CN107406830A - Rpe细胞群和制备它们的方法 - Google Patents

Abstract

公开了人多角形RPE细胞群。其中至少95％的细胞共表达前黑素小体蛋白(PMEL17)和细胞视黄醛结合蛋白(CRALBP)，其中细胞的跨上皮电阻大于100ohms。还公开了制备所述细胞的方法。

Description

RPE细胞群和制备它们的方法

技术领域

在一些实施方案中，本发明涉及视网膜色素上皮细胞，更具体但不排除性地，涉及对这种细胞作为治疗的评估。本发明还涉及从胚胎干细胞制备视网膜色素上皮细胞。

背景技术

视网膜色素上皮(RPE)是单层色素细胞，其位于神经视网膜和脉络膜毛细血管之间。RPE细胞在视网膜及其感光器的维持和功能中起关键作用。这些包括血-视网膜屏障的形成、杂散光的吸收、神经视网膜的营养物供应、视觉色素的再生，以及感光器的脱落外节段的摄取和再循环。

视网膜组织可能因为许多原因而变性。其中包括：动脉或静脉阻塞、糖尿病性视网膜病变和早产儿视网膜病变，其通常是遗传性的。疾病诸如视网膜色素变性、视网膜息肉、格子样变性、Best疾病和年龄相关性黄斑变性(AMD)的特征在于渐进型视网膜变性。

RPE细胞可能潜在地用于以上提及的视网膜疾病中的变性RPE的细胞替代疗法。它也可以用作载体以引入用于治疗视网膜变性疾病的基因。这些细胞还可以用作视网膜变性疾病的体外模型，作为治疗有效的小分子的高通量筛选工具，和用于发现和测试新的视网膜变性疾病的药物。RPE细胞也可用于RPE发育、成熟、特征、性质、代谢、免疫原性、功能和与其他细胞类型的相互作用的基础研究。

人胎儿和成年RPE已被用作同种异体移植的替代供体来源。然而，在获得足够组织供应中的实际问题以及关于使用来自流产胎儿的组织的伦理问题限制了这些供体来源的广泛使用。鉴于成人和胎儿RPE移植物供应的这些限制，已经研究了潜在的替代供体来源。人多能干细胞作为用于移植的RPE细胞的来源提供显著的优势。它们的多能发育潜力可能使其能够分化为真正的功能性RPE细胞，并且鉴于其具有无限自我更新的潜力，它们可以作为RPE细胞的无限供体来源。实际上，已经证明人胚胎干细胞(hESC)和人诱导多能干细胞(iPS)在体外分化成RPE细胞，并且在视网膜下移植至由RPE功能障碍引起的视网膜变性的皇家外科医学院(RCS)大鼠模型后，减弱视网膜变性并且保留视觉功能。因此，多能干细胞可能是产生RPE细胞的无限来源。

目前用于从多能干细胞衍生RPE细胞的方案产生色素和非色素细胞的混合群体。然而，在基础研究、药物发现和细胞治疗中，使用的RPE细胞需要纯色素细胞群。

背景技术包括WO2013/114360、WO2008/129554和WO2013/184809

发明简述

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供人多角形RPE细胞群，其中至少95％的细胞共表达前黑素小体蛋白(PMEL17)和细胞视黄醛结合蛋白(CRALBP)，其中所述细胞群的跨上皮电阻大于100ohms。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供人RPE细胞群，其中至少80％的细胞共表达前黑素小体蛋白(PMEL17)和细胞视黄醛结合蛋白(CRALBP)，其中所述细胞群分泌以下的每一个：血管生成素、金属蛋白酶2的组织抑制剂(TIMP2)、可溶性糖蛋白130(sgp130)和可溶形式的肿瘤坏死因子-α的普遍存在的膜受体1(sTNF-R1)。

根据本发明的实施方案，细胞群分泌以下的每一个：血管生成素、金属蛋白酶2的组织抑制剂(TIMP2)、可溶性糖蛋白130(sgp130)和可溶形式的肿瘤坏死因子-α的普遍存在的膜受体1(sTNF-R1)。

根据本发明的实施方案，细胞以极化方式分泌血管生成素、TIMP2、sgp130或sTNF-R1。

根据本发明的实施方案，细胞以极化方式分泌血管生成素、TIMP2、sgp130和sTNF-R1的每一个。

根据本发明的实施方案，顶端分泌sgp130:底端分泌sgp130的比例大于1。

根据本发明的实施方案，顶端分泌sTNF-R1：底端分泌sTNF-R1的比例大于1。

根据本发明的实施方案，底端分泌血管生成素:顶端分泌血管生成素的比例大于1。

根据本发明的实施方案，顶端分泌TIMP2:底端分泌TIMP2的比例大于1。

根据本发明的实施方案，群体中Oct4⁺TRA-1-60⁺细胞的数量低于1:250,000。

根据本发明的实施方案，如免疫染色所测量，至少80％的细胞表达Bestrophin 1。

根据本发明的实施方案，如免疫染色所测量，至少80％的细胞表达小眼畸形相关转录因子(MITF)。

根据本发明的实施方案，如FACS所测量，超过50％的细胞表达配对盒基因6(PAX-6)。

根据本发明的实施方案，细胞分泌超过750ng色素上皮衍生因子(PEDF)/ml/天。

根据本发明的实施方案，细胞以极化方式分泌PEDF和血管内皮生长因子(VEGF)。

根据本发明的实施方案，顶端分泌PEDF:底端分泌PEDF的比例大于1。

根据本发明的实施方案，在2-8℃孵育8小时后，比例仍然大于1。

根据本发明的实施方案，细胞群的跨上皮电阻大于100ohms。

根据本发明的实施方案，在2-8℃孵育8小时后，细胞的跨上皮电阻仍然大于100ohms。

根据本发明的实施方案，底端分泌VEGF:顶端分泌VEGF的比例大于1。

根据本发明的实施方案，在2-8℃孵育8小时后，比例仍然大于1。

根据本发明的实施方案，细胞群能够在视网膜下施用后拯救RCS大鼠的视觉灵敏度。

根据本发明的实施方案，在视网膜下施用后，细胞群能够拯救RCS大鼠的感光器至少180天。

根据本发明的实施方案，细胞群通过人胚胎干细胞的离体分化制备。

根据本发明的实施方案，细胞群通过以下来制备：

(a)在含有烟碱的培养基中培养人胚胎干细胞以制备分化细胞，其中所述培养基不含激活素A；

(b)在含有烟碱和激活素A的培养基中培养分化细胞以制备进一步分化为RPE谱系的细胞；和

(c)在含有烟碱的培养基中培养进一步分化为RPE谱系的细胞，其中所述培养基不含激活素A。

根据本发明的实施方案，胚胎干细胞在含有bFGF和TFGβ的培养基中增殖。

根据本发明的实施方案，胚胎干细胞在人脐带成纤维细胞上培养。

根据本发明的实施方案，步骤(a)-(c)在其中环境氧气水平小于约10％的条件下进行。

根据本发明的实施方案，方法进一步在步骤(c)之后包括在其中环境氧气水平大于约10％的条件下，在烟碱存在下，在培养基中培养已分化的细胞。

根据本发明的一些实施方案的方面，提供包含本文所述的细胞群作为活性剂和药学上可接受的载体的药物组合物。

根据本发明的一些实施方案的方面，提供本文所述的细胞群用于治疗视网膜变性的用途。

根据本发明的一些实施方案的方面，提供用于制备RPE细胞的方法，包括：

(a)在含有分化剂的培养基中培养多能干细胞以制备分化细胞，其中所述培养基不含转化生长因子β(TGFβ)超家族的成员；

(b)在含有转化生长因子β(TGFβ)超家族的成员和分化剂的培养基中培养分化细胞以制备进一步分化为RPE谱系的细胞；

(c)在含有分化剂的培养基中培养进一步分化为RPE谱系的细胞以制备RPE细胞，其中所述培养基不含转化生长因子β(TGFβ)超家族的成员，其中步骤(a)-(c)在其中环境氧气水平小于约10％的条件下进行。

