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CN106755329B - 基于二代测序技术检测α和β地中海贫血点突变的试剂盒 - Google Patents

基于二代测序技术检测α和β地中海贫血点突变的试剂盒 Download PDF

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CN106755329B
CN106755329B CN201611063372.4A CN201611063372A CN106755329B CN 106755329 B CN106755329 B CN 106755329B CN 201611063372 A CN201611063372 A CN 201611063372A CN 106755329 B CN106755329 B CN 106755329B
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dna
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何升
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Guangxi Maternal and Child Health Hospital
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Guangxi Maternal and Child Health Hospital
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Abstract

本发明涉及一种基于二代测序技术检测α和β地中海贫血点突变的方法及试剂盒，检测方法包括α和β地中海贫血累及的HBA1和HBA2以及HBB三个基因的外显子、调控、转录区间的PCR扩增引物序列SEQ ID NO1‑17和5’端PCR标记引物序列SEQ ID NO18‑115以及3’端PCR标记引物序列SEQ ID NO116‑213；检测步骤为：（1）、构建第二代测序文库；（2）、第二代测序文库纯化；（3）、第二代测序仪测序；（4）、生物信息学分析，获得结果；检测用的试剂盒包括前述所述的引物序列及第二代测序仪solexa。本发明的检测方法具有操作步骤简单，检测特导性高，检测范围广、成本低等特点。

