CN103705918B - 抗猪流行性腹泻病毒高免血清及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了采用猪流行性腹泻病毒ZJ08株CGMCC No.7806的的灭活疫苗为免疫原免疫50‑60日龄长大二元猪，经三次免疫，制备了高免血清。本发明制备的高免血清性状良好，无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染，特异性强，安全性好，人工感染治愈率达100%。血清中和效价在2⁶以上，对血清进行分装，‑70℃，保存期12个月。

Description

抗猪流行性腹泻病毒高免血清及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种抗病毒血清的制备方法，具体是一种抗猪流行性腹泻病毒高免血清及其制备方法。

背景技术

猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea, PED）是引起猪腹泻的一种急性、接触性病毒性肠道传染病，以水样腹泻、呕吐、脱水和食欲下降为特征。PEDV可在猪群中持续存在，各种年龄猪均易感。哺乳仔猪、架子猪和育肥猪的发病率可达100%，尤以哺乳仔猪严重，病死率达100%。该病是一种病毒病，目前尚无有效的治疗药物方法。给妊娠母猪接种疫苗，仔猪可通过初乳以被动免疫的方式获得抵抗力，但是随着母源抗体的消失或参差不齐，仔猪的抵抗力逐渐下降或不同，对流行性腹泻的易感性也表现不同，一旦发病，就造成巨大的经济损失。采用高免血清进行群体治疗是以被动免疫的方式使仔猪获得免疫力，达到保护仔猪的目的。目前为止，这种方法是可行的。但是临床上流行的猪流行性腹泻病毒毒株一旦发生变异，由此制备的高免血清治疗效果就会减弱，感染猪的发病率和死亡率就会增加。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种抗猪流行性腹泻病毒高免血清及其制备方法。

首先，本发明提供一种抗猪流行性腹泻病毒高免血清，其为以猪流行性腹泻病毒ZJ08株CGMCC No.7806的灭活疫苗为免疫原，从免疫猪中分离血清制得。

其中，所述的猪流行性腹泻病毒ZJ08株CGMCC No.7806的灭活疫苗为将猪流行性腹泻病毒ZJ08株灭活与油佐剂乳化制备而成。

本发明还提供所述的抗猪流行性腹泻病毒高免血清的制备方法，包括如下步骤：

1）免疫：以所述的猪流行性腹泻病毒灭活疫苗为免疫原免疫50-60日龄长大二元猪，第一次免疫：肌肉注射共4ml，第二次免疫：在第一次免疫后14日进行，免疫剂量8ml，分两点注射，第三次免疫：在第二次免疫后14日进行，免疫剂量16ml，分三点注射；

2）采血：最后一次免疫后15～21日，检测中和抗体效价，达到2⁹以上时，杀猪无菌放血；

3）血清分离与制备：用消毒刀将凝固血划成1-3平方厘米的小块，滤出血清，分装于无菌生理盐水瓶中，其余置于-70℃保存。

本发明的PEDV ZJ08株是申请人从浙江一发病猪场分离到的强毒株经过105代致弱后获得的猪流行性腹泻病毒弱毒株，是目前国内的PEDV流行株，该疫苗株毒力稳定，安全，免疫原性好，能够抵抗目前临床上流行的强毒株的攻击，保护率达90%以上。

将分离到的PEDV 105-145代PEDV致弱株命名为猪流行性腹泻病毒ZJ08株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号是CGMCC No. 7806，保藏时间是2013年6月28日。

本发明成功试制出了抗猪流行性腹泻病毒的高免血清，其物理性状良好，无细菌、霉菌和支原体生长，无外源病毒污染，中和抗体效价在2⁶倍以上。试验结果表明，本血清不但具有较高的抗体效价，而且还具有很强的特异性，完全符合检测用血清标准的要求，为评价疫苗免疫效力提供了有力工具。血清效力评估结果表明，本发明制备的高免血清治愈率更高。

附图说明

图1为PEDV CPE图片（400×）。

图2为PEDV 分离毒S基因PCR检测结果。图中，1: 样品；2: 阴性对照；M: DNAMarker DL2000。

图3为PEDV 分离毒M基因PCR检测结果。图中，1: 样品；2: 阴性对照；M: DNAMarker DL2000。

图4为PEDV 分离毒M基因系统进化分析结果。

图5为PEDV 分离毒ORF3基因PCR检测结果。图中，1: 样品；2: 阴性对照；M: DNAMarker DL2000。

图6为不同代次PEDV ORF3 序列比对结果。

图7所示为本发明的高免血清与猪瘟病毒（CSFV）免疫荧光检测结果。其中，A 为接种PEDV高免血清和CSFV混合物的细胞孔；B为接种细胞维持液的细胞孔。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1 猪流行性腹泻病毒ZJ08株免疫原的制备