根据本发明的实施方案，步骤(a)在非粘附条件下进行。

根据本发明的实施方案，所述非粘附条件包含非粘附培养板。

根据本发明的实施方案，步骤(a)包括：

i)在非粘附条件下且不存在激活素A下，在含有烟碱的培养基中培养培养的人多能干细胞群以制备包含分化细胞的细胞簇；随后；

ii)在粘附条件下且不存在激活素A下，在含有烟碱的培养基中培养(i)的分化细胞。

根据本发明的实施方案，方法在步骤(ii)之前进一步包括分离细胞簇以制备细胞团或细胞的单细胞悬浮液。

根据本发明的实施方案，方法在步骤(c)之后进一步包括在分化剂存在且在其中环境氧气水平大于约10％的条件下在培养基中培养已分化的细胞。

根据本发明的实施方案，转化生长因子β(TGFβ)超家族的成员选自TGFβ1、TGFβ3和激活素A。

根据本发明的实施方案，步骤(a)的分化剂和步骤(c)的分化剂相同。

根据本发明的实施方案，步骤(a)的分化剂是烟碱(NA)或3-氨基苯甲酰胺。

根据本发明的实施方案，方法在步骤(c)之后进一步包括选择多角形细胞。

根据本发明的实施方案，方法进一步包括增殖多角形细胞。

根据本发明的实施方案，增殖在粘附表面或细胞外基质上进行。

根据本发明的实施方案，多能干细胞包含胚胎干细胞。

根据本发明的实施方案，胚胎干细胞在含有bFGF和TGFβ的培养基中增殖。

根据本发明的实施方案，胚胎干细胞在人脐带成纤维细胞上培养。

除非另有定义，本文所用的所有技术和/或科学术语具有本发明涉及领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文所述的相似或等同的方法和材料可以用于实施或测试本发明的实施方案，以下描述示例性方法和/或材料。在矛盾的情况下，将以本专利的说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和实施例仅仅是说明性的，而不必然是限制性的。

参考所附附图，仅通过实施例的方式在此描述本发明的一些实施方案。现在详细地具体地参考附图，强调所示的细节是示例性的，且是出于说明性讨论本发明的实施方案的目的。在这方面，说明书和附图使如何实施本发明的实施方案对于本领域技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1是说明数据线性的图表。

图2是用抗CRALBP和抗PMEL17染色的阴性对照hESC细胞的FACS分析。

图3是用抗CRALBP和抗PMEL17染色的参考RPE系5C细胞的阴性对照的FACS分析。

图4是用抗CRALBP和抗PMEL17染色的hESC中25％掺加5C的FACS分析。

图5是用抗CRALBP和抗PMEL17染色的hESC中50％掺加5C的FACS分析。

图6是用抗CRALBP和抗PMEL17染色的hESC中75％掺加5C的FACS分析。

图7是用抗CRALBP和抗PMEL17染色的hESC中95％掺加5C的FACS分析。

图8是用同种型对照染色的hESC的FACS分析。

图9是用同种型对照染色的5C细胞的FACS分析。

图10：来自非RPE色素细胞((PMEL17+CRALBP-；例如黑色素细胞)的分化RPE细胞(CRALBP+PMEL17+)与PMEL17共免疫染色。

图11：在过程控制(IPC)点5和8-10的模拟4和5的形态结果。

图12：制造过程，步骤1-3：制备人脐带成纤维细胞饲养器工作细胞库。

图13：制造过程，步骤4-5：扩增hESC。

图14：制造过程，步骤6-13：分化为RPE细胞。

图15：制造过程，步骤14-17：扩增色素细胞。

图16：详细的制造过程和过程控制点(黄色星，IPC1-11)。(NUTSPlus,含有bFGF和TGFβ的Nutristem培养基；NUTSMinus,不含bFGF和TGFβ的Nutristem培养基；NIC,烟碱；SB,球状体)。

图17：在模拟生产运行4和5中CRALBP+PMEL17+RPE细胞的水平。IPC点8和11的密度图(*IPC点8在冻存后测试)，以及阳性对照5C和阴性对照HAD-C102hESC的代表性密度图(阴性对照组中CRALBP+PMEL17+的范围为0.02-0.17％)。每个图中的数字表示活的单细胞门控群体中的CRALBP+PMEL17+细胞百分比。使用FCS express 4软件进行分析。

图18：使用RPE标志物Bestrophin 1、MITF、ZO-1和CRALBP特异性抗体的模拟5IPC点7、10和11的免疫荧光染色。

图19A-C：P60的第2组(BSS+；图19A)、第5组对侧未处理眼睛(OD；图19B)和第5组处理眼睛(OS；图19C)的代表性彩色眼底照片。高剂量处理的眼睛(OS)中的超高和超低色素区域被推定为指示移植细胞。

图20：在P60、P100、P150和P200测量的视动跟踪灵敏度阈值。细胞处理的组(第3组-25000,第4组-100000和第5组-200000)表现优于所有对照，其中第4组(100000)和第5组(200000)的剂量获得最佳拯救。对侧未操作的眼睛与第1组(未处理)和第2组(介质对照/BSS+)相同(未显示)。

图21A-B：示出了代表性大鼠的焦点(图21A)和全场(图21B)结果的图。

图22A-B：图22A示出了代表性细胞处理的眼睛的甲酚紫染色切片的单独图像的照片。箭头之间示出了感光器保护的位置和推定的移植细胞的位置。图22B示出了在出生后第60、100、150和200天的注射BSS+(第2组)的眼睛和代表性细胞注射的眼睛(代表多个剂量组)之间的比较。GCL：神经节细胞层；ONL：外核层；RPE：视网膜色素上皮。

