[go: up one dir, main page]

CN107201407A - 一种焦磷酸测序法检测vkorc1和cyp2c9基因多态性的引物及方法 - Google Patents

一种焦磷酸测序法检测vkorc1和cyp2c9基因多态性的引物及方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107201407A
CN107201407A CN201710499942.2A CN201710499942A CN107201407A CN 107201407 A CN107201407 A CN 107201407A CN 201710499942 A CN201710499942 A CN 201710499942A CN 107201407 A CN107201407 A CN 107201407A
Authority
CN
China
Prior art keywords
vkorc1
primer
pyrosequencing
gene
sequencing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710499942.2A
Other languages
English (en)
Inventor
黄盛文
杨楠楠
徐琴
韩媛媛
李頔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guizhou Provincial Peoples Hospital
Original Assignee
Guizhou Provincial Peoples Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guizhou Provincial Peoples Hospital filed Critical Guizhou Provincial Peoples Hospital
Priority to CN201710499942.2A priority Critical patent/CN107201407A/zh
Publication of CN107201407A publication Critical patent/CN107201407A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种焦磷酸测序法检测VKORC1和CYP2C9基因多态性的引物及方法，属于分子生物学检验领域。所述引物包括VKORC1‑1639G>A、CYP2C9430C>T、CYP2C91075A>C基因的扩增上下游引物和测序引物，所述方法包括标本采集及DNA提取、PCR扩增反应、PCR产物凝胶电泳分析和焦磷酸测序，所述标本采集及DNA提取中用到的DNA提取试剂盒包括裂解缓冲液、吸附剂、漂洗缓冲液和洗脱缓冲液，所述裂解缓冲液包括氯化钠、柠檬酸钠、变性剂、还原剂、乙二胺四乙酸、离子型表面活性剂、无水乙醇和超纯水。总之，本发明提供的检测方法具有检测结果准确、特异性高、检测周期短、操作简单、成本低等优点。

Description

一种焦磷酸测序法检测VKORC1和CYP2C9基因多态性的引物及 方法
技术领域
本发明属于分子生物学检验领域，具体涉及一种焦磷酸测序法检测VKORC1和CYP2C9基因多态性的引物及方法。
背景技术
焦磷酸测序(Pyrosequencing)是一种聚合原理的DNA测序(即，确定DNA中核苷酸的顺序)方法，属于新一代DNA序列分析技术，具备同时对大量样品进行测序分析的能力，并具有高通量、特异性高、快速、直观及低成本的优点。其基本原理为，由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)，PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值，每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比；然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成；最后通过分析岀峰值的情况，达到测定DNA序列的目的。
华法林是一种双香豆素衍生物，是目前临床上应用最广泛的口服抗凝药物之一，用于预防和治疗深静脉血栓、肺栓塞、心脏瓣膜置换术及房颤导致的血栓形成。但华法林的稳定剂量在人群中存在明显个体差异，正确估算不同个体华法林的安全、有效治疗剂量有助于降低过度抗凝和出血的风险。遗传因素是影响华法林用量个体差异的主要因素，其中维生素K环氧化物还原酶复合体亚单位1基因(vitaminKepoxidereductasecomplexsubunit1，VKORC1)和细胞色素P4502C9基因(cytochromeP4502C9，CYP2C9)是影响华法林个体剂量差异的最主要原因。VKORC1-1639G>A基因位点存在多态性，与华法林剂量和疗效密切相关。与野生型等位基因CYP2C9*1相比，CYP2C9430C>T和CYP2C91075A>C变异所对应的等位基因CYP2C9*2和CYP2C9*3导致酶活性降低，从而使华法林代谢减慢，易出现出血等不良反应。在用药前对VKORC1和CYP2C9基因进行分型，可帮助病人预测华法林的维持剂量。
对VKORC1-1639G>A、CYP2C9430C>T和CYP2C91075A>C3个位点的基因分型有助于华法林个体化治疗。目前对这3个SNP位点的分型方法可以分为两类：一类是单链构象多态性(SSCP)、变性梯度凝胶电泳(DDGE)、酶切扩增多态性序列(CAPS)、等位基因特异性PCR(AS-PCR)等传统的检测方法。另一类是直接测序、DNA芯片、变性高效液相色谱(DHPLC)、质谱检测技术、高分辨率溶解曲线(HRM)等新技术。传统方法对设备要求不高、成本低，但检测速度慢，很难实现高通量的检测；新方法能实现高通量、自动化检测，但对设备和技术要求高，成本较高。
发明内容
针对以上技术问题，本发明提供一种可对VKORC1和CYP2C9基因进行快速、准确和批量检测的焦磷酸测序法检测VKORC1和/或CYP2C9基因多态性的方法。