取浙江某猪场猪流行性腹泻阳性小肠适量，刮取肠粘膜和内容物，按照1:5的比例（重量:体积）加入PBS，反复冻融3次，离心取上清，0.22μm滤膜过滤，滤液中加入终浓度为20μg/ml的胰酶，37℃处理1.5小时。

按常规方法接种长满单层的Vero细胞，按照10%的比例接种病毒，37℃吸附1小时，补足细胞维持液（含10µg/ml的胰酶），37℃温箱培养。传至第17代时则出现明显、稳定的CPE变化，细胞圆缩，颗粒增加，聚堆呈葡萄串样，细胞出现损伤和脱落（图1）。

根据S基因设计检测引物对：正向引物为5’-GGATACTTTGGCCTCTTGTG-3’；反向引物为5’-CGCACTCGGATTACTCACAGC -3’， 95℃预变性5min，95℃ 45s 、50℃ 1min、72℃ 2min进行32个循环后，72℃5min延伸。PEDV扩增片段为484bp。结果见图2。

根据GenBank中PEDV的基因序列设计扩增M基因序列的引物：

PEDV-M-F: GTCTTACATGCGAATTGACC

PEDV-M-R: GGCATAGAGAGATAATGGCA

扩增的M基因片段的大小为：808 bp，结果见图3，序列如SEQ ID No.5所示。

结果表明， PEDV（ZJ08株）与经典参考株如英国CV777株、比利时Brl/87株、韩国KPD-9F株和日本JMe2株等相比，不在一个进化分支上，已经发生了明显的变异（图4），为国内新发现的流行株。

扩增ORF3序列的引物为：

ORF3-F: TCCTAGACTTCAACCTTACG

ORF3-R: GGTGACAAGTGAAGCACAGA

扩增的ORF3的片段的大小为：833 bp（图5）。

将猪流行性腹泻病毒在Vero细胞上连续传代100代，并在此过程进行了克隆纯化，然后继续在Vero细胞上传代至145代。将第145代病毒进行RT-PCR检测，扩增S基因片段为484bp。PEDV ZJ08株ORF3基因序列在第105代开始ORF3基因突然出现49个核苷酸的缺失，第105代、125代、145代保持稳定缺失49个核苷酸（图6），序列如SEQ ID No.6所示。

按现行《中国兽药典》附录对第105~145代病毒进行无菌、支原体及外源病毒检验，结果无细菌，霉菌，支原体及外源病毒污染。

将分离致弱的105~145代致弱株种毒命名为PEDV ZJ08株，其微生物保藏号是CGMCC No. 7806；保藏时间是2013年6月28日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

取PEDV ZJ08株第125代与细胞维持液按1:50的比例接种到已长满单层的Vero细胞上，置于37℃培养，待80%细胞出现病变时收获病毒，测定毒价，（病毒含量为10⁷TCID₅₀/ml），加入0.3%的甲醛，置于37℃恒温培养箱24h进行灭活，期间摇动数次，加入3倍量油佐剂，经乳化制备成灭活疫苗，4℃保存备用。

实施例2 血清制备

1）免疫程序

第一次免疫：肌肉注射共4ml。

第二次免疫：在第一次免疫后14日进行，免疫剂量8ml，分两点注射。

第三次免疫：在第二次免疫后14日进行，免疫剂量16ml，分三点注射。

2）采血

最后一次免疫后15～21日，（先采血1次后，采用中和实验方法测血清效价，再放血致死，间隔3～4日），对猪进行健康检查，无任何疾病者，于采血前12小时不喂饲料，但不限制饮水。事前先将杀猪刀、进刀部位皮肤消毒，装血的浅盆经洗净后蒸汽消毒。无菌放血。

3）血清分离与制备

采用自然凝结加压法分离血清。用消毒刀将凝固血划成1 平方厘米的小块，滤出血清，分装于经过蒸汽消毒的容量为500毫升的生理盐水瓶中，每瓶取出20ml被检，其余置于-70℃保存。

猪流行性腹泻病毒ZJ08株灭活后与油佐剂乳化制备成免疫原，最后一次免疫接种后15日检查其中和抗体效价，达到2⁶以上。随后按常规方法无菌采血及分离血清，并对血清半成品进行了纯净性检验。结果表明，制备的血清中无细菌、霉菌和支原体生长，无外源病毒污染，均符合要求。

