靶核酸具有100％的互补性。
10.根据实施方案1-8所述的寡核苷酸，其中所述靶核酸是RNA。
11根据实施方案10所述的寡核苷酸，其中所述RNA是长非编码RNA。
12.根据实施方案1-11所述的寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列包含至少10个连续核苷酸，特别是11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29个连续核苷酸，或者由其组成。
13.根据实施方案1-12所述的寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列包含12至22个核苷酸或由其组成。
14.根据实施方案13所述的寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列包含15-20个核苷酸或由其组成。
15.根据实施方案1-14所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含长度为10至35的核苷酸或由其组成。
16.根据实施方案15所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含长度为15至24的核苷酸或由其组成。
17.根据实施方案15或17所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含长度为17至22的核苷酸或由其组成。
18.根据实施方案1-17所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸或连续核苷酸序列是单链的。
19.根据实施方案1-18所述的寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列与靶核酸的子序列互补，所述子序列选自由表1或2所示的区域组成的组。
20.根据实施方案1-18所述的寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列与靶核酸的子序列互补，所述子序列选自由SEQ ID NO:1的位置1589-10889、46089-53989和60789-62489组成的组。
21.根据实施方案1-18所述的寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列与对应于SEQID NO:1的位置5218-5240的靶核酸的子序列互补。
22.根据实施方案1-18所述的寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列与对应于SEQID NO:1的位置5782-5803的靶核酸的子序列互补。
23.根据实施方案1-18所述的寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列与对应于SEQID NO:1的位置8113-8139的靶核酸的子序列互补。
24.根据实施方案1-18所述的寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列与对应于SEQID NO:1的位置9200-9250的靶核酸的子序列互补。
25.根据实施方案1-18所述的寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列与对应于SEQID NO:1的位置11505-11555的靶核酸的子序列互补。
26.根据实施方案1-18所述的寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列与对应于SEQID NO:1的位置13223-13242的靶核酸的子序列互补。
27.根据实施方案1-18所述的寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列与对应于SEQID NO:1的位置15100-15150的靶核酸的子序列互补。
28.根据实施方案1-18所述的寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列与对应于SEQID NO:1的位置15113-15180的靶核酸的子序列互补。
29.根据实施方案1-18所述的寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列与对应于SEQID NO:1的位置29635-29705的靶核酸的子序列互补。
30.根据实施方案1-18所述的寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列与对应于SEQID NO:1的位置30590-30740的靶核酸的子序列互补。
31.根据实施方案1-18所述的寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列与对应于SEQID NO:1的位置39800-39855的靶核酸的子序列互补。
32.根据实施方案1-18所述的寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列与对应于SEQID NO:1的位置44435-44460的靶核酸的子序列互补。
33.根据实施方案1-18所述的寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列与对应于SEQID NO:1的位置45245-45270的靶核酸的子序列互补。
34.根据实施方案1-18所述的寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列与对应于SEQID NO:1的位置46380-46430的靶核酸的子序列互补。
35.根据实施方案1-18所述的寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列与对应于SEQID NO:1的位置68915-68940的靶核酸的子序列互补。
36.根据实施方案1-35所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸既不是siRNA，也不是自我互补的。
37.根据实施方案1-36所述的寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列包含选自由以下组成的组的序列，或者由其组成：SEQ ID NO:4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,1819,20,21,22,23,23,24,25,26,26,27,28,29,30,31,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,44,45,45,46,47,48,49,50,51,52,53,53,54,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,79,80,81,8283,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,95,96,96,96,97,98,99,100,101,101,102,103,104,105,106,107,108,109,110,111,112,113,114,115,116,117,118,119,120,121,122,123,124,125,126,127,128,129,130,131,132,133,134,135,136,137,138,139,140,141,142,143,144,145,146,147,148,149,150,151,152,153,154,155,156,157,158,159,160,161,162,163,164,165,166,167,168,169,170,171,172,173,174,175,176,177,178,179,180,181,182,183,184,185,186,187,188,189,190,191,192,193,194,195,196,197,198,199,200,201,202,203,204,205,206,207,208,209,210,211,212,213,214,215,216,217,218,219,220,221,222,223,224,225,226,227,228,229,230,231,232,233,234,235,236,237,238,239,240,241,242,243,244,245,246,247,248,249,250,251,252,253,254,255,256,257,258,259,260,261,262,263,264,265,266,267,268,269,270,271,272,273,274,275,276,277,278,279,280,281,282,283,284,285,286,287,288,289,290,291,292,293,294,295,296,297,298,299,300,301,302,303,304,304,305,306,307,308,309,310,311,312,313,314,315,316,317,318,319,320,321,322,323,324,325,326,327,328,329,330,331,332,333,334,335,336,337,338,339,340,341,342,343,344,345,346,347,348,349,350,351,352,353,354,355,356,357,358,359,360,361,362,363,364,365,366,367,368,369,370,371,372,373,374,375,376,377,378,379,380,381,382,383,384,385,386,387,388,389,390,391,392,393,394,395,396,397,398,399,400,401,402,403,404,405,406,407,408,409,410,411,412,413,414,415,416,417,418,419,420,421,422,423,424,425,426,427,428,429,430,431,432,433,434,435,436,437,438,439,440,441,442,443,444,445,446,447,448,449,450,451,452,453,454,455,456,457,458,459,460,461,462,463,464,465,466,467,468,469,470,471,472