CN106834240A - 一株小反刍兽疫活疫苗生产用病毒克隆纯化株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株小反刍兽疫病毒克隆纯化株及其应用。该株病毒是由引进的小反刍兽疫病毒弱毒PPRV 75/1株经克隆纯化后获得的一株病毒PPRV 75/1Clone9株，克隆后病毒滴度提高10～100倍；用其制备的小反刍兽疫活疫苗在保存及使用过程中病毒滴度下降不超过0.3个滴度；安全及免疫效力均高于OIE规定标准，免疫攻毒保护试验结果，免疫102TCID50保护率为96.7％；免疫103TCID50保护率为100％。
Description
技术领域
本发明涉及小反刍兽疫活疫苗生产用病毒克隆纯化株的建立及其应用。属于兽用生物制品领域。
背景技术
小反刍兽疫(Peste des petits ruminants，PPR)又名小反刍兽伪牛瘟(Pseudo-rinderpest)，是由小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus，PPRV)引起的一种急性、烈性、接触性传染病；OIE将其列为A类传染病，易感群发病率高达100％，暴发严重时死亡率达100％。目前该病尚无有效治疗方法，主要通过早期诊断和疫苗免疫进行控制。该病自十九世纪四十年代首次在科特迪瓦报道以来，先后在大多数非洲国家、阿拉伯半岛、以色列、叙利亚、伊拉克、约旦和土耳其等中东地区以及南亚的印度半岛流行。2003年以来，我国周边的老挝、印度、尼泊尔、俄罗斯、巴基斯坦和缅甸等国均暴发了大规模的PPR疫情。2007年，我国西藏部分地区发生PPR疫情。
小反刍兽疫可导致小反刍兽大量发病死亡。小反刍兽疫病毒具有免疫抑制作用，感染后会导致动物机体免疫力下降，造成其他病原继发感染，使疫情更加复杂难以应付。目前，全球大约62.5％的小反刍兽面临该病的威胁，因此，该病造成的经济和社会影响是巨大的。
世界动物卫生组织(Office International Des Epizooties，OIE)推荐的小反刍兽疫活疫苗的生产毒株是由1975年从尼日利亚分离到的PPRV 75/1株病毒，经过Vero细胞培养，连续传代达70代以后致弱获得的疫苗毒株。目前OIE参考实验室已经传代至120代，病毒仍然保持一定的免疫保护力。毒株在细胞上繁殖以后以冻干的形式－20℃条件下保存。
发明内容
本申请人自小反刍兽疫参考实验室引进了该疫苗毒株后在毒种繁殖过程中发现，细胞病变不规律，病变出现时间在96h以上且不典型，病毒含量偏低，特别是在进行病毒中和试验时病变很不规律。本发明的目的是为了通过对引进了小反刍兽疫病毒75/1株并进行了克隆纯化选择以获得在Vero细胞上繁殖能力强、病毒滴度高、安全性和免疫原性仍良好，更适用于疫苗生产的毒株。
本发明的技术方案
1.一株小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus)克隆纯化株，其特征在于该株病毒已于2016年12月15日送交送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物保藏委员会普通微生物保藏中心，保藏号分别为：CGMCCNo.13388。
2.如权利要求1所述一株小反刍兽疫病毒克隆纯化株，其特征在于该毒株是对引进的小反刍兽疫病毒弱毒75/1株进行克隆纯化后获得的。
3.如权利要求1所述一株小反刍兽疫病毒克隆纯化株的应用，其特征在于该株病毒用于制备小反刍兽疫活疫苗。
4.如权利要求3所述所述一株小反刍兽疫病毒克隆纯化株的应用，其特征在于用所述小反刍兽疫活疫苗的制备方法为用小反刍兽疫弱毒75/1Clone9株(CGMCC No.13388)病毒作为疫苗生产毒株，接种Vero细胞，当细胞出现细胞病变达70％以上时，将细胞瓶移至-20℃反复冻融3次，分别收获病毒液；再将其混合后加冻干保护剂经真空干燥制成小反刍兽疫活疫苗。
