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CN107174658B - 人用水痘病毒灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

人用水痘病毒灭活疫苗及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体提供一种人用水痘病毒灭活疫苗及其制备方法，是将β‑丙内酯与水痘病毒浓缩液按体积比1：2000～1：8000混合，在3～5℃条件下灭活12～36h，随后在34～37℃条件下水解1.5～3h，得到灭活病毒液；灭活病毒液经纯化、分装、冻干后制备成灭活疫苗。本方法制备的水痘病毒灭活疫苗安全、有效，接种反应轻微，对不适用减毒活疫苗的免疫功能低下的人群更适用。

Description

人用水痘病毒灭活疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及人用水痘病毒灭活疫苗及其制备方法。
背景技术
水痘和带状疱疹的病原体均为水痘-带状疱疹病毒(Varicella-zoster virus,VZV)。VZV属疱疹病毒科，为双链DNA病毒。
VZV是一种具有高度传染性的疱疹病毒，既可引发水痘，也可引发带状疱疹(herpes zoster，HZ)；前者通常见于儿童期和年轻成年人，后者则是潜伏VZV再活化和复制导致。在初次感染VZV后，病毒可在感觉神经节中保持休眠状态，这样的VZV再活化与免疫功能下降有关，多发生在老年人或免疫功能低下的人群中(Weinberg等人，Journal ofInfectious Diseases(2009)200：1068-77)。有些患者在HZ皮疹痊愈后与HZ相关的疼痛还会持续很长时间。
使用疫苗预防水痘的作用已在全球范围内得到认同。基于减毒活病毒(VZV Oka株)的水痘疫苗于上世纪70年代和80年代研制和进行临床试验。1984年，该疫苗首先在德国和瑞典获得上市许可。目前市售的有数种冻干水痘减毒活疫苗，可冰箱冷藏或冷冻。这些疫苗有的为单价疫苗(仅含VZV病毒成份)，有的则与麻疹、腮腺炎、风疹三联疫苗(MMR)制成联合疫苗。
研究表明单价水痘减毒活疫苗耐受性良好，健康儿童接种水痘疫苗后最常报告的不良事件均较轻微，其中包括注射部位轻度压痛、发红和皮疹。然而，活减毒疫苗可能不适用于免疫功能低下的患者。由VZV Oka株引起的罕见并发症包括肺炎、肝炎、带状疱疹脑膜炎、复发性带状疱疹、严重皮疹以及继发性VZV传播，这主要发生于免疫功能受损者或接种时有未被确诊的其他严重病症的患者。免疫功能低下的个体，包括患有血液恶性肿瘤的患者、经历免疫抑制治疗的患者、接受造血干细胞移植(HCT)或实体器官移植(SOT)的患者、HIV感染的患者和具有自身免疫性疾病的患者，具有相对于一般群体更高的发展HZ的发病率。此外，这些患者群体处于发展严重和威胁生命的并发症的增加的风险中。目前，对水痘的治疗没有特效药，以预防为主，只能通过接种水痘疫苗的方法预防感染VZV病毒，所以安全有效的水痘疫苗对高危人群免疫意义重大。
为适应上述免疫低下者使用该疫苗，目前研究人员已经研究开发了灭活疫苗、病毒样颗粒疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗。通过热灭活VZV或通过使用亚单位疫苗可以开发对于免疫功能低下受试者的更安全的疫苗(Cohen,J.I.,(2008)J.Infect.Dis.197(Suppl 2):S237-S241)。Redman等人(J.Infectious Diseases(1997)176:578-85)描述了通过在50℃加热而灭活的并导致<1.2pfu/0.5mL的感染性病毒含量的灭活VZV疫苗。然而对于免疫功能低下的患者，即便该水平的感染性也是具有风险的。美国专利号为6214354和5997880提到了使用灭活VZV疫苗的潜能并公开了生产并测试热处理的疫苗的例子；默沙东公司的专利(CN 103167880A)中使用了γ辐射灭活VZV病毒来制造水痘灭活疫苗。如果开发了灭活VZV的方法，所述方法可制得在免疫功能低下的患者中安全并有效(即无感染性但保留其免疫原性和抗原性)的VZV样品，这将满足重大的医疗需要。