图23：在大量细胞核中测量的外核层厚度。每个点表示来自所有年龄的每个剂量组的每只动物的计数。

图24：用抗人细胞核标志物(H.N.M，绿色)、抗前黑素体标志物(PMEL17，红色)、抗人增殖标志物(Ki67，红色)和抗大鼠锥细胞arrestin(红色)染色的P60、P100、P150和P200的阳性对照组织和代表性实验细胞处理的动物的免疫荧光图像。Dapi(蓝色)用于背景染色以突出核层。人黑色素瘤用作PMEL17阳性对照组织，人扁桃体用于Ki67和幼年RCS大鼠视网膜用于锥细胞arrestin。向下的箭头表示外核层；向上的箭头表示阳性染色的如本文所述制备的人RPE细胞

图25是示出了将细胞视网膜下移植入RCS大鼠后锥细胞定量的图。在所有年龄，细胞处理的眼睛显著高于对照眼睛。

图26A-J：视网膜下空间中的细胞的免疫荧光染色。图26A表示具有多个RPE细胞(红色，箭头)中心并且没有碎片区域(使用抗大鼠视紫红质抗体观察，绿色；箭头)的视网膜区域，但是当细胞不是中心(外周)，碎片区重构。在更高的放大倍数(图26B)，一些视紫红质染色的外节段沿着移植细胞停留。此外，随着与移植细胞的距离增加，碎片区重构。图26C-J是整个部分中显示移植细胞内的视紫红质阳性组织(箭头)切片的单独切片。

图27A-C是示出了视网膜下注射入NOD-SCID后细胞的生物分布的照片。图27A示出了移植后9个月，细胞植入NOD-SCID视网膜下空间的能力。色素细胞的人细胞核和PMEL17染色为阳性。图27B是示出了在注射后的水泡位置处的成簇细胞的照片。图27C是示出了注射后细胞随后扩散到单层中的照片。

图28是可用于测定RPE细胞效力的转移孔试验的示意图。

图29是FACS分析的结果，示出了在生产中(P0)如本文所述制备的RPE细胞中的PAX6表达(P2-DP,药物产品：模拟IV、模拟V、批次2A；HuRPE：来自ScienCell的正常人RPE)。

图30是示出了通过FACS测定的细胞中的PAX6表达的图(HES，用作阴性对照的人胚胎干细胞)。

图31是FACS分析的结果，示出了PAX6和CRALBP的双重染色。

图32A-C是示出了ELISA评估细胞的血管生成素分泌的图。A.模拟V生产中血管生成素分泌增加。B.三个不同批次的细胞(第3代)且在转移孔(transwell)上3周(第4代)的血管生成素分泌，在此期间评估顶端和底端分泌。C.RPE 7细胞(第3代)的血管生成素分泌。

图33A-E示出了细胞的TIMP-1和TIMP-2分泌。A.通过蛋白质阵列检测到的相对TEVIP-1和TIMP-2蛋白水平。B.在模拟V生产的QC点3和4中的ELISA TIMP-2水平。C-D.不同批次的细胞(第3代)且在期间评估顶端和底端分泌的转移孔上3周(第4代)的ELISA TIMP-2分泌水平。E.由RPE 7和HuRPE对照细胞(第3代，第4天和第14天)分泌的TIMP-2水平。

图34A-D示出了ELISA测量的细胞的sgp130分泌。A.在模拟V生产的QC点3和4中的sgp130分泌水平。B-C.各个批次的细胞(第3代)且在期间评估顶端和底端分泌转移孔上3周(第4代)分泌的sgp130水平。D.由RPE 7和HuRPE对照细胞(第3代，第4天和第14天)分泌的sgp130水平。

图35A-D示出了ELISA测量的细胞上清液中的sTNF-R1蛋白水平。A.来自模拟V生产的QC点3和4的细胞上清液中的sTNF-R1水平。B-C.批次(第3代)和在期间评估顶端和底端分泌的转移孔上3周(第4代)的sTNF-R1水平。D.在第4天和第14天的RPE 7和对照HuRPE细胞培养物中的sTNF-R1水平。

图36示出了在转移孔上的5C(参考线)、RPE1和RPE7的形态。在接种至转移孔上后，每周(第1-4周)对5C、RPE1和RPE7成像。5C从第1周产生均匀的多角形单层，而RPE1和RPE7在接种后一周产生不同的非均匀形态，并且在第2周开始出现孔。在培养3周后，将培养物中的RPE1细胞与转移孔分离。

图37示出了RPE1和RPE7细胞共表达CRALBP和PMEL-17。FACS纯度分析表明分别有99.91％和96.29％的RPE1和RPE7细胞为RPE标记物CRALBP和PMEL-17的双阳性，与模拟V细胞(阳性对照)中所见的水平类似。HAD-C102hESC用作阴性对照。

发明详述

在一些实施方案中，本发明涉及视网膜色素上皮细胞，更具体但不排除性地，涉及对这种细胞作为治疗的评估。本发明还涉及从人胚胎干细胞制备视网膜色素上皮细胞。

在详细解释本发明的至少一个实施方案前，需要理解本发明并不必然限制于在以下说明书中所示的细节或实施例示范的应用。本发明能够具有其他实施方案或以各种方式实施或进行。

神经视网膜引发视觉，并由下面的视网膜色素上皮(RPE)支持。RPE细胞的功能障碍、变性和缺失是Best疾病(视网膜色素变性(RP)的亚型)和年龄相关性黄斑变性(AMD)的主要特征，其是西方世界视觉障碍的主要原因。在这些情况下，视觉逐渐损失，通常导致失明。

视网膜和邻近的RPE均来自神经外胚层。在低等物种中，RPE再生视网膜，但在哺乳动物中，RPE介导的再生被抑制，更新通过位于外周视网膜边缘的干细胞以非常有限的程度发生。

人胚胎干细胞(hESC)可以作为用于移植的RPE细胞的无限供体来源。已经证明小鼠、灵长类和人ESC分化成RPE样细胞、减弱视网膜变性和在视网膜下移植后保留视觉功能的潜力。

已经开发了各种方案以将人胚胎干细胞分化为RPE细胞(参见例如WO2008/129554)。

本发明人现在已经发现了基于特定多肽表达的鉴定已经成功分化成RPE细胞的细胞群的独特且简单的方法。在这些已分化的细胞上表达的无数潜在多肽中，本发明人已经发现两种特定标志物的组合可用于证实成功的分化。

本发明人还发现，色素上皮衍生因子(PEDF)的分泌可以用作标志物来证实RPE分化过程的早期阶段(参见表4)。

进一步减少本发明以实施的同时，本发明人鉴定了RPE细胞分泌的其他蛋白，其在一些实施方案中可以用作定义细胞的签名。

因此，根据本发明的一个方面，提供鉴定细胞群是否是治疗眼部疾病的合适治疗剂的方法，包括分析细胞群中前黑素小体蛋白(PMEL17)和至少一种选自细胞视黄醛结合蛋白(CRALBP)、卵磷脂视黄醇酰基转移酶(LRAT)和性别决定区域Y盒9(SOX 9)的多肽的共表达，其中当共表达PMEL17和所述至少一种多肽的细胞数大于预定水平时，将细胞群鉴定为用于治疗视网膜疾病的合适治疗剂。

