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CN106659148A - 即用打印细胞和集成装置 - Google Patents

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CN106659148A
CN106659148A CN201580027934.7A CN201580027934A CN106659148A CN 106659148 A CN106659148 A CN 106659148A CN 201580027934 A CN201580027934 A CN 201580027934A CN 106659148 A CN106659148 A CN 106659148A
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CN
China
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cells
cell
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aggregation
aggregates
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Application number
CN201580027934.7A
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English (en)
Inventor
乔纳森·艾伦·罗利
利耶·腾·洛克
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Rust Biological Ltd By Share Ltd
Original Assignee
Rust Biological Ltd By Share Ltd
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Publication date
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Abstract

本文公开了提供用于实验、治疗和组织工程改造方案的即用形式的细胞材料的组合物、装置和方法。例如，公开了含有作为聚集体存在的冷冻或非冷冻细胞的组合物。还公开了含有细胞材料的组合物，其在储存后适于分散，例如，通过3D打印。还公开了用于产生生物墨组合物的试剂盒。还公开了包含本文所述的细胞材料组合物的封闭系统装置。

Description

即用打印细胞和集成装置
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年5月12日提交的美国临时申请No.61/992,184的权益，该临时申请据此通过引用整体并入本文。
背景
再生医学在临床上显示出很好的前景，但是研究人员可利用其进行实验和临床试验的细胞材料的成本和可用性妨碍着该领域的发展。非常需要以高质量和低成本制造并且以加速产品开发和制造努力的量和形式递送给转化研究者和装置制造者的标准化原代细胞。还需要具有足以用于组织工程改造应用(例如生物打印)的保质期的细胞形式。特别地，需要即用且稳定形式的间充质干细胞(MSC)用于组织工程改造和细胞治疗应用。
概述
本文公开了为实验、治疗和组织工程改造方案提供“即用”形式的细胞材料的组合物、装置和方法。例如，公开了包含作为聚集体存在的冷冻或非冷冻细胞的组合物，包括包含间充质干细胞的聚集体。所述聚集体可以含有每个聚集体平均约100至200,000个细胞，包括每个聚集体约1,000至约100,000个细胞。在一些情况下，所述聚集体含有每个聚集体平均约1,000、5,000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000、110,000、120,000、130,000、140,000、150,000、160,000、170,000、180,000、190,000或200,000个细胞。例如，细胞聚集体可以用作组织工程改造的构成单元(buildingblock)，例如通过3D打印，以及用于细胞治疗应用的功能性可植入物体。因此，细胞聚集体的标志是聚集体内的单个细胞维持其活力和功能的能力，并且当聚集体在培养物中彼此融合时，它们能够形成功能组织。因此，聚集体融合的能力可以证明良好的细胞活力和功能。聚集体还优选具有相似的尺寸和体积。例如，在一些实施方案中，组合物中每个细胞聚集体的平均直径方差小于5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％。
所公开的组合物还可包含足以维持至少70％的细胞活力的量的冷冻保存剂和/或生物保存剂。例如，细胞可以是具有一定量的冷冻保存剂(例如二甲亚砜(DMSO))的冷冻细胞，其足以保持细胞聚集体在-10℃至-80℃、例如-20℃下储存至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个月之后融合的能力。作为另一个实例，所述细胞可以是具有一定量的生物保存剂(例如)的非冷冻细胞，其足以保持细胞聚集体在0至25℃(例如4℃)下储存至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30天之后融合的能力。
所公开的组合物的细胞可以是当一起培养时能够形成细胞聚集体且融合的任何细胞。在一些情况下，所述细胞是具有对应于所工程改造的所需组织的细胞谱系潜能的未分化的干细胞或祖细胞。所述细胞可以是单能的、寡能的、多能的(multipotent)或多能的(pluripotent)。在一些实施方案中，所述细胞是成体干细胞。所述细胞优选是同种异体或自体的。在一些特定实施方案中，所述细胞包括间充质干细胞(MSC)。所述组合物可以含有单细胞类型，例如MSC。然而，在一些实施方案中，所述组合物含有两种或更多种不同类型的细胞，即两种或更多种不同谱系的细胞。所述细胞可以是动物细胞，例如人细胞。
还公开了含有细胞材料的组合物，其在储存后适于分散，例如，通过3D打印。所公开的组合物包含悬浮在粘性基质中的细胞，使得细胞的平均细胞密度为每毫升1至100百万个细胞，包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100百万个细胞/毫升。此外，所述粘性基质可以具有有效维持组合物中细胞密度方差小于5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％至少24小时、36小时、48小时、72小时或120小时的粘度。在一些实施方案中，所述组合物中的细胞在0℃至25℃(例如4℃)下储存至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30天后具有至少70％的细胞活力。“活力”是指细胞是活的和功能性的。细胞的功能可以根据细胞的类型而不同，但包括复制、分泌细胞因子、分泌生长因子、粘附到组织培养塑料、粘附到其他细胞、迁移的能力或其任何组合。在一些情况下，确定活力涉及检测由细胞产生的一种或多种酶的存在和/或活性。如上所述，细胞可以作为聚集体存在。评价聚集体中细胞活力的一个重要方法是测试聚集体融合的能力。因此，所述组合物还可包含生物保存剂、冷冻保存剂或其组合。
用于悬浮细胞的粘性基质可以是适合于3D打印和/或组织工程改造的任何生物相容性聚合物。在一些情况下，所述聚合物是生物聚合物。例如，合适的生物聚合物包括多糖、多肽和糖蛋白。这包括天然或合成来源的细胞外基质(ECM)分子。在一些实施方案中，生物相容性聚合物包括藻酸盐。可以调节生物相容性聚合物的粘度以维持细胞的悬浮，同时还优选足够流体以用于分散，例如通过经针或喷嘴注射。在特定实施方案中，所述细胞在组合物中维持密度方差小于5％、10％、15％或20％至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30天。
还公开了用于产生生物墨(bioink)组合物的试剂盒。在一些情况下，所述试剂盒包含组合物，所述组合物包含含有每个聚集体平均约1,000至约100,000个细胞的细胞聚集体。所述试剂盒还可以包含生物相容性聚合物。所述生物相容性聚合物可以与细胞聚集体在相同或不同的容器中。所述试剂盒还可以包含交联剂。此试剂也可以与细胞聚集体在相同或不同的容器中，只要生物相容性聚合物和交联剂在不同的容器中即可。
还公开了包含本文所述的细胞材料组合物的封闭系统装置。所述封闭系统装置可以被配置以作为离散单元在表面上分配组合物。例如，在一些实施方案中，每个离散单元可以包含受控量的细胞。封闭系统装置的实例是盒(catridge)，例如在三维(3D)打印机装置中使用的盒。
在附图和下面的描述中阐述了本发明的一个或多个实施方案的细节。根据说明书和附图以及权利要求书，本发明的其它特征、目的和优点将是显而易见的。
附图说明
图1A显示在铺板后粘附2小时的间充质干细胞(MSC)的图像。图1B是两个批次的MSC在铺板和扩增2代后的生长曲线。
图2是柱状图，其显示在解冻和扩增冷冻保存的MSC后，三批MSC表达CD73、CD90、CD105和CD166，而对CD45、CD34和CD14呈阴性。
图3是显示解冻和扩增冷冻保存的MSC后三个批次的MSC中血管生成细胞因子的分泌水平的条形图。
图4显示在解冻和扩增冷冻保存的MSC后，MSC分化为成脂(A)和成骨(B)谱系。
图5是显示在解冻和扩增冷冻保存的MSC后MSC维持其免疫调节功能的条形图。
图6A和6B是显示hMSC聚集体形成的图像。
图7A是显示MSC聚集体自发融合的图像，其指示活的和具有代谢活性的细胞。图7B显示MSC聚集体附着，其指示活的和具有代谢活性的细胞。
图8是柱状图，其显示当在37℃培养物中铺板和孵育时，MSC聚集体继续分泌血管生成细胞因子。
图9是显示MSC聚集体的吲哚胺-吡咯2，3-双加氧酶(IDO)活性的条形图。
图10A是显示包封在藻酸盐中并挤压到CaCl2的单细胞和聚集体MSC的图像。图10B是显示在包封后用钙荧光素-AM染色的具有高度活性的MSC聚集体(绿色)的图像。图10C是显示MSC聚集体在挤压的藻酸盐中融合的图像。
图11是一系列图像，其显示在TC板中培养1天后，在4℃下于具有4％HSA的hypothermosol、培养基或盐水中储存3天和7天的hMSC聚集体。
图12是一系列图像，其显示在TC板中培养6天后，在4℃下于具有4％HSA的hypothermosol，培养基或盐水中储存3天和7天的hMSC聚集体。
图13是一系列图像，其显示在非粘附板中培养1天后，在4℃下于具有4％HSA的hypothermosol、培养基或盐水中储存3天和7天的hMSC聚集体。
图14是显示在4℃下于HTS、盐水、培养基中储存3或7天后MSC聚集体的IDO活性的条形图。
图15是显示在4℃下于HTS、盐水、培养基中储存3或7天后MSC聚集体的Ang-2、FGF、HGF、IL-8、TIMP-1、TIMP-2和VEGF分泌的条形图。
图16是一系列图像，其显示冷冻保存的hMSC聚集体维持聚集体融合的能力，以及个体细胞附着到组织培养(TC)塑料并从聚集体生长的能力。
图17是显示冷冻保存的聚集体维持诱导型免疫调节表型的条形图。
图18是显示冷冻保存和非冷冻MSC聚集体的Ang-2、FGF、HGF、IL-8、TIMP-1、TIMP-2和VEGF分泌的条形图。
图19A至19C是显示冷冻保存的MSC聚集体能够制成环形(图19A-19B)的图像，H&E染色证实整个环结构中聚集体的一致的健康融合(图19C)。