,473,474,475,476,477,478,479,480,481,482,483,484,485,486,487,488,489,490,491,492,493,494,495,496,497,498,499,500,501,502,503,504,505,506,507,508,509,510,511,512,513,514,515,516,517,518,519,520,521,522,523,524,525,526,527,528,529,530,531,532,533,534,535,536,537,538,539,540,541,542,543,544,545,546,547,548,549,550,551,552,553,554,555,556,557,558,559,560,561,562,563,564,565,566,567,568,569,570,571,572,573,574,575,576,577,578,579,580,581,582,583,584,585,586,587,588,589,590,591,592,593,594,595,596,596,597,598,599,600,601,602,603,604,605,606，607，608，609,610,611,612,613,614,615,616,617,618,619,620,621,622,623,624,625,626,627,628,629,630,631,632,633,634,635,636,637,638,639,640,641,642,643,644,645,646,647,648,649,650,651,652,653,654,655,656,657,658,659,660,661,662,663,664,665,666,667,668,669,670,671,672,673,674,675,676,677,678,679,680,681,682,683,684,685,686,687,688,689，690，691，692,693,694,695,696,697,698,699,700,702,703,704,705,706,707,708,709,710,711,712，713,714,715,716,717,718,719,719,720,721,722,723,724,725,726,727,728,729,730,731,732,733,734,735,736,737,738,739,740,741,742,743,744,745,746,747,748,749,750,751,752,754,755,756,757,758,759,760,761,762,763,764,765,766,767,768,769,770,772,773,774,775,776,777,778,779,780,781,782,783,784,785,786,787,788,789,790,791,792,793,794,795,796,797,798,799,800,801,802,803,804,805,806,807,808,809,810,811,812,813,814,815,816,817和818。
38.根据实施方案1-36所述的寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列包含选自由以下组成的组的序列，或者由其组成：SEQ ID NO:166、167、167或169(参见实施例部分中的表3中列出的基序序列)。
39.根据实施方案1-36所述的寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列包含选自由以下组成的组的序列，或者由其组成：SEQ ID NO:570、571、572、679、680、681、682和683(参见实施例部分中的表3中列出的基序序列)。
40.根据实施方案1-36所述的寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列包含选自由以下组成的组的序列，或者由其组成：SEQ ID NO:570、571、572、679、680、681、682和683(参见实施例部分中的表3中列出的基序序列)。
41.根据实施方案1-36所述的寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列包含选自由以下组成的组的序列，或者由其组成：SEQ ID NO:35、199至210或SEQ ID NO:582至584(参见实施例部分中的表3中列出的基序序列)。
42.根据实施方案1-36所述的寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列包含选自由以下组成的组的序列，或者由其组成：SEQ ID NO:236、237、238、239、240和590(参见实施例部分中的表3中列出的基序序列)。
43.根据实施方案1-36所述的寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列包含选自由以下组成的组的序列，或者由其组成：SEQ ID NO:221至225或SEQ ID NO:585至589(参见实施例部分中的表3中列出的基序序列)。
44.根据实施方案1-36所述的寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列包含选自由以下组成的组的序列，或者由其组成：SEQ ID NO:241或591(参见实施例部分中的表3中列出的基序序列)。
45.根据实施方案1-36所述的寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列包含选自由以下组成的组的序列，或者由其组成：SEQ ID NO:46-48、285至305或SEQ ID NO:613至632或SEQ ID NO:721至807(参见实施例部分中的表3中列出的基序序列)。
46.根据实施方案1-36所述的寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列包含选自由以下组成的组的序列，或者由其组成：SEQ ID NO:331、332、638、639、640、808、809、810、811、812、813、814和815(参见实施例部分中的表3中列出的基序序列)。
47.根据实施方案1-36所述的寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列包含选自由以下组成的组的序列，或者由其组成：SEQ ID NO:409至411或SEQ ID NO:642至646或SEQ IDNO:816至818(参见实施例部分中的表3中列出的基序序列)。
48.根据实施方案1-47所述的寡核苷酸，其中相比于所述连续核苷酸序列与之互补的靶核酸，所述连续核苷酸序列具有零至三个错配。
49.根据实施方案48所述的寡核苷酸，其中相比于所述靶核酸，所述连续核苷酸序列具有一个错配。
50.根据实施方案48所述的寡核苷酸，其中相比于所述靶核酸，所述连续核苷酸序列具有两个错配。
51.根据实施方案48所述的寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列与所述靶核酸序列完全互补。
52.根据实施方案1-51所述的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含一个或多个修饰的核苷。
53.根据实施方案52所述的寡核苷酸，其中所述一个或多个修饰的核苷是高亲和力修饰的核苷。
54.根据实施方案52或53所述的寡核苷酸，其中所述一个或多个修饰的核苷是2’糖修饰的核苷。
55.根据实施方案54所述的寡核苷酸，其中所述一个或多个2’糖修饰的核苷独立地选自由以下组成的组：2’-O-烷基-RNA、2’-O-甲基-RNA、2’-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧基乙基-RNA、2’-氨基-DNA、2’-氟-DNA、2’-氟-ANA和LNA核苷。
56.根据实施方案54所述的寡核苷酸，其中所述一个或多个修饰的核苷是LNA核苷。
57.根据实施方案56所述的寡核苷酸，其中所述修饰的LNA核苷是氧基-LNA。
58.根据实施方案57所述的寡核苷酸，其中所述修饰的核苷是β-D-氧基-LNA。
59.根据实施方案57所述的寡核苷酸，其中所述修饰的核苷是α-L-氧基-LNA。
60.根据实施方案56所述的寡核苷酸，其中所述修饰的LNA核苷是硫代-LNA。
61.根据实施方案56所述的寡核苷酸，其中所述修饰的LNA核苷是氨基-LNA。
62.根据实施方案56所述的寡核苷酸，其中所述修饰的LNA核苷是cET。
63.根据实施方案56所述的寡核苷酸，其中所述修饰的LNA核苷是ENA。
64.根据实施方案56所述的寡核苷酸，其中所述修饰的LNA核苷选自β-D-氧基-LNA、α-L-氧基-LNA、β-D-氨基-LNA、α-L-氨基-LNA、β-D-硫代-LNA、α-L-硫代-LNA、(S)cET、(R)cET、β-D-ENA和α-L-ENA。
65.根据实施方案1-64中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷间连接。
66.根据实施方案65所述的寡核苷酸，其中所述修饰的核苷间连接具有核酸酶抗性。
67.根据实施方案65或66所述的寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列内的所述核苷间连接中的至少50％是硫代磷酸酯核苷间连接或硼代磷酸酯核苷间连接。
68.根据实施方案65或66所述的寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列内的所有核苷间连接是硫代磷酸酯核苷间连接。
69.根据实施方案1-68所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸能够募集RNA酶H。
70.根据实施方案69所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是间隔聚体。
71.根据实施方案69或70所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是式5’-F-G-F’-3’的间隔聚体，其中区域F和F’独立地包含1-7个修饰的核苷或由其组成，并且G是能够募集RNA酶H的6至16个核苷的区域。
72.根据实施方案71所述的寡核苷酸，其中所述修饰的核苷是2’糖修饰的核苷，所述2’糖修饰的核苷独立地选自由以下组成的组：2’-O-烷基-RNA、2’-O-甲基-RNA、2’-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧基乙基-RNA、2’-氨基-DNA、2’-氟-DNA、阿糖基核酸(ANA)、2’-氟-ANA和LNA核苷。
