CN109602899B - 一种增强病毒抗原免疫原性的皮内注射技术及其在手足口病疫苗研究中的应用 - Google Patents
一种增强病毒抗原免疫原性的皮内注射技术及其在手足口病疫苗研究中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种增强病毒抗原免疫原性的皮内注射技术及其在手足口病疫苗研究中的应用，所述皮内注射技术适用于人用二价手足口病疫苗，所述人用二价手足口病疫苗由肠道病毒71型（EVA71）和柯萨奇病毒A组16型（CVA16）制备得到。所述疫苗以源自人胚肺的二倍体成纤维细胞（KMB17细胞）作为传代细胞基质制备。通过比较皮内及肌肉注射所述人用二价手足口病灭活疫苗，结果显示经该皮内注射免疫技术方法可以更为快速刺激天然免疫系统相关组分，增强病毒抗原免疫原作用，诱导激活天然免疫反应，启动特异性免疫反应，有效抵御病毒致病。
Description
技术领域
本发明属于人类预防医学的技术领域。更具体的说，本发明涉及一种增强病毒抗原免疫性的免疫注射技术，适用于人用手足口病灭活疫苗。
背景技术
由肠道病毒71型（EVA71）和柯萨奇病毒A组16型（CVA16）感染而导致的人类手足口病（HFMD）是近年来在亚洲—太平洋地区引起各国公共卫生管理层加以特别重视的病毒性传染病之一，该传染病受到普遍关注的主要原因包括两个方面：其一，已在全球各地区引起了若干次涉及人数众多、波及区域较广的大规模暴发流行。其二，在感染的人群中，可发现少数感染的个体出现严重的神经系统损伤及心肺衰竭的临床特征，而这些病人的临床预后通常是十分严重的。据我国疾病预防控制中心统计数据，2008年-2012年我国大陆报道的HFMD病例数均在150余万/年，死亡超过500例/年，而在1998至2000年期间台湾地区也出现的多至数十万儿童的流行。1999年在澳大利亚发生的HFMD大约涉及6000人，其中EV71感染人数约占50%，其余为CoxA16感染。20世纪80年代，手足口病在我国大陆流行主要以CA16感染为主，而进入21世纪后，逐渐转变为EVA71感染为主。韩国、马来西亚、新加坡、越南等地也相继报道有数万人的HFMD发病及数百人的死亡。因此，针对引起HFMD最主要的两种病原EVA71和CVA16研发手足口病疫苗所具有的预防和治疗的公共卫生意义的重要性不言而喻。
EVA71和CVA16均属于小RNA病毒属肠道病毒家族，具有正链RNA基因组，典型的二十面体结构，无包膜，通常通过粪口途径传播或呼吸道传播。病毒所导致的临床症状通常表现为手足口出现特征性疱疹，同时伴有一定程度的发热等感冒症状。个别患者可引起神经系统、呼吸系统的病变或并发症，导致重症甚至死亡。
EVA71自1969年在美国首次分离鉴定出来以后，迄今已出现A、B、C三个基因型，十余个基因亚型（B1-B5、C1-C5），每一个基因亚型又包括若干个毒株。根据现有分子流行病学分析表明，EVA71病毒共有7个血清型（A、O、C、Asia I、South African Territories 1、2、3），各血清型间均有较大程度的交叉。在我国多数地区的优势血清型为C4亚型。
CVA16自上世纪50年代首次分离报道后，研究学者对其进行深入研究，将其分为A、B和C三个基因型，亦有分类将B和C两个基因型合并，B型又可分为B1和B2亚型，B1型可继续分为B1a、B1b、B1c。在环太平地区，CVA16为HFMD的优势流行株。
尽管到目前为止，抗病毒的药物和相应疫苗的研究已取得了一些结果，但是随着针对EVA71的灭活疫苗的使用、手足口病病原谱的变化、各种肠道病毒间的交叉保护能力有限等问题的出现，针对CVA16以及其他肠道病毒的多价手足口病预防性疫苗的研究已成为一个十分迫切的问题。然而，在这样一个病原学复杂、感染致病机理研究尚不是非常清楚的背景下进行疫苗的开发探索，尤其是在CVA16疫苗研发遇到的重重技术瓶颈的情况下，对手足口病多价疫苗的技术工艺建立提出了更高的要求。因此，深入认识已有的EVA71及CVA16病原学、流行病学及感染发病机理相关资料，结合EVA71灭活疫苗的研究经验，二价甚至多价手足口病疫苗的制备及免疫方法的选择显得更为迫切与重要。