根据另一个方面，提供鉴定细胞群是否是治疗眼部疾病的合适治疗剂的方法，包括分析细胞群中细胞视黄醛结合蛋白(CRALBP)和至少一种选自前黑素小体蛋白(PMEL17)、卵磷脂视黄醇酰基转移酶(LRAT)和性别决定区域Y盒9(SOX 9)的多肽的共表达，其中当共表达CRALBP和所述至少一种多肽的细胞数大于预定水平时，将细胞群鉴定为用于治疗眼部疾病的合适治疗剂。

如本文所用，短语“合适治疗剂”是指细胞群用于治疗眼部疾病的合适性。治疗性细胞可以通过多种机制任何一种发挥作用。一个示例性机制是促进视网膜内退行性感光器或其他细胞的存活的营养支持作用。治疗性RPE细胞还可以通过补充正常功能的和/或退化的宿主RPE细胞的再生机制来发挥作用。根据一个实施方案，RPE细胞是成熟的，且具有吞噬包含视紫红质的感光器的外侧脱落节段的功能性能力。根据另一个实施方案，RPE细胞不是完全成熟的。

细胞群作为治疗剂的眼部疾病包括但不限于通常与视网膜功能障碍、视网膜损伤和/或视网膜色素上皮细胞丧失相关的视网膜疾病或病症。可以根据本发明治疗的疾病的非限制性列表包括视网膜色素变性、利伯氏先天性黑蒙、遗传性或获得性黄斑变性、年龄相关性黄斑变性(AMD)、Best疾病、视网膜脱离、回旋形萎缩、无脉络膜、模式营养不良以及RPE的其他营养不良、Stargardt病、由以下任何一种造成的损伤引起的RPE和视网膜损伤：光、激光、炎症、感染、辐射、新血管或创伤性损伤。

如上所述，本发明该方面的方法通过测量表达以下的量(例如细胞百分比)来进行：前黑素小体蛋白(PMEL17；SwissProt No.P40967)和至少一种选自细胞视黄醛结合蛋白(CRALBP；SwissProt No.P12271)、卵磷脂视黄醇酰基转移酶(LRAT；SwissProt No.095327)和性别决定区域Y盒9(SOX 9；P48436)的多肽。

或者，该方面的方法通过测量以下来进行：CRALBP(CRALBP；SwissProtNo.P12271)和至少一种选自卵磷脂视黄醇酰基转移酶(LRAT；SwissProt No.095327)、性别决定区域Y盒9(SOX 9；P48436)和PMEL17(SwissProt No.P40967)。

因此，例如，可以测量CRALBP和PMEL17；可以测量PMEL17和LRAT或可以测量PMEL17和SOX9。或者，可以测量CRALBP和LRAT，或可以测量CRALBP和SOX9。

将理解，可以测量超过两种本文所述的多肽，例如三种上述多肽甚至所有四种上述多肽。

分析上述多肽的表达的方法通常涉及使用特异性识别抗原的抗体。识别CRALBP的可商购抗体包括例如由Abeam制备的那些(例如ab15051和ab189329,克隆B2)。识别PMEL17的可商购抗体包括例如由Abeam制备的那些(例如ab137062和ab189330,克隆EPR4864)。识别LRAT的可商购抗体包括例如由Milipore制备的那些(例如MABN644)。识别SOX9的可商购抗体包括例如由Abeam制备的那些(例如ab185230)。分析可以使用本领域已知的任何方法进行，例如流式细胞术、蛋白质印迹、免疫细胞化学、放射免疫分析、PCR等。

对于流式细胞术，可以将抗体连接至荧光部分，并用荧光激活细胞分选仪(FACS)分析。或者，可以考虑使用具有荧光部分的二级抗体。

将理解，由于分析的多肽是细胞内多肽，通常将细胞透化以使抗体能够结合其靶标。可以先固定细胞以确保可溶性抗原或半衰期短的抗原的稳定性。这应当将靶标蛋白保留在原始的细胞定位。可以在透化缓冲液中制备抗体以确保细胞保持可渗透。将理解，当门控(gate on)细胞群时，流式细胞术上的细胞光散射谱将在透化和固定之后显著变化。

用于透化细胞膜的方法是本领域已知的，包括例如：

1.甲醛，然后洗涤剂：在(例如不超过4.5％的)甲醛中固定10-15分钟(这将稳定蛋白)，然后通过洗涤剂例如Triton或NP-40(PBS中0.1-1％)、Tween 20(PBS中0.1-1％)、Saponin、Digitonin和Leucoperm(例如PBS中0.5％v/v)破坏膜；

2.甲醛(例如不超过4.5％)，然后甲醇；

3.甲醇，然后洗涤剂(例如80％甲醇，然后0.1％Tween20)；

4.丙酮固定和透化。

如本文所用，术语“流式细胞术”是指通过以下测定样品中材料(例如含有特定标志物的RPE细胞)的比例的分析：标记材料(例如通过将标记抗体结合至材料)，使包括材料的液体流通过光束，通过一系列滤光器和反射镜将从样品发射的光分离成组成波长，并检测光。

可商购许多流式细胞仪，包括例如Becton Dickinson FACScan、Navios FlowCytometer(Beckman Coulter serial#AT15119 RHE9266和FACScalibur(BD Biosciences,Mountain View,CA)。可用于FACS分析的抗体在Schlossman S,Boumell L等,[LeucocyteTyping V.New York:Oxford University Press；1995]中教导，且可广泛商购。

将理解，上述多肽的表达水平可以在RNA水平和蛋白质水平上进行。基于RNA水平测定多肽表达的示例性方法包括但不限于PCR、RT-PCR、Northern印迹等。

为鉴定细胞可以用作治疗剂，在细胞中共表达的至少两种多肽的量与非RPE细胞(例如未分化的胚胎干细胞)相比应当在统计学上显著的水平上增加。

根据一个具体的实施方案，为鉴定细胞可以用作治疗剂，通过本领域技术人员已知的方法(例如FACS)测定，群体中至少80％的细胞应当表达可检测水平的PMEL17和上述多肽之一(例如CRALBP)，更优选群体中至少85％的细胞应当表达可检测水平的PMEL17和上述多肽之一(例如CRALBP)，更优选群体中至少90％的细胞应当表达可检测水平的PMEL17和上述多肽之一(例如CRALBP)，更优选群体中至少95％的细胞应当表达可检测水平的PMEL17和上述多肽之一(例如CRALBP)，更优选群体中100％的细胞应当表达可检测水平的PMEL17和上述多肽之一(例如CRALBP)。

根据另一个实施方案，为鉴定细胞可以用作治疗剂，与未分化ESC相比，共表达的CRALBP和上述多肽之一(例如PMEL17)的水平(例如通过荧光强度测量)应当增加至少2倍，更优选至少3倍，更优选至少4倍，甚至更优选至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍。

根据一个具体的实施方案，为鉴定细胞可以用作治疗剂，通过本领域技术人员已知的方法(例如FACS)测定，群体中至少80％的细胞应当表达可检测水平的CRALBP和上述多肽之一(例如PMEL17)，更优选群体中至少85％的细胞应当表达可检测水平的CRALBP和上述多肽之一(例如PMEL17)，更优选群体中至少90％的细胞应当表达可检测水平的CRALBP和上述多肽之一(例如PMEL17)，更优选群体中至少95％的细胞应当表达可检测水平的CRALBP和上述多肽之一(例如PMEL17)，更优选群体中100％的细胞应当表达可检测水平的CRALBP和上述多肽之一(例如PMEL17)。