5.如权利要求4所述一株小反刍兽疫病毒克隆纯化株的应用，其特征在于小反刍兽疫活疫苗的制备方法，其中的冻干保护剂配方及制备方法是(W/V)：蔗糖0.75，右旋糖苷0.40，山梨醇0.40，鱼明胶0.25，Na2HPO4 0.051，NaH2PO4 0.125，加少量双蒸水溶解，1molKOH调pH至7.2，双蒸水补至100％,115℃高压灭菌30min。
本发明的具体实施方式
1.小反刍兽疫病毒克隆纯化株的建立
(1)病毒繁殖将PPRV 75/1株病毒(由OIE小反刍兽疫参考实验室引进，原始毒株为125代)冻干毒水化后，用无血清MEM营养液作1:10稀释，接种Vero细胞(由美国菌种中心(ATCC)引进，F150代)单层，接种后在37℃下吸附1小时，然后加入含2％牛血清的MEM，在37℃下培养，每日观察细胞病变。待细胞病变达到80％以上时，将细胞瓶置-20℃反复冻融3次后收获培养物，与冻干保护剂混合均匀后冻干。批号为200201F126，作为原始毒种保存。
(2)病毒克隆用无血清MEM营养液将繁殖的PPR病毒液做10倍系列稀释至10-8，接种3块96孔细胞培养板，每稀释度接种24孔，每孔0.1ml，同时加入0.1ml Vero细胞悬液，在37℃、5％CO2条件下培养。每日观察细胞病变，选择只有1个蚀斑病变的细胞孔标记，继续培养并观察直到120h，收获仅出现1个蚀斑病变接种孔的培养物，按(1)所述方法传4代扩大培养制备PPRV单克隆基础毒种。3块细胞培养板共获得13个PPRV克隆，经比较试验从中获得一株纯化的克隆株小反刍兽疫病毒，命名为小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminantsvirus，PPRV)75/1Clone 9株，该病毒已于2016年12月15日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物保藏委员会普通微生物保藏中心，保藏号分别为：CGMCC No.13388。
2.小反刍兽疫活疫苗的制备
(1)生产用毒种PPRV 75/1Clone 9株生产用基础种毒，由中国兽医药品监察所提供。
(2)生产用细胞Vero细胞，中国兽医药品监察所保存并提供。
(3)小反刍兽疫病毒液的制备将PPRV毒种用无血清MEM水化后，按0.1％、0.5％、1％、2％同步接种不同细胞浓度的Vero细胞悬液，细胞悬液浓度分别调整为20～30万/ml、50～60万/ml。混匀后分别分装细胞瓶，置37℃培养箱培养，每天观察细胞病变，记录出现70％以上病变的时间，病变达到70％以上时，将细胞瓶移至-20℃反复冻融3次，收获病毒液。
(4)病毒液检验进行病毒液样品进行无菌检验、支原体检验和病毒含量测定。
1)无菌检验及支原体检验按现行《中国兽药典委员会编.中华人民共和国兽药典》二Ο一五年版(三部)中国农业出版社，2016，本发明以下称《中国兽药典》)进行检验。
2)病毒含量测定将收获的病毒液样品用无血清MEM作10倍系列稀释，取10-1～10－ 88个稀释度病毒液，接种96孔细胞培养板，每个稀释度接种5孔，每孔0.1ml，接种后每孔加入0.1ml山羊肾细胞悬液。置37℃5％CO2培养箱培养5～7天，根据细胞病变孔数按Reed-Muench法计算TCID50。
(5)配苗与冻干将检验合格的PPR病毒液与保护剂按(V/V)1:1混合后充分混匀、分装后，装箱后按本发明设计的冻干曲线冻干经真空冷冻干燥而成。
附图说明
图1 PPRV Clone 9感染细胞引起病变图图中A：PPRV 75/1 Clone 9感染细胞60h病变图，B：PPRV 75/1 Clone 9感染细胞72h病变图，C：PPRV 75/1 Clone 9感染细胞84h病变图，D：PPRV Clone 9感染细胞96h病变图，E：PPRV 75/1Clone 9感染细胞108h病变图，F：PPRV75/1 Clone 9感染细胞120h病变图。
本发明涉及生物材料资源信息
