CN107619886A - 一种提高ic‑rt‑pcr技术检测能力的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种提高IC‑RT‑PCR法检测RNA病毒检测能力的方法，属于免疫学检测技术领域和分子生物学技术领域。该方法通过对PCR管进行活性基团的修饰，使其能够高效吸附抗体和抗原等待测物，克服以往采用未经修饰PCR管存在吸附待测物能力弱的缺点，从而提高了检测方法的稳定性和灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及一种能够提高IC-RT-PCR技术检测RNA病毒能力的PCR管修饰方法，属于免疫学检测技术领域和分子生物学技术领域。
背景技术
免疫捕获-反转录-聚合酶链式反应（IC-RT-PCR）是利用抗病毒抗体特异吸附样品中的检测目标，再采用RT-PCR进行基因扩增。根据文献[1]所述，该技术具有简便、灵敏的优点，常用于RNA病毒、特别是植物RNA病毒的检测工作。
典型的IC-RT-PCR的检测方法如文献[2, 3]所描述，首先根据抗体效价（1:1000）用包被缓冲液稀释后，加入100 μL到灭菌的未修饰PCR管中，37℃孵育2 h或4 ℃过夜。加入200 μL的洗涤缓冲液（PBST），静置3 min后倒掉，重复洗PCR管3次，甩干溶液，置于冰上。取新鲜叶片，按1:5的稀释度用提取缓冲液研磨。4 ℃，10 000 r·min-1离心15 min。取100 μL上清液加入到上述PCR管中，37 ℃孵育2 h或4 ℃过夜。PBST洗管3次。进行RNA的释放：在上述管中加入20 μL释放缓冲液，65 ℃水浴10 min，置于冰上，从而得到样品中病毒RNA，用于进行常规的RT-PCR。
但是由于现有的IC-RT-PCR均采用未经处理的PCR管吸附抗体，主要通过PCR管和抗体间的疏水键进行结合，存在结合力弱、吸附量低等问题，导致检测重复性差、难于定量等问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高IC-RT-PCR检测技术能力的PCR管修饰方法。采用以下技术方案：通过硅烷化试剂对PCR管进行表面修饰，使其表面带有氨基、巯基、羧基、羟基或磷酸盐等基团，能够与抗体、抗原形成稳定的共价键，能够提高吸附抗体、抗原的能力，并且在后续洗涤过程中不易被冲洗损失，提高IC-RT-PCR的检测灵敏度和可靠性。
所述的硅烷化试剂包括但不限于氨基、巯基、羧基、羟基或磷酸盐基团的硅烷化试剂。
所述的修饰对象PCR管，其特征在于：包括但不限于PCR管、PCR联管、96孔PCR板、48孔PCR板、196孔PCR板、384孔PCR板和其它形式的PCR载体。
所述的PCR管修饰方法，其特征在于：采用0.1 μL-100 μL的0.01%-20% 硅烷溶液，加到PCR管，室温静置30 min-12 h进行修饰。
本发明的优点是：修饰的PCR管能够提高结合抗体的能力，避免洗涤过程中因pH值、盐浓度等变化导致抗体、抗原的脱落，提高检测灵敏度和重复性。再者，通过控制硅烷化试剂浓度可以控制PCR管吸附抗体和抗原的浓度，从而制备用于检测不同浓度梯度的PCR管，满足不同检测需求。不仅如此，使用修饰的PCR管还可以从低病毒浓度溶液中富集病毒粒体，可用于灌溉水、培养液等含低浓度病毒的样品的检测。
具体实施方式
本发明的目的对IC-RT-PCR检测方法使用的PCR管进行硅烷化修饰，提高PCR管吸附抗体、抗原的能力。通过修饰的PCR管具有更稳定的吸附能力，提高检测灵敏度、重复性和稳定性。
为了实现该目的，本发明的技术方案是：根据抗体含有的亲水基团，选择带有氨基、巯基、羧基、羟基或磷酸盐基团的硅烷化试剂，采用不同的浓度和体积添加到PCR管、PCR联管、96孔PCR板、48孔PCR板、196孔PCR板、384孔PCR板和其它形式的PCR载体中，室温静置30 min-12 h进行修饰，使其PCR载体带有氨基、巯基、羧基或羟基等亲水基团。检测步骤和检测条件同常规的IC-RT-PCR方法。
本发明包括的实验步骤
1）选用带有亲水基团的硅烷化试剂，优选带有氨基、巯基、羧基、羟基或磷酸盐的硅烷化试剂，使用无水乙醇、甲醇、正丁醇等合适溶剂进行配置。
2）PCR管于121 ℃进行湿热灭菌，80 ℃烘干。
3）将0.1 μL-100 μL的0.01%-20% 硅烷溶液，加到PCR管，室温静置30 min-12 h进行修饰。
4）用双蒸水反复重新5遍，80 ℃烘干，得到修饰后的PCR管，现用或密封保存。
5）抗体的吸附：根据病毒抗体使用浓度，用PBS稀释后，取1 ~100 μL抗体溶液加入到修饰后的PCR管，37℃孵育2 h或4 ℃过夜。加入200 μL的洗涤缓冲液（PBST），静置3 min后倒掉，重复洗PCR管3次，甩干溶液，置于冰上。
6）免疫捕获：取新鲜叶片，按1:5的稀释度用提取缓冲液研磨。4 ℃，10 000 r·min-1离心15 min。取100 μL上清液加入到上述PCR管中，37 ℃孵育2 h或4 ℃过夜。PBST洗管3次。
7）RNA的释放：在上述管中加入20 μL释放缓冲液，65 ℃水浴10 min，置于冰上，从而得到样品中病毒RNA，用于进行常规的RT-PCR。
实施实例一
本实施实例为氨基硅烷修饰PCR管为例，描述PCR的氨基修饰方法，并进一步比较使用常规PCR管和氨基修饰PCR管对检测结果的影响。说明本发明进行PCR管修饰的优点。
下述实施实例中所使用的方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施实例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
1 材料
1.1 主要实验设备与耗材
(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷和100 μL PCR管均为市场购买，抗体和RT-PCR试剂均为常规试剂。
2 方法
2.1 用无水乙醇配制0.1% (3-氨基丙基)三乙氧基硅烷。
2.2 PCR管于121 ℃进行湿热灭菌，80 ℃烘干。
2.3 将5 μL的0.1% (3-氨基丙基)三乙氧基硅烷溶液，加到PCR管，室温静置30min进行修饰。
4）用双蒸水反复重新5遍，80 ℃烘干，得到修饰后的PCR管，现用或密封保存。
5）抗体的吸附：根据病毒抗体使用浓度，用PBS稀释后，取5 μL抗体溶液加入到修饰后的PCR管，37℃孵育2 h。加入50 μL的洗涤缓冲液（PBST），静置3 min后倒掉，重复洗PCR管3次，甩干溶液，置于冰上。
6）免疫捕获：取新鲜叶片，按1:5的稀释度用提取缓冲液研磨。4 ℃，10 000 r·min-1离心15 min。取5 μL上清液加入到上述PCR管中，37 ℃孵育2 h。PBST洗管3次。
7）RNA的释放：在上述管中加入20 μL释放缓冲液，95 ℃水浴2 min，置于冰上，从而得到样品中病毒RNA，用于进行常规的RT-PCR。
3 结果
3.1 采用修饰PCR管进行IC-RT-PCR能够检测稀释200倍的携带建兰花叶病毒的阳性样品，而未修饰的PCR管的IC-RT-PCR检测到稀释10倍的阳性样品，说明检测灵敏度得到有效提高。
3.2采用修饰PCR管进行IC-RT-PCR检测从10个文心兰样品中检测建兰花叶病毒、3次实验的阳性率均为100%。采用未修饰的PCR进行3次的IC-RT-PCR检测，结果从10个样品中分别检测到7、8、7个阳性样品。由此可见，修饰PCR管提高了检测重复性。
实施实例二
本实施实例为氨基硅烷修饰PCR管为例，描述PCR的氨基修饰方法，并进一步比较使用常规PCR管和氨基修饰PCR管对检测结果的影响。说明本发明进行PCR管修饰的优点。
下述实施实例中所使用的方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施实例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
1 材料
1.1 主要实验设备与耗材
N,N-二乙基-3-氨丙基三甲氧基硅烷和100 μL PCR管均为市场购买，抗体和RT-PCR试剂均为常规试剂。
2 方法
2.1 用无水乙醇配制1% N,N-二乙基-3-氨丙基三甲氧基硅烷。
2.2 PCR管于121 ℃进行湿热灭菌，80 ℃烘干。
2.3 将1 μL的1% N,N-二乙基-3-氨丙基三甲氧基硅烷溶液，加到PCR管，室温静置30 min进行修饰。
4）用双蒸水反复重新5遍，80 ℃烘干，得到修饰后的PCR管，现用或密封保存。
5）抗体的吸附：根据病毒抗体使用浓度，用PBS稀释后，取5 μL抗体溶液加入到修饰后的PCR管，37℃孵育2 h。加入50 μL的洗涤缓冲液（PBST），静置3 min后倒掉，重复洗PCR管3次，甩干溶液，置于冰上。
6）免疫捕获：取新鲜叶片，按1:5的稀释度用提取缓冲液研磨。4 ℃，10 000 r·min-1离心15 min。取5 μL上清液加入到上述PCR管中，37 ℃孵育2 h。PBST洗管3次。
7）RNA的释放：在上述管中加入20 μL释放缓冲液，95 ℃水浴2 min，置于冰上，从而得到样品中病毒RNA，用于进行常规的RT-PCR。
3 结果
3.1 采用修饰PCR管进行IC-RT-PCR能够检测稀释500倍的携带番木瓜环斑病毒属的阳性样品，而未修饰的PCR管的IC-RT-PCR检测到稀释30倍的阳性样品，说明检测灵敏度得到有效提高。
3.2采用修饰PCR管进行IC-RT-PCR检测从10个番木瓜样品中检测建兰花叶病毒、3次实验的阳性率均为40%。采用未修饰的PCR进行3次的IC-RT-PCR检测，结果从10个样品中分别检测到1、0、3个阳性样品。由此可见，修饰PCR管提高了检测重复性。
由此可见，经修饰的PCR管能够提高结合抗体的能力，避免洗涤过程中因pH值、盐浓度等变化导致抗体、抗原的脱落，提高检测灵敏度和重复性。再者，通过控制硅烷化试剂浓度可以控制PCR管吸附抗体和抗原的浓度，从而制备用于检测不同浓度梯度的PCR管，满足不同检测需求。不仅如此，使用修饰的PCR管还可以从低病毒浓度溶液中富集病毒粒体，可用于灌溉水、培养液等含低浓度病毒的样品的检测。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
参考文献
[1]陈建军, 刘崇怀, 古勤生, 等. DAS-ELISA、RT-PCR和IC-RT-PCR检测葡萄卷叶病毒Ⅲ的比较研究[J]. 果树学报, 2003,20(3):173-177.
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[3]沈建国, 林双庆, 蔡伟, 等. TC/IC-RT-PCR检测黄瓜绿斑驳花叶病毒[J]. 福建农林大学学报：自然科学版, 2012,41(1):13-17.
Claims (4)
1.一种提高IC-RT-PCR技术检测能力的PCR管修饰方法，其特征在于：采用带有氨基、巯基、羧基、羟基或磷酸盐基团的硅烷化试剂对PCR管进行表面修饰，使PCR管能够吸附抗病毒抗体、病毒粒体。
2.根据权利要求1所述的硅烷化试剂，其特征在于：使用的硅烷化试剂为带有能够与抗体、病毒、或其他抗原蛋白结合基团的硅烷化试剂，包括但不限于氨基、巯基、羧基、羟基或磷酸盐基团的硅烷化试剂。
3.根据权利要求1所述的PCR管，其特征在于：修饰的PCR管，包括但不限于PCR管、PCR联管、96孔PCR板、48孔PCR板、196孔PCR板、384孔PCR板和其它形式的PCR载体。
4.根据权利要求1所述的PCR管修饰方法，其特征在于：采用0.1 μL-100 μL的0.01%-20% 硅烷溶液，加到PCR管，室温静置30 min-12 h进行修饰。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20180123 |
|
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