此外，可以在动物模型中体内鉴定细胞。一个这种模型是皇家外科医学院(RCS)大鼠模型。移植后，可以用包括以下的方法来分析细胞的疗效：眼底成像、视动跟踪阈值(OKT)、视网膜电图(ERG)、组织学、锥细胞(cone)计数和视紫红质摄入。这些方法进一步描述于本文以下的实施例5。

可以用其他方法鉴定或表征细胞，包括例如核型分析、形态学、细胞数量和活力、效价(PEDF和VEGF的屏障功能和极化分泌)，残留hESC水平、革兰氏染色和无菌性。可以进行的示例性分析描述于实施例4。

此外，可以分析细胞的屏障功能及其以极化方式分泌的生长因子水平(例如色素上皮衍生因子(PEDF)或VEGF、细胞因子、白介素和/或趋化因子)。

对于分泌的PEDF的分析，从细胞培养物收集上清液，收获并计数细胞。可以使用PEDF ELISA试验(例如ELISAquant^TM PEDF Sandwich ELISA Antigen Detection Kit,BioProductsMD,PED613)根据制造商的方案定量细胞培养物上清液中的PEDF的量。

此外，可以分析细胞中PEDF和VEGF的分泌方向。这可以通过图28所示的转移孔试验进行。定量之前或之后，细胞可以根据本领域已知的方法保存(例如冷冻或冻存)，或直接向受试者施用。

本发明预期分析包含来自任何来源的视网膜色素上皮(RPE)细胞的细胞群。因此，细胞群可以包含从供体获得的RPE细胞(即，视网膜色素层的天然RPE细胞)，或可以包含从干细胞群离体分化的RPE细胞(hSC衍生的RPE细胞，例如多能干细胞-如人胚胎干细胞)。根据另一个实施方案，RPE细胞通过转分化获得，参见例如其内容通过引用并入本文的Zhang等,Protein Cell 2014,5(l):48-58。

根据一个实施方案，分析的RPE细胞不表达Pax6。

根据另一个实施方案，分析的RPE细胞表达Pax6。

“视网膜色素上皮细胞”、“RPE细胞”、“RPE”可以如上下文所允许的交替使用，是指与形成视网膜的色素上皮细胞层的天然RPE细胞具有类似功能(例如在眼中移植后，它们显示与天然RPE细胞类似的功能活性)的细胞类型的细胞。

根据一个实施方案，RPE细胞表达至少一个、两个、三个、四个或五个成熟RPE细胞的标志物。此类标志物包括但不限于CARLBP、RPE65、PEDF、PMEL17、Bestrophin和酪氨酸酶。任选地，RPE细胞还可以表达RPE祖细胞的标志物，例如MITF。在另一个实施方案中，RPE细胞表达PAX-6。在另一个实施方案中，RPE细胞表达至少一个视网膜祖细胞的标志物，包括但不限于OTX2、SDG、SIX6和LHX2。

还根据另一个实施方案，RPE细胞是根据以下实施例部分所述的方法从胚胎干细胞分化的那些，实施例的内容包括在说明书中。

如本文所用，短语“成熟RPE细胞的标志物”是指相对于非RPE细胞或未成熟RPE细胞，成熟RPE细胞中升高(例如至少2倍、至少5倍、至少10倍)的抗原(例如蛋白质)。

如本文所用，短语“RPE祖细胞的标志物”是指相对于非RPE细胞，RPE祖细胞中升高(例如至少2倍、至少5倍、至少10倍)的抗原(例如蛋白质)。

根据另一个实施方案，RPE细胞具有与形成视网膜色素上皮细胞层的天然RPE细胞类似的形态，即色素化和/或具有特征性的多角形形状。

还根据另一个实施方案，RPE细胞能够治疗疾病例如黄斑变性。

还根据另一个实施方案，RPE细胞满足以上列出的至少1个、2个、3个、4个或全部要求。

如本文所用，术语“hSC衍生的RPE细胞”是指通过定向分化从hSC获得的RPE细胞。根据一个优选的实施方案，hSC衍生的RPE细胞是由以下定义的参数显示的功能性RPE细胞。术语“定向分化”与术语“RPE诱导的分化”可交替使用，理解为是指在诱导/促进分化成RPE细胞类型的培养条件下操作hSC的过程。

根据一个具体的实施方案，RPE细胞通过在一个或多个TGFβ超家族成员存在下定向分化hSC获得，且呈现至少一个以下特征：

-分化期间，培养细胞响应TFGβ信号转导；

-RPE细胞表达指示终末分化的标志物，例如bestrophin 1、CRALBP和/或RPE65；

-移植后(即原位)，RPE细胞呈现支持RPE细胞邻近的感光器的营养作用；

-进一步，原位RPE细胞能够发挥功能吞噬脱落的感光器外节段作为这些感光器正常更新过程的一部分；

-进一步，原位RPE细胞能够产生视网膜屏障并在视觉周期中发挥功能。

如本文所用，短语“干细胞”是指能够在培养物中保持延长时间的未分化状态(例如多能或专能干细胞)直至诱导分化成具有特定专门功能的其他细胞类型(例如完全分化的细胞)的细胞。优选地，短语“干细胞”涵盖胚胎干细胞(ESC)、诱导的多能干细胞(iPS)、成体干细胞、间充质干细胞和造血干细胞。

根据一个具体的实施方案，RPE细胞来自多能干细胞，包括人胚胎干细胞或诱导的多能干细胞。

短语“胚胎干细胞”是指能够分化成所有三个胚胎胚层(即内胚层、中胚层和外胚层)细胞或保持未分化状态的胚胎细胞。短语“胚胎干细胞”可以包括从以下获得的细胞：在植入胚胎前(即植入前囊胚)妊娠后形成的胚胎组织(例如囊胚)、从植入后/妊娠前阶段的囊胚获得的扩展囊胚细胞(EBC)(参见WO2006/040763)，和在妊娠期间任何时候，优选在妊娠10周之前从胎儿的生殖器组织获得的胚胎生殖(EG)细胞。可以用已知的细胞培养方法获得本发明一些实施方案中的胚胎干细胞。例如，可以从人囊胚分离人胚胎干细胞。人囊胚通常从人体内植入前胚胎或体外受精(IVF)胚胎获得。或者，可以将单细胞人胚胎扩大到囊胚期。为分离人ES细胞，从囊胚移除卵透明带，通过手术分离内细胞团(ICM)，其中裂解并通过温和吹打从紧密ICM中移除滋养层细胞。然后，将ICM铺板到含有使其能够生长的合适培养基的组织培养瓶中。9-15天后，通过机械分离或通过酶促降解将ICM衍生的生长分解成团块，然后将细胞再次铺板到新鲜的组织培养基上。通过微量移液器/干细胞工具单独选择显示未分化形态的克隆，机械分离成片段/团块，然后再次铺板。然后每4-7天常规分开所得的ES细胞。对于制备人ES细胞的方法的进一步细节，参见Reubinoff等,Nat Biotechnol2000,May:18(5):559；Thomson等,[U.S.Patent No.5,843,780；Science 282:1145,1998；Curr.Top.Dev.Biol.38:133,1998；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:7844,1995]；Bongso等,[Hum Reprod 4:706,1989]；和Gardner等,[Fertil.Steril.69:84,1998]。