图20A是示出每个聚合体以1000个细胞制成的100,000个聚集体的生成的过程流程图。图20B是显示细胞扩增的时间节省(天)的条形图。
图21A是显示不同藻酸盐制剂的可打印性测试的图像。图21B是显示不同藻酸盐制剂的稠度和粘性的图表。
图22是显示不同藻酸盐制剂的沉降和凝集(clumping)的图表。
图23是一系列图像，其显示在4℃下储存7天后MSC聚集体在水凝胶中的存活和在接种到TC板上时聚集体的扩大。
图24A和24B是显示用于MSC聚集体产品构造(product configuration)的生物墨试剂盒的图像。
图25是最终MSC聚集体生物墨产品构造的图像，其适合于在4℃下的产品运输和储存。
详述
所公开的组合物、装置和方法涉及再生医学、基于干细胞的技术和医疗装置、组织工程改造、生物医学研究和开发、来源于活细胞的细胞原材料和生物功能材料领域。特别地，公开了以能够将这些细胞或细胞来源的材料掺入生物和生物医学产品的形式递送的功能活细胞的稳定组合物和制剂。
本文提供了能够将细胞掺入工程改造组织、医疗装置或需要功能性活细胞的其他产品的高功能活细胞的稳定制剂。例如，公开了用于再生医学、组织工程改造和生物打印应用的细胞组合物。本文提供的稳定制剂使细胞或细胞聚集体以高活性和功能性的状态保持悬浮。
所述组合物可以含有作为单细胞悬液的细胞制剂或作为在数天、数周或数月的储存后即用的同源或异源细胞聚集细胞的细胞制剂。所述细胞制剂允许保持细胞活力和功能性。一些制剂中的细胞优选保持悬浮而在储存期间不沉降，并且具有递送到特定位置同时保持活力和功能的能力。稳定的制剂可以在冷冻(即冷冻保存)或非冷冻(生物保存)状态下稳定数周至数月或数年。冷冻状态是指稳定的制剂处于或低于冷冻温度(例如，等于或低于0℃，通常为至少-20℃)。在一些实施方案中，以冷冻状态储存的制剂还包含冷冻保存剂。非冷冻状态是指稳定的制剂处于高于冷冻温度(例如，等于或高于0℃)，通常为至少2℃。在一些实施方案中，非冷冻状态包括0至37℃，例如4至24℃。
本文所用的术语“细胞”还指个体细胞、细胞系、原代培养物或源自这样的细胞的培养物，除非特别指明。“培养物”是指包含相同或不同类型的分离的细胞的组合物。
在一些实施方案中，所公开的组合物包含干细胞或祖细胞。多能干细胞、成体干细胞、胚泡来源的干细胞、性腺来源的干细胞、畸胎瘤来源的干细胞、全能干细胞、多能干细胞、制瘤素非依赖性干细胞(OISC)、胚胎干细胞(ES)、胚胎生殖细胞(EG)和胚胎癌细胞(EC)都是干细胞的实例。干细胞可以具有这些性质的多种不同特性和种类。例如，在一些形式中，干细胞能够在未分化状态下增殖至少10、15、20、30代或更多代。在一些形式中，干细胞可以增殖超过一年而不分化。干细胞还可以在增殖和/或分化时维持正常核型。干细胞还能够保留分化成中胚层、内胚层和外胚层组织(包括生殖细胞、卵和精子)的能力。一些干细胞也可以是能够在未分化状态下在体外无限增殖的细胞。一些干细胞也可以通过延长培养维持正常核型。即使在延长培养后，一些干细胞也可以保持分化为所有三个胚胎胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的衍生物的潜力。一些干细胞可以在生物体中形成任何细胞类型。一些干细胞可在某些条件下形成胚状体，例如在不保持未分化生长的培养基上生长。例如，一些干细胞可以通过与胚泡融合形成嵌合体。
一些干细胞可以由多种标志物限定。例如，一些干细胞表达碱性磷酸酶。一些干细胞表达SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和/或TRA-1-81。一些干细胞不表达SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和/或TRA-1-81。一些干细胞表达Oct 4、Sox2和Nanog。应当理解，一些干细胞将在mRNA水平上表达这些干细胞，而另外一些干细胞还将例如在细胞表面或在细胞内在蛋白质水平表达它们。
在一些实施方案中，所公开的组合物包含除干细胞之外的细胞。成人体产生许多不同的细胞类型。这些不同的细胞类型包括但不限于角质化上皮细胞、湿复层屏障上皮细胞、外分泌分泌上皮细胞、激素分泌细胞、上皮吸收细胞(肠、外分泌腺和泌尿生殖道)、代谢和储存细胞、屏障功能细胞(肺、肠、外分泌腺和泌尿生殖道)、上皮细胞内衬封闭的内部体腔、具推进功能的纤毛细胞、细胞外基质分泌细胞、收缩细胞、血液和免疫系统细胞、感觉传感器细胞、自主神经元细胞、感觉器官和外周神经元支持细胞、中枢神经系统神经元和神经胶质细胞、晶状体细胞、色素细胞、生殖细胞和营养细胞(Nurse cell)。
人体的细胞包括角质化上皮细胞、表皮角化细胞(分化表皮细胞)、表皮基底细胞(干细胞)、指甲和趾甲的角化细胞、指甲床基底细胞(干细胞)、髓质毛干细胞、皮质毛干细胞、角质毛干细胞、角质毛根皮细胞、赫胥黎氏层(Huxley′s layer)的毛根皮细胞、汉勒氏层(Henle′s layer)的毛根皮细胞、外毛根皮细胞、毛基质细胞(干细胞)、湿复层屏障上皮细胞、角膜、舌、口腔、食管、肛管、远端尿道和阴道的复层扁平上皮的表面上皮细胞、角膜、舌、口腔、食道、肛管、远端尿道和阴道上皮的基底细胞(干细胞)、泌尿上皮细胞(衬里膀胱和泌尿道)、外分泌性分泌上皮细胞、唾液腺粘液细胞(富含多糖的分泌)、唾液腺浆液细胞(富含糖蛋白酶的分泌)、舌中的艾伯纳腺细胞(Von Ebner′s gland cell)(清洗味蕾)、乳腺细胞(乳分泌)、泪腺细胞(泪分泌)、耳中的泪腺细胞(蜡分泌)、外分泌腺汗腺暗细胞(糖蛋白分泌)、外分泌腺汗腺透明细胞(小分子分泌)、顶泌汗腺细胞(气味分泌、性激素敏感)、眼睑中的莫尔细胞(Moll cell)腺(专门的汗腺)、皮脂腺细胞(富含脂质的皮脂分泌)、鼻中的鲍曼氏腺细胞(清洗嗅觉上皮)、十二指肠中的布鲁纳氏腺细胞(酶和碱性粘液)、精囊泡细胞(分泌精液组分，包括用于游泳精子的果糖)、前列腺细胞(分泌精液组分)、球囊腺细胞(粘液分泌)、巴多林氏腺(Bartholin′s gland)细胞(阴道润滑剂分泌)、尿道腺细胞(粘液分泌)、子宫内膜细胞(碳水化合物分泌)、呼吸和消化道的分离的杯状细胞(粘液分泌)、胃内衬粘液细胞(粘液分泌)、胃腺产酶细胞(胃蛋白酶原分泌)、胃腺壁细胞(HCl分泌)、胰腺腺泡细胞(碳酸氢盐和消化酶分泌)、小肠帕内特细胞(Paneth cell)(溶菌酶分泌)、肺的II型肺细胞(表面活性剂分泌)、肺的克拉拉细胞(Clara cell)、分泌激素的细胞、分泌生长激素的前垂体细胞、分泌促卵泡激素的前垂体细胞、分泌促黄体生成激素的前垂体细胞、分泌促乳素的前垂体细胞、分泌促肾上腺皮质激素的前垂体细胞、分泌促甲状腺激素的前垂体细胞、分泌促黑素细胞激素的中间垂体细胞、分泌催产素的后垂体细胞、分泌加压素的后垂体细胞、分泌5-羟色胺的肠道和呼吸道细胞、分泌内啡肽的肠道和呼吸道细胞、分泌生长激素抑制素的肠道和呼吸道细胞、分泌胃泌素的肠道和呼吸道细胞、分泌胰泌素的肠道和呼吸道细胞、分泌缩胆囊素的肠道和呼吸道细胞、分泌胰岛素的肠道和呼吸道细胞、分泌胰高血糖素的肠道和呼吸道细胞、分泌蛙皮素的肠道和呼吸道细胞、分泌甲状腺激素的甲状腺细胞、分泌降血钙素的甲状腺细胞、分泌甲状旁腺激素的甲状旁腺细胞、甲状旁腺嗜酸性细胞、分泌肾上腺素的肾上腺细胞、分泌去甲肾上腺素的肾上腺细胞、分泌类固醇激素(盐皮质激素和糖皮质激素)的肾上腺细胞、分泌睾酮的睾丸的睾丸间质细胞、分泌雌激素的卵泡的卵泡内膜细胞、分泌孕酮的破裂卵泡的黄体细胞、肾脏肾小球旁细胞(肾素分泌)、肾的致密斑细胞、肾的极周细胞、肾的间质细胞、上皮吸收细胞(肠、外分泌腺和泌尿生殖道)、肠刷状缘细胞(具有微绒毛)、外分泌腺条纹管细胞、胆囊上皮细胞、肾近端小管刷状缘细胞、肾远端小管细胞、输出管无纤毛细胞、附睾性主细胞、附睾基底细胞、代谢和储存细胞、肝细胞(肝细胞)、白色脂肪细胞、褐色脂肪细胞、肝脂肪细胞、屏障功能细胞(肺、肠、外分泌腺和泌尿生殖道)、I型肺细胞(肺内衬空气空间)、胰管细胞(泡心细胞)、无横纹管细胞(汗腺、唾液腺、乳腺等)、肾小球壁细胞、肾小球足细胞、汉勒氏袢薄节片细胞(Loop of Henle thinsegment cell)(肾脏中)、肾收集管细胞、管细胞(精囊、前列腺等)、上皮细胞内衬封闭的内体腔、血管和淋巴血管内皮有孔细胞、血管和淋巴血管内皮连续细胞、血管和淋巴血管内皮脾细胞、滑膜细胞(内衬关节腔、透明质酸分泌)、浆膜细胞(内衬腹膜、胸膜和心包腔)、鳞状细胞(耳内衬外淋巴隙)、鳞状细胞(耳内衬内淋巴隙)、具有微绒毛的内淋巴囊的柱状细胞(耳内衬内淋巴隙)、没有微绒毛的内淋巴囊(耳内衬内淋巴隙)、暗细胞(耳内衬内淋巴隙)、前庭膜细胞(耳内衬内淋巴隙)、血管纹基底细胞(耳内衬内淋巴隙)、血管纹缘细胞(耳内衬内淋巴隙)、柯拉狄乌司氏细胞(Cell of Claudius)(耳内衬内淋巴隙)、伯特歇尔细胞(Cell of Boettcher)(耳内衬内淋巴隙)、脉络丛细胞(脑脊髓液分泌)、软蛛网膜鳞状细胞、眼的色素睫状体上皮细胞、眼的非色素睫状体上皮细胞、角膜内皮细胞、具推进功能的纤毛细胞、呼吸道纤毛细胞、输卵管纤毛细胞(雌性)、子宫内膜纤毛细胞(雌性)、睾丸纤毛细胞(雄性)、输出管纤毛细胞(雄性)、中枢神经系统的纤毛状室管膜细胞(内衬脑腔)、细胞外基质分泌细胞、成釉细胞上皮细胞(牙釉质分泌)、耳前庭半月面上皮细胞(蛋白聚糖分泌)、柯替氏器齿间上皮细胞(分泌覆盖毛细胞的盖膜)、疏松结缔组织成纤维细胞、角膜成纤维细胞、腱成纤维细胞、骨髓网状组织成纤维细胞、其他(非上皮)成纤维细胞、血液毛细血管周细胞、椎间盘髓核细胞、成牙骨质细胞/牙骨质细胞(牙根骨样牙基质分泌)、成牙质细胞/牙质细胞(牙齿牙质分泌)、透明软骨软骨细胞、纤维软骨软骨细胞、弹性软骨软骨细胞、成骨细胞/骨细胞、骨原细胞(成骨细胞的干细胞)、眼的玻璃体的玻璃体细胞、耳的外淋巴隙星状细胞、收缩细胞、红色骨骼肌细胞(慢)、白色骨骼肌细胞(快)、中间骨骼肌细胞、肌肉轴-核袋细胞、肌肉主轴-核链细胞、卫星细胞(干细胞)、普通心肌细胞、结节心肌细胞、浦肯野纤维细胞、平滑肌细胞(各种类型)、虹膜的肌上皮细胞、外分泌腺的肌上皮细胞、血液和免疫系统细胞、红细胞(血红细胞)、巨核细胞、单核细胞、结缔组织巨噬细胞(各种类型)、表皮朗格汉斯细胞、破骨细胞(骨中)、树突状细胞(淋巴组织中)、小胶质细胞(中枢神经系统)、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性细胞、肥大细胞、辅助T淋巴细胞、抑制T淋巴细胞、杀伤T淋巴细胞、IgM B淋巴细胞、IgG B淋巴细胞、IgA B淋巴细胞、IgE B淋巴细胞、杀伤细胞、干细胞和用于血液和免疫系统的定向祖细胞(各种类型)、感觉传感器细胞、眼感光杆细胞、眼感光器蓝感光锥细胞、眼感光器绿感光锥细胞、眼光感受器红感锥细胞、柯蒂氏器的听觉内毛细胞、柯蒂氏器的听觉外毛细胞、耳前庭器官的I型毛细胞(加速度和重力)、耳前庭器官的II型毛细胞(加速度和重力)、I型味蕾细胞、嗅觉神经元、嗅觉上皮的基底细胞(嗅觉神经元的干细胞)、I型颈动脉体细胞(血液pH感受器)、II型颈动脉体细胞(血液pH感受器)、表皮的默克尔细胞(触摸感受器)、触敏初级感觉神经元(各种类型)、冷感觉初级感觉神经元、热敏初级感觉神经元、痛敏初级感觉神经元(各种类型)、本体感觉初级感觉神经元(各种类型)、自主神经元细胞、胆碱能神经细胞(各种类型)、肾上腺素能神经细胞(各种类型)、肽能神经细胞(各种类型)、感觉器官和外周神经支持细胞、柯蒂氏器的内支柱细胞、柯蒂氏器的外支柱细胞、柯蒂氏器的内指骨/趾骨细胞、柯蒂氏器的外指骨/趾骨细胞、柯蒂氏器的缘细胞、柯蒂氏器的汉森细胞、前庭器官支持细胞、I型味蕾支持细胞、嗅觉上皮支持细胞、施万氏细胞、卫星细胞(包裹周围神经细胞体)、肠胶质细胞、中枢神经系统神经元和神经胶质细胞、神经元细胞(各种类型，分类仍然不良)、星形细胞胶质细胞(各种类型)、少突胶质细胞、晶状体细胞、前晶状体上皮细胞、含晶状体蛋白的晶状体纤维细胞、色素细胞、黑素细胞、视网膜色素上皮细胞、生殖细胞、卵子/卵母细胞、精母细胞、精原细胞(精细胞干细胞)、营养细胞、卵泡细胞、滋养细胞(睾丸中)及胸腺上皮细胞。
在一些情况下，所述细胞是间充质干细胞(MSC)或骨髓基质细胞(BMSC)。这些术语在本文全文中同义使用。MSC是令人感兴趣的，因为它们容易从骨髓的小量抽吸物或其他间充质干细胞源中分离，并且它们容易产生单细胞来源的集落。骨髓细胞可以从髂嵴、股骨、胫骨、脊柱、肋、膝或其他间充质组织获得。MSC的其他来源包括胚胎卵黄囊、胎盘、脐带、皮肤、脂肪、来自关节的滑膜组织和血液。可以通过用单克隆抗体鉴定的特异性细胞表面标志物来验证培养集落中MSC的存在。参见美国专利No.5,486,359和7,153,500。单细胞衍生的集落可以在约10周内扩增多达50次群体倍增，并且可以分化成成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞(Friedenstein等人，1970 Cell Tiss ue Kinet.3：393-403；Castro-Malaspina，等人，1980 Blood 56：289-301；Beresford等人，1992 J.Cell Sci.102：341-351；Prockop，1997Science 276：71-74)、肌细胞(Wakitani等人，1995 Muscle Nerve18：1417-1426)、星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元(Azizi等人，1998 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：3908-3913)；Kopen等人1999Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：10711-10716；Chopp等人，2000Neuroreport II 300 1-3005；Woodbury等人，2000 Neuroscience Res，61：364-370)。在极少数情况下，细胞可以分化成所有三种种系的细胞。因此，MSC用作多种间充质细胞谱系的祖细胞，包括骨、软骨、韧带、腱、脂肪、肌肉、心脏组织、基质、真皮及其他结缔组织。参见美国专利No.6,387,369和7,101,704。由于这些原因，目前正在测试MSC在许多人类疾病的细胞和基因治疗中的潜在用途(Horwitz等人，1999 Nat.Med.5：309-313；Caplan等人，2000 Clin.Orthoped.379：567-570)。
用于产生MSC聚集体的方法描述于Prockop等人的US2012/0219572和Bartosh等人，PNAS 2010 107(31)：13724-13729中，两者均通过引用整体并入本文用于本教导。例如，可以以促进球状体的聚集和形成的方式培养MSC。例如，MSC可以从人骨髓中分离并在悬滴或非粘附皿中在完全培养基(含有4mM L-谷氨酰胺、10％PBS和1％青霉素/链霉素的DMEM低葡萄糖)中培养。能够在体外支持MSC的任何培养基均可用于培养MSC。可支持MSC生长的培养基制剂包括但不限于达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)、α改良的最小必需培养基(αMEM)和Roswell Park Memorial Institute Media1640(RPMI Media 1640)等。通常，将多至20％胎牛血清(FBS)或1至20％马血清加入到上述培养基中以支持MSC的生长。然而，如果在培养基中以适当的浓度提供培养MSC所必需的生长因子、细胞因子和激素，也可以使用确定成分的培养基(defined medium)。在所公开的方法中有用的培养基可以含有一种或多种目的化合物，包括但不限于用于培养MSC的抗生素、促有丝分裂或分化的化合物。所述细胞可以例如在27℃至40℃(包括31℃至37℃)的温度下生长。二氧化碳含量可以维持在2％至10％之间，氧含量可以维持在1％至22％之间。
在一些实施方案中，在足以提供足够数量的细胞用于进一步培养的条件和时间下培养MSC。然后在促进细胞球形聚集体形成的条件下培养细胞。在一些实施方案中，细胞在Aggrewell板中培养。在一些实施方案中，将细胞培养为悬滴。在一些实施方案中，培养的MSC的每个悬滴含有约1,000至约500,000个细胞/滴。然后可以将MSC的悬滴培养足以形成间充质干细胞的球形聚集体的一段时间。通常，将细胞滴培养长达4天的时间段。
所述细胞可以来源于人或其他动物。例如，细胞可以来自小鼠、豚鼠、大鼠、牛、马、猪、绵羊或山羊。在一些实施方案中，所述细胞来源于非人灵长类动物。在一些情况下，所述细胞是自体的或同种异体的。
在一些情况下，所述细胞获自细胞培养物，其涉及群体倍增(细胞传代)。在这些情况下，所述细胞优选来自小于或等于50倍的群体倍增，包括在4至50、10至30之间的群体倍增。因此，细胞可以来自如下代数：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。
有几种生物材料可用于组织工程改造和细胞递送，其中大多数这些材料被认为是“水凝胶”或含水凝胶。这些材料的要求是1)生物相容性：细胞必须能够与材料组合，通常在整个材料中，并保持活力和功能；和2)在大多数情况下，水凝胶还必须促进嵌入的细胞和内源性细胞的迁移、增殖和分化。存在用于维持水凝胶的“可打印性”同时仍保持生物相容性和迁移/功能的初始需求的额外约束。这些在Malda，J等人，Adv.Mater.2013，25，5011-5028中概述。此外，可用于生物打印的许多商业来源的水凝胶描述于Murphy SV，Skardal A，Atala A.2013，Evaluation of hydrogels for bio-printing applications.J BiomedMater Res A部分2013：101A：272-284中，包括I型胶原蛋白、胶原蛋白/纤维蛋白、纤维蛋白、ExtracelTM水凝胶、ExtracelTM UV、酪胺取代的透明质酸(TS-NaHy)、CorgelTM、甲基纤维素-透明质酸(MC-HA)、壳聚糖、壳聚糖/胶原、藻酸盐、藻酸盐/明胶和聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)。
用于组织工程改造和生物打印的常见材料是藻酸盐、胶原、纤维蛋白、纤维蛋白原、聚乙二醇(PEG)、琼脂、琼脂糖、壳聚糖、透明质酸、甲基丙烯酰胺、明胶、普朗尼克(pluronic)、基质胶(matrigel)、甲基纤维素和PEG-DA(二丙烯酸酯)。这些材料通常不简单地单独使用，而是通常混合在一起以组合性质(例如，藻酸盐或PEG-DA的胶凝化特性与胶原/纤维蛋白的细胞粘附能力)制备新组合物。此外，可以从根本上设计新的水凝胶以考虑进这些性质(Guvendiren和Burdick，Current Opinion in Biotechnology 2013，24：841-846)。
用于所公开的组合物和方法的水凝胶与细胞的分配/打印相容，同时还具有在生物保存过程中具有细胞保持活力和功能数天/周/月的能力。
本文提供的组合物包含在长期储存后保持高活力和功能的细胞。活力是指在保存或储存之后，细胞是活的并且能够存在与存储之前相同的细胞功能。在一些情况下、高活力是指至少50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的初始细胞群体在保存或储存后能够存活、生长和发挥功能。
细胞活力可以使用本领域已知的方法测定。活力测定是确定器官、细胞或组织维持或恢复活力的能力的测定。可以通过使用0与1(或0与100％)之间的可量化指数由生存和死亡的全有或全无状态区分活力(Pegg DE(1989).“Viability assays for preservedcells，tissues，and organs”Cryobiology 26(3)：212-231)。例如，检查细胞中钾与钠的比例可以用作生存力的指标。如果细胞不具有高细胞内钾和低细胞内钠，则细胞膜可能不完整，和/或(2)钠-钾泵可能不能很好地操作。因此，许多测量细胞膜完整性的测定被用作活力的量化测量。这些可以是台盼蓝、碘化丙啶(PI)，其是可以穿透渗漏的细胞膜并且已经在市售细胞计数器中自动化的染料。其他类型的测定测量细胞群体的总代谢速率，例如测量总ATP、基于甲瓒的测定(MTT/XTT)和基于Alomar蓝或基于刃天青的测定。然而，生理功能的定量测量不指示损伤修复和恢复是否可能。细胞粘附到表面、扩散并最终迁移和分裂的能力的测定可能更多地指示活细胞，但可以产生相当多的时间并且可以更少定量。据言，所有这些测试都可用作活力测定以评估冷冻保存技术的成功、物质的毒性或物质在减轻有毒物质的影响中的有效性。
在所公开的研究中，使用自动PI膜完整性测定(Chemometech Inc的NucleoCounter NC100)作为荧光活/死测定，并使用Alomar蓝测量聚集体的细胞代谢。还使用了功能测试，其显示聚集体内的细胞仍可粘附于细胞培养塑料并从聚集体生长出来，并且当聚集体保持在非粘附表面上时，聚集体边缘处的细胞将与其他聚集体结合，使聚集体融合成单个较大的结构。一般的假设是，如果细胞仍然能够粘附培养板上且在培养板上扩散，或者如果细胞聚集体融合(其为粘附和扩散的3D等同形式)，那么许多细胞功能例如细胞因子分泌、分化和hMSC的免疫调节功能得以维持。
作为储存细胞的水溶液的结果，可以维持组合物中细胞(例如MSC)的高活力。水溶液可以例如包含减少细胞凋亡和细胞死亡的化学品和营养物。
因此，在一些实施方案中，所述组合物包含冷冻保存剂。冷冻保存剂的非限制性实例包括二甲亚砜(DMSO)、甘油、聚乙烯吡咯烷、聚乙二醇、白蛋白、葡聚糖、蔗糖、乙二醇、异赤藓醇、D-核糖醇、D-甘露醇、D-山梨糖醇、异肌醇、D-乳糖、氯化胆碱、氨基酸、甲醇、乙酰胺、单乙酸甘油酯、无机盐或其任何组合。在一些情况下，冷冻保存剂包含、CS2、CS5或CS10冷冻介质(BioLife Solutions，Inc)和5％DMSO。在一些情况下，冷冻保存剂包含1％至15％DMSO，例如2％至7.5％，包括5％DMSO。
在一些实施方案中，所公开的细胞组合物包含生物保存剂，其清除自由基、提供pH缓冲、提供膨胀/渗透支持、含有能量底物、具有在低温下平衡细胞内状态的离子浓度或其任何组合。例如，在一些实施方案中，所述生物保存制剂包含Hypo(BioLifeSolutions，Inc.)，例如HypoFRS。HypoFRS的组分包括Trolox(6-羟基-2，5，7，8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸)、Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cl-、H2PO4-、HCO3-、HEPES、乳糖醛酸、蔗糖、甘露醇、葡萄糖、葡聚糖-40、腺苷和谷胱甘肽，pH为7.6，渗透压为约360。因此，在一些实施方案中，所公开的细胞组合物包含2-10％DMSO和Hypo或FRS。
本文提供的组合物包含高体积和高细胞浓度的细胞。在一些实施方案中，所公开的细胞组合物包含浓度为至少1百万个细胞/mL的至少1千万个细胞。例如，在一些实施方案中，所述组合物包含至少1千万、1亿、10亿、100亿或500亿个细胞，浓度为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90或1亿个细胞/mL。
在一些实施方案中，所公开的细胞作为多细胞聚集体存在，其充当“微组织”，并且在打印时可用于更高阶3D组织的构成单元或者用于细胞治疗应用中的移植细胞的稳定形式。因此，这些聚集体优选具有均一的尺寸和形状，尽管不同尺寸和形状的多细胞聚集体在许多应用中也可能足够。聚集体还优选均匀地分散在细胞组合物中，以便在分配、挤出或打印时提供一致数量的细胞。
可以基于预期用途选择聚集体的尺寸和密度。在一些实施方案中，细胞以含有至少100、200、300、400、500、600、700、800、900、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000、150,000或200,000个细胞/聚集体的聚集体存在。在每种组合物中，聚集体优选具有小于5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％或20％的直径方差。
在一些实施方案中，将所公开的细胞悬浮在将细胞维持在悬浮液中以增强组合物内均匀分布同时还保持组合物用于挤出(例如用于生物打印)的适合性的粘性溶液(即，挤出材料)中。“均匀分布”是指细胞在每种组合物中具有小于5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％或20％的密度方差。例如，粘性溶液可以是水凝胶，例如上述的那些。因此，粘度优选足够高以保持均匀分布，同时足够低以适于通过生物打印机挤出。
在一些实施方案中，所公开的组合物(生物墨)的特征在于具有如下粘度：约500至1,000,000厘泊、约750至1,000,000厘泊、约1000至1,000,000厘泊、约1000至400,000厘泊、约2000至100,000厘泊、约3000至50,000厘泊、约4000至25,000厘泊、约5000至20,000厘泊或约6000至15000厘泊。粘度可以通过常规方法用粘度计测量。
在一些情况下，挤出材料也是适合组织工程改造的生物材料，例如胶原、透明质酸盐、纤维蛋白、藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖及其组合。在一些其它实施方案中，合适的水凝胶是合成聚合物。在另外一些实施方案中，合适的水凝胶包括衍生自聚(丙烯酸)及其衍生物、聚(环氧乙烷)、聚(乙二醇)及其共聚物、聚(乙烯醇)、聚磷腈及其组合的那些。
在一些实施方案中，挤出化合物包含光引发剂，其为在特定波长的光吸收时产生能够催化聚合或缩聚反应的反应性物质的分子。这些反应区也称为光聚合或辐射固化。光引发剂通常是含有芳族基团和羰基二者的酮。
在一些实施方案中，基于水凝胶的挤出化合物是热致可逆凝胶(也称为热响应凝胶或热凝胶)。在一些实施方案中，合适的热致可逆水凝胶在室温下不是液体。由聚氧丙烯和聚氧乙烯构成的聚合物在加入水溶液中时形成热致可逆凝胶。这些聚合物具有在生物打印机装置中可以保持的温度下从液态变为凝胶态的能力。液态到凝胶态的相变取决于溶液中聚合物的浓度和成分。
稳定的细胞制剂可以储存在例如传统的螺旋或隔膜顶部瓶中，或者在可以从冷冻或非冷冻储存中取出并与分配装置集成的无菌封闭系统装置内。所述分配装置可以例如是生物打印机或自动或者自动或手动注射装置。任选地，生物打印机可以是三维(3D)生物打印机。分配装置可以将活细胞递送到特定位置，同时保持细胞的无菌性和质量。因此，在一些实施方案中，所公开的细胞组合物包含在无菌或无菌生物墨盒或生物医学注射器内。
在一些实施方案中，所公开的同源细胞群体和粘性溶液包含用于生物打印的生物墨。本文所用的“生物墨”是指包含多个细胞的液体、半固体或固体组合物。在一些实施方案中，生物墨包含细胞悬液、细胞聚集体、含细胞的凝胶、多细胞体或组织。在一些实施方案中，所述生物墨还包含载体材料。在一些实施方案中，所述生物墨还包含提供允许进行生物打印的特定生物力学性质的非细胞材料。
本文所用“生物打印”是指通过与自动化、计算机辅助的、三维原型装置(例如，生物打印机)相容的方法利用细胞(例如，细胞溶液、含细胞的凝胶、细胞悬液、细胞浓度、多细胞聚集体、多细胞体等)的三维、精确沉积。
本文所用“盒”是指能够接收(和容纳)生物墨或支撑材料的任何物体。
在一些实施方案中，容器或盒具有无菌端口或管道，其允许细胞和生物材料从容器或盒中排出，同时在必要时保持无菌条件。
在一些实施方案中，生物打印机以特定模式并在计算机辅助设计软件指导的特定位置从盒中分配生物墨，以形成特定的细胞构建体、组织或器官。为了制造复杂的组织构建体，生物打印机以精确的速度和均匀的量沉积生物墨。在一些实施方案中，盒包含一个分配孔口。在多种其它实施方案中，盒包含2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个或更多个分配孔口。在另一实施方案中，分配孔口的边缘是平滑的或基本上平滑的。
许多类型的盒适用于生物打印机。在一些实施方案中，盒与涉及通过一个或多个分配孔口挤出半固体或固体生物墨或支撑材料的生物打印相容。在一些实施方案中，盒与涉及通过一个或多个分配孔口分配液体或半固体细胞溶液、细胞悬液或细胞浓度的生物打印相容。在一些实施方案中，盒与非连续生物打印相容。在一些实施方案中，盒与连续和/或基本上连续的生物打印相容。
在一些实施方案中，盒是毛细管或微量移液管。在一些实施方案中，盒是注射器或针。许多内径适合于基本上圆形或圆柱形的盒。在多种实施方案中，作为非限制性实例，合适的内径包括1、10、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更多μm，包括其中的增量。在另一些多种实施方案中，作为非限制性实例，合适的内径包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多mm，包括其中的增量。在一些实施方案中，盒具有约1μm至约1000μm的内径。在一个特定实施方案中，盒具有约500μm的内径。在另一个特定实施方案中，盒具有约250μm的内径。许多内部体积适于本文公开的盒。在多种实施方案中，作为非限制性实例，合适的内部体积包括0.1、1、10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更多ml，包括其中的增量。在另一些多种实施方案中，作为非限制性实例，合适的内部体积包括1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、199、300、400、500或更多ml，包括其中的增量。
在一些实施方案中，盒与生物墨水和/或支撑材料到2D或3D接收表面上的喷墨打印相容，例如美国专利No.7,051,654中所述。在另一些实施例中，盒包括在本文所述的计算机代码的控制下电压选通喷嘴或针的形式的分配孔口。
在一些实施方案中，盒被标记以指示其内容物的组成。在另一些实施例中，盒被标记以指示包含在其中的生物墨的组成。在一些实施方案中，盒的表面是有色的。在一些实施方案中，盒的外表面被染色、涂漆、用笔标记、由贴纸标记或其组合。
在一些情况下，盒是单次使用歧管系统，例如美国专利No.6,712,963中所述，其在本文中公开用于教导单次使用歧管单元。简而言之，一次性管和柔性壁容器可以通过无菌连接器组装。这些歧管可与至少一个远程控制的夹紧阀相互作用，该夹紧阀仅接合歧管管道的外表面。这样的歧管和夹管阀系统可以与蠕动型泵一起使用，其与远程操作的夹管阀一起可以由控制器操作，该控制器在无菌环境中提供生物技术流体的自动化和精确输送，同时避免或减少清洁和质量保证程序。
所公开的盒优选地配置成无菌地填充生物墨，然后保护生物墨免于暴露于环境以防止污染。因此，盒优选地具有在填充之后保持封闭系统的密封件。盒还应优选能够将生物墨中的细胞保持在特定温度。例如，盒可以是绝缘的。
所公开的盒还优选地配置成喷射其中的生物墨。例如，可以通过空气压力、液压、螺杆驱动的活塞等喷射生物墨。由于喷射可产生显著的压力，因此盒优选地由刚性材料形成。
盒具有至少一个用于喷射/分散生物墨的孔口。然而，多个孔口可以加速打印。在一些情况下，3D打印机配置有两个或更多个盒以分配两种或更多种类型的细胞。然而，在一些情况下，单个盒包含两个或更多个隔室和两个或更多个孔口，以便同时分配两种类型的细胞。或者，可以将2种或更多种细胞类型组合在悬浮在生物聚合物中的细胞聚集体中，或者2种细胞类型可以在相同水凝胶基质内以优化的比例混合在一起并同时挤出。
在一些实施方案中，盒含有本文所公开的含有悬浮在粘性基质中的细胞的组合物，使得细胞一旦从储存(例如冷冻或非冷冻)取出即可存活并准备打印。在一些情况下，这意味着粘性基质足够粘稠以保持细胞均匀地分散在组合物中，即不沉降到盒的底部。
还公开了用于产生生物墨组合物的试剂盒。在一些情况下，试剂盒包含含有细胞聚集体的组合物，所述细胞聚集体包含平均至少100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300多至200,000个细胞/聚集体。试剂盒还可包含非交联的生物相容性聚合物，例如藻酸盐。生物相容性聚合物可以与细胞聚集体在相同或不同的容器中。试剂盒还可以包含交联剂，例如硫酸钙。该试剂也可以与细胞聚集体在相同或不同的容器中，只要生物相容性聚合物和交联剂在不同的容器中即可。试剂盒可以进一步包含用于混合试剂盒的成分的器件，例如注射器。
已经描述了本发明的多个实施方案。然而，应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以进行多种修改。因此，其他实施方案在所附权利要求的范围内。
实施例
实施例1：MSC表征
可以培养、扩增和冷冻保存hMSC。当细胞解冻时，它们可以粘附到塑料上、分裂和增加数量，并且具有与包括分泌血管生成细胞因子在内的治疗相关的生物学功能，并且当用炎症分子(例如干扰素γ)和多能三线分化刺激时上调免疫调节酶。
hBM-MSC可以从几个来源以冷冻保存的形式购得。在该实验中，将一个1千万个hBM-MSC(供应商，RoosterBio，Frederick，MD，部分#MSC001)的小瓶解冻并铺板到T225培养瓶(Corning)中扩增培养基(RoosterBio，部分#KT-001)中。将hMSC以3,000个细胞/cm2接种并在37℃加湿的CO2培养箱中孵育。在2小时内，许多细胞粘附于培养皿(图1)，这是培养期间细胞扩增的先决条件。将MSC培养扩增4至5天，然后收获。一旦细胞达到80％至90％的视觉细胞汇合，用TrypLE收获试剂(Thermo Fisher)收获细胞，并用称为NucleocounterNC100(Chemometec)的自动化系统定量细胞计数和活力。还测定细胞的功能。hMSC可以连续传代多次，每次传代产生2至5次群体倍增，这取决于所使用的培养基。最终目标是获得足够高的群体倍增水平的细胞，使得可以由单个供体产生数千或数万个产物，并且保持细胞的生物学功能。
MSC的特征是标准流式细胞术标志物(图2)。将MSC在DMEM+10％血清中培养7至10天，并通过流式细胞术分析。该细胞对CD73、CD90、CD105和CD166呈阳性，对CD14、CD34和CD45呈阴性。
生物学功能：为了测定hMSC分泌到培养基中的一组生物因子，从培养物中收获hMSC，并以40,000个细胞/cm2在基础培养基(RoosterBio)+2％牛血清(Atlas Biologics)中铺板到24孔板中。将细胞在37℃下孵育24小时，+/-1小时，此时在-20℃冷冻下收集细胞培养基。然后使用Q-PlexTM人血管生成(9-plex，Quansys Biosystmes)基于完全定量ELISA的化学发光测定法测定收集的培养基，从而允许同时测量9种血管生成生物标志物ANG-2、碱性FGF、HGF、IL-8、TIMP-1、TIMP-2、TNFα、VEGF。多重ELISA提供培养上清液中以pg/mL计的分析物，然后将其归一化为接种到孔中的细胞数和培养时间，以获得以pg/细胞/天计的特异性细胞因子分泌度量(图3)。
扩增的hMSC在大量培养中向成脂(脂肪)和成骨(骨)分化(图4)。使用提供的方案将市售的试剂盒用于将MSC分化成脂肪细胞和成骨细胞(StemPro成脂和成骨分化试剂盒，Life Technologies)。通过用于成脂的脂质囊泡的油红O染色(图4A)和用于成骨的钙的茜素红染色(图4B)来检测分化。
通过将MSC暴露于IFN-γ诱导吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)表达和活性是人类MSC的免疫抑制功能(T细胞抑制)的关键(图5)。简言之，将MSC以40,000个细胞/cm2铺板到具有或不具有IFN-γ的培养基中。孵育24小时后，收集培养基上清液并冷冻。通过使用标准比色测定法定量犬尿氨酸(IDO酶活性的产物)来测量IDO活性。
MSC可从多个供应商购得，并且可以以生物保存形式(通常为冷冻保存)分布。可以将生物保存后的细胞铺板到培养物中，这些细胞在培养物中首先粘附然后生长。这些细胞能够表达多种治疗相关功能，例如多谱系分化、生物功能性细胞因子和因子的分泌，并且可以被诱导调节免疫系统。
实施例2：MSC聚集体形成和表征
解冻hBM-MSC(RoosterBio，Frederick，MD，部分#MSC001)，并铺板到T225烧瓶中RoosterBio生长培养基中，培养4至5天直到80％至90％汇合，或在解冻后直接接种到Aggrewell 400Ex板(Stem Cell Technologies)中生长培养基(RoosterBio)中。对于在聚集体形成之前的细胞扩增，将细胞以3000个细胞/cm2接种，并在37℃培养箱中孵育直到准备好收获。用TrypLE(Thermo Fisher)收获细胞，并以1000个细胞/聚集体的密度铺板到Aggrewell 400Ex中RoosterBio生长培养基中。在使用前根据制造商的说明用冲洗溶液冲洗Aggrewell一次。吸出冲洗溶液，并将单个细胞逐滴接种到每个微孔中以确保均匀的细胞分布。过夜，hMSC在37℃孵育的每个微孔中融合并形成多细胞聚集体(aggs)(图6A)。通过用生长培养基冲洗从孔中收集的聚集体并转移到50ml锥形管中。在通过重力使聚集体沉积在管的底部之后，通过在管中吸出生长培养基来获得浓缩的聚集体(图6B)。通常需要100,000至1,000,000个聚集体，每个聚集体1000至100,000个细胞以运行实验或创建临床尺寸的组织片。
将新鲜收集的hMSC聚集体铺板到非粘附有盖培养皿或平板中以培养多细胞聚集体。如果接种在非粘附培养板中，则聚集体将快速融合在一起(图7A)，而如果接种到组织培养(TC)塑料中，则聚集体将附着到板上，并且单个细胞将生长到培养皿上(图7B)。将培养物在37℃培养箱中孵育过夜，然后拍摄图像。
将MSC聚集体接种到平板中用于细胞因子分析，并在37℃下孵育24小时，+/-1小时，此时在-20℃冷冻下收集细胞培养基。然后使用Q-PlexTM人血管生成(9-plex，QuansysBiosystmes)基于完全定量ELISA的化学发光测定法测定收集的培养基，从而允许同时测量9种血管生成生物标志物ANG-2、碱性FGF、HGF、IL-8、TIMP-1、TIMP-2、TNFα、VEGF。多重ELISA提供培养上清液中以pg/mL计的分析物，然后将其归一化为接种到孔中的细胞数和培养时间，以获得以pg/细胞/天计的特异性细胞因子分泌量度(图8)。MSC聚集体还能够在干扰素γ存在下维持上调IDO活性的能力。
本实施例证明hMSC可以在细胞扩增后或解冻后直接形成聚集体。细胞维持其粘附培养塑料和融合的能力，这是MSC聚集体的关键属性。聚集体内的细胞还保持诸如多谱系分化、细胞因子分泌和免疫调节的功能。
实施例3：在水凝胶中的聚集体包封和定制构建体的挤出
对于细胞包封，将单个hMSC细胞或新鲜收集的hMSC聚集体悬浮于溶解于不具有Ca2+或Mg2+的DPBS中的2％藻酸盐(FMC BioPolymer)中。用针将细胞逐滴挤出至6.6mg/ml的CalCl2溶液中以形成球形珠或挤出成有盖培养皿中的定制形状，然后浸入CaCl2溶液以允许构建体交联。吸出CaCl2溶液并用生长培养基更换，然后在37℃培养箱中孵育构建体以使细胞成熟。用2μM钙荧光素-AM/DPBS对包封的MSC进行染色并用荧光显微镜成像，其在藻酸盐凝胶中显示出具有高活力的聚集体(图10B)。这些聚集体在培养5天后也保持其在凝胶中融合的能力(图10C)。
结果与讨论：
MSC聚集体对于生物打印是有吸引力的构型，这是因为容易打印以及聚集时细胞存活的机会更高。具有高活力的hMSC聚集体显示它们可以使用AggrewellTM板一致地产生。这些聚集体具有融合在一起并附着在表面上以增殖的能力，两者都是代谢活性细胞的关键功能参数。在37℃下于培养基中孵育新鲜收集的聚集体后早至几小时观察到了聚集体融合。
由于生物打印应用需要将细胞嵌入细胞相容性生物材料中，我们证明了封装在2％藻酸盐中并挤压成定制形状的单个细胞和聚集MSC具有高活力(图10B)，并且它们维持其在培养物中融合的能力(图10C)，因此确认聚集体细胞用于生物制造和生物打印应用的可行性。
虽然这种新产品形式已经在研究中使用，但是以聚集形式递送这些细胞的许多实际方面还没有得到解决。该领域中有许多假设收获细胞，制成聚集体，然后立即使用。然而，为了广泛采用，必须开发该技术以使MSC聚合体能够立即使用。基本上，必须使生物保存技术适应于MSC聚集体，并且必须维持其关键功能。
本文公开了hMSC聚集体的生物保存的最佳方法，具有“即用”制剂的经济和实际益处的概述及其有用性的证明。由于以聚集形式使用的MSC及其它细胞需要数亿至数十亿个细胞，标准技术将需要几个星期才能利用不广泛的细胞扩增技术产生细胞。公开了作为聚集体递送的高细胞数量的制剂作为缩短直至即用的显著时间段(数周至数月)的方式。这些“即用”制剂可以对进行该工作的实验室有重大的经济影响，并且可以引起更快速的发现和产品开发工作。
实施例4：生物保存的MSC聚集体
本实施例的目的是证明聚集体可以生物保存并且仍然保留关键功能。这里，将聚集体以非冷冻形式储存在细胞培养基(RoosterBio部分#KT-001)(用于细胞治疗的临床金标准储液，常规盐水+4％HSA(BioMed Supply)和Hypothermosol(Biolife Solutions))中后进行测试。在非冷冻储存中保存MSC聚集体功能数天或在冷冻保存形式中数周至数年能力将是该技术在未来商业化和易于使用的核心，并且如果MSC聚集体可以以即用形式购买的话则将节省研究人员和产品开发人员数周时间。
材料与方法
解冻hBM-MSC(RoosterBio，Frederick，MD，部分#MSC001)，并铺板到T225烧瓶中RoosterBioTM生长培养基(RoosterBio Inc.)中，培养4至5天直至80％至90％汇合，或在解冻后直接接种到AggrewellTM 400Ex板(Stem Cell Technologies)中RoosterBioTM生长培养基(RoosterBio Inc.)中。对于在聚集体形成之前的细胞扩增，将细胞以3,000个细胞/cm2接种，并在37℃培养箱中孵育直到准备好收获。用TrypLE收获细胞，并以1,000个细胞/聚集体的密度接种到AggrewellTM 400Ex中RoosterBioTM生长培养基中。在使用前根据制造商的说明用冲洗溶液冲洗AggrewellTM一次。吸出冲洗溶液，并将单个细胞逐滴接种到每个微孔中以确保均匀的细胞分布。过夜，hMSC在37℃孵育的每个微孔中融合并形成多细胞聚集体(图6A)。通过用生长培养基冲洗从孔中收集的聚集体并转移到50ml锥形管中。在通过重力使聚集体沉积在管的底部之后，通过在管中吸出生长培养基来获得浓缩的聚集体(图6B)。
将新鲜收集的聚集体以1500个聚集体/ml储液(即hypothermosol，10％FBS/DMEM或4％HSA/盐水)重悬浮。将各溶液中的聚集体等分到2ml冷冻管中，并在4℃冰箱中避光保存。
聚集体功能性(融合、细胞粘附于皿、IDO及细胞因子分泌)
在研究的第3或7天，收集来自不同条件的聚集体并用PBS冲洗一次，将250个聚集体(或250,000个细胞)重悬并接种在12孔板的每个孔中2％FBS/基础培养基中，所述基础培养基具有或不具有10ng/ml IFN-γ。收集另外的聚集体并铺板到非粘附的48孔板上以允许自发融合。在孵育24小时(图11)和6天(图12)后，对组织培养板上粘附的或在浮在非粘附表面上融合的细胞拍摄图像。将粘附培养物上的培养基收集到15ml离心管中用于IDO和细胞因子分泌测定。用250μl胰蛋白酶/EDTA处理铺板到组织培养板上的聚集体，并通过每10至15分钟吸移混合45分钟以从聚集体释放细胞。用Nucleo对脱落的细胞计数以进行总活细胞计数。
为了测量细胞因子分泌，使用Q-PlexTM人血管生成(9-plex，Quansys Biosystems)基于完全定量ELISA的化学发光测定法测定收集的上清液，从而允许同时测量九种血管生成生物标志物ANG-2、碱性FGF、HGF、IL-8、TIMP-1、TIMP-2、TNFc、VEGF。多重ELISA提供了培养上清液中以pg/mL计的分析物，然后将其归一化为接种到孔中的细胞数和培养时间，以获得以pg/细胞/天计的特异性细胞因子分泌度量。
为了测量IDO活性，使用如上文实施例1中所述的标准比色测定法测量犬尿氨酸的量。
结果与讨论：
由于生物打印应用需要细胞在打印之前保持高活力，因此优选聚集体可以在低温条件下储存一段时间(1至7天)，而不影响细胞的活力和功能。图11至13显示在具有4％HSA的hypothermosol溶液、生长培养基或盐水中储存3或7天后，聚集体(A)融合或(B)附着的能力。在储存在hypothermosol和生长培养基中的聚集体中观察到了相似的融合和粘附程度，然而，配制在4％HSA/盐水中的聚集体不能存活，如通过漂浮和松散聚集体结构所示的。在培养6天后(图12)，粘附在TC板上的聚集体在板中继续增殖以汇合，证明细胞保持代谢活性。
在各种制剂和储存持续期间，生物保存的聚集体的IDO活性(图14)和细胞因子分泌(图15)显示它们保持其功能性，尽管该研究表明hypothermosol中生物保存的聚集体胜过生长培养基和4％HSA/盐水储液。
实施例5：MSC聚集物冷冻保存和解冻后功能
如上所述用AggrewellTM 400EX制备hMSC聚集体(1000个细胞/聚集体)。以1至5M细胞/ml在5(Biolife Solutions)中重构新鲜收集的聚集体。将聚集体在控制速率冷冻装置(Biocision)中冷冻过夜，并转移到气相液氮中储存。在冷冻保存至少7天后，将2小瓶MSC聚集体解冻到2％FBS/基础培养基中并接种到组织培养板或非粘附板上以测试聚集体融合、细胞粘附和IDO及细胞因子功能测定(如上所述)。
为了证明聚集体的活力，使用约250,000个聚集体在15ml管中制造“环”形状，通过将聚集体接种在20μl移液管尖端周围。在1至4天后收集融合的MSC聚集体，用4％多聚甲醛固定，然后将样品脱水并用苏木精和伊红(H&E)(Alizee Pathology)染色以观察聚集体融合的紧密度。
结果
解冻后，hMSC聚集体能够保持融合在一起的能力(图16A)，并且单个细胞能够附着于组织培养塑料并从聚集体生长(图16B和16C)。此外，hMSC聚集体维持具有诱导型IDO表达(图17)以及分泌血管生成细胞因子的能力(图18)。可以制造冷冻聚集体以形成宏观形状例如环(图19A和19B)，H&E染色(图19C)证明由已经冷冻保存的融合聚集体形成的健康宏观组织。
讨论：