本发明的技术方案方案为：一种焦磷酸测序法检测VKORC1和CYP2C9基因多态性的引物，所述VKORC1检测的多态位点为VKORC1-1639G>A，所述CYP2C9检测的多态位点为CYP2C9430C>T和/或CYP2C91075A>C，所述引物包括：
(1)VKORC1-1639G>A基因的扩增引物为：
上游引物：5’-TGTTGGCCAGGCTTGTCTTAAACT-3'
下游引物：5’-TGGGAAGTCAAGCAAGAGAAGACC-3'
VKORC1-1639G>A基因的测序引物为：5’-GCGTGAGCCACCGCA-3'
(2)CYP2C9430C>T基因的扩增引物为：
上游引物：5’-CTCATGACGCTGCGGAATTTT-3'
下游引物：5’-CCACCCTTGGTTTTTCTCAACTC-3'
CYP2C9430C>T基因的测序引物为：5’-GGGCTTCCTCTTGAAC-3'
(3)CYP2C91075A>C基因的扩增引物为：
上游引物：5’-CCAGGAAGAGATTGAACGTGTGA-3'
下游引物：5’-TTTGGGGACTTCGAAAACATG-3'
CYP2C91075A>C基因的测序引物为：5’-CACGAGGTCCAGAGATAC-3'
进一步的，所述VKORC1-1639G>A基因下游引物的5’端、CYP2C9430C>T基因的上游引物的5’端、CYP2C91075A>C基因下游引物的5’端标记有生物素。
一种焦磷酸测序法检测VKORC1和CYP2C9基因多态性的方法，包括以下步骤：
S1：标本采集及DNA提取：抽取受试者外周静脉血2ml，使用EDTA-Na2抗凝，并取全血200μL，用DNA提取试剂盒提取基因组DNA，经核酸蛋白分析仪进行DNA纯度和浓度检测后于-20℃保存备用；
S2：PCR扩增反应：采用一种焦磷酸测序法检测VKORC1和CYP2C9基因多态性的引物，具体引物名称及序列、PCR扩增反应体系、PCR扩增反应条件如表1、表2、表3所示：
表1扩增及测序引及扩增片段长度
所述F为上游引物、R为下游引物、S为测序引物、Bio为生物素标记；
表2PCR扩增反应体系
表3PCR扩增反应条件
S3：PCR产物凝胶电泳分析：制备2％的琼脂糖凝胶，在所述琼脂糖凝胶中加入2μLPCR产物，在电压110V，电流400mA的条件下电泳40min，在凝胶成像仪上观察目的条带电泳结果；
S4：焦磷酸测序：配制所述测序引物退火缓冲液，固定所述PCR产物，使得所述琼脂糖凝胶与经所述生物素标记的PCR产物充分结合，在真空工作站中制备成单链DNA模板，之后在PyroMarkQ24试剂仓中依次对应加入dNTP、底物和酶混合物，在PyroMarkQ24软件上设置测序运行程序，并将所述试剂仓和24孔测序孔放入PyroMarkQ24中进行焦磷酸测序，15min测序结束后在同一软件读取结果并分析。
进一步的，S4中所述酶混合物为DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶。
进一步的，S1中所述DNA提取试剂盒包括裂解缓冲液、吸附剂、漂洗缓冲液和洗脱缓冲液，所述裂解缓冲液的组成成分按重量百分比计包括：氯化钠3-6％、柠檬酸钠0.3-0.8％、变性剂2-5％、还原剂0.05-0.2％、乙二胺四乙酸0.5-1.5％、离子型表面活性剂2.2-2.7％、无水乙醇30-40％，余量为超纯水，所述漂洗缓冲液的组成成分为乙二胺四乙酸和His-tag，所述乙二胺四乙酸和His-tag的摩尔百分比为1:10-20；所述吸附剂为纳米磁珠；所述洗脱缓冲液的为：0.5％氢氧化钠。
更进一步的，所述变性剂为盐酸胍、硫氰酸胍、异硫氰酸胍中任意一种，变性剂可溶解蛋白质,导致细胞结构破坏,核蛋白二级结构破坏,从核酸上解离下来。
更进一步的，所述还原剂为2-巯基乙醇(β-ME)、二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇、还原型的谷胱甘肽(GST)或半胱氨酸中任意一种，可保护蛋白质或酶中的疏基不至被氧化而失活。
更进一步的，所述离子型表面活性剂为SDS、DTAC、CTAB、CPB或OPB中任意一种，表面活性剂与固定在电极表面的DNA可通过静电和疏水性作用结合，从而改变DNA在电极表面的状态，使电活性小分子MB的电化学行为发生变化。
更进一步的，所述纳米磁珠为超顺磁性四氧化三铁石墨烯纳米微珠，直径为150-700nm，四氧化三铁具有优良的磁导性，石墨烯具有独特的二维结构和孔径分布，具有优异的吸附性能，二者采用化学沉淀法制备得到的四氧化三铁石墨烯复合材料水溶性较好且稳定性较强。
更进一步的，所述DNA提取试剂盒的使用方法包括以下步骤：
(1)将所述裂解缓冲液、漂洗缓冲液和洗脱缓冲液分别调节PH至7.5-8、7.0-7.5和7.8-8.2之间，并分别通过0.45μm滤膜除菌，得到除菌后的裂解缓冲液、漂洗缓冲液和洗脱缓冲液，置于4至-20℃备用；
(2)提取全血200μL放入样品管内；
(3)在所述样品管内加入1.7-2.5mL所述除菌后的裂解缓冲液，放入到37-42℃水浴中充分反应；
(4)加入所述超顺磁性四氧化三铁石墨烯纳米微珠，并充分混合，超顺磁性四氧化三铁石墨烯纳米微珠的加入量为步骤(3)中所述除菌后的裂解缓冲液质量的7-10％；
(5)将样品管放入离心机内，以10000-15000r/min转速离心1-2min,离心结束后弃掉上清液；
(6)使用2-3ml所述漂洗缓冲液重悬，以10000-15000r/min转速离心1-3min,弃掉上清液，重复此步骤1-3次；
(7)在25-30℃温度下干燥3-6min后，加入120-200μl所述洗脱缓冲液，在50-55℃水浴温度下溶解；
(8)再使用离心机，以10000-15000r/min转速离心1-3min,取上清液，得到所述基因组DNA。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明设计的基因多态性引物具有非常好的特异性，能准确区分各种型别的基因型。
(2)本发明提供的检测方法检测的结果与Sanger测序法检测结果完全一致，可以满足临床上对VKORC1和CYP2C9基因进行准确分型的要求。