小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus，PPRV)75/1株(请见DIALLO A,TAYLOR W P,LEFEVRE P C,et al.Attenuation of a strain of peste despetits ruminants virus:potential homologous live vaccine.Revue d’elevage etde Medecine Veterinare des Pays Tropicaux,1989,429(3):311-319)来自世界动物卫生组织(Office International Des Epizooties，OIE)，小反刍兽疫病毒(Peste despetits ruminants virus，PPRV)75/1Clone 9株(简称为PPRV Clone 9株)，该株病毒已于2016年12月15日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心CGMCC No.13388。Vero细胞：F168代，中国兽医药品监察所保存并提供(中国兽医药品监察所、中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著，中国兽医菌种目录(第二版)，中国农业科学技术出版社，2002年，p171-172)。
本发明的积极意义
本发明涉及一株小反刍兽疫病毒克隆纯化株及其应用。该株病毒是由引进的小反刍兽疫病毒弱毒PPRV 75/1株经克隆纯化后获得的一株病毒PPRV 75/1Clone 9株，克隆后病毒滴度提高10～100倍；用其制备的小反刍兽疫活疫苗在保存及使用过程中病毒滴度下降不超过0.3个滴度；安全及免疫效力均高于OIE规定标准，免疫攻毒保护试验结果，免疫102TCID50保护率为96.7％；免疫103TCID50保护率为100％。
实施例
以下实施为进一步说明本发明，不对本发明构成限制。
实施例1
——小反刍兽疫活疫苗生产毒种的克隆纯化
本申请人自小反刍兽疫参考实验室引进了该疫苗毒株后在毒种繁殖过程中发现，细胞病变不规律，病变出现时间在96h以上且不典型，病毒含量偏低，特别是在进行病毒中和试验时病变很不规律，为了选择在Vero细胞上繁殖能力强、病毒滴度高、适用于疫苗生产的毒株，对引进的毒株进行了克隆纯化，克隆纯化获得的克隆株被命名为小反刍兽疫病毒(Pester des petits ruminants virus，PPRV)75/1Clone 9株，该毒株已于2016年12月15日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物保藏委员会普通微生物保藏中心，保藏号分别为：CGMCC No.13388。
PPRV 75/1Clone 9株与2002年引进的PPRV 75/1原始毒种相比，克隆纯化后的PPRV 75/1Clone9毒株病毒含量增加了2.5倍，可达到105.6TCID50/0.1ml，毒种克隆纯化后安全性和免疫原性仍良好，更适用于疫苗生产。
1.病毒克隆
将PPRV 75/1株病毒(由OIE小反刍兽疫参考实验室引进，原始毒株为125代)冻干毒水化后，用无血清MEM营养液作1:10稀释，接种Vero细胞(由美国菌种中心(ATCC)引进，F150代)单层，接种后在37℃下吸附1小时，然后加入含2％牛血清的MEM，在37℃下培养，每日观察细胞病变。待细胞病变达到80％以上时，将细胞瓶置-20℃反复冻融3次后收获培养物，与冻干 保护剂混合均匀后冻干。批号为200201F126，作为原始毒种保存。
用无血清MEM营养液将繁殖的PPRV病毒液做10倍系列稀释至10-8，接种3块96孔细胞培养板，每稀释度接种24孔，每孔0.1ml，同时加入0.1ml Vero细胞悬液，在37℃、5％CO2条件下培养。每日观察细胞病变，选择只有1个蚀斑病变的细胞孔标记，继续培养并观察直到120h，收获仅出现1个蚀斑病变接种孔的培养物，将以上培养物传4代扩大培养制备PPRV单克隆基础毒种。