将理解，也可以根据本发明的一些实施方案使用可商购的干细胞。可以从NIH人胚胎干细胞登记处[Hypertext Transfer Protocol://grants(dot)nih(dot)gov/stem_cells/registry/current(dot)htm]和其他欧洲登记处购买人ES细胞。可商购的胚胎干细胞系的非限制性实例有HAD-C102、ESI、BG01、BG02、BG03、BG04,、CY12、CY30、CY92、CY10、TE03、TE32、CHB-4、CHB-5、CHB-6、CHB-8、CHB-9、CHB-10、CHB-11、CHB-12、HUES 1、HUES 2、HUES 3、HUES 4、HUES 5、HUES 6、HUES 7、HUES 8、HUES 9、HUES 10、HUES 11、HUES 12、HUES13、HUES 14、HUES 15、HUES 16、HUES 17、HUES 18、HUES 19、HUES 20、HUES 21、HUES 22、HUES 23、HUES 24、HUES 25、HUES 26、HUES 27、HUES 28、CyT49、RUES3、WA01、UCSF4、NYUES1、NYUES2、NYUES3、NYUES4、NYUES5、NYUES6、NYUES7、UCLA 1、UCLA 2、UCLA 3、WA077(H7)、WA09(H9)、WA13(H13)、WA14(H14)、HUES 62、HUES 63、HUES64、CT1、CT2、CT3、CT4、MA135、Eneavour-2、WIBR1、WIBR2、WIBR3、WIBR4、WIBR5、WIBR6、HUES 45、Shef 3、Shef 6、BJNheml9、BJNhem20、SA001、SA001。

此外，也可以从其他物种获得ES细胞，包括小鼠(Mills and Bradley,2001)、金仓鼠[Doetschman等,1988,Dev Biol.127:224-7]、大鼠[Iannaccone等,1994,Dev Biol.163:288-92]、兔[Giles等 1993,Mol Reprod Dev.36:130-8；Graves&Moreadith,1993,MolReprod Dev.1993,36:424-33]、几种家畜物种[Notarianni等,1991,J Reprod FertilSuppl.43:255-60；Wheeler 1994,Reprod Fertil Dev.6:563-8；Mitalipova等,2001,Cloning.3:59-67]和非人灵长类物种(猕猴和狨猴)[Thomson等,1995,Proc Natl AcadSci U S A.92:7844-8；Thomson等,1996,Biol Reprod.55:254-9]。

扩展囊胚细胞(EBC)可以从妊娠前阶段的受精后至少9天的囊胚获得。在培养囊胚前，消化卵透明带[例如通过Tyrode酸性溶液(Sigma Aldrich,St Louis,MO,USA)]以暴露内细胞团。然后，使用标准胚胎干细胞培养方法，在体外受精后(即，在妊娠事件之前)将囊胚作为整个胚胎培养至少9天并且不超过14天。

制备ES细胞的另一种方法描述于Chung等,Cell Stem Cell,Volume 2,Issue 2,113-117,7February 2008。该方法包括在体内受精过程期间从胚胎取出单细胞。胚胎在该过程中没有被破坏。

制备ES的另一种方法是通过孤雌生殖。胚胎在该过程中也没有被破坏。

目前采用的ES培养方法主要基于使用分泌干细胞增殖所需的因子同时抑制其分化的饲养层细胞。示例性的饲养层包括人胚胎成纤维细胞、成年输卵管上皮细胞，原代小鼠胚胎成纤维细胞(PMEF)，小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)、小鼠胎儿成纤维细胞(MFF)、人胚胎成纤维细胞(HEF)、人胚胎干细胞分化获得的人成纤维细胞、人胎儿肌细胞(HFM)、人胎儿皮肤细胞(HFS)、人成年皮肤细胞、人包皮成纤维细胞(HFF)、人脐带成纤维细胞、从脐带或胎盘获得的人细胞和人骨髓基质细胞(hMSC)。可以向培养基添加生长因子以使ESC保持在未分化状态。此类生长因子包括bFGF和/或TGFβ。在另一个实施方案中，可以向培养基添加试剂以使hESC保持在天然未分化状态，参见例如Kalkan等,2014,Phil.Trans.R.Soc.B,369:20130540。

不含饲养细胞的系统也用于ES细胞培养，该系统使用补充有血清替代物、细胞因子和生长因子(包括IL6和可溶IL6受体嵌合体)的基质替代饲养细胞层。在培养基存在下，干细胞可以在固体表面例如细胞外基质(例如,MatrigelR^TM或层粘连蛋白)上生长，例如Lonza L7系统、mTeSR、StemPro、XFKSR、E8。与需要同时生长饲养细胞和干细胞且可能造成混合细胞群的基于饲养层的培养不同，在无饲养层的系统上生长的干细胞容易与表面分离。用于生长干细胞的培养基包含有效抑制分化且促进其生长的因子，例如MEF调节的培养基和bFGF。然而，常用的无饲养层培养系统利用基于动物的基质(例如MatrigelR^TM)，其补充有小鼠或牛血清，或补充有MEF调节的培养基[Xu C,等(2001)Feeder-free growth ofundifferentiated human embryonic stem cells.Nat Biotechnol.19:971-4]，其带来动物病原体交叉传递给人ES细胞的风险，从而危及未来的临床应用。

用于将ESC分化为RPE谱系的许多方法是已知的，包括定向分化方案(例如描述于WO 2008/129554、2013/184809中的那些)和自发分化方案(例如描述于美国专利号8,268,303和美国专利申请20130196369中的那些)，各文献的内容通过引用并入本文。

根据一个具体的实施方案，用定向分化方案从ESC细胞制备RPE细胞，例如根据实施例部分所公开的那样。

在一个示例性的分化方案中，用第一分化剂将胚胎干细胞分化为RPE细胞谱系，然后用转化生长因子β(TGFβ)超家族的成员(例如TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3亚型，以及同源配体包括激活素(激活素A、激活素B和激活素AB)、Nodal、抗穆勒氏管激素(AMH)、一些骨形态发生蛋白(BMP)如BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6和BMP7，和生长分化因子(GDF))进一步分化为RPE细胞。

根据一个具体的实施方案，TGFβ超家族的成员选自TGFβ1、激活素A和TGFβ3。

根据一个具体的实施方案，转化生长因子β(TGFβ)超家族的成员是例如20-200ng/ml，如100-180ng/ml的激活素A。

第一分化剂促进分化为RPE谱系。例如，第一分化剂可以促进多能干细胞分化成神经祖细胞。这种细胞可能表达神经祖细胞标志物如PAX6。

根据一个具体的实施方案，第一分化剂是例如1-100mM、5-50mM、5-20mM之间，如10mM的烟碱(NA)。

NA，也称为“烟酰胺”，是维生素B3(烟酸)的酰胺衍生物形式，并被认为保留和提高β细胞的功能。NA的化学式为C₆H₆N₂O。NA是生长和食物转化为能量所必需的，且已经被用于关节炎治疗和糖尿病的治疗和预防。

根据一个具体的实施方案，烟碱是烟碱衍生物或烟碱模拟物。如本文所用，术语“烟碱(NA)的衍生物”是指天然NA的化学修饰衍生物的化合物。在一个实施方案中，化学修饰可以是通过酰胺部分的氮或氧取代基础NA结构的吡啶环(通过该环的碳或氮)。当取代时，一个或多个氢原子可以被取代基替换和/或取代基可以与N原子连接以形成四价带正电的氮。因此，本发明的烟碱包括取代或非取代的烟碱。在另一个实施方案中，化学修饰可以是单个基团的缺失或替换，例如以形成NA的硫代苯甲酰胺类似物，所有这些均是有机化学专业人员所理解的。在本发明的上下文中，衍生物还包括NA的核苷衍生物(例如烟酰胺腺嘌呤)。

已经描述了各种NA衍生物，一些还涉及PDE4酶的抑制活性(WO03/068233；WO02/060875；GB2327675A)，或作为VEGF-受体酪氨酸激酶抑制剂(WO01/55114)。例如，制备4-芳基-烟碱衍生物的方法(WO05/014549)。其他示例性的烟碱衍生物公开于WO01/55114和EP2128244。

烟碱模拟物包括烟碱的修饰形式和烟碱的化学类似物，其概括了烟碱对RPE细胞从多能细胞分化和成熟的影响。示例性的烟碱模拟物包括苯甲酸、3-氨基苯甲酸和6-氨基烟酰胺。另一类可作为烟碱模拟物的化合物是聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)的抑制剂。示例性的PARP抑制剂包括3-氨基苯甲酰胺、Iniparib(BSI 201)、奥拉帕尼(AZD-2281)、瑞卡帕布(AG014699,PF-01367338)、维利帕尼(ABT-888)、CEP 9722、MK 4827和BMN-673。

根据一个具体的实施方案，根据以下进行分化：

a)在含有第一分化剂(例如烟碱)的培养基中培养ESC；和

b)在含有TGFβ超家族的成员(例如激活素A)和第一分化剂(例如烟碱)的培养基中培养从步骤a)获得的细胞。

优选步骤(a)在TGFβ超家族的成员不存在的情况下进行。

上述方案还可以继续，在含有第一分化剂(例如烟碱)但不含TGFβ超家族的成员(例如激活素A)的培养基中培养步骤(b)获得的细胞。该步骤在本文称为步骤(c)。

现在用其他实施方案来进一步详细地描述上述方案。

一旦获得足够量的ESC，开始分化过程。通常，将它们从粘附细胞培养基上移除(例如通过使用胶原酶A、分散酶、TrypLE Select、EDTA)，并将其铺板至存在烟碱(且不存在激活素A)的非粘附底物上(例如Hydrocell非粘附细胞培养板)。示例性的烟碱浓度为1-100mM、5-50mM、5-20mM,例如10mM。一旦将细胞铺板至非粘附底物上，细胞培养物可以称为细胞悬浮液，优选悬浮培养物中游离的浮游簇，即衍生自人胚胎干细胞(hESC)的细胞的聚集体。细胞簇不粘附任何底物(例如培养板、载体)。游离的浮游干细胞的来源之前描述于其全文通过引用并入本文的WO 06/070370。这个阶段可以进行最少1天，更优选2天、3天、1周或甚至10天。优选地，细胞在含有烟碱(且不存在TGFβ超家族成员，例如激活素A)的悬浮液中培养不超过2周。

根据一个优选的实施方案，当在非粘附底物上培养细胞时，控制环境氧气条件使其百分比等于或低于约20％、15％、10％,更优选低于约9％、低于约8％、低于约7％、低于约6％，更优选约5％(例如为1％-20％、1％-10％或0-5％)。

非粘附细胞培养板的实例包括由Hydrocell(例如Cat No.174912),Nunc等制造的那些。

通常，簇包含至少50-500,000、50-100,000、50-50,000、50-10,000、50-5000、50-1000个细胞。根据一个实施方案，簇中的细胞没有组织为层，且形成不规则形状。在一个实施方案中，簇不含多能胚胎干细胞。在另一个实施方案中，簇包含少量的多能胚胎干细胞(例如在蛋白质水平共表达OCT4和TRA1-60的不超过5％，或不超过3％(例如0.01-2.7％)的细胞)。通常，簇包含在烟碱影响下已经部分分化的细胞。这种细胞可能表达神经前体标志物，例如PAX6。细胞还可能表达其他谱系祖细胞的标志物，例如甲胎蛋白、MIXL1和Brachyuri。

可以用本领域已知的酶促或非酶促方法(例如机械)来分离簇。根据一个实施方案，将细胞分离使其不再成簇-例如2-100,000个细胞、2-50,000个细胞、2-10,000个细胞、2-5000个细胞、2-1000个细胞、2-500个细胞、2-100个细胞、2-50个细胞的聚集体或团块。根据一个具体的实施方案，细胞处于单细胞悬浮液中。

然后将细胞(例如分离的细胞)铺板至粘附底物上，并在例如1-100mM、5-50mM、5-20mM，如10mM的烟碱存在下(且激活素A不存在)培养。这个阶段可以进行最少1天，更优选2天、3天、1周或甚至14天。优选地，在粘附细胞培养物上，在烟碱存在(且激活素不存在)下，细胞培养不超过1周。

总之，在加入第二分化剂(例如激活素A)之前，通常将细胞暴露至烟碱(浓度为1-100mM、5-50mM、5-20mM,如10mM)约2-3周，优选不超过4周。

粘附底物的实例包括但不限于胶原、纤连蛋白、核层蛋白(例如核层蛋白521)。

在第一阶段的定向分化(即在非粘附培养条件和低氧气环境条件下在烟碱(例如10nM)存在下培养，然后低氧气环境条件下且在烟碱存在下在粘附底物上培养)之后，然后将半分化的细胞在粘附底物上进行下一个阶段的分化-在烟碱(例如10mM)和激活素A(例如20-200ng/ml、100-200ng/ml,如140ng/ml、150ng/ml、160ng/ml或180ng/ml)存在下培养。这个阶段可以进行1天至10周、3天至10周、1-10周、1-8周、1-4周，例如进行至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周或甚至8周。优选该阶段进行约2周。根据一个实施方案，这个阶段的分化也是在低环境氧气条件下进行-即低于约20％、15％、10％,更优选低于约9％、低于约8％、低于约7％、低于约6％，更优选约5％(例如为1％-20％、1％-10％或0-5％)。