(3)本发明成功建立了基于焦磷酸测序技术的VKORC1和CYP2C9基因快速、准确的分型方法，可对这两个基因进行快速、批量的基因型检测，有助于临床上开展华法林个体化用药。
(4)本发明提供的检测方法具有检测结果准确、特异性高、检测周期短、操作简单、成本低并能有效满足临床检验要求的优点。
附图说明
图1是VKORC1-1639G>A基因型焦磷酸测序与Sanger测序对比图，其中，图1-A是VKORC1-1639G>A位点其中一种基因型的焦磷酸测序图，图1-a是VKORC1-1639G>A位点其中一种基因型的Sanger测序图；图1-B是VKORC1-1639G>A位点另一种基因型的焦磷酸测序图，图1-b是VKORC1-1639G>A位点另一种基因型的Sanger测序图；
图2是CYP2C9430C>T和CYP2C91075A>C基因型焦磷酸测序与Sanger测序对比图，其中，图2-A是CYP2C9430C>T位点基因型的焦磷酸测序图，图2-a是CYP2C9430C>T位点基因型的Sanger测序图；图2-B是CYP2C91075A>C其中一种基因型的焦磷酸测序图，图2-b是CYP2C91075A>C其中一种基因型的Sanger测序图；图2-C是CYP2C91075A>C另一种基因型的焦磷酸测序图，图2-c是CYP2C91075A>C另一种基因型的Sanger测序图。
具体实施方式
为便于对本发明的理解，下面结合附图和具体实施例做进一步的解释说明。
实施例1
一种焦磷酸测序法检测VKORC1和CYP2C9基因多态性的引物，所述VKORC1检测的多态位点为VKORC1-1639G>A，所述CYP2C9检测的多态位点为CYP2C9430C>T为CYP2C9430C>T和/或CYP2C91075A>C，所述引物包括：
(1)VKORC1-1639G>A基因的扩增引物为：
上游引物：5’-TGTTGGCCAGGCTTGTCTTAAACT-3'
下游引物：5’-TGGGAAGTCAAGCAAGAGAAGACC-3'
VKORC1-1639G>A基因的测序引物为：5’-GCGTGAGCCACCGCA-3'
(2)CYP2C9430C>T基因的扩增引物为：
上游引物：5’-CTCATGACGCTGCGGAATTTT-3'
下游引物：5’-CCACCCTTGGTTTTTCTCAACTC-3'
CYP2C9430C>T基因的测序引物为：5’-GGGCTTCCTCTTGAAC-3'
(3)CYP2C91075A>C基因的扩增引物为：
上游引物：5’-CCAGGAAGAGATTGAACGTGTGA-3'
下游引物：5’-TTTGGGGACTTCGAAAACATG-3'
CYP2C91075A>C基因的测序引物为：5’-CACGAGGTCCAGAGATAC-3'
其中，所述VKORC1-1639G>A基因下游引物的5’端、CYP2C9430C>T基因的上游引物的5’端、CYP2C91075A>C基因下游引物的5’端标记有生物素。
一种焦磷酸测序法检测VKORC1和CYP2C9基因多态性的方法，包括以下步骤：
S1：标本采集及DNA提取：抽取受试者外周静脉血2ml，使用EDTA-Na2抗凝，并取全血200μL，用DNA提取试剂盒提取基因组DNA，经核酸蛋白分析仪进行DNA纯度和浓度检测后于-20℃保存备用；其中，所述DNA提取试剂盒包括裂解缓冲液、吸附剂、漂洗缓冲液和洗脱缓冲液，所述裂解缓冲液的组成成分按重量百分比计包括：氯化钠3％、柠檬酸钠0.3％、盐酸胍2％、2-巯基乙醇(β-ME)0.05％、乙二胺四乙酸0.5％、SDS2.2％、无水乙醇30％，余量为超纯水，所述漂洗缓冲液的组成成分为乙二胺四乙酸和His-tag，所述乙二胺四乙酸和His-tag的摩尔百分比为1:10；所述吸附剂为纳米磁珠，其中，所述纳米磁珠为超顺磁性四氧化三铁石墨烯纳米微珠，直径为150nm，四氧化三铁具有优良的磁导性，石墨烯具有独特的二维结构和孔径分布，具有优异的吸附性能，二者采用化学沉淀法制备得到的四氧化三铁石墨烯复合材料水溶性较好且稳定性较强；所述洗脱缓冲液的为：0.5％氢氧化钠。
其中，所述DNA提取试剂盒的使用方法包括以下步骤：
(1)将所述裂解缓冲液、漂洗缓冲液和洗脱缓冲液分别调节PH至7.5、7.0和7.8，并分别通过0.45μm滤膜除菌，得到除菌后的裂解缓冲液、漂洗缓冲液和洗脱缓冲液，置于4℃备用；
(2)提取全血200μL放入样品管内；
(3)在所述样品管内加入1.7mL所述除菌后的裂解缓冲液，放入到37℃水浴中充分反应；
(4)加入所述超顺磁性四氧化三铁石墨烯纳米微珠，并充分混合，超顺磁性四氧化三铁石墨烯纳米微珠的加入量为步骤(3)中所述除菌后的裂解缓冲液质量的7％；
(5)将样品管放入离心机内，以10000r/min转速离心1min,离心结束后弃掉上清液；
(6)使用2ml所述漂洗缓冲液重悬，以10000r/min转速离心1min,弃掉上清液，重复此步骤1次；
(7)在25℃温度下干燥3min后，加入120μl所述洗脱缓冲液，在50℃水浴温度下溶解；
(8)再使用离心机，以10000r/min转速离心1min,取上清液，得到所述基因组DNA。
S2：PCR扩增反应：采用一种焦磷酸测序法检测VKORC1和CYP2C9基因多态性的引物，具体引物名称及序列、PCR扩增反应体系、PCR扩增反应条件如表1、表2、表3所示：
表1扩增及测序引及扩增片段长度
所述F为上游引物、R为下游引物、S为测序引物、Bio为生物素标记；
表2PCR扩增反应体系
试剂 体积
Mix 12.5μL
MgCl2(25mmol/L) 1.5μL
CoralLoadconcentrate(10×) 2.5μL
TaqDNA聚合酶 5μL
PrimerA 0.5μL
PrimerB 0.5μL
DNA模板 2μL
超纯水 0.5μL
总体积(μL) 25μL
表3PCR扩增反应条件
S3：PCR产物凝胶电泳分析：制备2％的琼脂糖凝胶，在所述琼脂糖凝胶中加入2μLPCR产物，在电压110V，电流400mA的条件下电泳40min，在凝胶成像仪上观察目的条带电泳结果；
