CN105394026A - 一种造血干细胞冻存新方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种造血干细胞冻存新方法，第一步，取造血干细胞保护剂、造血干细胞悬液或骨髓液，体积比为1-2:6；第二步，将造血干细胞悬液或骨髓液与造血干细胞保护剂混合均匀，然后排净空气、密封放入-80℃冰箱保存12小时；第三步，取出上述的造血干细胞悬液或骨髓液与造血干细胞保护剂混合液，然后再加入造血干细胞保护剂,造血干细胞保护剂与混合液的体积比为1：3，再次排净空气、密封放入-80℃冰箱保存；本发明冻存方法简便易操作，冻存效果更好。
Description
技术领域
本发明涉及一种造血干细胞冻存方法。
背景技术
造血干细胞是血液系统中的成体干细胞，是一个异质性的群体，具有长期自我更新的能力和分化成各类成熟血细胞的潜能。它是研究历史最长且最为深入的一类成体干细胞，对研究各类干细胞，包括肿瘤干细胞，具有重要指导意义。血液系统中的成熟细胞寿命极短，因此在人的一生中，造血干细胞需要根据机体的生理需求适时的补充血液系统各个成熟细胞组分。同时在损伤、炎症等应激状态下，造血干细胞也扮演着调节和维持体内血液系统各个细胞组分的生理平衡的角色。
造血干细胞在临床上应用极为广泛，造血干细胞冻存是保证造血干细胞移植成功的关键技术之一，故其冻存方式尤为重要。目前临床造血干细胞冻存有-196℃液氮程控降温保存和-80℃非程控降温保存，前者能长期保存且细胞损伤少，一般可保存23～25年，但操作复杂、设备昂贵，解冻后有细胞凝集现象，后者可保存干细胞1～2年，其操作相对简便、费用低，但保存细胞时间及细胞活性受限。
探索一种操作简便、快速、成本低廉及保存时间更长的干细胞冻存方法，对于临床造血干细胞的储存、应用及造血干细胞移植成功具有重要意义。在造血干细胞的冻存中，使用的冻存剂及方法均非常重要。目前应用于-80℃低温保存干细胞的保护剂有二甲基亚砜(下称DMSO)、CP-1、羟乙基淀粉、RPMI1640培养基、人血白蛋白等，不同的保护剂的配方及使用方法差异较大，对干细胞的保存效果与保存时间也存在差异，多数保存细胞的存活率为80％左右，干细胞安全难以保证，一些冻存方法还存在操作复杂缺点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种造血干细胞的冷冻保存方法，操作简便、保存成本低，细胞存活率更高。
为了实现以上目的，本发明的技术方案如下：造血干细胞冻存新方法，第一步，取造血干细胞保护剂、造血干细胞悬液或骨髓液，体积比为1-2:6；第二步，将造血干细胞悬液或骨髓液与造血干细胞保护剂混合均匀，然后排净空气、密封放入-80℃冰箱保存12小时；第三步，取出上述的造血干细胞悬液或骨髓液与造血干细胞保护剂混合液，然后再加入造血干细胞保护剂,造血干细胞保护剂与混合液的体积比为1：3，再次排净空气、密封放入-80℃冰箱保存；
所述的造血干细胞保护剂由试剂A和试剂B组成，试剂A与试剂B的体积比为2：3；
所述试剂A由二甲基亚砜、RPMI1640无菌培养基、羟乙基淀粉组成，溶剂为生理盐水，二甲基亚砜、RPMI1640无菌培养基、羟乙基淀粉的质量百分比分别为30％、5％、15％；
所述试剂B为人血白蛋白溶液，人血白蛋白的质量百分比为10％。
更加优选的技术方案，所述的造血干细胞保护剂、造血干细胞悬液或骨髓液的体积比为1.5:6。
以上体积的单位均为ml。
其中第三步中造血干细胞保护剂与混合液的体积比为1：3，混合液指第二步造血干细胞悬液或骨髓液与造血干细胞保护剂混合均匀得到的混合液。
二甲基亚砜(DMSO)具有高极性、高沸点、热稳定性好、与水混溶的特性，能溶于乙醇、丙醇、苯和氯仿等大多数有机物，被誉为“万能溶剂”。
与现有技术方案相比，本发明的有益效果：第一，造血干细胞保护剂分两次加入造血干细胞悬液或骨髓液，通过实验发现粒细胞巨噬细胞集落生成单位CFU-GM略高与传统冻存方法，但是细胞活力、CD34+细胞回收率的检测明显高于传统方法保存效果；第二，本发明保存方法能较简便的在-80℃非程控降温的条件下保存造血干细胞，保存简单方便，为临床外周血造血干细胞的储存应用及造血干细胞移植提供可靠保证。
具体实施方式
下面对本发明作进一步说明。
实施例：造血干细胞冻存新方法，第一步，取造血干细胞保护剂、造血干细胞悬液或骨髓液，体积比为1.5:6；第二步，将造血干细胞悬液或骨髓液与造血干细胞保护剂混合均匀，然后排净空气、密封放入-80℃冰箱保存12小时；第三步，取出上述的造血干细胞悬液或骨髓液与造血干细胞保护剂混合液，然后再加入造血干细胞保护剂,造血干细胞保护剂与混合液的体积比为1：3，再次排净空气、密封放入-80℃冰箱保存；造血干细胞保护剂由试剂A和试剂B组成，试剂A与试剂B的体积比为2：3；试剂A由二甲基亚砜、RPMI1640无菌培养基、羟乙基淀粉组成，溶剂为生理盐水，二甲基亚砜、RPMI1640无菌培养基、羟乙基淀粉的质量百分比分别为30％、5％、15％；试剂B为人血白蛋白溶液，人血白蛋白的质量百分比为10％。