Description

基于二代测序技术检测α和β地中海贫血点突变的试剂盒
技术领域
本发明涉及一种基于二代测序技术检测α和β地中海贫血点突变的方法及试剂盒，属于分子生物学领域。
背景技术
地中海贫血( thalassemia)，即珠蛋白生成障碍性贫血，是一组由珠蛋白基因缺失或点突变致使珠蛋白肽链合成部分或完全抑制的遗传性溶血性贫血疾病。临床表现根据病情严重程度不同而有所差异，患者主要以贫血、黄疸、肝脾肿大为突出表现。珠蛋白肽链分为α、β、γ、δ种，而地中海贫血主要有α、β、δβ、δ四种类型，以前两种(α、β地中海贫血) 最常见。在我国广西地区人群中总的携带率高达24.5%。此病目前缺乏有效治疗手段，应用相应分析技术通过人群筛查及产前诊断阻止重症患儿出生是国内外公认的首选预防措施。
在我国南方地区主要以α缺失型突变为主，但是点突变也占有很大比率，在广西人群携带率高达9.64%，且不同的点突变对应的表型存在明显的差异。然而目前世界上已经报道的α基因非缺失突变超过200种，β基因超过500种类型。但是目前针对非缺失型地中海贫血的分子诊断的PCR-反向斑点杂交法，其检测范围十分有限，包括我国常见的17种β点突变以及3种α点突突（αWS、αQS、αCS），极有可能造成漏诊，导致重症患儿出生。因此，现在迫切的需要一种方法对多种点突变进行快速检测。
检索到以下关于地中海贫血基因点突变的检测方法的专利：
1、中国专利，申请号：201310528510.1；申请人：苏州发士达生物科技有限公司；发明名称：一种用于β- 地中海贫血β17(A→T) 点突变的检测试剂盒及 ARMS-QPCR 检测方法；摘要：本发明公开了一种用于β-地中海贫血β17(A→T) 点突变的检测试剂盒及 ARMS-QPCR检测方法，其特征在于：检测试剂盒包括 PCR 反应液Ⅰ、PCR 反应液Ⅱ、混合酶液、DNA提取液、阴性对照液和阳性对照品；ARMS-QPCR 检测方法包括样品采集、ARMS 引物设计、样品处理等步骤。本发明提供的一种用于β- 地中海贫血β17(A→T)点突变的检测试剂盒检测待检β- 地中海贫血β17(A→T) 点突变的 DNA 样品时，只需3小时即可完成检测，同时采用实时荧光定量PCR法检测β- 地中海贫血β17(A→T) 点突变基因特异性较强，检测灵敏度高，方法简单，误差小，准确度高。
2、中国专利，申请号：201410510185.0；申请人：广东省妇幼保健院；发明名称：一组基于锁核酸增敏的液相芯片检测地中海贫血基因点突变的探针、检测试剂盒及检测方法；摘要：本发明公开一组基于锁核酸增敏的液相芯片检测地中海贫血基因点突变的探针、检测试剂盒及检测方法。本发明利用锁核酸能灵活修饰探针的特点，设计出用于检测地中海贫血基因点突变的探针，这些探针分别与不同编码的微珠进行耦联；然后设计本发明的特异性引物对突变位点进行扩增得到 PCR 产物，将其与耦联有探针的微珠进行杂交，再用荧光标记试剂进行荧光标记，最后通过液相芯片检测仪进行突变位点的检测。本发明基于LNA 增敏的探针较常规的探针长度缩短，但仍能保持较高的Tm值，使得完全匹配的探针和错配的探针杂交信号比值从原来的不到 2 倍提高到超过 4 倍以上的差异，因而容易区分。
3、中国专利，申请号：201510900715.7；申请人：海南医学院附属医院；发明名称：HBB基因突变和HLA分型检测试剂盒；摘要：本发明提供了一种基于高通量测序技术检测HBB基因突变和HLA分型的方法及相应的试剂盒。其中，所用的引物组合物包括特异性扩增人类胚胎β- 地中海贫血 HBB 基因上下游 1Mb 范围内紧密连锁的多态性位点（SNP）的引物和特异性扩增人类白细胞抗原系统HLA-A 基因上游、HLA-A 基因与HLA-B 基因之间、HLA-B基因与 HLA-DRA 基因之间、HLA-DRA 基因与HLA-DQB1 基因之间以及HLA-DQB1 基因下游范围内紧密连锁的多态性位点（SNP）的引物。本发明的方法具有通用性、多位点 SNP 测序、高通量、成本低、高灵敏度、特异性强的优点。
虽然本发明与上述三份专利检测的内容相似，但是跟本发明相比，前者检测范围更广；并且检测PCR扩增所用的引物序列也不一样；检测所用仪器也不一同，本发明用的是第二代测序仪。第二代测序技术是一种突破性技术，能同时快速地对多条DNA片段进行测序，支持研究人员同时对多种突变进行分析。其技术原理是在不同的DNA片段两端连接特异的序列构建测序所需的DNA文库，通过杂交和桥式PCR将DNA固定到芯片，再通过边合成边测序技术读取DNA碱基信息。利用数据分析软件快速发现文库DNA上的各种突变。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种操作步骤简单，且检测特导性高，检测范围广的能快速针对α和β地中海贫血点突变的检测方法。本发明还提供检测α和β地中海贫血点突变的试剂盒。
本发明的目的是通过以下技术方案实现：
第一方面，本发明提供一种基于二代测序技术检测α和β地中海贫血点突变的方法，其中包括针对检测α和β地中海贫血点突变检测用的PCR扩增引物序列SEQ ID NO：1-17和5’端PCR标记引物序列SEQ ID NO：18-115以及3’端PCR标记引物序列SEQ ID NO：116-213。
优选地，所述的检测方法还包括检测范围，所述检测范围为α和β地中海贫血累及的HBA1和HBA2以及HBB三个基因的外显子、调控和转录区间上的点突变。
第二方面，本发明还涉及基于二代测序技术检测α和β地中海贫血点突变的方法，具体步骤如下：
（1）、构建第二代测序文库；
（2）、第二代测序文库纯化；
（3）、第二代测序仪测序；
（4）、生物信息学分析，获得结果。
所述的步骤（1）构建第二代测序文库，包括1）、准备样品DNA；2）、准备引物和3）、多重PCR构建测序文库；其中，PCR 检测的反应程序为：预变性5min；然后95℃变性45s，60℃退火1.5min，72℃延伸1min扩增20循环。
第三方面，本发明涉及一种基于二代测序技术检测α和β地中海贫血点突变的试剂盒，所述的试剂盒包括上述所述的引物序列。
优选地，所述的试剂盒还包括第二代测序仪，所述测序仪为solexa测序仪。
与现有技术相比，本发明的积极效果是：