S4：焦磷酸测序：配制所述测序引物退火缓冲液，固定所述PCR产物，使得所述琼脂糖凝胶与经所述生物素标记的PCR产物充分结合，在真空工作站中制备成单链DNA模板，之后在PyroMarkQ24试剂仓中依次对应加入dNTP、底物和酶混合物，其中，所述酶混合物为DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶。在PyroMarkQ24软件上设置测序运行程序，并将所述试剂仓和24孔测序孔放入PyroMarkQ24中进行焦磷酸测序，15min测序结束后在同一软件读取结果并分析。
实施例2
一种焦磷酸测序法检测VKORC1和CYP2C9基因多态性的引物，所述VKORC1检测的多态位点为VKORC1-1639G>A，所述CYP2C9检测的多态位点为CYP2C9430C>T为CYP2C9430C>T和/或CYP2C91075A>C，所述引物包括：
(1)VKORC1-1639G>A基因的扩增引物为：
上游引物：5’-TGTTGGCCAGGCTTGTCTTAAACT-3'
下游引物：5’-TGGGAAGTCAAGCAAGAGAAGACC-3'
VKORC1-1639G>A基因的测序引物为：5’-GCGTGAGCCACCGCA-3'
(2)CYP2C9430C>T基因的扩增引物为：
上游引物：5’-CTCATGACGCTGCGGAATTTT-3'
下游引物：5’-CCACCCTTGGTTTTTCTCAACTC-3'
CYP2C9430C>T基因的测序引物为：5’-GGGCTTCCTCTTGAAC-3'
(3)CYP2C91075A>C基因的扩增引物为：
上游引物：5’-CCAGGAAGAGATTGAACGTGTGA-3'
下游引物：5’-TTTGGGGACTTCGAAAACATG-3'
CYP2C91075A>C基因的测序引物为：5’-CACGAGGTCCAGAGATAC-3'
其中，所述VKORC1-1639G>A基因下游引物的5’端、CYP2C9430C>T基因的上游引物的5’端、CYP2C91075A>C基因下游引物的5’端标记有生物素。
一种焦磷酸测序法检测VKORC1和CYP2C9基因多态性的方法，包括以下步骤：
S1：标本采集及DNA提取：抽取受试者外周静脉血2ml，使用EDTA-Na2抗凝，并取全血200μL，用DNA提取试剂盒提取基因组DNA，经核酸蛋白分析仪进行DNA纯度和浓度检测后于-20℃保存备用；其中，所述DNA提取试剂盒包括裂解缓冲液、吸附剂、漂洗缓冲液和洗脱缓冲液，所述裂解缓冲液的组成成分按重量百分比计包括：氯化钠4％、柠檬酸钠0.6％、硫氰酸胍3.5％、二硫苏糖醇(DTT)0.12％、乙二胺四乙酸1％、DTAC2.4％、无水乙醇35％，余量为超纯水，所述漂洗缓冲液的组成成分为乙二胺四乙酸和His-tag，所述乙二胺四乙酸和His-tag的摩尔百分比为1:15；所述吸附剂为纳米磁珠，其中，所述纳米磁珠为超顺磁性四氧化三铁石墨烯纳米微珠，直径为420nm，四氧化三铁具有优良的磁导性，石墨烯具有独特的二维结构和孔径分布，具有优异的吸附性能，二者采用化学沉淀法制备得到的四氧化三铁石墨烯复合材料水溶性较好且稳定性较强；所述洗脱缓冲液的为：0.5％氢氧化钠。
其中，所述DNA提取试剂盒的使用方法包括以下步骤：
(1)将所述裂解缓冲液、漂洗缓冲液和洗脱缓冲液分别调节PH至7.8、7.3和8.0，并分别通过0.45μm滤膜除菌，得到除菌后的裂解缓冲液、漂洗缓冲液和洗脱缓冲液，置于-10℃备用；
(2)提取全血200μL放入样品管内；
(3)在所述样品管内加入2.0mL所述除菌后的裂解缓冲液，放入到40℃水浴中充分反应；
(4)加入所述超顺磁性四氧化三铁石墨烯纳米微珠，并充分混合，超顺磁性四氧化三铁石墨烯纳米微珠的加入量为步骤(3)中所述除菌后的裂解缓冲液质量的8％；
(5)将样品管放入离心机内，以12000r/min转速离心90s,离心结束后弃掉上清液；
(6)使用2-3ml所述漂洗缓冲液重悬，以12000r/min转速离心2min,弃掉上清液，重复此步骤2次；
(7)在28℃温度下干燥4min后，加入160μl所述洗脱缓冲液，在53℃水浴温度下溶解；
(8)再使用离心机，以12000r/min转速离心2min,取上清液，得到所述基因组DNA。
S2：PCR扩增反应：采用一种焦磷酸测序法检测VKORC1和CYP2C9基因多态性的引物，具体引物名称及序列、PCR扩增反应体系、PCR扩增反应条件如表1、表2、表3所示：
表1扩增及测序引及扩增片段长度
所述F为上游引物、R为下游引物、S为测序引物、Bio为生物素标记；
表2PCR扩增反应体系
表3PCR扩增反应条件
其中，所述退火的反应温度分为56℃、51℃和51℃三个温度值，所述三个温度值分别对应VKORC1、CYP2C9*2和CYP2C9*3三个基因，针对不同的基因相应选择最适宜的退火反应温度，提高扩增效果。
S3：PCR产物凝胶电泳分析：制备2％的琼脂糖凝胶，在所述琼脂糖凝胶中加入2μLPCR产物，在电压110V，电流400mA的条件下电泳40min，在凝胶成像仪上观察目的条带电泳结果；
S4：焦磷酸测序：配制所述测序引物退火缓冲液，固定所述PCR产物，使得所述琼脂糖凝胶与经所述生物素标记的PCR产物充分结合，在真空工作站中制备成单链DNA模板，之后在PyroMarkQ24试剂仓中依次对应加入dNTP、底物和酶混合物，其中，所述酶混合物为DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶。在PyroMarkQ24软件上设置测序运行程序，并将所述试剂仓和24孔测序孔放入PyroMarkQ24中进行焦磷酸测序，15min测序结束后在同一软件读取结果并分析。
实施例3
一种焦磷酸测序法检测VKORC1和CYP2C9基因多态性的引物，所述VKORC1检测的多态位点为VKORC1-1639G>A，所述CYP2C9检测的多态位点为CYP2C9430C>T为CYP2C9430C>T和/或CYP2C91075A>C，所述引物包括：
(1)VKORC1-1639G>A基因的扩增引物为：
上游引物：5’-TGTTGGCCAGGCTTGTCTTAAACT-3'
下游引物：5’-TGGGAAGTCAAGCAAGAGAAGACC-3'