实施例3 血清效价测定

用DMEM将被检高免血清按1:2、1:16、1:32…1:512稀释，每个稀释度血清均加入等量滴度为200 TCID₅₀/0.1ml的PEDV ZJ08株，37℃中和1小时，接种长满Vero细胞单层的96孔细胞板6孔，每孔100μl，同时设不中和的病毒阳性对照细胞6孔和仅接种细胞维持液阴性对照细胞6孔，37℃ 5% CO₂培养箱培养3～5日，每日观察CPE，中和组和阴性对照组细胞孔均应不出现细胞病变，而病毒对照组细胞应出现细胞病变。以能够保护50%细胞不发生病变的血清最高稀释倍数，作为该血清的中和效价。从表1可以看出，制备的抗猪流行性腹泻病毒高免血清中和效价在2⁶以上。这也为以后疫苗效力评估中如何应用高免血清提供了依据。

表1 抗PEDV 高免血清效价测定结果

+:代表细胞出现病变；-:代表细胞未出现病变

实施例4 特异性检验

将被检血清用DMEM营养液2倍稀释，分别与200TCID₅₀/0.1ml PEDV、 TGEV、CSFV、PRV和PRRSV等量混合，置37℃中和1小时，中和后的混合液分别接种上述病毒的增殖细胞，依次为Vero、ST、PK、ST、Marc-145细胞单层，96孔细胞板6孔，每孔100μl，同时设不中和的病毒阳性对照细胞6孔和仅接种细胞维持液阴性对照细胞6孔，37℃ 5% CO2培养箱培养3～5日，每日观察CPE，中和组和阴性对照组细胞孔均应不出现细胞病变，而不中和组和病毒对照组细胞应出现细胞病变，猪瘟病毒采用免疫荧光方法进行检验。

特异性实验结果表明，该高免血清只能和PEDV发生中和，中和后的混合物接种细胞后没有出现细胞病变，其他几种血清与病毒的混合物接种细胞后除了猪瘟组外，均出现了细胞病变。接种血清猪瘟混合物的PK细胞，采用免疫荧光检测法每孔均出现了荧光（如图7）。上述结果说明，该高免血清与TGEV、CSFV、PRV和PRRSV均不能发生中和作用，血清的特异性很强。

实施例5 安全性检验

用体重18～22g 小白鼠5只，各皮下注射血清0.5ml，观察10日，均应健活。结果表明：该血清接种小鼠后10天，小鼠仍然健活，无任何临床症状。

实施例6效力检验

用14日龄同来源无猪流行性腹泻中和抗体的猪30头，分成三组：第一组10头，每头口服1000×MID/ml猪流行性腹泻p55株（福建省农科院提供第4代组织强毒）1ml，同时注射本发明制备的血清2ml；第二组10头，每头口服1000×MID/ml猪流行性腹泻病毒p55株（福建省农科院提供第4代组织强毒）1ml，同时注射由PEDV 弱毒疫苗株CV777（哈尔滨兽医研究所赠送，由哈尔滨兽医研究所通过将比利时的PEDV强毒致弱而成）制备的高免血清2ml（血清效价与本发明相同）；第三组10头，仅口服1000×MID/ml猪流行性腹泻病毒p55株（福建省农科院提供第4代组织强毒）1ml作为对照。对照猪应于注射后1～3日内出现典型腹泻症状，7日内至少8头死亡。而第一组和第二组各10头猪，观察7日，至少80%健活为合格。效力检验结果（表2），对照猪于注射后3日内出现典型腹泻症状，7日内10头全部死亡。而第一组的10头猪，观察7日，全部健活。第二组猪观察7日，3头死亡，表明本发明制备的高免血清对临床上分离的PEDV p55株治疗效果更好。

表2 高免血清效力检验结果

组别	接种物种类	试验仔猪数	观察时间	发病数	治愈率
						1	PEDV（V-ZJ08株）+本发明血清	10	7	0	100%
2	PEDV（V-ZJ08株）+PEDV 经典疫苗株制备的血清	10	7	3	70%
						3	PEDV（V-ZJ08株）	10	7	10	-