3块细胞培养板共获得13个PPRV 75/1株克隆，分布在10-6和10-7稀释度。将13个克隆病毒液接种Vero细胞传3代扩大培养，每个克隆病毒各培养收获约300ml病毒液。
2.毒种鉴定
(1)小反刍兽疫病毒毒种纯净性检验：
1)无菌及支原体检验按《中国兽药典》附录进行；
2)外源病毒检验将不同克隆毒种病毒液，加入等体积PPRV阳性血清，在37℃下中和1小时，分别接入Vero、PK15、BHK21、牛睾丸细胞后，在37℃下培养，按现行《中国兽药典》(三部)附录进行外源病毒检验。
将PPRV 75/1原始毒种和各克隆毒种结果详见表1。
表1小反刍兽疫病毒毒种纯净性检验结果
备注：“—”表示检测结果为阴性，“+”表示检测结果为阳性；“ND”表示未进行试验。
(2)病毒含量测定将不同克隆PPRV 75/1毒种用无血清MEM细胞培养液作10倍系列稀释，取10-1～10-6六个稀释度分别接种96孔细胞板，每稀释度接种5孔，每孔0.1ml，接种后每孔加入0.1ml Vero细胞悬液，在37℃5％CO2条件下培养6天，观察细胞病变。根据各稀释度出现的细胞病变孔数按Reed-Muench法计算每0.1ml病毒液含有的TCID50。
200201F126批原始毒种和各PPRV 75/1克隆毒种病毒液的病毒含量测定，每日观察细胞病变过程中记录各克隆毒种的融合细胞斑首次出现时间和100％病变时间。结果见表2。
PPRV Clone 9毒株致细胞病变特征和病变出现时间图片见图1。
表2PPRV 75/1克隆毒种病变时间及病毒含量测定结果
选择60～72h首次出现融合蚀斑、在120h病变达到100％、病毒毒价达到105.6TCID50/0.1ml的克隆病毒Clone9、Clone11、Clone12作为基础毒种的预选克隆病毒株进行安全和免疫原性测定，以确定基础毒种克隆株。
(3)鉴别检验将PPRV各克隆毒种稀释成200TCID50，与PPRV阳性血清中和后，接种Vero细胞培养至7天，13个克隆毒种检验结果均为病毒对照组出现典型病变，而病毒中和组和细胞对照组均未出现细胞病变。
(4)安全性检验将PPRV 75/1株克隆毒种用灭菌生理盐水稀释成105TCID50/ml，颈部皮下注射健康易感、10～15月龄山羊5只(血清中和抗体低于4倍)，每只1ml。接种后观察28天，均未出现体温升高和其它临床症状。其中PPRV 75/1Clone9株病毒液的体温观察记录见表3
表3PPRV 75/1Clone9毒株接种山羊体温记录表
(5)免疫原性测定
PPRV 75/1克隆毒种免疫羊中和抗体测定将被检血清在56℃灭活30min，用无血清MEM先作1:4稀释，再在96孔细胞培养板进行对倍稀释至1:1024，每稀释度接种5孔，每孔0.1ml，每孔加入30万/ml左右的Vero细胞悬液0.1ml。同时设立PPRV 75/1对照(病毒含量为100TCID50/0.1ml、10TCID50/0.1ml、1TCID50/0.1ml、0.1TCID50/0.1ml)，37℃5％CO2培养箱培养，每日观察细胞病变直至120h，记录每稀释度细胞病变孔数，以5个接种孔均不出现细胞病变的血清最高稀释度作为血清抗体效价。将Clone9、Clone11、Clone12三个PPRV 75/1克隆毒种用无血清MEM稀释成103TCID50/ml皮下接种5只易感山羊(血清中和抗体低于4倍)，接种剂量为1ml，与3只对照山羊混群饲养，观察至21天，所有接种山羊均无异常临床表现，体温及采食均正常。采血测定接种羊血清中和抗体，均大于16倍，对照山羊血清中和抗体均小于4倍。结果详见表4。
表4PPRV 75/1克隆毒种免疫原性测定结果
(6)克隆毒种的冻干