VKORC1-1639G>A基因的测序引物为：5’-GCGTGAGCCACCGCA-3'
(2)CYP2C9430C>T基因的扩增引物为：
上游引物：5’-CTCATGACGCTGCGGAATTTT-3'
下游引物：5’-CCACCCTTGGTTTTTCTCAACTC-3'
CYP2C9430C>T基因的测序引物为：5’-GGGCTTCCTCTTGAAC-3'
(3)CYP2C91075A>C基因的扩增引物为：
上游引物：5’-CCAGGAAGAGATTGAACGTGTGA-3'
下游引物：5’-TTTGGGGACTTCGAAAACATG-3'
CYP2C91075A>C基因的测序引物为：5’-CACGAGGTCCAGAGATAC-3'
其中，所述VKORC1-1639G>A基因下游引物的5’端、CYP2C9430C>T基因的上游引物的5’端、CYP2C91075A>C基因下游引物的5’端标记有生物素。
一种焦磷酸测序法检测VKORC1和CYP2C9基因多态性的方法，包括以下步骤：
S1：标本采集及DNA提取：抽取受试者外周静脉血2ml，使用EDTA-Na2抗凝，并取全血200μL，用DNA提取试剂盒提取基因组DNA，经核酸蛋白分析仪进行DNA纯度和浓度检测后于-20℃保存备用；其中，所述DNA提取试剂盒包括裂解缓冲液、吸附剂、漂洗缓冲液和洗脱缓冲液，所述裂解缓冲液的组成成分按重量百分比计包括：氯化钠6％、柠檬酸钠0.8％、异硫氰酸胍5％、二硫赤藓糖醇0.2％、乙二胺四乙酸1.5％、CTAB2.7％、无水乙醇40％，余量为超纯水，所述漂洗缓冲液的组成成分为乙二胺四乙酸和His-tag，所述乙二胺四乙酸和His-tag的摩尔百分比为1:20；所述吸附剂为纳米磁珠，其中，所述纳米磁珠为超顺磁性四氧化三铁石墨烯纳米微珠，直径为700nm，四氧化三铁具有优良的磁导性，石墨烯具有独特的二维结构和孔径分布，具有优异的吸附性能，二者采用化学沉淀法制备得到的四氧化三铁石墨烯复合材料水溶性较好且稳定性较强；所述洗脱缓冲液的为：0.5％氢氧化钠。
其中，所述DNA提取试剂盒的使用方法包括以下步骤：
(1)将所述裂解缓冲液、漂洗缓冲液和洗脱缓冲液分别调节PH至8、7.5和8.2，并分别通过0.45μm滤膜除菌，得到除菌后的裂解缓冲液、漂洗缓冲液和洗脱缓冲液，置于-20℃备用；
(2)提取全血200μL放入样品管内；
(3)在所述样品管内加入2.5mL所述除菌后的裂解缓冲液，放入到42℃水浴中充分反应；
(4)加入所述超顺磁性四氧化三铁石墨烯纳米微珠，并充分混合，超顺磁性四氧化三铁石墨烯纳米微珠的加入量为步骤(3)中所述除菌后的裂解缓冲液质量的10％；
(5)将样品管放入离心机内，以15000r/min转速离心2min,离心结束后弃掉上清液；
(6)使用3ml所述漂洗缓冲液重悬，以15000r/min转速离心3min,弃掉上清液，重复此步骤3次；
(7)在30℃温度下干燥6min后，加入200μl所述洗脱缓冲液，在55℃水浴温度下溶解；
(8)再使用离心机，以15000r/min转速离心3min,取上清液，得到所述基因组DNA。
S2：PCR扩增反应：采用一种焦磷酸测序法检测VKORC1和CYP2C9基因多态性的引物，具体引物名称及序列、PCR扩增反应体系、PCR扩增反应条件如表1、表2、表3所示：
表1扩增及测序引及扩增片段长度
所述F为上游引物、R为下游引物、S为测序引物、Bio为生物素标记；
表2PCR扩增反应体系
试剂 体积
Mix 12.5μL
MgCl2(25mmol/L) 1.5μL
CoralLoadconcentrate(10×) 2.5μL
TaqDNA聚合酶 5μL
PrimerA 0.5μL
PrimerB 0.5μL
DNA模板 2μL
超纯水 0.5μL
总体积(μL) 25μL
表3PCR扩增反应条件
其中，所述退火的反应温度分为56℃、51℃和51℃三个温度值，所述三个温度值分别对应VKORC1、CYP2C9*2和CYP2C9*3三个基因，针对不同的基因相应选择最适宜的退火反应温度，提高扩增效果。
S3：PCR产物凝胶电泳分析：制备2％的琼脂糖凝胶，在所述琼脂糖凝胶中加入2μLPCR产物，在电压110V，电流400mA的条件下电泳40min，在凝胶成像仪上观察目的条带电泳结果；
S4：焦磷酸测序：配制所述测序引物退火缓冲液，固定所述PCR产物，使得所述琼脂糖凝胶与经所述生物素标记的PCR产物充分结合，在真空工作站中制备成单链DNA模板，之后在PyroMarkQ24试剂仓中依次对应加入dNTP、底物和酶混合物，其中，所述酶混合物为DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶。在PyroMarkQ24软件上设置测序运行程序，并将所述试剂仓和24孔测序孔放入PyroMarkQ24中进行焦磷酸测序，15min测序结束后在同一软件读取结果并分析。
试验例
试验：受检者采用实施例2方法的检测结果
1、试验对象
来自贵州省人民医院的成人50例，其中男21例，女29例，平均年龄(35.7±9.7)岁。
2、主要仪器与试剂
PyroMarkQ24焦磷酸测序仪(德国Qiagen公司)；
Veriti96-WellPCR扩增仪(美国Aooliedbiosystems公司)；
D3-Milli-Q超纯水机(美国Merck公司)；
核酸蛋白分析仪(德国Eppendorf公司)；
SepharoseBeads(美国GEHealthcare公司)；
专用聚合酶链反应试剂和测序试剂(德国Qiagen公司)。
3、不同基因型测序结果
根据待测位点出峰的碱基和峰高，可以清晰判断3个SNP位点的基因型。其中，图1显示VKORC1-1639G>A位点的2种基因型，灰色部分为待测位点。如图1-A中，待测区域出现的两个峰高C为模板序列碱基，单个峰高T(T＝100％)表示该位点为TT纯合子。由于该位点测序引物设计为反向测序，实际基因型为纯合子AA。如图1-B所示，待测区域出现两个半峰高C(其中两个峰高为模板序列碱基)，半个峰高T(C＝50％,T＝50％)，即该位点为杂合子AG。