按照以上方法制备造血干细胞保护剂150ml+250ml，准备600ml(A组)+600ml(B组)+600ml(C组)造血干细胞悬液，取上述150ml保护剂与600ml(C组)造血干细胞混合均匀，分成10份分别装入10个密封袋保存，作为C组试验用。
实验一共分3组即A,B,C，每组分别采用10个密封袋保存，采用本发明技术方案和传统的冻存方案在不同时间点进行抽样检测，每组的数据均取平均值(即每组的数据均是取10个数据的平均值)，结果如下。
本发明冻存方法与传统造血干细胞冻存方法实际效果比较如下表，其中传统冻存方法指-196℃液氮程控降温保存和-80℃非程控降温保存，传统冻存方法(包括保护剂配比)属于现有的公知技术，不详细描述。但是传统保护剂的配比各个资料文件中数值略有不同，为了更好的进行试验，以下试验中传统冻存方法(即传统-196℃液氮程控降温保存)采用的保护剂中二甲基亚砜、羟乙基淀粉、人血白蛋白的质量百分比为10％，6％，4％；保护剂与造血干细胞悬液的体积比为1:4。传统冻存方法(传统-80℃非程控降温保存)采用的保护剂中二甲基亚砜，1640、血液保存液I的质量百分比为10％,5％，4％，保护剂与造血干细胞悬液的体积比为1:4。
表1是冻存过程中不同时间点细胞活力的检测(％)
表2是冻存过程中不同时间点粒细胞巨噬细胞集落生成单位CFU-GM的检测(每10万个细胞)
表3是冻存过程中不同时间点CD34+细胞(造血干细胞)的检测(％)
通过以上3组实验可以发现，本发明的方法冻存的干细胞的细胞活性、粒细胞巨噬细胞集落生成单位CFU-GM和CD34+细胞回收率均略优于传统冻存方法。
Claims (2)
1.一种造血干细胞冻存新方法，其特征在于：第一步，取造血干细胞保护剂、造血干细胞悬液或骨髓液，体积比为1-2:6；第二步，将造血干细胞悬液或骨髓液与造血干细胞保护剂混合均匀，然后排净空气、密封放入-80℃冰箱保存12小时；第三步，取出上述的造血干细胞悬液或骨髓液与造血干细胞保护剂混合液，然后再加入造血干细胞保护剂,造血干细胞保护剂与混合液的体积比为1：3，再次排净空气、密封放入-80℃冰箱保存；
所述的造血干细胞保护剂由试剂A和试剂B组成，试剂A与试剂B的体积比为2：3；
所述试剂A由二甲基亚砜、RPMI1640无菌培养基、羟乙基淀粉组成，溶剂为生理盐水，二甲基亚砜、RPMI1640无菌培养基、羟乙基淀粉的质量百分比分别为30％、5％、15％；
所述试剂B为人血白蛋白溶液，人血白蛋白的质量百分比为10％。
2.根据权利要求1所述的造血干细胞冻存新方法，其特征在于：第一步，造血干细胞保护剂、造血干细胞悬液或骨髓液的体积比为1.5:6。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Tian Liping Inventor before: Qin Ling |
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| CB03 | Change of inventor or designer information | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20170811 Address after: 100096 Beijing City, Huilongguan Changping District small town north of the village Applicant after: Beijing army joint Stem Cell Biotechnology Co., Ltd. Address before: 225300 Jiangsu city of Taizhou province China pharmaceutical Road East, Xinyang City Road on the north side of G25 7 storey building on the west side Applicant before: JIANGSU SAIERT BIOTECHNOLOGY CO., LTD. |
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| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |