CN102539499B - 复合纳米修饰丝网印刷电极及检测伏马毒素b1的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种复合纳米修饰丝网印刷电极及检测伏马毒素B1的方法。所述丝网印刷电极的工作电极上涂覆有多壁碳纳米管-胶体金-壳聚糖混合物膜层。制备过程为：将多壁碳纳米管活化，制备胶体金，利用壳聚糖将多壁碳纳米管和胶体金混合均匀；将混合物涂覆在工作电极表面，37℃干燥成膜，即得。本发明检测伏马毒素B1的方法是鉴于待测样品若有FB1毒素，则与抗FB1抗体竞争结合，使与电极上的FB1-OVA结合的抗体量减少，并由此使电极上HRP-羊抗鼠二抗的量也减少，并影响电流变化值_ΔI；然后根据FB1标准品绘制的标准曲线来判定谷物检测样品中FB1的含量。本发明检测对象单一且针对性强，准确率高，灵敏度强。

Description

复合纳米修饰丝网印刷电极及检测伏马毒素B1的方法

技术领域

本发明属于检测技术领域，具体涉及一种用复合纳米材料(碳纳米管与胶体金)修饰的丝网印刷电极及检测伏马毒素B1的方法。

背景技术

伏马毒素B1(Fumonisin B1，FB1)是串珠镰刀菌在一定湿度和温度条件下繁殖所产生的次级代谢产物，在全世界范围内分布广泛。1988年，Gelderblom等首次从串珠镰刀菌培养液中分离出伏马毒素。伏马毒素能够对玉米及其制品造成污染，而且在以谷物为原料的一些产品中如面条、啤酒、调味品，甚至在芦笋中也检测到了伏马毒素。据报道，伏马毒素与马脑白质软化症，猪的肺水肿症候群，大鼠肝癌等疾病有关。除上述疾病外，在南非的特兰斯凯地区和中国林县地区研究发现，食用伏马毒素污染的玉米制品与人类食道癌相关。串珠镰刀菌产生的毒素已经被国际癌症研究会(InternationalAgency for Research on Cancer，IARC)划分到2B类--可能的人类致癌物。加入WTO之后，农产品及相关食品的国际贸易量日益增加，随之对进出口产品的生物安全性的要求也越来越高，为了保证这类产品的顺利上市和食用者的健康，出入境检疫、海关、生产企业、监督部门等部门迫切需要一种特异、快速、简便的伏马毒素检测方法。

电化学传感器是将感受的物理量、化学量等信息按一定规律转换成便于测量和传输的电信号的装置。它由固定化的生物敏感材料作为识别元件，经过理化换能器产生间断的或连续的信号，再由接受装置放大或直接收集处理。因为换能器产生的信号强度与被分析物浓度成比例，因此电化学传感器在一定程度上能精确定量被测物。

随着电化学检测方法的发展，利用纳米材料作为电极修饰物从而提高电子转移速度、放大检测信号、提高检测灵敏度，成为电化学传感器的重要领域。其中，多壁碳纳米管由于具有较大表面积、为电子转移提供良好通道、孔穴结构更能增强电子转移的特点，在电化学传感器的研究上广泛应用。而丝网印刷电极相比较普通玻碳电极而言，除了具有良好的电化学表现，还具有以下优势：1.三电极系统整合在体积较小的基板上；2.可抛弃式，无须再次研磨；3.可大量使用，利于大规模现场检测；4.可进行任意修饰，并保存较长时间。