实施例7 保存期试验

将猪流行性腹泻病毒 ZJ08株高免血清置于-70℃条件下保存，于1、3、6、9、12、15个月测定血清效价，按照实施例3中的方法进行。

结果表明，在-70℃条件下保存15个月，血清中和效价2^6.9，将血清保存期定为-70℃条件下保存12个月（见表3）。

表3 血清-70℃保存不同时间的效价测定结果

不同保存时间

1个月

3个月

6个月

9个月

12个月

15个月

血清中和效价

2<sup>6.8</sup>

2<sup>6.9</sup>

2<sup>6.8</sup>

2<sup>6.9</sup>

2<sup>7.0</sup>

2<sup>6.9</sup>

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 北京大北农科技集团股份有限公司动物医学研究中心

福州大北农生物技术有限公司

北京科牧丰生物制药有限公司

北京大北农科技集团股份有限公司

<120> 抗猪流行性腹泻病毒高免血清及其制备方法

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtcttacatg cgaattgacc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggcatagaga gataatggca 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tcctagactt caaccttacg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggtgacaagt gaagcacaga 20

<210> 5

<211> 681

<212> DNA

<213> PEDV M基因

<400> 5

atgtctaacg gttttattcc cgttgatgag gtgattgaac accttagaaa ctggaatttc 60

acatggaata tcatactgac gatactactt gtagtgcttc agtatggcca ttacaagtac 120

tctgtgttct tgtatggtgt caagatggct attctatgga tactttggcc tcttgtgttg 180

gcactgtcac tttttgatgc atgggctagc ttccaggtca actgggtctt tttcgctttc 240

agcatcctta tggcttgcat cactcttatg ctgtggataa tgtattttgt caatagcatt 300

cggttgtggc gcaggacaca ttcttggtgg tctttcaatc ctgaaactga cgcgcttctc 360

actacttctg tgatgggccg acaggtctgc attccagtgc ttggagcacc aactggtgta 420

acgctaacac tccttagtgg tacattgttt gtagagggct ataaggttgc tactggcgta 480

caggtaagtc aattgcctga tttcgtcaca gtcgccaagg ccactacaac aattgtctat 540

ggacgtgttg gtcgttcagt caatgcttca tctggcactg gttgggcttt ctatgtccgg 600

tcaaaacacg gcgactactc agctgtgagt aatccgagtg cggttctcac agatagtgag 660

aaagtgcttc atttagtcta a 681

<210> 6

<211> 626

<212> DNA

<213> PEDV ZJ08 ORF3

<400> 6

atgtttcttg gactttttca atacacgatt gacacagttg tcaaagatgt ctcaaagtct 60

gctaacttgt ctttggatgc tgtccaagag ttggagctca atgtagttcc aattagacaa 120

gcttcaaatg tgacgggttt tcttttcacc agtgttttta tctacttctt tgcactgttt 180

aaagcgtctt ctttgaggcg caattatatt atgttggcag cgcgttttgc tgtcattgtt 240

ctttttgttg cacacttatt ggcaggcttt gtttagtctg cttttactcc tggcgctata 300

aaaatgcgct ctttattatc tttaatacta cgacactttc tttcctcaat ggtaaagcag 360

cttattatga cggcaaatcc attgtgattt tagaaggtgg tgaccattac atcacttttg 420

gcaactcttt tgttgctttc gttagtagca ttgacttgta tctagctata cgtgggcggc 480

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tcttttcgca acatcaaatt gttggcatta ctaatgctgc atttgactca attcaactag 600

acgagtatgc tacaattagt gaatga 626

Claims (3)

1.一种抗猪流行性腹泻病毒高免血清，其为以猪流行性腹泻病毒ZJ08株CGMCCNo.7806的灭活疫苗为免疫原，从免疫猪中分离血清制得。

2.如权利要求1所述的高免血清，其特征在于，所述的猪流行性腹泻病毒ZJ08株CGMCCNo.7806的灭活疫苗为将猪流行性腹泻病毒ZJ08株灭活与油佐剂乳化制备而成。

3.权利要求1或2所述的高免血清的制备方法，其包括如下步骤：

1）免疫：以权利要求1或2所述的猪流行性腹泻病毒ZJ08株CGMCC No.7806的灭活疫苗为免疫原免疫50-60日龄长大二元猪，第一次免疫：肌肉注射共4ml，第二次免疫：在第一次免疫后14日进行，免疫剂量8ml，分两点注射，第三次免疫：在第二次免疫后14日进行，免疫剂量16ml，分三点注射；

2）采血：最后一次免疫后15～21日，检测中和抗体效价，达到2⁹以上时，杀猪无菌放血；

3）血清分离与制备：用消毒刀将凝固血划成1-3平方厘米的小块，滤出血清，分装于无菌生理盐水瓶中，其余置于-70℃保存。