依据13个PPRV 75/1克隆毒株的病毒含量、细胞病变产生时间、细胞病变典型程度以及3个预选克隆株的免疫原性测定结果，决定选用Clone9毒株作为小反刍兽疫活疫苗生产用基础毒种，将病毒液解冻后按1:1加入冻干保护剂，进行冻干。由于Clone9毒株克隆纯化时传代了4次，冻干毒种相当于原毒种的130代，标记批号为200601F130作为小反刍兽疫活疫苗生产用基础毒种，冻干后置-70℃保存，该株病毒被命名为小反刍兽疫病毒(Pestedes petits ruminants virus，PPRV)75/1Clone 9株，简称为PPRV Clone 9株，该毒株已于2016年12月15日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物保藏委员会普通微生物保藏中心，保藏号分别为：CGMCC No.13388。
本发明所述小反刍兽疫疫苗毒株75/1毒种是经Vero细胞传代70代致弱，建立的原基础毒种为120代，具有良好的免疫原性，为OIE推荐的预防小反刍兽疫的疫苗毒株。但自小反刍兽疫参考实验室引进了该疫苗毒株后在毒种繁殖过程中发现，细胞病变不规律，病变出现时间在96h以上且不典型，病毒含量偏低，特别是在进行病毒中和试验时病变很不规律，为了选择在Vero细胞上 繁殖能力强、病毒滴度高、适用于疫苗生产的毒株，对引进的毒株进行了克隆纯化，与2002年引进的PPRV原始毒种相比，结果表明克隆纯化后的PPRV 75/1Clone9毒株病毒含量增加了2.5倍，可达到105.6TCID50/0.1ml，毒种克隆纯化后安全性和免疫原性仍良好，更适用于疫苗生产。
实施例2
——小反刍兽疫活疫苗生产毒种种子批的制备
预防小反刍兽疫的有效手段是接种小反刍兽疫疫苗。为研制小反刍兽疫活疫苗，特制备小反刍兽疫活疫苗生产用基础种子批2批和生产种子批1批，并对其进行系统检定。现将研究结果报告如下：
1.病毒繁殖
将PPR 75/1Clone9冻干毒种用无血清MEM水化后，按照细胞维持液的1％接种Vero细胞单层，接种后置37℃培养约120h，待细胞病变达到70％以上时，将细胞瓶置-20℃冻融3次，收获病毒液，如此传代到145代；将141、145代病毒液按照1:1比例加入冻干保护剂，分装安瓿，每支1ml，分装后冷冻干燥。基础毒种批号分别为200601F130、200701F141、200801F145。冻干后保存于-70℃冰箱备用(见表5)。
表5PPRV 75/1株原始毒种和基础毒种、生产毒种种子批制备详细信息
| 毒种代次 | 传代用细胞及代次 | 冻干日期 | 冻干支数 | 保存条件 |
| 200201F126 | VeroF160 | 2002.10 | 300支 | -70℃冰箱 |
| 200601F130 | VeroF161 | 2006.9 | 400支 | -70℃冰箱 |
| 200701F141 | VeroF163 | 2007.9 | 400支 | -70℃冰箱 |
| 200801F145 | VeroF169 | 2008.4 | 300支 | -70℃冰箱 |
2.毒种检定
(1)无菌及支原体检验按《中国兽药典》附录进行；
外源病毒检验将毒种用无血清MEM营养液水化后，加入等体积PPR阳性血清，在37℃下中和1小时，分别接种Vero、PK15、BHK21、牛睾丸细胞后，在37℃下培养，按《中国兽药典》附录进行外源病毒检验。检验结果见表6。
表6小反刍兽疫病毒纯净性检验结果
注：“—”表示检测结果为阴性，“+”表示检测结果为阳性；“ND”表示未进行试验。
鉴别检验将200201F126、200601F130、200701F141、200801F145批毒种用无血清MEM营养液稀释成200TCID50/0.1ml，加入等体积PPRV阳性血清，在37℃下中和1小时，接种Vero细胞单层，在37℃下吸附1小时，再加入含2％牛血清的MEM，
置37℃培养7天，病毒对照组均出现PPRV引起的典型病变，病毒中和组和细胞对照组均未出现细胞病变。
(2)病毒含量测定将冻干的PPR基础毒种用无血清MEM营养液作10倍系列稀释，取10-1～10-6稀释病毒液，分别接种96孔细胞板，每稀释度接种5孔，每孔0.1ml，接种后加入0.1mlVero细胞悬液，在37℃、5％CO2条件下培养箱培养6天，观察细胞病变，根据细胞病变孔数按Reed-Muench法计算病毒含量。200201F126、200601F130、200701F141、200801F145批毒种病毒含量测定结果见表7。
表7毒种病毒含量测定结果
(3)安全性检验将200201F126、200601F130、200701F141、200801F145批PPR冻干毒种分别用无血清MEM营养液稀释成105TCID50/ml，经颈部皮下各注射10-15月龄健康易感山羊5只(血清中和抗体低于4倍)，每只1ml。接种后观察28天，连续测定体温15天，所有接种山羊无异常临床表现，体温及采食均正常。
(4)高代次毒种免疫原性测定将200701F141、200801F145批PPR冻干毒种用灭菌生理盐水稀释成103TCID50/ml，颈部皮下注射易感山羊5只(血清中和抗体低于4倍)，每只1ml。接种后21天，采血分离血清，将血清在56℃水浴灭能30分钟，在96孔细胞培养板上先作1:4稀释，再对倍稀释至1:1024,每稀释度接种5孔,每孔0.1ml,每孔加入100TCID50/0.1mlPPR病毒液0.1ml，37℃作用1h，每孔加入0.1ml Vero细胞悬液；同时设立PPRV对照(病毒含量为100TCID50/0.1ml、10TCID50/0.1ml、1TCID50/0.1ml、0.1TCID50/0.1ml)，37℃5％CO2培养箱培养到6天,记录每稀释度细胞病变孔数,以5孔试验孔均无细胞病变的血清最高稀释度作为血清中和抗体效价。
高代次200701F141、200801F145批毒种免疫原性检定结果见表8。
表8高代次200701F141、200801F145批PPR基础毒种免疫原性检定结果
(5)毒种的保存期试验将2002年引进并繁殖冻干的原始毒种200201F126批和200601F130批、200701F141批、200801F145批Clone9毒种保存于-70℃，每间隔12～24个月进行一次全面检验。
1)不同保存时间PPRV基础毒种病毒含量和免疫原性
2002年制备鉴定的200201F126批PPR原始毒种在-70℃冰箱保存至2013年10月。200601F130批、200701F141批、200801F145批基础毒种在-70℃冰箱分别保存4～6年。每1～2年测定毒种的 病毒含量及免疫原性，结果见表9。
表9不同代次PPRV基础毒种保存不同时间后的免疫原性及病毒含量测定结果
试验开始前采用中和试验方法筛选健康易感山羊，所用试验用羊PPR中和抗体均小于4倍，每个免疫原性测定试验均设对照山羊3只，与接种PPRV毒种的山羊同条件饲养，并采血测定其PPR中和抗体。试验结果表明，所有对照羊PPRV中和抗体均小于4倍，对照成立。
2)PPRV基础毒种的保存期结果
不同代次PPRV原始毒种和基础及生产毒种保存不同时间后检验结果见表10。试验结果表明，200201F126批冻干毒种在-70℃冰箱保存11年后，200601F130、200701F141批冻干毒种在-70℃冰箱保存6～7年后，200801F145批冻干毒种在-70℃冰箱保存5年后，经检验均可达到毒种标准的规定。
表10PPRV毒种的保存期结果
结论：
小反刍兽疫疫苗毒株75/1毒种经Vero细胞传代70代致弱，以120代为基础毒种的小反刍兽疫疫苗毒株，具有良好的免疫原性，为OIE推荐的预防小反刍兽疫的唯一疫苗毒株。
根据疫苗研制要求，本实验室共制备毒种种子批4批，经检验，毒种纯净，无外源病毒污染，4个批次的病毒含量均不低于104.7TCID50/0.1ml，200201F126批、200701F141批、200801F145批毒种以103TCID50免疫山羊，21天中和抗体均达到1:10以上，证明该毒种的免疫原性良好。将200701F141批、200801F145批毒种按100个免疫剂量接种山羊，接种羊未出现任何不良反应，证明该毒种的安全性良好；将基础毒种代次范围限定在F130～F141代，可满足疫苗生产用要求。