73.根据实施方案71或72所述的寡核苷酸，其中区域F和F’中修饰的核苷中的一个或多个是LNA核苷。
74.根据实施方案73所述的寡核苷酸，其中区域F和F’中所有修饰的核苷都是LNA核苷。
75.根据实施方案74所述的寡核苷酸，其中区域F和F’由LNA核苷组成。
76.根据实施方案73-75所述的寡核苷酸，其中区域F和F’中所有修饰的核苷都是氧基-LNA核苷。
77.根据实施方案73所述的寡核苷酸，其中区域F和F’中的至少一个还包含至少一个2’取代的修饰的核苷，所述2’取代的修饰的核苷独立地选自由以下组成的组：2’-O-烷基-RNA、2’-O-甲基-RNA、2’-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧基乙基-RNA、2’-氨基-DNA和2’-氟-DNA。
78.根据实施方案73-77所述的寡核苷酸，其中区域G中募集RNA酶H的核苷独立地选自DNA、α-L-LNA、C4’烷基化的DNA、ANA和2’F-ANA以及UNA。
79.根据实施方案78所述的寡核苷酸，其中区域G中的所述核苷是DNA和/或α-L-LNA核苷。
80.根据实施方案78或79所述的寡核苷酸，其中区域G由至少75％DNA核苷组成。
81.根据实施方案1-80所述的寡核苷酸，其中与对照相比，所述寡核苷酸能够使UBE3A的表达增加至少30％。
82.根据实施方案1-81所述的寡核苷酸，其中与对照相比，SNORD109B下游的SNHG14转录物的水平降低至少20％。
83.根据实施方案1-82所述的寡核苷酸，其中与对照相比，SNORD115的表达未受到显著影响。
84.根据实施方案1-83所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸选自CMPID NO:4_1至678_1。
85.根据实施方案1-83所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸选自由以下组成的组：CMP ID NO:4_1，4_2，5_1，5_2，6_1，6_2,7_1,7_2,8_1,9_1,10_1,11_1,11_2,12_1,12_2,13_1,13_2,14_1,15_1,16_1,17_1,17_2,18_1,18_2,19_1,19_2,20_1,21_1,22_1,23_1,23_2,24_1,25_1，26_1,26_2,27_1,28_1,28_2,29_1,29_2,30_1,31_1,31_2,32_1,33_1,34_1,34_2,34_3,34_4,34_5,34_6,34_7,35_1,35_2,36_1,37_1,38_1,38_2,38_3,38_4,38_5,38_6,39_1,39_2,39_3,39_4,39_5,40_1,40_2,40_3,40_4,40_5,40_6,40_7，40_8，41_1，42_1，43_1,44_1,44_2,45_1,45_2,46_1,47_1,48_1,48_2,48_3,48_4,48_5,48_6,48_7,49_1,50_1,51_1,52_1,53_1,53_2,54_1,54_2,54_3,55_1,55_2,56_1,57_1,58_1,58_2,58_3,59_1,59_2,60_1,60_2,60_3,61_1，62_1，63_1,64_1,64_2,65_1,66_1,67_1,68_1，69_1,69_2,69_3,70_1,70_2,70_3,71_1,72_1,72_2,73_1,73_2,73_3,74_1,74_2,75_1,75_2,76_1,77_1，77_2,77_3,78_1，79_1,79_2,79_3,80_1,80_2,80_3,81_1,82_1,82_2,83_1,83_2,84_1,84_2,85_1,85_2,86_1,87_1,88_1,88_2,89_1,90_1,91_1,92_1,93_1,94_1,95_1,95_2,96_1,96_2,96_3,97_1,97_2，97_3，97_4，98_1,98_2,98_3,99_1,99_2,99_3,99_4,100_1,100_2,100_3,101_1,101_2,101_3,101_4，102_1,102_2,102_3,102_4,103_1,103_2,103_3,103_4,104_1,104_2,104_3,105_1，105_2，105_3，105_4，106_1，106_2，106_3,106_4,107_1,107_2,107_3,107_4,108_1,108_2,108_3,108_4,109_1,109_2,109_3,109_4,110_1,110_2,111_1,111_2,111_3,112_1,112_2,113_1,114_1,115_1,116_1,117_1,118_1,119_1,120_1,120_2,121_1,122_1,123_1,124_1,125_1,126_1,126_2,127_1,128_1,128_2,128_3,128_4,129_1,129_2,130_1,131_1,132_1,132_2,132_3,133_1,133_2,133_3,133_4,134_1,134_2,135_1,135_2,136_1,137_1,138_1,139_1,140_1,141_1,142_1,143_1,144_1,145_1,145_2,146_1,146_2,147_1,148_1,149_1,150_1,150_2,151_1,152_1,153_1,154_1,155_1,156_1,157_1,158_1,159_1,160_1,161_1,162_1,163_1,164_1,165_1,166_1,167_1,168_1,169_1,169_10,169_11,169_12,169_13,169_14,169_15,169_16,169_17,169_18,169_19,169_2,169_20,169_21,169_22,169_23,169_24,169_25,169_26,169_27,169_28,169_29,169_3,169_30,169_31,169_32,169_33,169_34,169_35,169_36,169_37,169_38,169_39,169_4,169_40,169_41,169_42,169_43,169_44,169_45,169_46,169_47,169_48,169_49,169_5,169_50,169_51,169_52,169_53,169_54,169_55,169_56,169_57,169_6,169_7,169_8,169_9,169_58,169_59,169_60,169_61,169_62,170_1,171_1,172_1,173_1,174_1,175_1,176_1,177_1,178_1,179_1,180_1,181_1,182_1,183_1,184_1,185_1,186_1,187_1,188_1,189_1,190_1,191_1,192_1,193_1,194_1,195_1,196_1,197_1,198_1,199_1,200_1,201_1,202_1,203_1,204_1,205_1,206_1,207_1,208_1,208_2,208_3,208_4,208_5,208_6,208_7,209_1,209_10,209_2,209_3,209_4,209_5,209_6,209_7,209_8,209_9,210_1,211_1,212_1,213_1,214_1,215_1,216_1,217_1,218_1,219_1,220_1,221_1,222_1,223_1,224_1,225_1,226_1,227_1,228_1,229_1,230_1,231_1,232_1,233_1,234_1,235_1,236_1,236_10,236_11,236_12,236_13,236_14,236_15,236_16,236_2,236_3,236_4,236_5,236_6,236_7,236_8,236_9,236_17,236_18,236_19,236_20,236_21,237_1,237_10,237_11,237_12,237_13,237_14,237_15,237_16,237_2,237_3,237_4,237_5,237_6,237_7,237_8,237_9,237_17,237_18,237_19,237_20,237_21,238_1,239_1,239_10,239_11,239_12,239_13,239_14,239_15,239_16,239_2,239_3,239_4,239_5,239_6,239_7,239_8,239_9,239_17,239_18,239_19,239_20,239_21,240_1,241_1,241_10,241_2,241_3,241_4,241_5,241_6,241_7,241_8,241_9,241_11,241_12,241_13,241_14,241_15,242_1,243_1,244_1,244_2,244_3,244_4,244_5,245_1,246_1,247_1,248_1,249_1,250_1,251_1,252_1,253_1,254_1,255_1,256_1,257_1,258_1,259_1,260_1,261_1,262_1,263_1,264_1,265_1,266_1,267_1,268_1,269_1,270_1,271_1,272_1,273_1,274_1,275_1,276_1,277_1,278_1,279_1,280_1,281_1,282_1,283_1,284_1,285_1,285_2,285_3,285_4,285_5,285_6,285_7,285_8,285_9,285_10,285_11,286_1,287_1,288_1,289_1,290_1,291_1,292_1,293_1,294_1,295_1,296_1,297_1,298_1,299_1,300_1,301_1,302_1,303_1,304_1,304_10,304_2,304_3,304_4,304_5,304_6,304_7,304_8,304_9,304_11,304_12,304_13,304_14,304_15,305_1,306_1,307_1,308_1,309_1,310_1,311_1,312_1,313_1,314_1,315_1,316_1,317_1,318_1,319_1,320_1,321_1,322_1,323_1,324_1,325_1,326_1,327_1,328_1,329_1,330_1,331_1,332_1,333_1,334_1,335_1,336_1,337_1,338_1,339_1,340_1,341_1,342_1,343_1,344_1,345_1,346_1,347_1,348_1,349_1,350_1,351_1,352_1,353_1,354_1,355_1,356_1,357_1,358_1,359_1,360_1,361_1,361_10,361_2,361_3,361_4,361_5,361_6,361_7,361_8,361_9,362_1,362_10,362_2,362_3,362_4,362_5,362_6,362_7,362_8,362_9,363_1,364_1,365_1,366_1,367_1,368_1,369_1,370_1,371_1,372_1,373_1,374_1,375_1,376_1,377_1,378_1,379_1,380_1,381_1,382_1,383_1,384_1,385_1,386_1,387_1,388_1,389_1,390_1,391_1,392_1,393_1,394_1,395_1,396_1,397_1,398_1,399_1,400_1,401_1,402_1,403_1,404_1,405_1,406_1,407_1,408_1,409_1,410_1,411_1,412_1,413_1,414_1,415_1,416_1,417_1,418_1,419_1,420_1,421_1,422_1,423_1,424_1,425_1,425_10,425_2,425_3,425_4,425_5,425_6,425_7,425_8,425_9,426_1,427_1,428_1,429_1,430_1,431_1,432_1,433_1,434_1,435_1,436_1,437_1,438_1,439_1,440_1,441_1,442_1,443_1,444_1,445_1,446_1,447_1,448_1,449_1,450_1,451_1,452_1,453_1,454_1,455_1,456_1,457_1,458_1,459_1,460_1,461_1,462_1,463_1,464_1,465_1,466_1,467_1,468_1,469_1,470_1,471_1,472_1,473_1,474_1,475_1,476_1,477_1,478_1,479_1,480_1,481_1,482_1,483_1,484_1,485_1,486_1,487_1,488_1,489_1,490_1,491_1,492_1,493_1,494_1,495_1,496_1,497_1,498_1,499_1,500_1,501_1,502_1,503_1,504_1,505_1,506_1,507_1,508_1,509_1,510_1,5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646_10,646_11,646_12,646_13,646_14,646_15,646_16,646_17,646_18,646_19,646_2,646_3,646_4,646_5,646_6,646_7,646_8,646_9,646_20,646_21,646_22,646_23,646_24,647_1,648_1,649_1,650_1,651_1,652_1,653_1,654_1,655_1,656_1,657_1,658_1,659_1,660_1,661_1,662_1,663_1,664_1,665_1,666_1,667_1,668_1,669_1,670_1,671_1,672_1,673_1,674_1,675_1,676_1,677_1,678_1,679_1,679_2,679_3,679_4,679_5,680_1,680_2,680_3,680_4,680_5,681_1,681_2,681_3,681_4,681_5,682_1,682_2,682_3,682_4,682_5,683_1,683_2,683_3,683_4,683_5,684_1,684_2,684_3,684_4,684_5,685_1,685_2,685_3,685_4,685_5,686_1,686_2,686_3,686_4,686_5,687_1,687_2,687_3,687_4,687_5,688_1,688_2,688_3,688_4,688_5,689_1,689_2,689_3,689_4,689_5,690_1,690_2,690_3,690_4,690_5,691_1,691_2,692_1,692_2,692_3,692_4,692_5,693_1,693_2,693_3,693_4,693_5,694_1,694_2,694_3,694_4,694_5,695_1,695_2,695_3,695_4,695_5,696_1,696_2,696_3,696_4,696_5,697_1,697_2,697_3,697_4,697_5,698_1,698_2,698_3,698_4,698_5,699_1,699_2,699_3,699_4,699_5,700_1,700_2,700_3,700_4,700_5,701_1,701_2,701_3,701_4,701_5,702_1,702_2,702_3,702_4,702_5,703_1,703_2,703_3,703_4,703_5,704_1,704_2,704_3,704_4,704_5,705_1,705_2,705_3,705_4,705_5,706_1,706_2,706_3,706_4,706_5,707_1,707_2,707_3,707_4,707_5,708_1,708_2,708_3,708_4,708_5,709_1,709_2,709_3,709_4,709_5,710_1,710_2,710_3,710_4,710_5,711_1,711_2,711_3,711_4,711_5,712_1,712_2,712_3,712_4,712_5,713_1,713_2,713_3,713_4,713_5,714_1,714_2,714_3,714_4,714_5,715_1,715_2,715_3,715_4,715_5,716_1,716_2,716_3,716_4,716_5,717_1,717_2,717_3,717_4,717_5,718_1,718_2,719_1,719_2,719_3,719_4,719_5,720_1,720_2,720_3,720_4,720_5,721_1,721_2,721_3,721_4,721_5,722_1,722_2,722_3,722_4,722_5,723_1,723_2,723_3,723_4,723_5,724_1,724_2,724_3,724_4,724_5,725_1,725_2,725_3,725_4,725_5,726_1,726_2,726_3,726_4,726_5,727_1,727_2,727_3,727_4,727_5,728_1,728_2,728_3,728_4,728_5,729_1,729_2,729_3,729_4,729_5,730_1,730_2,730_3,730_4,730_5,731_1,731_2,731_3,731_4,731_5,732_1,732_2,732_3,732_4,732_5,733_1,733_2,733_3,733_4,733_5,734_1,734_2,734_3,734_4,734_5,735_1,735_2,735_3,__________735_4,735_5,736_1,736_2,736_3,736_4,736_5,737_1,737_2,737_3,737_4,737_5,738_1,738_2,738_3,738_4,738_5,738_6,739_1,739_2,739_3,739_4,739_5,740_1,740_2,740_3,740_4,740_5,741_1,741_2,741_3,741_4,741_5,742_1,742_2,742_3,743_1,743_2,743_3,743_4,743_5，744_1，744_2,744_3,744_4,744_5，745_1，745_2，745_3，745_4，745_5，746_1，746_2，746_3，747_1，747_2，747_3,747_4，747_5,748_1,748_2,748_3,748_4,748_5,749_1,749_2,749_3,749_4,749_5,750_1,750_2,750_3,750_4,751_1,751_2，751_3,751_4,751_5,752_1,752_2,752_3,752_4,752_5,753_1,753_2,753_3,753_4,753_5,754_1,754_2,754_3,754_4,754_5,755_1,755_2,755_3,755_4,755_5,756_1,756_2,756_3,756_4,756_5,757_1,757_2,757_3,757_4,757_5,758_1,758_2,758_3,758_4，758_5，759_1，759_2，759_3，759_4，759_5，760_1，760_2，760_3,760_4,760_5,761_1,761_2,761_3,761_4,761_5,762_1,762_2,762_3,762_4,762_5,763_1,763_2,763_3,763_4,763_5,764_1,764_2,764_3,764_4,764_5,765_1,765_2,765_3,765_4,765_5,766_1,766_2,766_3,766_4,766_5,767_1,767_2,767_3,767_4,767_5,768_1,768_2,768_3,768_4,768_5,769_1,769_2,769_3,769_4,769_5,770_1,770_2,770_3,770_4,770_5,771_1,771_2,771_3,771_4,771_5,772_1,772_2,772_3,772_4,772_5,773_1,773_2,773_3,773_4,773_5,774_1,774_2,774_3,774_4,774_5,775_1,775_2,775_3,775_4,775_5,776_1,776_2,776_3,776_4,776_5,777_1,777_2,777_3,777_4,777_5,778_1,778_2,778_3,778_4,778_5,779_1,779_2,779_3,779_4,779_5,780_1,780_2,780_3，780_4，780_5,781_1,782_1,782_2,782_3,782_4,782_5,783_1,783_2,783_3,783_4，783_5，784_1,784_2，784_3，784_4，784_5,785_1,786_1,786_2,786_3,786_4,786_5,787_1,787_2,787_3,787_4,787_5,788_1,788_2,788_3,788_4,788_5,789_1,789_2,789_3,789_4,789_5,790_1,790_2,790_3,790_4,790_5,791_1,791_2,791_3,791_4,791_5,792_1,792_2,792_3,792_4,792_5,793_1,793_2,793_3,793_4,793_5，794_1,794_2,794_3,794_4,794_5，795_1,795_2,795_3,795_4,795_5，796_1,796_2,796_3,796_4,796_5,797_1,797_2,797_3,797_4,797_5,798_1,798_2,798_3,798_4,798_5,799_1,799_2,799_3,799_4,799_5,800_1,800_2,800_3,800_4,800_5,801_1,801_2,801_3,801_4,801_5,802_1,802_2,802_3,802_4,802_5,803_1,803_2,803_3,803_4,803_5,804_1,804_2,804_3,804_4,804_5,805_1,805_2,805_3,805_4,805_5,806_1,806_2,806_3,806_4,806_5,807_1,807_2,807_3,807_4,807_5,808_1,808_2,808_3,808_4,808_5,809_1，809_2,809_3,809_4,809_5,810_1,810_2,810_3,810_4,810_5,811_1,811_2,811_3,811_4,811_5,812_1,812_2,812_3，812_4，812_5，813_1，813_2,813_3，813_4，813_5，814_1,814_2,814_3,814_4,814_5,815_1,815_2,815_3,815_4,815_5,816_1,816_2,816_3,816_4,816_5,816_6,817_1和818_1。
86.根据实施方案85所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸选自CMP-ID-NO:155_1或165_1。
87.根据实施方案85所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸选自由以下组成的组：CMP-ID-NO 169_52、169_50或169_56。
88.根据实施方案85所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸选自由以下组成的组：CMP-ID-NO:172_1、272_1、572_7、572_6或572_5。
89.根据实施方案85所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸选自CMP-ID-NO:175_1。
90.根据实施方案85所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸选自CMP-ID-NO:178_1。
91.根据实施方案85所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸选自CMP-ID-NO:573_8、186_1或187_1。
92.根据实施方案85所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸选自CMP-ID-NO:186_1。
93.根据实施方案85所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸选自由以下组成的组：CMP-ID-NO:200_1、204_1、206_1、35_2或209_1。
94.根据实施方案85所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸选自由以下组成的组：CMP-ID-NO:585_1、585_8、586_9、586_5、586_8、586_4或586_6。
95.根据实施方案85所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸选自CMP-ID-NO:233_1。
96.根据实施方案85所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸选自CMP-ID-NO:237_8或590_13。
97.根据实施方案85所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸选自CMP-ID-NO:220_1。
98.根据实施方案85所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸选自由以下组成的组：CMP-ID-NO:591_1、592_2、592_4或241_9。
99.根据实施方案85所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸选自由以下组成的组：CMP-ID-NO:597_4、598_4、39_1或602_1。
100.根据实施方案85所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸选自CMP-ID-NO:39_1。
101.根据实施方案85所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸选自CMP-ID-NO:611_7。
102.根据实施方案85所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸选自由以下组成的组：CMP-ID-NO:271_1或278_1。
103.根据实施方案85所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸选自由以下组成的组：CMP-ID-NO:616_4、621_2、621_1、622_3、622_5、622_4、624_3、624_5、287_1、625_6、626_7、626_8、626_9、48_1、631_6、631_1、303_1、304_6或304_10。
104.根据实施方案85所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸选自CMP-ID-NO:636_8。
105.根据实施方案85所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸选自由以下组成的组：CMP-ID-NO:638_8、639_5、331_1或640_4。
106.根据实施方案85所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸选自由以下组成的组：CMP-ID-NO:359_1、361_1、361_5、362_1或641_5。
107.根据实施方案85所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸选自由以下组成的组：CMP-ID-NO:378_1、379_1或399_1。
108.根据实施方案85所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸选自由以下组成的组：CMP-ID-NO:403_1、405_1、642_12、642_13、644_3或646_16。
109.根据实施方案85所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸选自CMP-ID-NO:85_1或425_5。
110.根据实施方案85所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸选自CMP-ID-NO:116_1。
111.根据实施方案85所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸选自CMP-ID-NO:123_1或124_1。
112.根据实施方案85所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸选自CMP-ID-NO:126_2。
113.一种缀合物，所述缀合物包含根据权利要求1-112中任一项所述的寡核苷酸以及与所述寡核苷酸共价连接的至少一个缀合物部分。
114.根据实施方案113所述的寡核苷酸缀合物，其中所述缀合物部分选自碳水化合物、细胞表面受体配体、药物物质、激素、亲脂性物质、聚合物、蛋白质、肽、毒素、维生素、病毒蛋白或其组合。
115.根据实施方案113或114所述的寡核苷酸缀合物，其中所述缀合物部分是抗体或抗体片段。
116.根据实施方案115所述的寡核苷酸缀合物，其中所述抗体或抗体片段对转铁蛋白受体具有亲和力。
117.根据实施方案113-115所述的寡核苷酸缀合物，所述缀合物包含位于所述寡核苷酸与所述缀合物部分之间的接头。
118.根据实施方案117所述的寡核苷酸缀合物，其中所述接头是生理学上不稳定的接头。
119.根据实施方案118所述的寡核苷酸缀合物，其中所述生理学上不稳定的接头是核酸酶敏感的接头。
120.根据实施方案118或119所述的寡核苷酸缀合物，其中所述寡核苷酸具有式D-F-G-F’或F-G-F’-D’，其中F、F’和G是如实施方案73-80中所定义的，并且D或D’包含具有核苷间连接的1、2或3个DNA核苷。
121.根据实施方案113-120所述的寡核苷酸缀合物，其中与未缀合的寡核苷酸相比，展现出改善的缀合物寡核苷酸到脑中的摄取。
122.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据实施方案1-112所述的寡核苷酸或根据实施方案113-121所述的缀合物，以及药用稀释剂、载体、盐和/或辅剂。
123.一种用于制备根据实施方案1-112所述的寡核苷酸的方法，所述方法包括使核苷酸单元反应，由此形成包含在所述寡核苷酸中的共价连接的连续核苷酸单元。
124.根据实施方案123所述的方法，所述方法还包括使所述连续核苷酸序列与非核苷酸缀合部分反应。
125.一种用于制备根据实施方案122所述的组合物的方法，所述方法包括将所述寡核苷酸与药用稀释剂、载体、盐和/或辅剂混合。