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，在EVA71灭活疫苗经验的基础上，提供一种适用于人用手足口病灭活疫苗的免疫技术方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种人用二价手足口病灭活疫苗，所述疫苗由肠道病毒71型（EVA71）和柯萨奇病毒A组16型（CVA16）以源自人胚肺的二倍体成纤维细胞（KMB17细胞）作为传代细胞基质制备得到，且所述疫苗是皮内注射的疫苗。使用皮内注射技术方法能够更为快速、有效激活天然免疫系统相关组分，增强疫苗中病毒抗原成分的免疫原作用，诱导激活天然免疫反应，启动特异性免疫反应，有效提高机体对病毒致病的免疫防御能力。
进一步的，所述EVA71保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 16684。
进一步的，所述CVA16保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 6350。
进一步的，所述疫苗的成分包括：
EVA71灭活纯化抗原 100-400U/mL
CVA16灭活纯化抗原 100-400U/mL
氢氧化铝 0.5-0.8mg/mL。
本发明的另一方面：
以上所述的人用二价手足口病灭活疫苗用于制备预防或治疗疾病的药物的用途。
本发明的另一方面：
一种人用二价手足口病灭活疫苗的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
（1）细胞培养：挑选生长致密的KMB-17细胞，弃去培养液，以胰酶消化，而后弃去胰酶液，以DMEM悬浮细胞，得到细胞悬液；
（2）病毒接种及培养：将上述细胞悬液加入细胞工厂中，混匀后置于37℃ 3-4天；长成致密单层后，弃去培养液；分别加入EVA71或CVA16病毒毒种，接种量moi为0.02-0.05；混匀后置于37℃，适时轻轻晃动；而后加入定量细胞生长培养液，置于37℃ 3-4天；待细胞完全病变后，收集病毒收获液；
（3）浓缩：将上述病毒收获液进行过滤处理，去除细胞碎片，而后进行超滤浓缩，得到病毒浓缩液；
（4）纯化：将上述病毒浓缩液上样于Sepharose 6FF柱层析纯化，而后再经iodixanol密度梯度离心纯化，收集纯化后的病毒颗粒峰；采用ELISA抗原检测试剂盒检测EVA71或CVA16抗原含量，Lowry法测定蛋白浓度，配比稀释调整抗原浓度为2000U/mL；
（5）灭活：加入甲醛灭活病毒，再经透析浓缩，电泳和HPLC确定病毒颗粒纯度高于95%，采用ELISA抗原检测试剂盒检测EVA71或CVA16抗原含量，Lowry法测定蛋白浓度，得到灭活纯化抗原液；
（6）配制成品：将上述灭活纯化抗原液分别过滤除菌后，以磷酸缓冲液调整稀释至EVA71 100U/mL、CVA16 100U/mL，同时加入Al(OH)3至终浓度为0.5mg/mL，该产品即为所述的人用二价手足口病灭活疫苗。
本发明相比现有技术的有益效果为：
1、本发明技术方案的提出是基于EVA71和CVA16同属肠道病毒成员，有多种类似的、成功的肠道病毒疫苗的研制经验可以借鉴，尤其是同样导致手足口病的EVA71灭活疫苗的研制经验。作为一种具有安全性和应急意义的疫苗，其受益人群主要为儿童群体，灭活疫苗具有相对的优势。作为新型的预防性疫苗，使用合适的细胞基质可以提升该疫苗的质量品质。目前已经广泛使用于灭活疫苗生产的传代细胞基质主要包括：来自非洲绿猴肾的Vero细胞和来自人胚肺的二倍体成纤维细胞（KMB17细胞）。后者尽管在病毒的生长复制支持能力方面相对Vero细胞较差，但其作为源自人的细胞，具有更好的安全性。同时，结合EVA71灭活疫苗生产技术工艺及质量控制标准正是基于KMB17细胞基质的经验，本发明所描述的人用二价手足口病灭活疫苗也同样适用人二倍体细胞制备；
2、本发明提供了一种使用人二倍体细胞（KMB17细胞）基质制备人用二价手足口病灭活疫苗及其制备方法，EVA71和CVA16两毒株均具有在人二倍体细胞（KMB17细胞）基质中良好生长和复制的能力，毒种吸附接种KMB17细胞后3-4天即可出现典型细胞病变现象；毒种在KMB17细胞上的生长动力曲线表明，8小时内接种细胞即可出现初步的典型病变，24-48小时内出现病变高峰，此时病毒收获液进行滴度检测，其滴度通常为7.0±0.5 LogCCID50；毒种按104.5CCID50/只接种3-4日龄乳鼠，可在3-5天内引起乳鼠出现典型的四肢麻痹或死亡现象；并且，国内外尚无针对EVA71和CVA16 的二价疫苗以及多价疫苗上市，也未见相关的专利授权；
3、本发明所述的人用二价手足口病灭活疫苗的免疫方法，为皮内注射免疫，相比皮内及肌肉途径，皮内注射免疫能够有效启动天然免疫系统以保证该疫苗能够有效诱导良好的免疫反应，能够有效抵御病毒致病。
附图说明
图1为EVA71和CVA16在KMB17细胞上的生长动力曲线；
图2为所述人用二价手足口病灭活疫苗经皮内、肌肉免疫小鼠两针后一个月诱导的中和抗体效价检测；
图3为所述人用二价手足口病灭活疫苗经皮内、肌肉免疫小鼠接种局部组织中天然免疫信号分子检测；
图4 为所述人用二价手足口病灭活疫苗经皮内、肌肉免疫小鼠接种局部组织中抗原与ILCs的共定位关系；
图5 为所述人用二价手足口病灭活疫苗经皮内、肌肉免疫小鼠接种局部组织中抗原与树突状细胞（DCs）的共定位关系；
图6 为所述人用二价手足口病灭活疫苗经皮内免疫小鼠激活的树突状细胞（DCs）及天然免疫淋巴细胞（ILCs）对T细胞的抗原递呈及T细胞特异性增殖反应；
图7为所述人用二价手足口病灭活疫苗经皮内、肌肉免疫小鼠其子代动物的免疫保护性。
具体实施方式
通过借助以下实施例将更加详细的说明本发明。需要指出的是，以下实施例仅为说明性的，本发明的保护范围并不受这些实施例的限制。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
所述肠道病毒71型（EVA71）：已于2018年10月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101），保藏编号为CGMCC No. 16684。
所述柯萨奇病毒A16型（CVA16）：已于2012年07月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101），保藏编号为CGMCC No. 6350。
实施例1
本实施例提供了一种人用二价手足口病灭活疫苗的制备方法，具体步骤如下：
（1）细胞培养：根据KMB-17细胞生产检定规程，挑选生长致密的第28代KMB-17细胞，弃去培养液，以0.1%胰酶消化，弃去胰酶液，以原培养液体积的4%体积DMEM悬浮细胞，得到细胞悬液；
（2）病毒接种及培养：适量上述细胞悬液加入细胞工厂中，混匀后置于37℃ 3-4天；长成致密单层后，弃去培养液；分别加入EVA71或CVA16病毒毒种，接种量moi为0.02-0.05；混匀后置于37℃，适时轻轻晃动；30min后，加入定量细胞生长培养液，置于37℃ 3-4天；待细胞完全病变后，收集病毒收获液；
（3）浓缩：将上述病毒收获液用SAS单芯过滤装置过滤，去除细胞碎片；使用MasterFlex超滤浓缩仪进行超滤浓缩，得到病毒浓缩液；
（4）纯化：一定体积的病毒浓缩液上样于Sepharose 6FF柱层析纯化，而后再经iodixanol密度梯度离心纯化，收集纯化后的病毒颗粒峰；采用ELISA抗原检测试剂盒检测EVA71或CVA16抗原含量，Lowry法测定蛋白浓度，配比稀释调整抗原浓度为2000U/mL；
（5）灭活：按1:2000比例加入甲醛37℃ 12天灭活病毒，再经透析浓缩至原体积的5%，电泳和HPLC确定病毒颗粒纯度高于95%，采用ELISA抗原检测试剂盒检测EVA71或CVA16抗原含量，Lowry法测定蛋白浓度，得到灭活纯化抗原液；
（6）配制成品：将上述灭活纯化抗原液分别过滤除菌后，以磷酸缓冲液调整稀释至EVA71 100U/mL、CVA16 100U/mL，同时加入Al(OH)3至终浓度为0.5mg/mL，该产品即为所需的人用二价手足口病灭活疫苗成品。
实施例2
本实施例是实施例1所述人用二价手足口病灭活疫苗制备过程中，各中间产物的分布检测。
其中，病毒收获液、病毒浓缩液、灭活纯化抗原液、半成品均为无异物、无沉淀的澄清液体，无菌检测、支原体检测均为阴性，无异常毒素，pH 7.2-8.0，见表1。
如图1所示，病毒接种KMB17细胞后的不同时间点取样，进行感染性滴度检测。结果表明8小时内接种细胞即可出现初步的典型病变，24-48小时内出现病变高峰，其滴度通常为7.0±0.5LogCCID50。
实施例3
本实施例对实施例1制备得到的所述人用二价手足口病灭活疫苗成品的安全性检测。
疫苗成品按0.2mL/只注射体重为18-20g小鼠腹腔、皮内、肌肉，各组20只，一月内应无死亡，小鼠体重增加同于正常生理盐水对照组，见表2。
疫苗成品甲醛含量不高于50μg/剂，细菌内毒素不高于100EU/剂。且在无菌检测中为阴性，见表3。
实施例4
本实施例对实施例1制备得到的所述人用二价手足口病灭活疫苗成品经皮内免疫注射能够快速有效刺激天然免疫反应相关分子，增强疫苗中病毒抗原成分的免疫原作用，诱导良好的免疫反应。
疫苗成品按0.2mL/只以皮内和肌肉途径分别注射体重为18-20g小鼠两次（0、1月），可在动物体内产生高于64效价的抗EVA71中和抗体以及高于32效价的抗CVA16中和抗体；与此同时，佐剂对照组并不能诱导相应抗体产生，由图2可见，所述人用二价手足口病灭活疫苗经皮内注射方法免疫可具有良好的免疫原性。由图3可知，通过对疫苗成品经皮内、肌肉免疫小鼠接种局部组织中天然免疫信号分子检测，证明所述人用二价手足口病灭活疫苗经皮内注射方法免疫可激活天然免疫信号相关分子表达。由图4可知，通过对疫苗成品经皮内、肌肉免疫小鼠接种局部组织中抗原与ILCs的共定位关系，证明抗原与ILCs共定位，且表现为接种后12小时较高的共定位率，随后至24、48小时逐渐减少的趋势。由图5可知，通过对疫苗成品经皮内、肌肉免疫小鼠接种局部组织中抗原与DCs的共定位关系，证明抗原与DCs共定位，且表现为随着时间延长两者共定位频率的增加趋势。有图6可知，通过对疫苗成品经皮内免疫小鼠激活的DCS及ILCS对T细胞的抗原递呈及T细胞特异性增殖反应，证明二价手足口病灭活疫苗经皮内注射方法免疫可激活T细胞特异性增殖反应。
实施例5
本实施例为实施例1制备得到的所述人用二价手足口病灭活疫苗成品的保护性检测。
疫苗成品按0.2mL/只以皮内和肌肉途径注射体重为18-20g小鼠两次（0、1月），一月后交配产子代，经皮内途径免疫的小鼠诞下的至少90%以上子代可抵御的EVA71和CVA16致死剂量病毒攻击，参见图7，证明所述人用二价手足口病灭活疫苗经皮内注射方法免疫具有良好的保护效果。
Claims (2)
1.一种人用二价手足口病灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)细胞培养：以DMEM液培养KMB-17细胞；
(2)病毒接种及培养：将EVA71或CVA16病毒毒种分别加入长成致密单层的KBM-17细胞中，置于37℃培养；待细胞完全病变后，收集病毒收获液；
(3)浓缩：将上述病毒收获液分别进行过滤处理，去除细胞碎片，而后进行超滤浓缩，得到病毒浓缩液；
(4)纯化：将上述病毒浓缩液分别上样于Sepharose 6FF柱层析纯化，而后再经iodixanol密度梯度离心纯化，收集纯化后的病毒颗粒峰；
(5)灭活：加入甲醛分别灭活病毒，再经透析浓缩，得到灭活纯化抗原液；
(6)配制成品：将上述灭活纯化抗原液分别过滤除菌后，以磷酸缓冲液调整稀释至EVA71 100-400U/mL、CVA16 100-400U/mL，同时加入Al(OH)3至终浓度为0.5-0.8mg/mL，该产品即为所述的人用二价手足口病灭活疫苗；
所述EVA71保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.16684；
所述CVA16保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.6350。
2.权利要求1所述方法制备得到的人用二价手足口病灭活疫苗在制备预防疾病的药物的用途。
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