1、检测范围广、灵敏度高，本发明PCR扩增区间覆盖HBA1和HBA2以及HBB三个基因的外显子、调控和转录区间，基于第二代测序技术可对Clinvar数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/）关于HBB、HBA1和HBA2三个基因已报道801个点突变进行检测，同时也发现区间内未报道过罕见突变，然而DNA起始量仅需5μg；
2、操作简单，ilumina 标准扩增子文库构建的试剂盒需要末端修复、3’端加A、接头链接、PCR扩增四个步骤而每步都需要纯化，而本发明只需一次PCR扩增和一次纯化就可完成文库构建；
3、通量高，基于高通量测序技术，通过在每个样品上加上不同的标签序列，可以一次地对大量样品进行分析。本发明设计5’端和3’端特异标签序列各96种，能同时进行96×96个样品实验；
4、检测灵敏度高、特异性高，本发明DNA起始量仅需5μg，即可完成超过801种点突变检测，基于二代测序技术，可能扩增序列进行特异识别，检测特异性极高；
5、成本低，本发明建库方法简单，而且随着测序技术的不断发展和测序成本的不断降低，以及一次对大量样品进行分析，检测成本也在不段下降；
6、结果分析简单，本发明通过生物信息分析，结果直接生成文本格式，便于自动化操作。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解为：这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如：sambrook等分子克隆：实验室手册见New York Cold Spring HarborLaboratory 出版社1989年版中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
本实施例的寡核苷酸引物序列由英潍捷基公司生产。
（1）、构建第二代测序文库：
1）、准备样品DNA，用常规方法提取全基因组DNA；
2）、准备引物：将合成的引物加TE溶液稀释到10μM。将PCR扩增引物按下体系混合成MIX：
Figure 673702DEST_PATH_IMAGE001
3）、多重PCR构建测序文库：在PCR体系中，加入2μL DNA、25μL 2×Multiplex PCRBuffer和0.25μL Multiplex PCR Enzyme Mix(TAKARA Multiplex PCR Assay KitVer.2)，以及2μL PCR扩增引物MIX和5’端和3’端特异标记引物各1μL，最后加去离子水至50μL进行PCR反应，预变性5min；然后95℃变性45s，60℃退火1.5min，72℃延伸1min扩增20循环。
（2）、第二代测序文库纯化：向50μL PCR产物中，加入35μL贝克曼磁珠，移入1.5mLPE管，漩涡振荡混匀，室温静止5min后，移入磁力架，待液体澄清后，除去上清，加入70%酒精500μL，静置1min后移除上清，再加入500μL 70%的酒精，1min后移除。室温干燥5min，待酒精挥发后，将标本移下磁力架后，加入27μL TB溶液，充分混匀后，静置3min。再次振荡混匀，再静置3min后，将标本上磁力架，待澄清后，取25μL上清保存。
（3）、第二代测序仪测序：本实施例利用illumina MiSeq Reagent Kit(300cycles PE)试剂盒测序，将200个标本等量混合后，文库混合液稀释到12pmol/μL，并使其变性，制备所需的预填充试剂盒，将文库混合液装到指定槽的试剂盒中，设置实验步骤并检查各运行参数，选择Sequence开始运行，实验结束后查看测序结果。
（4）、生物信息学分析，获得结果；首先对新一代测序数据进行预处理，包括剪除3'端质量值低于20的序列、去除平均质量值低于20的序列；然后使用bwa将质控后的序列比对到参考基因组序列上(版本号hg19)，利用GATK工具判读SNP和Indel位点；利用SNPnexus工具注释SNP，找到可能性的功能性位点，最后利用dbSNP、千人基因组数据库、HGMD等数据库、clinvar数据库进行注释和比较，从而检测后α和β地中海贫血点突变。本实施例实验操作简单，检测灵敏度，范围广。
序列表
<110> 广西壮族自治区妇幼保健院
<120>基于二代测序技术检测α和β地中海贫血点突变的试剂盒
<160> 213
<170> PatentIn version 3.5
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<212> DNA
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<223> 人工序列
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caagcagaag acggcatacg agatccagcc ggtctcgtgg gctcgg 46
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<212> DNA
<213> Artifieial Sequence
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caagcagaag acggcatacg agatattaga cgtctcgtgg gctcgg 46
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caagcagaag acggcatacg agatgacttg ggtctcgtgg gctcgg 46
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caagcagaag acggcatacg agattctctc agtctcgtgg gctcgg 46
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caagcagaag acggcatacg agatagatcg cgtctcgtgg gctcgg 46
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caagcagaag acggcatacg agatatacca tgtctcgtgg gctcgg 46

Claims (1)

1. 基于二代测序技术检测α和β地中海贫血点突变的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括α和β地中海贫血累及的HBA1和HBA2以及HBB三个基因的外显子、调控、转录区间的PCR扩增引物序列和两端PCR标记引物序列，其中PCR扩增引物序列为SEQ ID NO：1-17，两端PCR标记引物序列分别为5’端PCR标记引物序列SEQ ID NO：18-115及3’端PCR标记引物序列SEQ ID NO：116-213；
所述的试剂盒还包括第二代测序仪，所述测序仪为solexa测序仪；
所述试剂盒的使用方法具体步骤如下：
（1）、构建第二代测序文库；
（2）、第二代测序文库纯化：向50μL PCR产物中，加入35μL贝克曼磁珠，移入1.5mL PE管，漩涡振荡混匀，室温静止5min后，移入磁力架，待液体澄清后，除去上清，加入70%酒精500μL，静置1min后移除上清，再加入500μL 70%的酒精，1min后移除；室温干燥5min，待酒精挥发后，将标本移下磁力架后，加入27μL TB溶液，充分混匀后，静置3min；再次振荡混匀，再静置3min后，将标本上磁力架，待澄清后，取25μL上清保存；
（3）、第二代测序仪测序：利用illumina MiSeq Reagent Kit 300cycles PE试剂盒测序，将200个标本等量混合后，文库混合液稀释到12pmol/μL，并使其变性，制备所需的预填充试剂盒，将文库混合液装到指定槽的试剂盒中，设置实验步骤并检查各运行参数，选择Sequence开始运行，实验结束后查看测序结果；
（4）、生物信息学分析，获得结果；首先对新一代测序数据进行预处理，包括剪除3 '端质量值低于20的序列、去除平均质量值低于20的序列；然后使用bwa将质控后的序列比对到版本号hg19的参考基因组序列上，利用GATK工具判读SNP和Indel位点；利用SNPnexus工具注释SNP，找到可能性的功能性位点，最后利用dbSNP、千人基因组数据库、HGMD数据库、clinvar数据库进行注释和比较，从而检测α和β地中海贫血点突变；
所述的步骤（1）构建第二代测序文库，包括以下几个步骤：
1）、准备样品DNA，用常规方法提取全基因组DNA；
2）、准备引物：将合成的引物加TE溶液稀释到10μM；将PCR扩增引物按以下体系混合成MIX：SEQ ID NO：1-17所示PCR扩增引物的浓度均为10mM；体积分别为0.4、0.4、0.6、0.6、0.6、0.6、0.4、0.4、2.5、2.5、3.5、3、6.5、1、1、0.6、0.6μL；
3）、多重PCR构建测序文库：在PCR体系中，加入2μL DNA、25μL 2×Multiplex PCRBuffer和0.25μL Multiplex PCR Enzyme Mix，以及2μL PCR扩增引物MIX和5’端和3’端特异标记引物各1μL，最后加去离子水至50μL进行PCR反应；PCR检测的反应程序为：预变性5min；然后95℃变性45s，60℃退火1.5min，72℃延伸1min扩增20循环。
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