126.一种用于诱导其中父本UBE3A的表达被抑制的靶细胞中的UBE3A表达的体内或体外方法，所述方法包括将根据实施方案1-112中任一项所述的寡核苷酸或根据实施方案113-121所述的缀合物或根据实施方案122所述的药物组合物以有效量施用至所述细胞。
127.根据实施方案126所述的寡核苷酸，其中与对照相比，UBE3A的表达增加至少40％。
128.根据实施方案126或127所述的方法，其中与对照相比，SNORD109B下游的SNHG14转录物的水平降低至少30％。
129.根据实施方案126-128所述的方法，其中所述靶细胞是神经元细胞。
130.根据实施方案126-129所述的方法，其中与对照相比，SNORD115的表达未受到显著影响。
131.一种用于治疗或预防疾病的方法，所述方法包括将治疗或预防有效量的根据实施方案1-112所述的寡核苷酸、或根据实施方案113-121所述的缀合物、或根据实施方案122所述的药物组合物施用至患有或易患所述疾病的受试者。
132.根据实施方案1-112所述的寡核苷酸、或根据实施方案113-121所述的缀合物、或根据实施方案122所述的药物组合物，其用于用作治疗或预防受试者中的疾病的药物。
133.根据实施方案1-112所述的寡核苷酸或根据实施方案113-121所述的缀合物用于制备药物的用途，所述药物用于治疗或预防受试者中的疾病。
134.根据实施方案131-133所述的方法、寡核苷酸或用途，其中所述疾病与UBE3A的体内活性相关。
135.根据实施方案131-134所述的方法、寡核苷酸或用途，其中所述疾病与神经元细胞中UBE3A表达降低和/或UBE3A活性降低相关。
136.根据实施方案135所述的方法、寡核苷酸或用途，其中UBE3A表达降低和/或UBE3A活性降低是由UBE3A基因的母本等位基因中的突变引起的。
137.根据实施方案134-136所述的方法、寡核苷酸或用途，其中与不使用根据实施方案1-112所述的寡核苷酸或根据实施方案113-121所述的缀合物或根据实施方案122所述的药物组合物的表达相比，UBE3A表达增加至少30％、或至少50％、或至少70％、或至少90％、或至少100％、或至少150％、或至少200％。
138.根据实施方案131-137所述的方法、寡核苷酸或用途，其中所述疾病是安吉尔曼综合征。
139.根据实施方案131-138所述的方法、寡核苷酸或用途，其中所述受试者是哺乳动物。
140.根据实施方案139所述的方法、寡核苷酸或用途，其中所述哺乳动物是人。
141.根据实施方案139或140所述的方法、寡核苷酸或用途，其中所述受试者是婴儿或青少年。
实施例
材料与方法
表3：与SEQ ID NO:1互补的寡核苷酸或连续核碱基序列(由SEQ ID NO表示的基序序列)、由这些制造的寡核苷酸设计以及基于基序序列设计的具体寡核苷酸化合物(由CMPID NO表示)的列表。
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Figure BDA0001658050150000991
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设计参考间隔聚体设计F-G-F’，其中每个数字代表连续的修饰的核苷(例如2’修饰的核苷)的数量(第一个数字＝5’侧翼)，随后是DNA核苷的数量(第二个数字＝间隔区域)，随后是修饰的核苷(例如2’修饰的核苷)的数量(第三个数字＝3’侧翼)，任选地在DNA和LNA的进一步重复区域之前或之后，其不必须是与靶核酸互补的连续序列的一部分。对于表3中的一些寡核苷酸，侧翼是混合侧翼，这种侧翼以2’修饰的核苷开始和结束，在这些情况下，间隙区域具有5以上的数量，不位于设计的5’或3’末端。
对于寡核苷酸化合物，大写字母代表β-D-氧基LNA核苷，小写字母代表DNA核苷，所有LNA C均为5-甲基胞嘧啶，并且5-甲基DNA胞嘧啶以“e”表示，所有核苷间连接均为硫代磷酸酯核苷间连接。
EX-EX指示为起始于SEQ ID NO：1的寡核苷酸是设计为跨越SNHG14-023(ENST00000554726)的外显子-外显子连接互补的外显子-外显子跨越寡核苷酸。寡核苷酸主要跨越外显子2和外显子3(即，与外显子2中的区域和外显子3中的区域互补)。
寡核苷酸合成
寡核苷酸合成通常是本领域已知的。下面是可以利用的方案。本发明的寡核苷酸可以通过在所使用的装置、载体(support)和浓度方面略微改变方法来生产。
以1-4μmol的规模在MerMade12或Oligomaker DNA/RNA合成仪上使用亚磷酰胺法在尿苷通用载体上合成寡核苷酸。在合成的终点，使用氨水在60℃将寡核苷酸从固体载体上切割5-16小时。将寡核苷酸通过反相HPLC(RP-HPLC)或通过固相萃取纯化并且通过UPLC进行表征，并且通过ESI-MS进一步确认分子量。
寡核苷酸的延伸：
通过使用0.1M的5’-O-DMT-保护的亚酰胺(amidite)在乙腈中和作为活化剂的DCI(4,5-二氰基咪唑)在乙腈中(0.25M)的溶液，进行β-氰基乙基-亚磷酰胺(DNA-A(Bz)、DNA-G(ibu)、DNA-C(Bz)、DNA-T、LNA-5-甲基-C(Bz)、LNA-A(Bz)、LNA-G(dmf)、LNA-T或氨基-C6接头)的偶联。对于最终的循环，可以使用具有所需修饰的亚磷酰胺，例如用于连接缀合物基团的C6接头或同样的缀合物基团。通过使用氢化苍耳烷(xanthane)(0.01M，在乙腈/吡啶9:1中)，进行用于引入硫代磷酸酯的硫醇化。使用在THF/吡啶/水7:2:1中的0.02M碘引入磷酸二酯连接。其余的试剂是典型地用于寡核苷酸合成的试剂。
借助RP-HPLC的纯化：
通过制备RP-HPLC在Phenomenex Jupiter C18 10μ150x10mm柱上将粗制化合物纯化。在5mL/分钟的流速下，使用0.1M乙酸铵pH 8和乙腈作为缓冲液。将收集的级分冻干以得到通常为白色固体的纯化的化合物。
缩写：
DCI：4,5-二氰基咪唑
DCM：二氯甲烷
DMF：二甲基甲酰胺
DMT：4,4’-二甲氧基三苯甲基
THF：四氢呋喃
Bz：苯甲酰基
Ibu：异丁酰基
RP-HPLC：反相高效液相色谱
Tm测定
将寡核苷酸和RNA靶标双链体在500ml无RNA酶水中稀释至3mM并且与500ml 2x Tm缓冲液(200mM NaCl，0.2mM EDTA，20mM磷酸钠，pH 7.0)混合。将溶液加热至95℃3分钟，并且之后允许其在室温退火30分钟。在配备有使用PE Templab软件(Perkin Elmer)的Peltier温度编程器PTP6的Lambda 40UV/VIS分光光度计上测量双链体解链温度(Tm)。将温度从20℃升高至95℃并且之后降至25℃，在260nm记录吸收。使用解链和退火二者的一阶导数和局部最大值来评价双链体Tm。
小鼠原代皮质神经元细胞培养物的制备
根据标准程序，从15日龄的小鼠胚胎大脑制备原代皮质神经元培养物。简言之，在室温用聚-L-赖氨酸(50μg/ml聚-L-赖氨酸，10mM四硼酸钠，pH8缓冲液)包被培养板2-3小时。使用前，用1×PBS洗涤平板。切下收获的小鼠胚胎大脑并用剃刀刀片均化，并且浸入38ml解剖介质(HBSS，0.01M Hepes，青霉素/链霉素)中。然后，加入2ml胰蛋白酶，并且将细胞在37℃温育30分钟并离心。将细胞溶解在20ml DMEM(+10％FBS)中并通过注射器进一步均化。随后将其以500rpm离心15分钟。将细胞溶解于DMEM(+10％FBS)中，并且接种于96孔板(0.1×10^6个细胞/孔，于100μl)中。神经元细胞培养物准备好用于在接种后直接使用。
筛选小鼠原代皮质神经元细胞培养物中的寡核苷酸
将细胞在96孔板中在生长培养基(Gibco Neurobasal培养基，B27补充物，Glutamax，青霉素-链霉素)中培养，并且以所需浓度与寡核苷酸温育3天。从细胞中分离总RNA，并且使用来自Quanta Bioscience(95134-500)的qScriptTMXLT One-Step RT-qPCR
Figure BDA0001658050150001831
Low ROXTM试剂盒通过qPCR分析测量敲低(knock-down)效力。使用来自Thermo Fisher Scientific的商业taqman测定来测量Ube3a_ATS(包括GAPDH用于标准化)。
人原代神经元细胞培养物的生成
任何所述时间点的任何细胞系在37℃、5％CO2和95％相对湿度下温育。
人诱导的多能干细胞(hiPSC)培养物
从诊断出安吉尔曼综合征的患者获得人全血样品。对于成红细胞，富集原代外周血单核细胞(PMCS)的后续培养物。通过用CytoTune-iPS Sendai重编程试剂盒(ThermoFisher Scientific)重编程成红细胞来生成患者特异性iPSC系。使用mTESR1(STEMCELLTechnologies)中的hESC合格的基质胶(Corning)(每日更换培养基)，将衍生的iPSC系维持在无饲养层条件下。达到会合时，使用温和细胞解离试剂(STEMCELL Technologies)将集落解离成大小为50-200μm的细胞簇，并且在10μM Y-27632(Calbiochem)的存在下以1:10–1:20的比例进行传代培养。
分化成神经祖细胞(NPC)
在诱导神经分化后，将iPSC衍生的细胞维持在基础培养基中，所述基础培养基由等体积的DMEM:F12Glutamax培养基和神经基础培养基(Gibco，Invitrogen)构成，补充有1xB27(Gibco,Invitrogen)、1x N2(Gibco,Invitrogen)、0.1mMβ-巯基乙醇(Gibco,Invitrogen)和所示补充物。
神经祖细胞(NPC)通过双重SMAD抑制并根据公布的程序(略作改变)而来源于hiPSC(Chambers等人2009Nat Biotechnol.Vol.3pp.275-80，Boissart等人,2013TranslPsychiatry.3:e294)。将HiPSC用Accutase(Innovative Cell Technologies Inc.)解离成单细胞悬浮液并重悬于进一步补充有10μM Y-27632(Calbiochem)、5ng/ml FGF(Peprotech)、10μM SB-431542(Calbiochem)和100nM LDN(Calbiochem)的基础培养基中。将单细胞悬浮液转移至AggreWell800平板(STEMCELL Technologies)，使得能够形成由8000个细胞组成的聚集体。5天后，将神经聚集体转移至用聚-L-鸟氨酸(Sigma)和层粘连蛋白(Roche)包被的平板上，并且允许在补充有FGF的基础培养基中在持续的双重SMAD抑制(SB-431542和LDN)下形成神经莲座(rosette)。使用STEMdiffTM神经莲座选择试剂(STEMCELL Technologies)选择性地分离神经莲座，将其重铺于包被有聚-L-鸟氨酸和层粘连蛋白521(BioLamina)的培养皿中，并且在补充有10ng/ml FGF(Peprotech)、10ng/ml EGF(RnD)和20ng/ml BDNF(Peprotech)的基础培养基中进行扩增。当达到会合时，用0.05％胰蛋白酶/EDTA(Gibco,Invitrogen)将细胞酶促解离，并且进行传代培养。在补充有FGF、EGF和BDNF的基础培养基中持续传代得到10至20代内的稳定神经祖细胞系(NPC系)。稳定的神经祖细胞系由其自我更新的能力和发育阶段特异性标记物Sox2和Nestin的表达来定义。在特定刺激下，NPC分化成神经元(MAP2+、Tau+、HuC/D+)和星形胶质细胞(GFAP+)后代(Dunkley等人,2015Proteomics Clin Appl.Vol.7-8pp.684-94)。