目前，已知的对于水痘疫苗灭活的方法有热灭活和γ射线灭活。热灭活最早由Smith等研制猪霍乱灭活菌苗时提出，该方法简单易行。但加热杀死微生物的方法比较粗糙，容易造成蛋白质变性，进而免疫原性受到明显影响，而且这种方法可能存在灭活不彻底的可能，残留的病毒含量对于免疫力低下的患者仍然是不安全的；另外，有研究表明60Coγ射线辐照所产生的单态氧和自由基对蛋白质具有较大的损伤作用，主要表现为蛋白质一级结构上的肽键断裂、氨基酸组成发生变化和空间构象中β折叠含量减少，紧密的结构趋于松散，无规则卷曲明显增加。生活在细胞系统中的病毒具有最大的抗辐射性，双链病毒没有单链病毒对电离辐射的灭活作用敏感。辐照工艺中剂量的均匀度控制不好也会影响疫苗质量。
β-丙内酯(beta-propiolacto ne,BPL)又名羟基丙酸β内酯，是一种杂环类化合物(C3H4O2)，对病毒具有很强的灭活作用，是一种良好的病毒灭活剂。BPL灭活机制是作用于病原体DNA或RNA，通过与核酸的嘌呤碱基(主要是鸟嘌呤)反应破坏核酸的结构，但不直接作用于蛋白质，因此能保持良好的免疫原性。BPL极易水解，在37℃水浴水解2h后消失，其水解为无毒性的人体脂肪代谢产物β-羟基丙酸。另外，由于其能在疫苗液体中完全水解，不必考虑在成品疫苗中的残留，接种反应也轻微。同时，β-丙内酯灭活病原时间短，从而显著地缩短了疫苗生产周期，提高了经济效益。
发明内容
本发明的目的是解决上述现有技术的不足，提供人用水痘病毒灭活疫苗及其制备方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
人用水痘病毒灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
(1)将人胚胎成纤维(MRC-5)细胞传代不超过34代；
(2)当细胞扩增到融合度90％以上时，将水痘病毒接种到细胞中进行感染；
(3)将感染了水痘病毒的细胞加入含有2％～5％胎牛血清的最低必须(MEM)培养基中，置于34～37℃细胞培养箱培养；
(4)观察细胞病变程度，待致细胞病变效应(CPE)达到50％以上时，倒掉培养基，用磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤细胞；
(5)加入0.02～0.05％的乙二胺四乙酸(EDTA)溶液洗脱感染细胞，将细胞悬液离心处理，去掉上清，加入稳定剂合并、混匀，单瓶取样做无菌检测，-65～-80℃冻存；
(6)将检测无菌的样品进行超声破碎，离心，收集上清液，即病毒原液；
(7)采用超滤膜包对病毒原液进行超滤浓缩；
(8)检测超滤浓缩后的病毒液蛋白含量和病毒滴度；
(9)将β-丙内酯与蛋白含量为35～95mg/mL、病毒滴度不小于4.0lgPFU/mL的病毒浓缩液按体积比1：2000～1：8000混合，在3～5℃条件下灭活12～36h，随后在34～37℃条件下水解1.5～3h，得到灭活病毒液；
(10)采用柱层析纯化灭活病毒液，得到灭活病毒纯化液；
(11)将灭活病毒纯化液在人胚胎成纤维(MRC-5)细胞至少盲传3代，检测病毒滴度，结果均应无空斑形成。
(12)分装、冻干灭活病毒纯化液即得水痘病毒灭活疫苗。
优选地，步骤(2)所述将病毒接种到细胞中进行感染的感染复数(M.O.I.)为0.01～0.1。
优选地，步骤(5)所述的离心条件为3～5℃下3000～4000rpm离心10～15分钟。
优选地，步骤(6)所述的离心条件为3～5℃下7000～8000rpm离心10～15分钟。
优选地，步骤(7)所述的采用超滤膜包对病毒原液进行超滤浓缩是采用截留分子量为100KD或者300KD的超滤膜包对病毒原液超滤浓缩30～60倍。
优选地，步骤(8)所述的蛋白含量使用Lowry法检测。
优选地，步骤(9)所述的灭活条件为β-丙内酯与病毒浓缩液按体积比1：8000混合，在4℃条件下灭活24h，随后在37℃条件下水解2h。
优选地，步骤(10)所述的纯化方式为使用Sepharose 4FF层析柱将病毒灭活液分批上样，在280nm紫外检测下收取水痘病毒蛋白峰，即为灭活病毒纯化液。
优选地，步骤(8)和(11)所述病毒滴度使用蚀斑法检测。
本发明还保护上述任一项制备方法制备出的人用水痘病毒灭活疫苗。
本发明的有益效果在于：
β-丙内酯直接作用于病原体DNA或RNA，通过与核酸的嘌呤碱基(主要是鸟嘌呤)反应破坏核酸的结构，但不直接作用于蛋白质，与热灭活、γ射线灭活、甲醛灭活相比，具有更好的免疫原性，灭活效果彻底。另外，由于β-丙内酯极易水解，能在疫苗液体中完全水解，水解为无毒性的人体脂肪代谢产物β-羟基丙酸，因此不必考虑在成品疫苗中的残留，接种反应也轻微。同时，β-丙内酯灭活病原时间短，从而显著地缩短了疫苗生产周期，提高了经济效益。本方法制备的水痘病毒灭活疫苗安全、有效，接种反应轻微，对不适用减毒活疫苗的免疫功能低下的人群更适用。