200201F126毒种在-70℃保存11年后，仍可满足小反刍兽疫疫苗生产用毒种的要求，200601F130、200701F141、200801F145批毒种在-70℃保存5-7年后，病毒含量及免疫原性未见明显降低；可满足小反刍兽疫疫苗生产用毒种的要求，根据试验结果，将毒种保存期确定为冻干后-70℃保存10年。
实施例3
——小反刍兽疫活疫苗的制备
(1)生产用毒种 PPRV 75/1Clone 9株生产用基础种毒，由中国兽医药品监察所制备并提供。
(2)生产用细胞 Vero细胞：中国兽医药品监察所保存并提供。
(3)小反刍兽疫病毒液的制备将PPRV毒种用无血清MEM水化后，按0.1％、0.5％、1％、2％同步接种不同细胞浓度的Vero细胞悬液，细胞悬液浓度分别调整为20～30万/ml、50～60万/ml。混匀后分别分装细胞瓶，置37℃培养箱培养，每天观察细胞病变，记录出现70％以上病变的时间，病变达到70％以上时，将细胞瓶移至-20℃反复冻融3次，收获病毒液。
(4)病毒液检验 进行病毒液样品进行无菌检验、支原体检验和病毒含量测定。
1)无菌检验及支原体检验 按现行《中国兽药典》)进行检验。
2)病毒含量测定 将收获的病毒液样品用无血清MEM作10倍系列稀释，取10-1～10－88个稀释度病毒液，接种96孔细胞培养板，每个稀释度接种5孔，每孔0.1ml，接种后每孔加入0.1ml山羊肾细胞悬液。置37℃5％CO2培养箱培养5～7天，根据细胞病变孔数按Reed-Muench法计算TCID50。
(5)配苗与冻干 将检验合格的PPR病毒液与保护剂按(V/V)1:1混合后充分混匀、分装后，装箱后按本发明设计的冻干曲线冻干经真空冷冻干燥而成。
本发明所涉及的实验材料为：
(1)小反刍兽疫病毒弱毒75/1株，由OIE小反刍兽疫参考实验室引进，原始毒株为125代，小反刍兽疫疫苗毒株75/1毒种是经Vero细胞传代70代致弱，建立的原基础毒种为120代，具有良好的免疫原性，为OIE推荐的预防小反刍兽疫的疫苗毒株。
(2)Vero细胞，由美国菌种中心(ATCC)引进，中国兽医药品监察所保存并提供。
(3)小反刍兽疫阳性血清由OIE小反刍兽疫参考实验室引进。
(4)10～15月龄健康易感山羊30只，均购于新疆乌鲁木齐市南山地区。免疫接种前采血测定中和抗体，选抗体效价为4倍以下的羊用于试验。
(5)其它常规试剂，由中国兽医药品监察所提供。
Claims (5)
1.一株小反刍兽疫病毒克隆纯化株，其特征在于该株病毒被命名为小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus)75/1Clone9株，并于2016年12月15日送交送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物保藏委员会普通微生物保藏中心，保藏号为：CGMCC No.13388。
2.如权利要求1所述一株小反刍兽疫病毒克隆纯化株，其特征在于该毒株是对引进的小反刍兽疫病毒弱毒75/1株进行克隆纯化后获得的。
3.如权利要求1所述一株小反刍兽疫病毒克隆纯化株的应用，其特征在于该株病毒用于制备小反刍兽疫活疫苗。
4.如权利要求3所述所述一株小反刍兽疫病毒克隆纯化株的应用，其特征在于用所述小反刍兽疫活疫苗的制备方法为用小反刍兽疫弱毒CGMCC No.13388株病毒作为疫苗生产毒株，接种Vero细胞，当细胞出现细胞病变达70％以上时，将细胞瓶移至-20℃反复冻融3次，分别收获病毒液；再将其混合后加冻干保护剂经真空干燥制成小反刍兽疫活疫苗。
5.如权利要求4所述一株小反刍兽疫病毒克隆纯化株的应用，其特征在于小反刍兽疫活疫苗的制备方法，其中的冻干保护剂配方及制备方法是(W/V)：蔗糖0.75，右旋糖苷0.40，山梨醇0.40，鱼明胶0.25，Na2HPO4 0.051，NaH2PO4 0.125，加少量双蒸水溶解，1mol KOH调pH至7.2，双蒸水补至100％,115℃高压灭菌30min。
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Country Status (1)