其中，图2显示CYP2C9430C>T和CYP2C91075A>C基因型焦磷酸测序与Sanger测序对比结果，其中图2-A显示CYP2C9430C>T位点基因型，图2-B和图2-C显示CYP2C91075A>C位点基因型。如图2-A所示，待测区域出现两个峰高G(其中一个为模板序列，G＝95％)，该位点也是反向测序，即基因型为纯合子CC。如图2-B所示，待测区域出现一个峰高A(A＝97％)，即该位点为纯合子AA；如图2-C所示，待测区域出现半个峰高A和半个峰高C(A＝47％，C＝53％)，即该位点为杂合子AC。左边为焦磷酸测序法检测结果，右边为Sanger测序法检测结果。所有样本3个位点的两种基因分型方法的结果完全一致。
4、基因型分布结果
50例标本中，VKORC-1639G>A纯合子AA41例，杂合子AG9例,各占82％和18％，未检出GG纯合子。CYP2C9430C>T只检出纯合子CC，未检出等位基因CYP2C9*2。根据CYP2C91075A>C分型结果，纯合子*1/*1和杂合子*1/*3分别有45例和5例，各占90％和10％，未检出纯合子*3/*3。具体如表4所示：
表4 50例受检者VKORC1和CYP2C9等位基因和基因型频率的分布
注：n，等位基因数；N，基因型例数
5、结论
由以上数据可看出样本的检测结果与Sanger测序法检测结果完全一致，可以满足临床上对VKORC1和CYP2C9基因进行准确分型的要求。
尽管已参照其具体实施方案描述和阐明了本发明，但本领域技术人员会认识到，可以在不背离本发明的精神和范围的情况下对其作出各种改变、修改和取代。因此，本发明意在仅受下列权利要求的范围限制且这些权利要求应在合理的程度上尽可能广义地解释。
序列表
<110> 贵州省人民医院
<120> 一种焦磷酸测序法检测VKORC1和CYP2C9基因多态性的引物及方法
<130> 无
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> 根据实验要求而设计，作为VKORC1-1639G>A基因的扩增上游引物
<400> 1
tgttggccag gcttgtctta aact 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> 根据实验要求而设计，作为VKORC1-1639G>A基因的扩增下游引物
<313> (1)..(24)
<400> 2
tgggaagtca agcaagagaa gacc 24
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(15)
<223> 根据实验要求而设计，作为VKORC1-1639G>A基因的测序引物
<313> (1)..(15)
<400> 3
gcgtgagcca ccgca 15
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> 根据实验要求而设计，作为CYP2C9430C>T基因的扩增上游引物
<400> 4
ctcatgacgc tgcggaattt t 21
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> 根据实验要求而设计，作为CYP2C9430C>T基因的扩增下游引物
<400> 5
ccacccttgg tttttctcaa ctc 23
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> 根据实验要求而设计，作为CYP2C9430C>T基因的测序引物
<400> 6
gggcttcctc ttgaac 16
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> 根据实验要求而设计，作为CYP2C91075A>C基因的扩增上游引物
<400> 7
ccaggaagag attgaacgtg tga 23
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> 根据实验要求而设计，作为CYP2C91075A>C基因的扩增下游引物
<400> 8
tttggggact tcgaaaacat g 21
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> 根据实验要求而设计，作为CYP2C91075A>C基因的测序引物
<400> 9
cacgaggtcc agagatac 18

Claims (10)

1.一种焦磷酸测序法检测VKORC1和CYP2C9基因多态性的引物，其特征在于，所述VKORC1检测的多态位点为VKORC1-1639G>A，所述CYP2C9检测的多态位点为CYP2C9430C>T和CYP2C91075A>C，所述引物包括：
(1)VKORC1-1639G>A基因的扩增引物为：
上游引物：5’-TGTTGGCCAGGCTTGTCTTAAACT-3'
下游引物：5’-TGGGAAGTCAAGCAAGAGAAGACC-3'
VKORC1-1639G>A基因的测序引物为：5’-GCGTGAGCCACCGCA-3'
(2)CYP2C9430C>T基因的扩增引物为：
上游引物：5’-CTCATGACGCTGCGGAATTTT-3'
下游引物：5’-CCACCCTTGGTTTTTCTCAACTC-3'
CYP2C9430C>T基因的测序引物为：5’-GGGCTTCCTCTTGAAC-3'
(3)CYP2C91075A>C基因的扩增引物为：
上游引物：5’-CCAGGAAGAGATTGAACGTGTGA-3'
下游引物：5’-TTTGGGGACTTCGAAAACATG-3'
CYP2C91075A>C基因的测序引物为：5’-CACGAGGTCCAGAGATAC-3'。
2.如权利要求1所述的一种焦磷酸测序法检测VKORC1和CYP2C9基因多态性的引物，其特征在于，所述VKORC1-1639G>A基因下游引物的5’端、CYP2C9430C>T基因的上游引物的5’端、CYP2C91075A>C基因下游引物的5’端标记有生物素。
3.一种焦磷酸测序法检测VKORC1和CYP2C9基因多态性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：标本采集及DNA提取：抽取受试者外周静脉血2ml，使用EDTA-Na2抗凝，并取全血200μL，用DNA提取试剂盒提取基因组DNA，经核酸蛋白分析仪进行DNA纯度和浓度检测后于-20℃保存备用；
S2：PCR扩增反应：采用一种焦磷酸测序法检测VKORC1和CYP2C9基因多态性的引物，具体引物名称及序列、PCR扩增反应体系、PCR扩增反应条件如表1、表2、表3所示：
表1扩增及测序引及扩增片段长度
所述F为上游引物、R为下游引物、S为测序引物、Bio为生物素标记；
表2 PCR扩增反应体系
试剂 体积 Mix 12.5μL MgCl2(25mmol/L) 1.5μL CoralLoadconcentrate(10×) 2.5μL TaqDNA聚合酶 5μL PrimerA 0.5μL PrimerB 0.5μL DNA模板 2μL 超纯水 0.5μL 总体积(μL) 25μL
表3 PCR扩增反应条件
S3：PCR产物凝胶电泳分析：制备2％的琼脂糖凝胶，在所述琼脂糖凝胶中加入2μLPCR产物，在电压110V，电流400mA的条件下电泳40min，在凝胶成像仪上观察目的条带电泳结果；
S4：焦磷酸测序：配制所述测序引物退火缓冲液，固定所述PCR产物，使得所述琼脂糖凝胶与经所述生物素标记的PCR产物充分结合，在真空工作站中制备成单链DNA模板，之后在PyroMarkQ24试剂仓中依次对应加入dNTP、底物和酶混合物，在PyroMarkQ24软件上设置测序运行程序，并将所述试剂仓和24孔测序孔放入PyroMarkQ24中进行焦磷酸测序，15min测序结束后在同一软件读取结果并分析。
4.如权利要求3所述的一种焦磷酸测序法检测VKORC1和CYP2C9基因多态性的方法，其特征在于，S4中所述酶混合物为DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶。
5.如权利要求3所述的一种焦磷酸测序法检测VKORC1和CYP2C9基因多态性的方法，其特征在于，S4中所述酶混合物为DNA polymerase、ATP sulfurylase、Luciferase、Apyrase。
6.如权利要求3所述的一种焦磷酸测序法检测VKORC1和CYP2C9基因多态性的方法，其特征在于，S1中所述DNA提取试剂盒包括裂解缓冲液、吸附剂、漂洗缓冲液和洗脱缓冲液，所述裂解缓冲液的组成成分按重量百分比计包括：氯化钠3-6％、柠檬酸钠0.3-0.8％、变性剂2-5％、还原剂0.05-0.2％、乙二胺四乙酸0.5-1.5％、离子型表面活性剂2.2-2.7％、无水乙醇30-40％，余量为超纯水，所述漂洗缓冲液的组成成分为乙二胺四乙酸和His-tag，所述乙二胺四乙酸和His-tag的摩尔百分比为1:10-20；所述吸附剂为纳米磁珠；所述洗脱缓冲液的为：0.5％氢氧化钠。
7.如权利要求6所述的一种焦磷酸测序法检测VKORC1和CYP2C9基因多态性的方法，其特征在于，所述变性剂为盐酸胍、硫氰酸胍、异硫氰酸胍中任意一种。
8.如权利要求6所述的一种焦磷酸测序法检测VKORC1和CYP2C9基因多态性的方法，其特征在于，所述还原剂为2-巯基乙醇(β-ME)、二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇、还原型的谷胱甘肽(GST)或半胱氨酸中任意一种。
9.如权利要求6所述的一种焦磷酸测序法检测VKORC1和CYP2C9基因多态性的方法，其特征在于，所述离子型表面活性剂为SDS、DTAC、CTAB、CPB或OPB中任意一种。
10.如权利要求6所述的一种焦磷酸测序法检测VKORC1和CYP2C9基因多态性的方法，其特征在于，所述纳米磁珠为超顺磁性四氧化三铁石墨烯纳米微珠，直径为150-700nm。
CN201710499942.2A 2017-06-27 2017-06-27 一种焦磷酸测序法检测vkorc1和cyp2c9基因多态性的引物及方法 Pending CN107201407A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710499942.2A CN107201407A (zh) 2017-06-27 2017-06-27 一种焦磷酸测序法检测vkorc1和cyp2c9基因多态性的引物及方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710499942.2A CN107201407A (zh) 2017-06-27 2017-06-27 一种焦磷酸测序法检测vkorc1和cyp2c9基因多态性的引物及方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107201407A true CN107201407A (zh) 2017-09-26

Family

ID=59907083

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710499942.2A Pending CN107201407A (zh) 2017-06-27 2017-06-27 一种焦磷酸测序法检测vkorc1和cyp2c9基因多态性的引物及方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107201407A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113584144A (zh) * 2021-06-09 2021-11-02 湖南菲思特精准医疗科技有限公司 一种华法林代谢标志物检测试剂盒及其检测方法和应用
WO2022227363A1 (zh) * 2021-04-28 2022-11-03 浙江大学 含有半胱氨酸的毛细管凝胶电泳样品缓冲液

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20100077396A (ko) * 2008-12-29 2010-07-08 인제대학교 산학협력단 항응고제의 약물반응과 관련된 유전자의 변이 유전형 진단방법
CN102676666A (zh) * 2012-05-04 2012-09-19 周宏灏 焦磷酸测序法检测华法林个体化用药基因多态性的试剂盒及方法
CN103820553A (zh) * 2014-02-27 2014-05-28 厦门大学附属中山医院 用于指导华法林个体化用药的多重pcr联合焦磷酸测序试剂盒及其检测方法
CN104471074A (zh) * 2012-03-28 2015-03-25 长角牛疫苗和诊断有限责任公司 用于从生物样品中采集和分离核酸的组合物和方法
CN105368826A (zh) * 2015-05-14 2016-03-02 长沙三济生物科技有限公司 焦磷酸测序法检测cyp2c9基因分型的引物对及试剂盒
CN105886606A (zh) * 2015-12-04 2016-08-24 长沙迪安医学检验所有限公司 焦磷酸测序法快速检测华法林代谢酶基因多态性的试剂盒及其应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20100077396A (ko) * 2008-12-29 2010-07-08 인제대학교 산학협력단 항응고제의 약물반응과 관련된 유전자의 변이 유전형 진단방법
CN104471074A (zh) * 2012-03-28 2015-03-25 长角牛疫苗和诊断有限责任公司 用于从生物样品中采集和分离核酸的组合物和方法
CN102676666A (zh) * 2012-05-04 2012-09-19 周宏灏 焦磷酸测序法检测华法林个体化用药基因多态性的试剂盒及方法
CN103820553A (zh) * 2014-02-27 2014-05-28 厦门大学附属中山医院 用于指导华法林个体化用药的多重pcr联合焦磷酸测序试剂盒及其检测方法
CN105368826A (zh) * 2015-05-14 2016-03-02 长沙三济生物科技有限公司 焦磷酸测序法检测cyp2c9基因分型的引物对及试剂盒
CN105886606A (zh) * 2015-12-04 2016-08-24 长沙迪安医学检验所有限公司 焦磷酸测序法快速检测华法林代谢酶基因多态性的试剂盒及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KIM, KA等: "Multiplex pyrosequencing method to determine CYP2C9*3, VKORC1*2, and CYP4F2*3 polymorphisms simultaneously: its application to a Korean population and comparisons with other ethnic groups", 《MOLECULAR BIOLOGY REPORTS》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022227363A1 (zh) * 2021-04-28 2022-11-03 浙江大学 含有半胱氨酸的毛细管凝胶电泳样品缓冲液
CN113584144A (zh) * 2021-06-09 2021-11-02 湖南菲思特精准医疗科技有限公司 一种华法林代谢标志物检测试剂盒及其检测方法和应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106755329B (zh) 基于二代测序技术检测α和β地中海贫血点突变的试剂盒
CN105441567B (zh) 一种牦牛foxo1基因单核苷酸多态性的检测方法及其试剂盒
CN104774933A (zh) 用于检测人il28b基因多态性的引物、试剂盒及方法
CN104120180B (zh) 一种人类aldh2基因型检测试剂盒
CN110846399A (zh) 一种心血管疾病个体化用药基因检测体系试剂盒及其应用
CN103492570B (zh) 一种强直性脊柱炎相关特异性单核苷酸多态性的检测方法及其试剂盒
CN104109716B (zh) 一种人类hla-b27基因分型试剂盒
CN109593847B (zh) 检测微卫星nr24位点稳定性的引物对、试剂盒及方法
CN107201407A (zh) 一种焦磷酸测序法检测vkorc1和cyp2c9基因多态性的引物及方法
WO2023142619A1 (zh) 一种扩张型心肌病基因检测标志物及其应用
CN110656112A (zh) 一种Liddle综合征基因检测试剂盒
CN110205363A (zh) 载脂蛋白e基因kasp分型检测试剂盒及其方法
CN105274228A (zh) 一种华法林药物基因突变位点检测的试剂盒及检测方法
CN104774918A (zh) 基于实时荧光pcr的il28b基因多态性检测试剂盒
CN103695534B (zh) 检测dhfr的c829t单核苷酸多态性的引物和方法
CN107287299A (zh) 基于焦磷酸测序技术的用于cyp2c19基因多态性快速检测的方法
CN103789415B (zh) 检测cftr基因δf508位点突变的方法和寡核苷酸
CN105969842A (zh) 基于AllGlo探针的Glu504lys检测分型试剂盒及其分型方法
CN101182584A (zh) 一种与衰老或长寿关联的基因检测试剂盒
CN105274221A (zh) 一种cyp3a5*3的检测试剂盒
CN104531689A (zh) 与哮喘相关的基因单核苷酸多态性位点、预测哮喘的试剂盒及其应用
CN103882113B (zh) 一种预测强直性脊柱炎易感性的试剂盒
CN102251059B (zh) 乙型肝炎病毒拉米夫定耐药核酸定量检测引物及其探针
CN110484619A (zh) 一种利用rs11249454检测氯吡格雷药效试剂盒
CN110760578A (zh) 一种检测人cyp2c9和vkorc1基因多态性的试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20170926