这是第一个证明hMSC聚集体可以冷冻保存的实施例。此外，hMSC聚集体的关键功能是在冷冻保存后维持，包括单个细胞从聚集体生长到TC塑料上的能力，聚集体融合到更大的宏观组织中的能力，以及细胞分泌细胞因子和维持其诱导型IDO活性的能力。该新的冷冻保存组合物的益处是其实用性，其中冷冻保存的产品形式使得聚集体细胞的留存、按需供应相比于制备新鲜聚集体所需的复杂和冗长的制备步骤。根据需要解冻和使用聚集体的灵活性节省了研究者或临床医生数周至数月的细胞培养时间，如图20A中的工艺流程图所示。当转移到cGMP制造设施时，节省的时间量转换成成千上万美元(图20B)。
实施例6：藻酸盐生物墨开发
生物墨需要包含细胞和生物相容性水凝胶基质以在储存期间将单个细胞或聚集体悬浮在均匀的悬液中，以防止细胞凝集并维持细胞浓度均匀性。针对2种不同的钙源(CaCl2和CaSO4)测试了高粘度高M和高G藻酸盐，包括低粘度藻酸盐。水凝胶基质中的钙的量可以决定水凝胶的交联程度，因此决定打印构建体的结构和完整性。在该研究中，对由于其缓释作用而允许充分胶凝化以配制细胞的CaSO4的量进行滴定以获得最佳的可打印性，从而允许使用者在胶凝化之前操作和混合溶液的合理的“时间窗口”。在这里，我们显示中至高粘度的高G藻酸盐可用于制备具有良好的“可打印性”的生物墨，即保持“半固体”结构的能力(其特征在于易于从喷嘴挤出，凝胶厚度足以保持在适当位置的形状，但是不会太坚固以至于其碎裂)和粘性，这是凝胶粘附并整合到其自身上用于构建多层形状的能力。合适的制剂还将允许聚集体在储存期间保持在均匀溶液中，以避免沉降和凝集(图22)，这可能阻塞打印头。最后，打印后CaCl2洗涤处理增强形状，并使细胞成熟时保持结构。
方法：
在不具有Ca2+或Mg2+的DPBS中制备2％至8％中等粘度(Sigma Aldrich)或高粘度(FMC Biopolymer)藻酸盐，其具有高G(protanal)或高M(来自Sigma的manugel&藻酸钠)。在DPBS中制备25mg/ml CaSO4，并用于将藻酸盐胶凝化至适当的稠度。使用不同体积的藻酸盐，即10％v/v/、5％v/v或2.5％v/v，用不同的藻酸盐类型测试，并将凝胶孵育过夜以确定“凝胶化”和“可打印性”的程度。
结果：
低粘度藻酸盐没有交联得足够好以即使在藻酸盐浓度高达8％时也部分凝胶化结构。中/高粘度藻酸盐(这里使用Manugel(一种高M藻酸盐)和Protanal(一种高G藻酸盐))更合适并且显示出制备良好的可打印制剂。氯化钙作为二价阳离子源不是最佳的，因此使用硫酸钙更缓慢地将钙释放到混合物中，产生更均匀的水凝胶。在高G藻酸盐中较高水平的硫酸钙导致过于刚性的凝胶，当挤出注射器针头组件时其碎裂。硫酸钙的中间水平(1.25mg/mL，在2％protanal中混合)是理想的，使得藻酸盐具有平滑的喷射稠度、形成多层的能力，其中新喷出的藻酸盐粘附到先前挤出的材料(粘性)从而形成3D结构。低水平的硫酸钙不足以凝胶化藻酸盐，并且其仍然是流体-对于打印是不理想的(图21)。
在打印3D结构之后，打印结构不是立即机械稳定的。用小体积的溶解的氯化钙“固化”打印结构，产生机械稳定的结构。鉴定用于生物墨的如下过程和制剂：通过注射器混合(将2个注射器与连接器连接在一起并混合2至10次)将细胞或细胞聚集体混合到2％高G、中至高粘度藻酸盐中；将所有溶液转移至一个注射器中，加入硫酸钙至终浓度为1.25mg/mL，并通过注射器混合进行混合；使藻酸盐凝胶静置5分钟，或长达数周；将注射器或其他盒系统放置在3D打印机上并打印3D组织；并且根据应用将打印的组织置于培养物或生物反应器中。
因此，考虑了这样的生物墨试剂盒，其包括：非胶凝化的水凝胶聚合物(例如藻酸盐)的注射器或其他容器；允许2个注射器无菌连接的无菌连接装置；包含交联剂(例如，硫酸钙)的另一注射器，以及包含含有细胞或细胞聚集体的第三注射器(图24A和24B)。
使用该试剂盒，最终用户可以快速、容易地和可重复地产生用于各种应用的含细胞的生物墨。
在一些情况下，所述生物墨在运输之前与细胞凝胶化(图25)，使得客户可以完全跳过上述过程并将包含生物墨的盒插入3D打印机中并直接打印(即用)，从而节省相当多的时间。
实施例7：藻酸盐生物墨的生物保存
材料与方法
生物墨A制备
通过在不断搅拌下，在20ml hypothermosol中稀释0.4g protanal(高G藻酸盐)制备hypothermosol(BioLife Solutions)中的2％藻酸盐。将MSC聚集体混合到2ml藻酸盐溶液中，并加入10％的25mg/ml CaSO4并使用注射器混合，以允许部分胶凝化。用石蜡膜密封注射器并在4℃下于黑暗中储存，直到准备用于测试。
生物墨B制备
对于具有hypothermosol和胶原的藻酸盐生物墨，根据制造商的说明制备3mg/ml胶原(Collagen Solutions Inc.)，其中将1份缓冲溶液加入到9份冰上的胶原溶液中并充分混合。为了使聚集体与胶原和藻酸盐合并，将MSC聚集体加入1ml的3mg/ml胶原溶液中，然后与等体积的2％藻酸盐混合。一旦溶液充分混合，则用注射器加入10％v/v的25mg/mlCaSO4，并充分混合以部分凝胶化生物墨溶液。类似地，用石蜡膜密封注射器并在4℃下于暗处储存直到准备用于测试。
在储存2周后，将50至100μl的生物墨A和B挤出到15ml离心管中。将4ml的50mM柠檬酸钠加入到凝胶中并在37℃下孵育以溶解凝胶。将管每10分钟反转保持30分钟，直到凝胶溶解。通过以200×g离心5分钟收集细胞。吸出上清液，将细胞重悬于2％FBS/基础培养基中并铺板到TC板中以允许附着。
为了制备对照细胞，将新鲜解冻的MSC用50mM柠檬酸钠孵育30分钟，类似于从藻酸盐释放MSC的过程，然后将其离心并铺板到TC板上。
监测MSC在TC培养板上的附着，并在接种后第1天和第6天拍摄图像(图23)，其中观察到生物墨B中的MSC聚集体附着在TC板上以增殖，证明用于保存MSC聚集体的高度可行的生物墨制剂。生物墨A和B的可打印性都是粘性和强的，并且3D结构可以用部分固体凝胶成形。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义与所公开的发明所属领域的技术人员通常理解的相同。本文引用的出版物和其引用的材料通过引用特别地并入。
本领域技术人员将认识到或者能够仅使用常规实验来确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等同变化形式。这些等同变化形式旨在被所附权利要求所涵盖。

Claims (31)

1.一种在冷冻保存剂中包含冷冻细胞的组合物，其中所述细胞形成为聚集体，所述聚集体含有每个聚集体平均至少1,000个细胞，并且其中所述细胞聚集体在-60℃下储存至少6个月后具有至少70％的细胞活力。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中至少70％的所述聚集体在-60℃下储存至少6个月后保留融合的能力。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述聚集体在所述组合物中具有小于20％的平均直径方差。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述冷冻保存剂包括二甲亚砜(DMSO)。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述细胞包括间充质干细胞。
6.一种在生物保存剂中包含细胞的组合物，其中所述细胞形成为聚集体，所述聚集体含有每个聚集体平均至少1,000个细胞，并且其中所述细胞聚集体具有至少70％的细胞活力，并且在4℃下储存至少7天后保留融合的能力。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中至少70％的所述聚集体在4℃下储存至少7天后保留融合的能力。
8.根据权利要求6或7所述的组合物，其中所述聚集体在所述组合物中具有小于20％的平均直径方差。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的组合物，其中所述生物保存剂包括Hypo
10.根据权利要求6至9中任一项所述的组合物，其中所述细胞包括间充质干细胞。
11.一种包含悬浮在粘性基质中的细胞的组合物，其中所述细胞的平均细胞密度为至少一百万个细胞/毫升，其中所述粘性基质具有有效维持细胞密度方差小于10％至少48小时的粘度，其中所述细胞在4℃下储存至少7天后具有至少70％的细胞活力。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述细胞形成为聚集体，所述聚集体含有每个聚集体平均至少1,000个细胞，其中所述聚集体在4℃下储存至少7天后保留融合的能力。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述聚集体在所述组合物中具有小于10％的平均直径方差。
14.根据权利要求11至13中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含生物保存剂、冷冻保存剂或其组合。
15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述生物保存剂包括Hypo
16.根据权利要求14或15所述的组合物，其中所述冷冻保存剂包括二甲亚砜(DMSO)。
17.根据权利要求11至16中任一项所述的组合物，其中所述粘性基质包含生物相容性聚合物。
18.根据权利要求17所述的组合物，其中所述生物相容性聚合物包括生物聚合物。
19.根据权利要求18所述的组合物，其中所述生物相容性聚合物包括多糖。
20.根据权利要求19所述的组合物，其中所述生物相容性聚合物包括藻酸盐。
21.根据权利要求11至20中任一项所述的组合物，其中所述细胞在所述组合物中具有小于10％的密度方差。
22.根据权利要求11至21中任一项所述的组合物，其中所述细胞包括间充质干细胞。
23.根据权利要求11至22中任一项所述的组合物，其中所述细胞还包括内皮细胞。
24.一种试剂盒，其包括：
a)包含含有每个聚集体平均至少300个细胞的细胞聚集体的组合物；
b)生物相容性聚合物；和
c)交联剂。
25.根据权利要求24所述的试剂盒，其中所述组合物是权利要求1至15中任一项所述的组合物。
26.根据权利要求24或25所述的试剂盒，其中所述生物相容性聚合物包括生物聚合物。
27.根据权利要求26所述的试剂盒，其中所述生物相容性聚合物包括多糖。
28.根据权利要求27所述的试剂盒，其中所述生物相容性聚合物包括藻酸盐。
29.一种包含权利要求1至21中任一项所述的组合物的封闭系统装置，其中所述封闭系统装置被配置为将所述组合物作为离散单元分配，其中每个离散单元包含受控量的所述细胞。
30.根据权利要求29所述的封闭系统装置，其中所述封闭系统装置是盒。
31.根据权利要求29或30所述的封闭系统装置，其中所述封闭系统装置被配置成用于三维(3D)打印机装置。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108379659A (zh) * 2018-05-06 2018-08-10 西北工业大学 一种细胞密度多梯度人工软骨制备方法
CN108795687A (zh) * 2018-05-10 2018-11-13 太原理工大学 一种可检测细胞活性的3d生物打印机
CN109758613A (zh) * 2019-01-25 2019-05-17 上海交通大学医学院附属第九人民医院 一种三维打印结合生物三维打印技术制备肌腱方法
CN112243384A (zh) * 2018-05-14 2021-01-19 鲁斯特生物股份有限公司 与源自高渗细胞溶液的细胞外物质有关的方法和组合物
CN114854666A (zh) * 2022-06-02 2022-08-05 深圳大学 无支架组织结构的制作方法
CN115003156A (zh) * 2019-11-20 2022-09-02 住友制药株式会社 冷冻细胞聚集体的方法
EP4192939A4 (en) * 2020-08-10 2024-10-30 Angiocrine Bioscience, Inc. COMPOSITIONS OF CRYOPRESERVED ENDOTHELIAL CELLS

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL3233493T3 (pl) 2014-12-18 2021-12-13 Cellink Ab Celulozowy biotusz nanowłóknisty do biodrukowania 3d do zastosowań w hodowaniu komórek, inżynierii tkankowej i medycynie regeneracyjnej
CN107406830A (zh) 2014-12-30 2017-11-28 细胞治疗神经科学有限公司 Rpe细胞群和制备它们的方法
US20180117219A1 (en) 2015-04-29 2018-05-03 Northwestern University 3d printing of biomedical implants
SG11201805533QA (en) * 2016-01-14 2018-07-30 Depuy Synthes Products Inc Composition and methods for cryopreservation of hutc
JP7177045B2 (ja) * 2016-06-03 2022-11-22 ビコ グループ アー・ベー 化粧品の試験及び移植のためのモデルとして使用するための、新規のプリンティングヘッドを用いたヒト皮膚の３ｄバイオプリンティングのための、フィブリン含有又は非含有のｒｇｄ接合多糖類バイオインクの調製及び適用
WO2017214592A1 (en) * 2016-06-09 2017-12-14 Paul Gatenholm Preparation of modified cellulose nanofibrils with extracellular matrix components as 3d bioprinting bioinks
DE102016217174A1 (de) * 2016-09-09 2018-03-15 Henkel Ag & Co. Kgaa In-vitro Verfahren zur Identifizierung und Analyse von Sekretionsproteinen unter Verwendung eines dreidimensionalen Zellkulturmodells der Schweißdrüse
EP3635045A1 (en) 2017-05-26 2020-04-15 Infinite Material Solutions, LLC Water soluble polymer compositions
DE102017120470A1 (de) * 2017-09-06 2019-03-07 Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule (Rwth) Aachen Verfahren zum Herstellen einer dreidimensionalen biologischen Struktur und diese Struktur so erhaltend
AU2018393494A1 (en) * 2017-12-29 2020-07-09 Cell Cure Neurosciences Ltd. Retinal pigment epithelium cell compositions
WO2019145795A2 (en) 2018-01-26 2019-08-01 Cellink Ab Systems and methods for optical assessments of bioink printability
WO2019199229A1 (en) * 2018-04-09 2019-10-17 Cellresearch Corporation Pte. Ltd. A method of transporting mesenchymal stem cells by means of a transporting solution and a method of administering stem cells to wounds
US20220113232A1 (en) * 2018-08-17 2022-04-14 Osaka University Particle Distribution Method
WO2020077118A1 (en) 2018-10-10 2020-04-16 Cellink Ab Double network bioinks
KR102200859B1 (ko) * 2018-12-20 2021-01-12 성균관대학교산학협력단 세포 전기방사를 이용한 조직재생용 세포지지체의 제조방법
KR102143591B1 (ko) 2019-03-14 2020-08-11 주식회사 클리셀 바이오 3d 프린터용 생체 물질의 셀 서스펜션 유지 장치 및 방법
US11826951B2 (en) 2019-09-06 2023-11-28 Cellink Ab Temperature-controlled multi-material overprinting
KR20220108763A (ko) * 2019-10-08 2022-08-03 셀리서치 코포레이션 피티이 리미티드 중간엽 줄기 세포 저장 또는 수송 제형 및 이의 제조 방법 및 사용 방법
US12371581B2 (en) 2020-03-25 2025-07-29 Infinite Material Solutions, Llc High performance water soluble polymer compositions
US11559389B2 (en) 2020-05-05 2023-01-24 International Business Machines Corporation Bioprinted living tissue with therapy capability
DE102020127787B4 (de) * 2020-10-22 2025-08-14 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung eingetragener Verein Verfahren und Kryokonservierungsvorrichtung zur Kryokonservierung einer Vielzahl von Zellverbänden aus biologischen Zellen
JP7018527B1 (ja) 2020-12-16 2022-02-10 アニコム先進医療研究所株式会社 細胞の保存方法および細胞懸濁液
PT118103A (pt) * 2022-07-13 2024-01-15 Univ Aveiro Biomaterial para imunomodulação, processo de produção e suas aplicações

Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5798113A (en) * 1991-04-25 1998-08-25 Brown University Research Foundation Implantable biocompatible immunoisolatory vehicle for delivery of selected therapeutic products
US20050129730A1 (en) * 2002-04-04 2005-06-16 W.R. Grace & Company Tissue composites and uses thereof
WO2005117962A1 (en) * 2004-06-02 2005-12-15 Victor Bronshtein Preservation by vaporization
CN101227913A (zh) * 2004-10-12 2008-07-23 Fmc生物聚合物联合股份有限公司 自胶凝的藻酸盐体系及其用途
US20090130756A1 (en) * 2007-11-20 2009-05-21 Pioneer Surgical Orthobiologics,Inc. Cryopreservation of cells using cross-linked bioactive hydrogel matrix particles
CN100497580C (zh) * 2003-10-20 2009-06-10 株式会社Jms 细胞处理装置、组织再生用组合物及组织再生方法
US20110250688A1 (en) * 2008-11-24 2011-10-13 Immunotrex Corporation Three Dimensional Tissue Generation
US20120076854A1 (en) * 2008-12-05 2012-03-29 Reneuron Limited Cellular compositions for use in therapy
WO2013077424A1 (ja) * 2011-11-25 2013-05-30 住友化学株式会社 多能性幹細胞由来の組織の凍結保存方法
CN103146572A (zh) * 2011-12-07 2013-06-12 清华大学 一种实现细胞集落均质性生长的装置和方法
CN103275924A (zh) * 2005-04-21 2013-09-04 塞尔希斯体外生物公司 新的细胞组合物及其制备方法
CN103380113A (zh) * 2010-11-15 2013-10-30 生命科技公司 含胺的转染试剂及其制备和使用方法

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5496722A (en) * 1988-06-30 1996-03-05 The United States Of America As Represented By The Administrator Of The National Aeronautics And Space Administration Method for producing non-neoplastic, three dimensional, mammalian tissue and cell aggregates under microgravity culture conditions and the products produced therefrom
US5486359A (en) 1990-11-16 1996-01-23 Osiris Therapeutics, Inc. Human mesenchymal stem cells
CA2296704C (en) 1997-07-14 2010-10-19 Osiris Therapeutics, Inc. Cardiac muscle regeneration using mesenchymal stem cells