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|---|---|
| CN (1) | CN106834240B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110872579A (zh) * | 2019-12-04 | 2020-03-10 | 天康生物股份有限公司 | 小反刍兽疫病毒的制备方法、疫苗及制备方法和应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101264062A (zh) * | 2007-03-12 | 2008-09-17 | 袁红杰 | 制备冻干基因工程菌感受态细胞的生产工艺及保护剂配方 |
| CN104830807A (zh) * | 2015-04-23 | 2015-08-12 | 江苏赛锘威生物医药有限公司 | 一株可用于制造疫苗的高效价狂犬疫苗毒株ctn-1v-t |
| CN106244563A (zh) * | 2016-08-02 | 2016-12-21 | 浙江农林大学 | 一种猪流行性腹泻病毒空斑纯化方法 |
-
2017
- 2017-02-21 CN CN201710092018.2A patent/CN106834240B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101264062A (zh) * | 2007-03-12 | 2008-09-17 | 袁红杰 | 制备冻干基因工程菌感受态细胞的生产工艺及保护剂配方 |
| CN104830807A (zh) * | 2015-04-23 | 2015-08-12 | 江苏赛锘威生物医药有限公司 | 一株可用于制造疫苗的高效价狂犬疫苗毒株ctn-1v-t |
| CN106244563A (zh) * | 2016-08-02 | 2016-12-21 | 浙江农林大学 | 一种猪流行性腹泻病毒空斑纯化方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 印春生等: "小反刍兽疫活疫苗临床试验研究", 《中国兽医杂志》 * |
| 肖长赏等: "新城疫弱毒耐热B株蚀斑克隆纯化与免疫原性研究", 《中国动物检疫》 * |
| 薛青红等: "小反刍兽疫活疫苗的安全性评价试验", 《中国兽医杂志》 * |
| 解燕乡等: "汉坦病毒在Vero细胞上的适应传代及疫苗候选株的选育", 《中华微生物学和免疫学杂志》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110872579A (zh) * | 2019-12-04 | 2020-03-10 | 天康生物股份有限公司 | 小反刍兽疫病毒的制备方法、疫苗及制备方法和应用 |
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| CN106834240B (zh) | 2020-03-10 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Zhi Haibing Inventor after: Xue Qinghong Inventor after: Yin Chunsheng Inventor before: Xue Qinghong Inventor before: Yin Chunsheng Inventor before: Sun Miao Inventor before: Zhang Guangchuan Inventor before: Zhi Haibing |
|
| CB03 | Change of inventor or designer information | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |