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CN107156112A - 一种用于cik细胞于‑80℃直接冻存的冻存液 - Google Patents

一种用于cik细胞于‑80℃直接冻存的冻存液 Download PDF

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CN107156112A
CN107156112A CN201710636110.0A CN201710636110A CN107156112A CN 107156112 A CN107156112 A CN 107156112A CN 201710636110 A CN201710636110 A CN 201710636110A CN 107156112 A CN107156112 A CN 107156112A
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cik cells
cik
cryopreservation
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胡攀勇
张钟祥
张世超
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SHANDONG XINRUI BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.
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Nanjing Bai Tektronix Biological Technology Co Ltd
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Abstract

本发明公开了一种用于CIK细胞于‑80℃直接冻存的冻存液，该冻存液以RPMI‑1640培养液为基质，在基质中添加DMSO、FBS复配而成，基质中还添加有效量的人β2‑微球蛋白。使用本发明提供的细胞冻存液冻存CIK细胞时，可以直接于‑80℃冻存，且不会导致CIK细胞杀伤力明显降低，可以简化CIK细胞低温冻存工艺。

Description

一种用于CIK细胞于-80℃直接冻存的冻存液
技术领域
本发明属于细胞冻存领域，具体涉及一种用于CIK细胞于-80℃直接冻存的冻存液。
背景技术
冻存CIK细胞时，一般降温程序为：首先于4℃冰箱中放置1h，然后-20℃冰箱中放置2h，最后转至-80℃低温冰箱放置(或用液氮保存)，程序繁琐。但是，若直接将CIK细胞转至-80℃低温冰箱保存，会显著降低CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性【参考文献：-80℃冰箱直接冻存对细胞因子诱导的杀伤细胞杀伤活性的影响，细胞与分子免疫学杂志，2012，28(10)】。
这主要与细胞冻存液有关，现有冻存液不适合用作CIK细胞于-80℃直接冻存的保护剂。
发明内容
本发明旨在克服现有技术的不足，简化CIK细胞低温冻存工艺，提供一种用于CIK细胞于-80℃直接冻存的冻存液。
本发明通过如下技术方案得以实现：
一种细胞冻存液，以RPMI-1640培养液为基质，在基质中添加DMSO、FBS复配而成，基质中还添加有效量的人β2-微球蛋白。
优选地，1L基质添加1-2g人β2-微球蛋白。
优选地，1L基质添加80-120mLDMSO。
优选地，1L基质添加180-220mLFBS。
上述细胞冻存液在CIK细胞冻存方面的应用。
本发明优点：
使用本发明提供的细胞冻存液冻存CIK细胞时，可以直接于-80℃冻存，且不会导致CIK细胞杀伤力明显降低，可以简化CIK细胞低温冻存工艺。
附图说明
图1为不同CIK细胞对K562细胞的杀伤率(％)。
具体实施方式
为了更好地解释本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步介绍。实施例中未特别强调的实验材料均为常规实验材料，属于本领域技术人员易于获得的范畴。
实施例1
一、实验材料和方法
1、细胞冻存液的配制
在RPMI-1640培养液(美国Gibco公司)中添加二甲基亚砜(DMSO)、胎牛血清(FBS，美国Gibco公司)和人β2-微球蛋白(购于武汉戴安生物技术有限公司，货号P0008)，其中：1LRPMI-1640培养液中分别添加1.5g人β2-微球蛋白、100mL DMSO、200mLFBS。混合均匀后于4℃低温保存，使用前取出并轻轻摇匀。
另按照常规配方配制对比冻存液，对比冻存液的成分为含10％DMSO及20％FBS的RPMI-1640作为冻存剂。
2、CIK细胞的培养扩增
取肝素抗凝的健康志愿者外周血20ml，用淋巴细胞分离液密度梯度离心(2400×g，20min)，轻轻吸取灰白色层的单个核细胞，用生理盐水洗涤3次，以RPMI-1640培养液调整细胞密度为5×106/mL，加到培养瓶内，每瓶15mL，置37℃、5％CO2培养箱中培养2h，轻轻摇匀，吸出悬浮细胞，离心后去上清用RPMI-1640培养液(含100mL/L FBS、rhIL-2500U/mL，小鼠抗人CD3单克隆抗体500ng/mL，IFN-γ1000U/ml，rhIL-1100U/mL)调细胞密度为2.5×106/mL，加到培养瓶内，每瓶20mL。接种当天记为0天，每隔3d半量换液并补足rhIFN-γ及rhIL-2。
3、CIK细胞的冻存和复苏
CIK培养至第12天时，留1瓶CIK用于检测杀伤活性外，收集其余细胞，计数，分别用上述本发明配方冻存液和对比冻存液调整细胞密度为5×107/mL，直接冻存于-80℃冰箱。
冻存6个月后，将冻存管从-80℃冰箱取出后立即投入40℃水浴中快速融化，800r/min离心10min，弃上清，用RPMI-1640培养液(含100mL/L FBS、rhIL-2500U/mL，IFN-γ1000U/mL，rhIL-1100U/mL)重悬细胞，调整细胞密度为2.5×106/mL，37℃、5％CO2培养箱内培养。
3、CIK细胞的杀伤活性
分别将培养至第12天未冻存、用本发明细胞冻存液冻存6月复苏培养5天、用对比冻存液冻存6月复苏培养5天的CIK细胞与对数期的K562细胞按照效靶比20:1混合，同时设单独的靶细胞及效应细胞孔，用LDH释放法，测定490nm的吸光度(A)值，计算各组CIK对K562细胞的杀伤率(％)。
二、实验结果
培养至第12天未冻存、用本发明细胞冻存液冻存6月复苏培养5天、用对比冻存液冻存6月复苏培养5天的CIK细胞对K562细胞的杀伤率如表1和图1所示。与未冻存的CIK细胞相比，用本发明细胞冻存液冻存6月复苏培养5天、用对比冻存液冻存6月复苏培养5天的CIK细胞对K562细胞的杀伤率均降低，但是用本发明细胞冻存液冻存6月复苏培养5天的CIK细胞对K562细胞的杀伤率降低不明显，显著优于对比冻存液的冻存效果。
表1不同CIK细胞对K562细胞的杀伤率(％)
上述结果表明，使用本发明提供的细胞冻存液冻存CIK细胞时，可以直接于-80℃冻存，且不会导致CIK细胞杀伤力明显降低，可以简化CIK细胞低温冻存工艺。
上述实施例仅用于进一步解释本发明的技术方案，本领域技术人员应当明白，任何简单替换或修改均不脱离本发明，本发明的保护范围并不受限于上述具体实施例。

Claims (5)

1.一种细胞冻存液，以RPMI-1640培养液为基质，在基质中添加DMSO、FBS复配而成，其特征在于：基质中还添加有效量的人β2-微球蛋白。
2.根据权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于：1L基质添加1-2g人β2-微球蛋白。
3.根据权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于：1L基质添加80-120mLDMSO。
4.根据权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于：1L基质添加180-220mLFBS。
5.权利要求1-4任一所述细胞冻存液在CIK细胞冻存方面的应用。
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