具体实施方式
为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明作进一步描述，以下实施例仅是对本发明进行说明而非对其加以限定。
实施例1人用水痘病毒灭活疫苗制备方法
(1)将MRC-5细胞在细胞培养瓶及细胞工厂中传代至28代；
(2)细胞扩增到融合度90％以上时，将病毒接种到细胞中进行感染，M.O.I.为0.01-0.1；
(3)加入含有2％～5％胎牛血清的MEM培养基，置于34～37℃细胞培养箱培养；
(4)每天观察细胞病变程度，待细胞CPE达到50％以上时，倒掉培养基，用PBS洗涤细胞；
(5)加入0.03％的EDTA溶液洗脱感染细胞，将细胞悬液收集于离心管中，在4℃下4000rpm离心10分钟，去掉上清，加入稳定剂合并、混匀，单瓶取样做无菌检测，-80℃冻存；
(6)将检测无菌的样品置于超声瓶中进行超声破碎，在4℃下8000rpm离心10分钟，收集上清，即病毒原液；
(7)采用截留分子量为100KD的超滤膜包进行50倍浓缩；
(8)Lowry法检测蛋白含量为52mg/mL，蚀斑法检测病毒滴度为4.9lgPFU/mL；
(9)将β-丙内酯与病毒浓缩液按体积比1：6000混合，3～5℃灭活12～36h，35℃水解2h；
(10)柱层析纯化灭活病毒液，根据紫外检测值收取病毒峰，得到灭活病毒纯化液；
(11)灭活病毒纯化液在MRC-5细胞盲传3代，蚀斑法检测病毒滴度；
(12)分装、冻干灭活病毒纯化液即得水痘灭活疫苗；
实施例2病毒浓缩液蛋白浓度的选择
(1)按人用水痘病毒灭活疫苗制备方法步骤(1)-(10)制备5批灭活病毒液；
(2)测得病毒浓缩液的浓度与灭活后的感染性如下表所示：
Figure BDA0001283505110000051
根据上表结果我们选择对蛋白含量为35～95mg/ml的病毒浓缩液进行灭活。
实施例3蚀斑法测定水痘病毒灭活疫苗的感染性
将MRC-5细胞铺6孔板，每孔接种3*105个细胞，5％CO2培养箱34～37℃孵育3～4天后，细胞长成单层后即可测定水痘病毒滴度。吸弃培养基，将水痘病毒灭活疫苗稀释到适当浓度感染细胞，在5％CO2培养箱34～37℃吸附1～2小时，然后每孔补加3mL病毒培养液，在5％CO2培养箱34～37℃培养。培养7～10天后进行染色。计数取平均值，乘以稀释系数和接种体积校正因子，得出水痘病毒灭活疫苗滴度，即用lg PFU/mL来表示，经灭活过的水痘病毒灭活疫苗滴度结果均无空斑形成。
实施例4水痘病毒灭活及灭活验证
(1)按人用水痘病毒灭活疫苗制备方法步骤(1)-(7)得到病毒浓缩液；
(2)将(1)步骤得到的病毒浓缩液检测其蛋白含量和病毒滴度，将蛋白含量为35～95mg/mL且病毒滴度不小于4.0lgPFU/ml的病毒浓缩液按表1～4加入灭活剂β-丙内酯(BPL)进行灭活和水解反应：
表1
Figure BDA0001283505110000061
表2
Figure BDA0001283505110000062
表3
Figure BDA0001283505110000071
表4
Figure BDA0001283505110000072
(3)根据(2)步骤结果确定蛋白含量应为35～95mg/mL，病毒滴度不小于4lgPFU/mL时，灭活剂加入比例为1：2000～1：8000，灭活温度为3～5℃，灭活时间为12～36h，水解温度为34～37℃水解时间为1.5h～3h，以此条件灭活的病毒液接入长成单层细胞的24孔板中，34～37℃吸附1～2h后补充病毒培养液1mL，34～37℃培养70～96h时，收集病毒液接入长成单层细胞的24孔板中，这样连续盲传3代，收集病毒液用蚀斑法测病毒滴度；
(4)按照实施例2中的方法测得灭活后的病毒滴度为0，即说明灭活疫苗没有感染性。
实施例5人用水痘病毒灭活疫苗纯化方法
按人用水痘病毒灭活疫苗制备方法(1)-(9)获得灭活病毒液。使用Sepharose4FF层析柱进行灭活后病毒液的纯化，按照层析柱的上样量将病毒灭活液分批上样，在280nm紫外检测下收取水痘病毒蛋白峰，即为灭活病毒纯化液。
实施例6冻干人用水痘病毒灭活疫苗制备方法
按人用水痘病毒灭活疫苗制备方法(1)-(10)获得灭活病毒纯化液后加入保护剂，分装每剂量0.5mL，冻干成白色疏松体，复溶后为澄明液体。
实施例7
(1)按人用水痘病毒灭活疫苗制备方法(1)-(7)获得病毒浓缩液；
(2)在病毒浓缩液中加入适量的甲醛，进行灭活，在不同时间点取样检测病毒感染性，盲传3代，结果如下表：
灭活时间(h) 感染性
24 有空斑形成
48 有空斑形成
72 无空斑形成
96 无空斑形成
(3)取等体积的病毒浓缩液分别加入甲醛和β-丙内酯灭活，免疫BALB/c小鼠，4周后静脉取血，用ELISA法和FAMA法检测血清中的VZV IgG水平如下表：
VZV IgG阳转率 甲醛 β-丙内酯
ELISA法(％) 62 89
FAMA法(％) 100％ 100％
(4)两种灭活剂的比较如下表：
Figure BDA0001283505110000081
以上所述实施方式仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims (9)

1.人用水痘病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将MRC-5细胞传代不超过34代；
（2）当细胞扩增到融合度90％以上时，将水痘病毒接种到细胞中进行感染；
（3）将感染了水痘病毒的细胞加入含有2％～5％胎牛血清的最低必须培养基中，置于34～37℃细胞培养箱培养；
（4）观察细胞病变程度，待致细胞病变效应达到50％以上时，倒掉培养基，用磷酸盐缓冲溶液洗涤细胞；
（5）加入0 .02％-0 .05％的EDTA溶液洗脱感染细胞，将细胞悬液离心处理，去掉上清，合并、混匀，单瓶取样做无菌检测，-65～-80℃冻存；
（6）将检测无菌的样品进行超声破碎，离心，收集上清液，即病毒原液；
（7）采用超滤膜包对病毒原液进行超滤浓缩，所述的采用超滤膜包对病毒原液进行超滤浓缩是采用截留分子量为100KD或者300KD的超滤膜包对病毒原液超滤浓缩30～60倍；
（8）检测超滤浓缩后的病毒液蛋白含量和病毒滴度；
（9）将β-丙内酯与蛋白含量为35～95mg/mL、病毒滴度不小于4.0lgPFU/mL的病毒浓缩液按体积比1∶8000混合，在3～5℃条件下灭活12～36h，随后在34～37℃条件下水解1.5～3h，得到灭活病毒液；
（10）采用柱层析纯化灭活病毒液，得到灭活病毒纯化液；
（11）将灭活病毒纯化液在MRC-5细胞至少盲传3代，检测病毒滴度，结果均应无空斑形成；
（12）分装、冻干灭活病毒纯化液即得水痘病毒灭活疫苗。
2.根据权利要求1所述的人用水痘病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤（2）所述将病毒接种到细胞中进行感染的感染复数为0.01～0.1。
3.根据权利要求1所述的人用水痘病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤（5）所述的离心条件为3～5℃下3000～4000rpm离心10-15分钟。
4.根据权利要求1所述的人用水痘病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤（6）所述的离心条件为3～5℃下7000～8000rpm离心10-15分钟。
5.根据权利要求1所述的人用水痘病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤（8）所述的蛋白含量使用Lowry法检测。
6.根据权利要求1所述的人用水痘病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤（9）所述的灭活条件为在4℃条件下灭活24h，随后在37℃条件下水解2h。
7.根据权利要求1所述的人用水痘病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤（10）所述的纯化方式为使用Sepharose 4FF层析柱将病毒灭活液分批上样，在280nm紫外检测下收取水痘病毒蛋白峰，即为灭活病毒纯化液。
8.根据权利要求1所述的人用水痘病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤（8）和（11）所述病毒滴度使用蚀斑法检测。
9.一种权利要求1～8任一项制备的人用水痘病毒灭活疫苗。
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