WO1999015199A1 (en) 1997-09-20 1999-04-01 Osiris Therapeutics, Inc. Antigen presenting mesenchymal stem cells
US6914136B2 (en) * 1998-01-16 2005-07-05 Setagon, Inc. Methods and compositions for expressing polynucleotides specifically in smooth muscle cells in vivo
CA2328425A1 (en) 1998-05-22 1999-12-02 Osiris Therapeutics, Inc. Production of megakaryocytes by co-culturing human mesenchymal stem cells with cd34+ cells
US6712963B2 (en) 2002-06-14 2004-03-30 Scilog, Llc Single-use manifold for automated, aseptic transfer of solutions in bioprocessing applications
US7051654B2 (en) * 2003-05-30 2006-05-30 Clemson University Ink-jet printing of viable cells
US20070020754A1 (en) 2003-10-20 2007-01-25 Rui Yuge Cell handling device, human tissue regeneration composition, and human tissue regeneration method
US8241905B2 (en) * 2004-02-24 2012-08-14 The Curators Of The University Of Missouri Self-assembling cell aggregates and methods of making engineered tissue using the same
US20060257378A1 (en) * 2005-03-21 2006-11-16 Florida International University Board Of Trustees Adaptive SOL-GEL immobilization agents for cell delivery
WO2010143747A1 (ja) 2009-06-10 2010-12-16 公立大学法人奈良県立医科大学 人工腸管の作製法
US20120219572A1 (en) * 2009-11-12 2012-08-30 Prockop Darwin J Spheroidal Aggregates of Mesenchymal Stem Cells
KR101970368B1 (ko) 2011-05-17 2019-04-18 론자 워커스빌 아이엔씨. 인간 다능성 줄기세포의 계대 및 수득을 위한 제제 및 방법
WO2015066705A1 (en) * 2013-11-04 2015-05-07 University Of Iowa Research Foundation Bioprinter and methods of using same

Patent Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5798113A (en) * 1991-04-25 1998-08-25 Brown University Research Foundation Implantable biocompatible immunoisolatory vehicle for delivery of selected therapeutic products
US20050129730A1 (en) * 2002-04-04 2005-06-16 W.R. Grace & Company Tissue composites and uses thereof
CN100497580C (zh) * 2003-10-20 2009-06-10 株式会社Jms 细胞处理装置、组织再生用组合物及组织再生方法
EP1750760A4 (en) * 2004-06-02 2012-08-29 Victor Bronshtein VAPORIZATION CONSERVATION
WO2005117962A1 (en) * 2004-06-02 2005-12-15 Victor Bronshtein Preservation by vaporization
EP2567708A2 (en) * 2004-06-02 2013-03-13 Victor Bronshtein Preservation by vaporization
CN101227913A (zh) * 2004-10-12 2008-07-23 Fmc生物聚合物联合股份有限公司 自胶凝的藻酸盐体系及其用途
CN103275924A (zh) * 2005-04-21 2013-09-04 塞尔希斯体外生物公司 新的细胞组合物及其制备方法
US20090130756A1 (en) * 2007-11-20 2009-05-21 Pioneer Surgical Orthobiologics,Inc. Cryopreservation of cells using cross-linked bioactive hydrogel matrix particles
US20110250688A1 (en) * 2008-11-24 2011-10-13 Immunotrex Corporation Three Dimensional Tissue Generation
US20120076854A1 (en) * 2008-12-05 2012-03-29 Reneuron Limited Cellular compositions for use in therapy
CN103380113A (zh) * 2010-11-15 2013-10-30 生命科技公司 含胺的转染试剂及其制备和使用方法
WO2013077424A1 (ja) * 2011-11-25 2013-05-30 住友化学株式会社 多能性幹細胞由来の組織の凍結保存方法
CN103146572A (zh) * 2011-12-07 2013-06-12 清华大学 一种实现细胞集落均质性生长的装置和方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
IRENE GINIS 等: "Evaluation of Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells After Cryopreservation and Hypothermic Storage in Clinically Safe Medium", 《TISSUE ENGINEERING》 *
ISOBEL RUTH MASSIE: "Development of an Optimised Cryopreservation Protocol for Encapsulated Liver Cell Spheroids，towards delivery of a Bioartificial Liver", 《伦敦大学博士论文》 *
JENNA L. WILSON 等: "Alginate Encapsulation Parameters Influence the Differentiation of Microencapsulated Embryonic Stem Cell Aggregates", 《BIOTECHNOL BIOENG.》 *
SART S. 等: "Cryopreservation of pluripotent stem cell aggregates in defined protein-free formulation", 《BIOTECHNOL PROG.》 *
ZHOU Q. 等: "Developmental Potential of Mouse Embryos Reconstructed from Metaphase Embryonic Stem Cell Nuclei", 《BIOLOGY OF REPRODUCTION》 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108379659A (zh) * 2018-05-06 2018-08-10 西北工业大学 一种细胞密度多梯度人工软骨制备方法
CN108795687A (zh) * 2018-05-10 2018-11-13 太原理工大学 一种可检测细胞活性的3d生物打印机
CN108795687B (zh) * 2018-05-10 2021-10-26 太原理工大学 一种可检测细胞活性的3d生物打印机
CN112243384A (zh) * 2018-05-14 2021-01-19 鲁斯特生物股份有限公司 与源自高渗细胞溶液的细胞外物质有关的方法和组合物
CN112243384B (zh) * 2018-05-14 2024-07-26 鲁斯特生物股份有限公司 与源自高渗细胞溶液的细胞外物质有关的方法和组合物
CN109758613A (zh) * 2019-01-25 2019-05-17 上海交通大学医学院附属第九人民医院 一种三维打印结合生物三维打印技术制备肌腱方法
CN115003156A (zh) * 2019-11-20 2022-09-02 住友制药株式会社 冷冻细胞聚集体的方法
EP4192939A4 (en) * 2020-08-10 2024-10-30 Angiocrine Bioscience, Inc. COMPOSITIONS OF CRYOPRESERVED ENDOTHELIAL CELLS
CN114854666A (zh) * 2022-06-02 2022-08-05 深圳大学 无支架组织结构的制作方法

Also Published As

Publication number Publication date
US11058106B2 (en) 2021-07-13
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AU2015259373B2 (en) 2019-05-02
ES2880948T3 (es) 2021-11-26
IL248911A0 (en) 2017-01-31
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EP3142485B1 (en) 2021-04-28
KR102311902B1 (ko) 2021-10-13
JP2017515510A (ja) 2017-06-15
KR20170005450A (ko) 2017-01-13
CA2948820A1 (en) 2015-11-19
EP3142485A1 (en) 2017-03-22
WO2015175457A1 (en) 2015-11-19
JP6817194B2 (ja) 2021-01-20
AU2015259373A1 (en) 2016-11-24
EP3142485A4 (en) 2017-12-13

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