关于伏马毒素的检测国内外已建立了多种方法。目前检测伏马毒素的方法主要为高效液相色谱法(HPLC)和酶联免疫吸附法(ELISA)。然而，由于伏马毒素本身既没有特异的紫外吸收基团，同时也没有荧光特性，但在一定条件下伏马毒素可同某些物质反应形成具有荧光的衍生物，因此荧光衍生剂和衍生方法的选择与HPLC检测伏马毒素的准确度和灵敏性有密切关系。此外该法需要对检测样品进行严格的预处理，还需要高效液相色谱仪等贵重仪器，同时要求有专业的操作人员，不利于现场常规检测使用。而ELISA方法虽然较HPLC简单，可以大批量检测，但是灵敏度有限，且不宜进行现场检测。本方法使用仪器体积小、重量轻，便于携带，适于现场检测，同时具有检测灵敏的特点。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术存在的不足，提供一种复合纳米材料修饰丝网印刷电极及检测伏马毒素B1的方法。本方法使用多壁碳纳米管/胶体金/壳聚糖混合物作为电极的修饰系统，利用了多壁碳纳米管由于具有较大表面积，能为电子转移提供良好通道、孔穴结构从而能增强电子转移的特点以及胶体金由于具有球体结构，在附着在多壁碳纳米管上后有增强电子转移的特点，实现了有效放大检测信号，从而提高了检测伏马毒素B1的灵敏度。

本发明是通过以下技术方案来实现的：

本发明涉及一种复合纳米修饰丝网印刷电极，所述丝网印刷电极的工作电极的工作区域涂覆有多壁碳纳米管-胶体金-壳聚糖混合物膜层。

优选的，所述胶体金为16～18nm。

本发明还涉及一种制备上述的复合纳米修饰丝网印刷电极的方法，包括如下步骤：

步骤一、将多壁碳纳米管活化，并制备胶体金，利用壳聚糖将多壁碳纳米管和胶体金混合均匀；

步骤二、将步骤一制得的混合物涂覆在丝网印刷电极的工作电极表面，37℃干燥成膜，即得。

优选的，步骤一中所述多壁碳纳米管活化方法具体为：5mg多壁碳纳米管溶于15ml体积比为1∶3的HNO₃和H₂SO₄混合而得的活化溶液中，超声30min后，9000rpm离心5min，去除上清后，加入超纯水洗涤，9000rpm离心5min，去除上清，合并残留物，60℃烘箱烘干，加入5ml水，配制成1mg/ml溶液，4℃贮存备用。

优选的，步骤一中所述胶体金的制备方法具体为：将100ml的HAuCl₄溶液加热至沸腾，之后加入1.2ml的柠檬酸三钠溶液，煮沸7～10min，最后加三蒸水至100ml，即得胶体金溶液；所述柠檬酸三钠溶液中柠檬酸三钠质量占溶液总体积的百分比为1％，所述HAuCl₄溶液中HAuCl₄质量占溶液总体积的百分比为0.01％。

优选的，步骤一中所述壳聚糖与多壁碳纳米管和胶体金的混合具体为：将体积比为1∶5∶5的多壁碳纳米管溶液、胶体金溶液和壳聚糖溶液混合，超声混匀；所述壳聚糖溶液中壳聚糖质量占溶液总体积的百分比为2％。

本发明还涉及一种用上述的复合纳米修饰丝网印刷电极检测伏马毒素B1的方法，包括如下步骤：

步骤一，将6μl FB1-OVA滴加在所述工作电极区域，37℃放置30min；使用0.01MPBST洗涤工作电极，晾干，滴加8μl BSA溶液，以封闭工作电极，37℃放置30min；所述BSA溶液中BSA质量占溶液总体积的百分比为1％；

步骤二，取0.75g待测样品，加入3ml甲醇溶液，震荡、静置、离心，使用0.01MPBS稀释5倍，取5μl备用；

步骤三，将抗FB1单克隆抗体分别与不同浓度的FB1标准品和待测样品稀释液混合，37℃孵育60min；

步骤四，使用0.01M PBST洗涤工作电极，晾干，滴加6μl步骤三制得的抗FB1单克隆抗体和FB1标准品或待测样品稀释液的混合溶液，37℃放置30min；

步骤五，使用0.01M PBST洗涤工作电极，晾干，滴加6μlHRP标记的羊抗鼠二抗，37℃放置30min；

步骤六，使用0.01M PBST洗涤工作电极，并晾干，将丝网印刷电极放入10ml pH为7.4的0.01M PBS的缓冲液中，测定背景电流，记录为I₀；

步骤七，将丝网印刷电极取出，使用0.01M PBST洗涤工作电极，并晾干，放入10mlpH为7.4的0.01M PBS的缓冲液中，再加入过氧化氢和氢醌，使其浓度分别为2mM和0.1mM，搅拌溶液20min后，停止搅拌，测定电流，记录为I，电流变化值_ΔI＝I-I₀；

步骤八；使用Excel软件，将FB1标准品不同浓度与相对应的_ΔI绘制标准曲线，将待测样品相对应的_ΔI带入标准曲线中，得到FB1浓度，并乘以稀释因子，即为待测样品中FB1含量。

优选的，步骤二中，所述离心为3000转离心15分。

优选的，步骤二中，所述甲醇溶液中甲醇与水的体积比为80∶20。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：本发明检测对象单一且针对性强，准确率高，灵敏度强，灵敏度大于常用的酶联免疫吸附法；可以满足粮食储存销售机构、出入境、海关等检验部门快速、正确地判断FB1毒素含量的要求，并且便于基层推广和运用。

附图说明

图1为本发明实施例示意图；

其中，1为参比电极，2为工作电极，3为对电极，4为胶体金，5为多壁碳纳米管，6为OVA-FB1，7为抗FB1单克隆抗体，8为羊抗鼠HRP标记二抗。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下面实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例

本发明实施例的示意图如图1所示，所述丝网印刷电极包括参比电极1、工作电极2、对电极3；所述工作电极2的工作区域涂覆有多壁碳纳米管5-胶体金4-壳聚糖混合物膜层；用所述丝网印刷电极检测样品中的伏马毒素B1(FB1)时，首先将OVA-FB16滴加在已涂覆有混合物膜层的工作电极上，干燥后再加入抗FB1单克隆抗体7与待测样品萃取液的混合溶液，干燥后再加入HRP标记的羊抗鼠二抗8，最后加入底物溶液H₂0₂和HQ。

制备本发明的复合纳米材料修饰丝网印刷电极以及用其检测伏马毒素B1的方法具体步骤如下：

步骤一，碳纳米管的活化

将5mg碳纳米管溶于15ml混合酸溶液(HNO₃与H₂SO₄体积比为1∶3)中，超声混匀30分钟。将溶液分装，置于离心机中，9000转/分钟离心5分钟，去除上清后，再用超纯水洗涤一次，具体为9000转/分钟离心5分钟。去除上清后，合并残留物，置于60℃烘箱烘干。最后加入5ml水，4℃储存备用。

步骤二，胶体金的制备

先将100ml的0.001％(W/V)HAuCl4溶液加热至沸腾，迅速加入1.3ml的1％(W/V)柠檬酸三钠水溶液，开始有些蓝色，然后浅蓝、蓝色，再加热出现红色，煮沸7～10min出现透明的酒红色，最后加三蒸水至100ml。使用电镜镜检，确保制备的金颗粒尽量使其大小一致，均匀，颗粒直径在16～18nm。

步骤三，在丝网印刷电极上修饰复合纳米材料

将10μl碳纳米管溶液和50μl胶体金溶液加入至50μl 2％(W/V)壳聚糖溶液中。超声混匀5分钟后，取6μl滴加在丝网印刷电极的工作电极上，室温干燥30分钟即可。

步骤四，样品处理

取0.75g待测样品，加入3ml甲醇溶液(甲醇与水的体积比为80∶20)，震荡15min后，静置10min，3000转离心15分后，使用0.01M PBS稀释5倍，取5μl备用。

步骤五，检测过程

将6μl FB1-OVA滴加在工作电极区域，37℃放置30min。使用0.01M PBST洗涤工作电极，并晾干，滴加8μl 1％(W/V)BSA溶液，以封闭工作电极，37℃放置30min。

将抗FB1单克隆抗体分别与FB1标准品(0、0.1、0.5、1、5、10、50、100ng/ml)和待测样品稀释液混合，37℃孵育60min。使用0.01M PBST洗涤工作电极，并晾干，滴加6μl抗FB1单克隆抗体和FB1标准品或待测样品稀释液的混合溶液，37℃放置30min。使用0.01M PBST洗涤工作电极，并晾干，滴加6μl HRP标记的羊抗鼠二抗，37℃放置30min。使用0.01M PBST洗涤工作电极，并晾干，将丝网印刷电极放入10ml 0.01M PBS(pH 7.4)的缓冲液中，测定背景电流，记录为I₀；将丝网印刷电极取出，使用0.01M PBST洗涤工作电极，并晾干，放入10ml 0.01M PBS(pH 7.4)的缓冲液中，再加入过氧化氢(H₂O₂)和氢醌(HQ)，使其浓度分别为2mM和0.1mM，搅拌溶液20min后，停止搅拌，测定电流，记录为I，电流变化值_ΔI＝I-I₀；使用Excel软件，将FB1标准品不同浓度与相对应的_ΔI绘制标准曲线，将待测样品相对应的_ΔI带入标准曲线中，得到FB1浓度，并×稀释因子(4×5)，即为待测样品中FB1含量(μg/kg)。

综上所述，本发明检测样品中FB1的方法是鉴于待测样品若有FB1毒素，则与抗FB1抗体竞争结合，使与电极上的FB1-OVA结合的抗体量减少，并由此使电极上HRP-羊抗鼠二抗的量也减少，并影响电流变化值_ΔI；该方法根据FB1标准品绘制的标准曲线来判定谷物检测样品中FB1的含量。可以看出，本实施例的方法可直接定量检测样品中的FB1，不需要专业培训，操作方便、快速。

Claims (3)

1.一种用复合纳米修饰丝网印刷电极检测伏马毒素B1的方法，其特征在于，所述丝网印刷电极的工作电极的工作区域涂覆有多壁碳纳米管-胶体金-壳聚糖混合物膜层；所述方法包括如下步骤：

步骤一，将6μL FB1-OVA滴加在所述工作电极的工作区域，37℃放置30min；使用0.01M PBST洗涤工作电极，晾干，滴加8μL BSA溶液，以封闭工作电极，37℃放置30min；所述BSA溶液中BSA质量占溶液总体积的百分比为1%；

步骤二，取0.75g待测样品，加入3mL甲醇溶液，震荡、静置、离心，使用0.01MPBS稀释5倍，取5μL备用；

步骤三，将抗FB1单克隆抗体分别与不同浓度的FB1标准品和待测样品稀释液混合，37℃孵育60min；

步骤四，使用0.01M PBST洗涤工作电极，晾干，滴加6μL步骤三制得的抗FB1单克隆抗体和FB1标准品或待测样品稀释液的混合溶液，37℃放置30min；

步骤五，使用0.01M PBST洗涤工作电极，晾干，滴加6μLHRP标记的羊抗鼠二抗，37℃放置30min；

步骤六，使用0.01M PBST洗涤工作电极，并晾干，将丝网印刷电极放入10mL pH为7.4的0.01M PBS的缓冲液中，测定背景电流，记录为I0；

步骤七，将丝网印刷电极取出，使用0.01M PBST洗涤工作电极，并晾干，放入10mLpH为7.4的0.01M PBS的缓冲液中，再加入过氧化氢和氢醌，使其浓度分别为2mM和0.1mM，搅拌溶液20min后，停止搅拌，测定电流，记录为I，电流变化值_△I=I－I₀；

步骤八；使用Excel软件，将FB1标准品不同浓度与相对应的_△I绘制标准曲线，将待测样品相对应的_△I带入标准曲线中，得到FB1浓度，并乘以稀释因子，即为待测样品中FB1含量。

2.如权利要求1所述的复合纳米修饰丝网印刷电极检测伏马毒素B1的方法，其特征在于，步骤二中所述离心为3000转/min，离心15分钟。

3.如权利要求1所述的复合纳米修饰丝网印刷电极检测伏马毒素B1的方法，其特征在于，步骤二中所述甲醇溶液中甲醇与水体积比为80:20。

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