NPC培养
先前已经描述了NPC培养的条件并且将其在略作改变的情况下使用(Boissart等人,2013Transl Psychiatry.3:e294)。简言之，将细胞保持在包被有层粘连蛋白521(BioLamina)的培养皿中，并且在基本培养基中培养[由等体积的DMEM:F12Glutamax培养基和神经基础培养基(Gibco,Invitrogen)构成，补充有1x B27(Gibco,Invitrogen)、1x N2(Gibco,Invitrogen)、0.1mMβ-巯基乙醇(Gibco,Invitrogen)]并补充有10ng/ml FGF(Peprotech)、10ng/mlEGF(RnD)和20ng/ml BDNF(Peprotech)。
分化成神经元细胞培养物
为了诱导NPC的神经元分化，将细胞用0.05％胰蛋白酶/EDTA(Gibco,Invitrogen)解离成单细胞悬浮液，并且以12.000个细胞/cm2的密度接种于包被有层粘连蛋白521(BioLamina)的培养皿上，并且在补充有200ng/ml Shh(Peprotech)、100ng/ml FGF8(Peprotech)和100μM抗坏血酸磷酸酯(Sigma)的基础培养基中保持7天。随后，将细胞以45000个细胞/cm2的密度重铺于补充有20ng/ml BDNF(Peprotech)、10ng/ml GDNF(Peprotech)、0.5mM cAMP(BIOLOG Life Science)和100μM抗坏血酸磷酸酯(Sigma)的基础培养基中，并且分化21天。在分化的第21天，将分化的神经元培养物重新铺在筛选相容的平板格式上。通过将培养物用Accutase(Innovative Cell Technologies Inc.)解离成单细胞悬浮液来进行重铺。在10μM Y-27632(来自Calbiochem的细胞可渗透的、可逆的Rho激酶抑制剂)的存在下，将细胞以200.000个细胞/cm2的密度接种到384孔微量滴定板中，用于最终的寡核苷酸筛选测定。神经元培养物在补充有20ng/ml BDNF(Peprotech)、10ng/ml GDNF(Peprotech)、0.5mM cAMP(BIOLOG Life Science)和100μM抗坏血酸磷酸酯(Sigma)的基础培养基中进一步分化另外7天。分化培养基每周更换两次。在35天的总分化期后，神经元细胞培养物准备好用于寡核苷酸处理。
在人神经元细胞培养物中筛选寡核苷酸-384孔系统
为了筛选，将寡核苷酸储液用水预先稀释至指定浓度到384孔微量滴定板(化合物平板)中。平板布局充当治疗模板。将来自每个孔的2微升寡核苷酸稀释液从化合物平板转移到相应的培养板中。所有液体处理均在无菌条件下使用半自动实验室机器人系统(Beckmancoulter)在层流中完成。在不改变培养基的情况下，将神经元细胞培养物与寡核苷酸温育5天。随后，将神经元培养物裂解并用RealTime即用细胞裂解和RNA病毒Master试剂盒(Roche)进行qPCR测定。使用半自动实验室机器人系统(Beckmancoulter)进行液体处理。样品通过Lightcycler480实时PCR系统(Roche)进行分析。
使用以下引物和探针，通过qPCR监测UBE3A的转录物丰度来评价寡核苷酸的活性。
UBE3a-有义链：
正向引物：ATATGTGGAAGCCGGAATCT(SEQ ID NO:837)，
反向引物：TCCCAGAACTCCCTAATCAGAA(SEQ ID NO:838)，
用染料FAM标记的内部探针：
ATGACGGTGGCTATACCAGG(SEQ ID NO:839)
将RT-qPCR与作为管家基因用于标准化的PPIA(肽酰脯氨酰异构酶A)复用。PPIA引物和用染料VIC标记的探针购自Thermo Fisher Scientific(测定ID Hs99999904_m1)。每个平板包含作为阴性对照的非靶向寡核苷酸(模拟物)(TTGaataagtggaTGT(SEQ ID NO:846))和参考寡核苷酸CMP ID NO:41_1，其导致UBE3A mRNA的上调。
寡核苷酸的选择性通过计数器筛选位于15号染色体上的SNORD109B上游的SNORD115转录物来验证。使用以下引物和探针通过qPCR监测SNORD115的表达。
正向引物：GGGTCAATGATGAGAACCTTAT(SEQ ID NO:840)，
反向引物：GGGCCTCAGCGTAATCCTATT(SEQ ID NO:841)，
用染料FAM标记的内部探针：
TTCTGAAGAGAGGTGATGACTTAAAA(SEQ ID NO:842)。
进行寡核苷酸处理时，RT-qPCR与PPIA(Thermo Fisher Scientific)复用。
使用以下引物和探针，通过RT-qPCR测量SNORD109B下游的SNHG14转录物(也称为UBE3A抑制物)的减少。
正向引物：ATCCGAGGCATGAATCTCAC(SEQ ID NO:843)，
反向引物：CAGGCCAAAACCCTTGATAA(SEQ ID NO:844)，
用染料FAM标记的内部探针：
TTGCTGAGCATTTTTGCATC(SEQ ID NO:845)。
RT-qPCR与PPIA(Thermo Fisher Scientific)复用。
数据表示为相对于所有平板的模拟物的平均％表达并且归一化至参考寡核苷酸以解释板与板的变化。
在人神经元细胞培养物中筛选寡核苷酸-96孔系统
为了筛选，将寡核苷酸储液用水预先稀释至指定浓度到96孔微量滴定板(化合物平板)中。平板布局充当处理模板。将来自每个孔的2微升寡核苷酸稀释液从化合物平板转移到相应的培养板中。所有液体处理均在无菌条件下使用半自动实验室机器人系统(Beckman Coulter)在层流中完成。在不改变培养基的情况下，将神经元细胞培养物与寡核苷酸温育5天。随后，将神经元培养物裂解并且使用RNA纯化试剂盒Pure Link Pro96(12173011A)LifeTechnologies纯化RNA。使用半自动实验室机器人系统(Beckmancoulter)进行液体处理。Ube3a和Ube3a-ATS的qPCR分析使用来自Quanta(95134-50)的qScriptTMXLT 1-Step RT-qPCR ToughMix Low ROX在ViiATM7实时PCR系统Thermo FisherScientific上进行。
使用以下引物和探针：
qPCR UBE3a-有义链：
正向引物：ATATGTGGAAGCCGGAATCT(SEQ ID NO:697)，
反向引物：TCCCAGAACTCCCTAATCAGAA(SEQ ID NO:698)，
用染料FAM标记的内部探针：
ATGACGGTGGCTATACCAGG(SEQ ID NO:699)。
qPCR SNORD109B下游的SNHG14转录物(也称为UBE3A抑制物)：
可从ThermoFisher商购的引物和探针集：Hs01372957_m1。这些引物扩增了Genbank转录物AF400500.1中的87bp外显子-外显子跨越序列。
QPCR GAPDH转录物：
可从Thermofisher商购的引物和探针集：基因符号：具有以下测定细节：RefSeq：NM_002046.3，探针外显子位置：3，扩增子大小：122bp。对应的TaqMan测定ID：Hs99999905_m1。
对于Ube3a和Ube3a-ATS两者的RT-qPCR与作为管家基因用于标准化的GAPDH复用。每个平板包含作为阴性对照的非靶向寡核苷酸(模拟物)(TTGaataagtggaTGT(SEQ ID NO:846))和参考寡核苷酸CMP ID NO:21_1，其导致UBE3AmRNA的上调。此外，还包括一组寡核苷酸，其不靶向SNORD109B下游的Ub3a或SNHG14转录物(也称为UBE3A抑制物)，以监测测定噪音和检测假阳性的风险。这些随机分布在平板上。
对照寡核苷酸：
CGAaccactgaaCAA(SEQ ID NO:819)
CGAaccactgaacAAA(SEQ ID NO:820)
CGAagtgcacaCG(SEQ ID NO:821)
GCGtaaagagaGGT(SEQ ID NO:822)
GAGAaggcacagaCGG(SEQ ID NO:823)
GCGaagtgcacaCGG(SEQ ID NO:824)
GAGaaggcacagaCGG(SEQ ID NO:825)
CGAaccactgAACA(SEQ ID NO:826)
GAAccactgaacAAA(SEQ ID NO:827)
caGCGtaaagagaGG(SEQ ID NO:828)
GCgtaaagagAGG(SEQ ID NO:829)
CGAaccactgaAC(SEQ ID NO:830)
CGAAccactgaaCAAA(SEQ ID NO:831)
AGCgaagtgcacaCGG(SEQ ID NO:832)
AGGtgaagcgaAGTG(SEQ ID NO:833)
TAGTaaactgagCCA(SEQ ID NO:834)
AGAaggcacagaCGG(SEQ ID NO:835)
CCGcagtatggaTCG(SEQ ID NO:836)
实施例1-小鼠原代神经元细胞培养物中的寡核苷酸活性
对靶向与UBE3A前-mRNA反义的SNHG14长非编码RNA部分(SEQ ID NO:1的位置55319至141053)的寡核苷酸测试它们减少阻止UBE3A表达的SNHG14长非编码RNA转录物的能力(在数据表中也称为UBE3A抑制物或UBE3A-SUP)以及它们在小鼠原代皮质神经元细胞培养物中诱导UBE3AmRNA再表达的能力，如上文“材料和方法”部分中所描述的而获得的。寡核苷酸浓度为5μM。
根据在“材料和方法”部分中描述的用于筛选小鼠皮层神经元细胞培养物的方案，对寡核苷酸进行筛选。结果显示于表4中。
表4：原代小鼠神经元细胞培养物中的寡核苷酸活性
Figure BDA0001658050150001881
Figure BDA0001658050150001891
实施例2-人神经元细胞培养物中的寡核苷酸活性
在来源于患者的人神经元细胞培养物中测试靶向对应于15号染色体上位置25278410至25419462(SEQ ID NO:1)的SNORD109B下游区域中的人SNHG14的寡核苷酸(参见“材料与方法”部分中的方案)。对寡核苷酸减少SNORD109B下游区域中的SNHG14转录物(在数据表中也称为UBE3A抑制物或UBE3A-SUP)而不影响SNORD115表达的能力进行分析。此外，对诱导UBE3AmRNA再表达的能力进行分析。
根据在上述“材料和方法”部分中描述的用于筛选人神经元细胞培养物的方案，对寡核苷酸进行筛选。
结果显示于表5中。已经测量了所有化合物的UBE3AmRNA的表达，而对于所有化合物尚未分析UBE3A抑制物的敲低和SNORD1115水平的维持。
表5：来源于患者的人神经元细胞培养物中的寡核苷酸活性
Figure BDA0001658050150001901
Figure BDA0001658050150001911
Figure BDA0001658050150001921
Figure BDA0001658050150001931
Figure BDA0001658050150001941
Figure BDA0001658050150001951
与5微摩尔浓度的模拟寡核苷酸相比时，在测试的187种化合物中，约90％显示出UBE3A的再表达。相比于与UBE3A编码区互补的区域(重叠区域)，能够诱导UBE3A再表达的寡核苷酸的数量在SEQ ID NO:1的位置1至55318之间的区域(非重叠区域)中较高。图2绘制了相对于模拟物寡核苷酸，寡核苷酸根据它们在15号染色体上的位置的分布比上UBE3AmRNA表达。
对于已经测试了SNORD115的寡核苷酸，与1和5μM的模拟物相比，不存在显著的下调。
实施例3-靶向SNORD109B下游和与UBE3A前-mRNA反义的区域上游的区域中的SNHG14转录物的寡核苷酸的活性
在来源于患者的人神经元细胞培养物中测试靶向SEQ ID NO:1的位置4806-54939的寡核苷酸(参见“材料与方法”部分中的方案)。对寡核苷酸减少SNORD109B下游区域中的SNHG14转录物(在数据表中也称为UBE3A抑制物或UBE3A-SUP)的能力进行分析。此外，对诱导UBE3A mRNA再表达的能力进行分析。
根据在“材料和方法”-“在人神经元细胞培养物中筛选寡核苷酸-96孔系统”部分中描述的用于筛选人神经元细胞培养物的方案，对寡核苷酸进行筛选。
结果显示于表6中。
表6：来源于患者的人神经元细胞培养物中的寡核苷酸活性
Figure BDA0001658050150001961
Figure BDA0001658050150001971
Figure BDA0001658050150001981
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Figure BDA0001658050150002001
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Figure BDA0001658050150002071
Figure BDA0001658050150002081
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Figure BDA0001658050150002111
实施例4-靶向与UBE3A前-mRNA反义的区域中的SNHG14转录物的寡核苷酸的活性
在来源于患者的人神经元细胞培养物中测试靶向SEQ ID NO:1的位置55337-136214的寡核苷酸(参见“材料与方法”部分中的方案)。对寡核苷酸减少SNORD109B下游区域中的SNHG14转录物(在数据表中也称为UBE3A抑制物或UBE3A-SUP)的能力进行分析。此外，对诱导UBE3A mRNA再表达的能力进行分析。
根据在“材料和方法”-“在人神经元细胞培养物中筛选寡核苷酸-96孔系统”部分中描述的用于筛选人神经元细胞培养物的方案，对寡核苷酸进行筛选。
结果显示于表7中。
表7：来源于患者的人神经元细胞培养物中的寡核苷酸活性
Figure BDA0001658050150002121
Figure BDA0001658050150002131
Figure BDA0001658050150002141
Figure BDA0001658050150002151
Figure BDA0001658050150002161
Figure BDA0001658050150002171
实施例5-靶向SNORD109B下游和与UBE3A前-mRNA反义的区域上游的区域中的SNHG14转录物的寡核苷酸的活性
在来源于患者的人神经元细胞培养物中测试靶向SEQ ID NO:1的位置5224-51257的寡核苷酸(参见“材料与方法”部分中的方案)。对寡核苷酸减少SNORD109B下游区域中的SNHG14转录物(在数据表中也称为UBE3A抑制物或UBE3A-SUP)的能力进行分析。此外，对诱导UBE3A mRNA再表达的能力进行分析。
根据在“材料和方法”-“在人神经元细胞培养物中筛选寡核苷酸-96孔系统”部分中描述的用于筛选人神经元细胞培养物的方案(具有以下改变)，对寡核苷酸进行筛选。
UBE3a-有义链引物
使用可从ThermoFisher商购的引物和探针：Hs00166580_m1，扩增refseq ID NM_000462.3的位置838中的94bp序列。
每个平板包括PBS对照(代替非靶向寡核苷酸上)和阳性对照寡核苷酸CMP ID NO:271_1，其导致UBE3AmRNA的上调。不包括另外的对照寡核苷酸。
数据表示为相对于所有平板的PBS对照的平均％表达并且归一化至阳性对照寡核苷酸以在效力水平上处理板与板之间的变化。结果显示于表8中。
表8：来源于患者的人神经元细胞培养物中的寡核苷酸活性
Figure BDA0001658050150002181
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Figure BDA0001658050150002371
Figure BDA0001658050150002381
实施例6-外显子-外显子跨越寡核苷酸的活性
对设计为跨越SNHG14-023(ENST00000554726)的外显子-外显子连接互补的寡核苷酸，测试它们减少SNORD109B下游区域中的SNHG14转录物(在数据表中也称为UBE3A抑制物或UBE3A-SUP)的能力。此外，对诱导UBE3A mRNA再表达的能力进行分析。寡核苷酸主要跨越外显子2和外显子3(即，与外显子2中的区域和外显子3中的区域互补)。
根据实施例5部分中描述的用于筛选人神经元细胞培养物的方案，对寡核苷酸进行筛选。
结果显示于表9中。
表9：来源于患者的人神经元细胞培养物中的寡核苷酸活性
Figure BDA0001658050150002382
Figure BDA0001658050150002391
实施例7-测试所选择的寡核苷酸的体外功效和效力
基于上述实施例2至5中的筛选，选择52个寡核苷酸用于效力和功效测试。
如在材料和方法部分“在人神经元细胞培养物中筛选寡核苷酸-96孔系统”中所描述的(具有以下改变)，在来源于人AS患者的细胞中对寡核苷酸进行筛选。
对于UBE3a有义链引物，使用可从ThermoFisher商购的引物和探针：Hs00166580_m1，扩增refseq ID NM_000462.3的位置838中的94bp序列。
每个平板包括PBS对照(代替非靶向寡核苷酸上)，并且包括先前筛选中鉴定的阳性对照寡核苷酸CMP ID NO:186_1和39_1。不包括材料和方法部分中描述的另外的对照寡核苷酸。使用10点半对数稀释法，寡核苷酸测试浓度为31.6μM至1nM。在不同的5周中在5个独立的实验中测试所有寡核苷酸。在数据QC过程中，如果一些平板是明显的异常值(例如没有检测到PCR产物)，则将这些平板从分析中移除。在这种过滤后，每个报告值后至少有三个独立的实验。
在使用4参数S形剂量反应模型的曲线拟合后，确定EC50(UBE3A mRNA再表达)和IC50(SNORD109B下游区域中的SNHG14转录物(在数据表中也称为UBE3A抑制物或UBE3A-SUP)的减少)。使用IDBS(XLfit)的Biobook软件中可用的拟合机器执行拟合。从曲线拟合确定UBE3A的最大可获得的上调(UBE3A Max Up)和UBE3A-SUP的最大可获得的敲低(UBE3A-SUP max Kd)。两者均显示为对照(PBS处理的细胞)的％。结果显示于表10中，所述值报告为每个生物重复的几何平均值。
表10：寡核苷酸EC50和IC 50值和最大UBE3A上调和UBE3A抑制物敲低。
Figure BDA0001658050150002401
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Claims (10)

1.一种反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸是寡核苷酸化合物TTAcActtaattatactTCC，其中大写字母表示的核苷酸中的核苷是β-D-氧基LNA核苷，小写字母表示的核苷酸中的核苷是DNA核苷，全部的LNA修饰的C是5-甲基胞嘧啶，全部的核苷间连接是硫代磷酸酯核苷间连接。
2.一种药物组合物，所述药物组合物包含：根据权利要求1所述的反义寡核苷酸，以及药用稀释剂、溶剂、载体、盐和/或辅剂。
3.根据权利要求2所述的药物组合物，其中所述药用稀释剂包括磷酸盐缓冲液(PBS)。
4.根据权利要求2或3所述的药物组合物，其中所述盐是钠盐。
5.根据权利要求2或3所述的药物组合物，其中所述盐是钾盐。
6.一种用于诱导其中父本UBE3A的表达被抑制的靶细胞中的UBE3A表达的体外方法，所述方法包括将权利要求1所述的反义寡核苷酸或权利要求2-5任一项所述的药物组合物以有效量施用至所述细胞，其中所述靶细胞是神经元细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其中与对照相比，UBE3A的表达增加至少40％。
8.根据权利要求6所述的方法，其中与对照相比，SNORD109B下游的SNHG14转录物的水平降低至少30％。
9.根据权利要求6-8中任一项所述的方法，其中与对照相比，SNORD115的表达未受到显著影响。
10.根据权利要求1所述的反义寡核苷酸或根据权利要求2-5任一项所述的药物组合物用于制备药物的用途，所述药物用于治疗或预防安吉尔曼综合征。
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