在第二阶段的定向分化(即，在烟碱和激活素A存在下，在粘附底物上培养)之后，任选将进一步分化的细胞在粘附底物上进行随后阶段的分化-在烟碱(例如1-100mM、5-50mM、5-20mM,如10mM)存在且激活素A不存在下培养。这个阶段可以进行至少1天、2天、3天、1周、至少2周、至少3周或甚至4周。优选该阶段进行约1周。该阶段的分化可以在低(即，低于约20％、15％、10％,更优选低于约9％、低于约8％、低于约7％、低于约6％，更优选约5％(例如为1％-20％、1％-10％或0-5％))或正常环境氧气条件下或两者的组合下进行(即，初始在低环境氧气条件下，随后当观察到轻度色素细胞时则在正常氧气条件下)。

根据一个具体的实施方案，当环境氧气条件恢复到正常环境条件时，在烟碱(例如10mM)存在且激活素A不存在下再培养细胞至少一天(例如多达两周)。

根据本发明的基础培养基是本领域已知的用于支持细胞离体生长的任何已知细胞培养基，通常是含有确定基础溶液的培养基，其包括盐、糖、氨基酸和在培养物中维持细胞存活状态所需的任何其他营养物。根据本发明可以使用的可商购基础培养基的非限制性实例包括Nuristem(对于ESC分化不含bFGF和TGFβ,对于ESC扩增含有bFGF和TGFβ)、Neurobasal^TM、KO-DMEM、DMEM、DMEM/F12、Lonza L7系统、mTeSR、StemPro、XF KSR、E8、Cellgro^TM干细胞生长培养基或X-Vivo^TM。基础培养基可以补充有本领域已知的处理细胞培养物的多种试剂。以下是可以包括在根据本公开使用的培养细胞中的各种补充剂的非限制性参考：

-血清或含有血清替代物的基质，例如但不限于剔除血清取代物(KOSR)、Nutridoma-CS、TCH^TM、N2、N2衍生物、或B27或其组合；

-细胞外基质(ECM)成分，例如但不限于纤连蛋白、核层蛋白、胶原和明胶。ECM可以用于携带一个或多个生长因子TGFβ超家族的成员；

-抗细菌剂，例如但不限于青霉素和链霉素；

-非必需氨基酸(NEAA)，已知对于促进SC在培养物中的存活起重要作用的神经营养因子，例如但不限于BDNF、NT3、NT4。

根据一个优选的实施方案，用于分化ESC的培养基是Nuristem培养基(BiologicalIndustries,05-102-1A或05-100-1A)。

根据一个具体的实施方案，ESC的分化在无异种(xeno-free)条件下进行。

根据一个实施方案，增殖/生长培养基不含异种污染物，即不含源自动物的成分例如血清、源自动物的生长因子和白蛋白。因此，根据该实施方案，培养在异种污染物不存在的情况下进行。

用于在无异种条件下培养ESC的其他方法在其全文通过引用并入本文的美国专利申请公开号20130196369中提供。

在分化步骤期间，可以监测胚胎干细胞的分化状态。可以检查已知指示分化的细胞或组织特异性标志物来测定细胞分化。

可以使用本领域熟知的免疫学技术来检测组织/细胞特异性标志物[Thomson JA等,(1998).Science 282:1145-7]。实例包括但不限于，用于膜结合或细胞内标志物的流式细胞术、用于细胞外和细胞内标志物的免疫组化，和用于分泌的分子标志物(例如PEDF)的酶免疫测定。

因此，根据本发明的另一个方面，提供用于制备视网膜上皮细胞的方法，包括：

(a)在含有分化剂的培养基中培养多能干细胞以制备分化细胞，其中所述培养基不含转化生长因子β(TGFβ)超家族的成员；

(b)在含有转化生长因子β(TGFβ)超家族的成员和分化剂的培养基中培养分化细胞以制备进一步分化为RPE谱系的细胞；

(c)分析来自进一步分化为RPE谱系的细胞的色素上皮衍生因子(PEDF)的分泌；和

(d)在含有分化剂的培养基中培养进一步分化为RPE谱系的细胞以制备RPE细胞，其中所述培养基不含转化生长因子β(TGFβ)超家族的成员，其中当PEDF高于预定水平时进行步骤(d)。

优选地，当PEDF水平高于100ng/ml/天、200ng/ml/天、300ng/ml/天、400ng/ml/天或500ng/ml/天时进行步骤(d)。

在分化过程期间或之后测定细胞效力的另一种方法是分析屏障功能和极化的PEDF和VEGF分泌，如本文以下实施例4所述。

一旦细胞被促进成RPE细胞，它们可以被选择和/或扩增。

根据一个具体的实施方案，选择是基于阴性选择，即移除非RPE细胞。这可以通过移除非色素细胞或移除非多角形细胞或通过使用表面标志物机械进行。

根据另一个实施方案，选择是基于阳性选择，即基于形态的选择(例如色素细胞和/或多角形细胞)。这可以通过视觉分析或使用表面标志物来进行。

还根据另一个实施方案，选择首先基于阴性选择，然后基于阳性选择。

RPE细胞的扩增可以在细胞外基质(例如明胶、胶原或聚-D-赖氨酸和核层蛋白)上进行。为了扩增，可以在无血清KOM、含血清的培养基(例如DMEM+20％)或Nuristem培养基(06-5102-01-lA Biological Industries)中培养细胞。任选地，可以在扩增阶段期间将细胞暴露于浓度为1-100mM、5-50mM、5-20mM,如10mM的烟碱。在这些培养条件下，色素细胞减少色素沉着并获得纤维样形态。进一步延长培养并增殖为高密度培养物之后，细胞重新获得特征性的多角形形态，优选的也获得RPE细胞的色素沉着。

RPE细胞可以在悬浮液或在单层中扩增。可以通过本领域技术人员熟知的方法将单层培养物中RPE细胞的扩增改进为生物反应器中的大规模扩增。

根据本文所述的方法制备的RPE细胞群可以根据很多不同参数来表征。

因此，例如所得RPE细胞的形状是多角形并且是着色的。

根据一个实施方案，所得RPE细胞群的至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％细胞共表达前黑素小体蛋白(PMEL17)和细胞视黄醛结合蛋白(CRALBP)。

施用后，本文所述的细胞能够形成单层(如图27C所示)。

根据一个实施方案，单层中的细胞的跨上皮电阻大于100ohms。

优选地，细胞的跨上皮电阻大于150、200、250、300、300、400、500、600、700、800或甚至大于900ohms。

根据一个具体的实施方案，TEER为100-1000ohms,更优选为100-900ohms，例如为200-900ohms、300-800ohms、300-700ohms、400-800ohms或400-700ohms。

用于测量跨上皮电阻(TEER)的设备是本领域已知的。用于测量TEER的示例性设置如图28所示。

将理解，本文所公开的细胞群不含未分化的人胚胎干细胞。根据一个实施方案，例如通过FACS测量，少于1:250,000个细胞是Oct4⁺TRA-1-60⁺细胞。如通过PCR测量，细胞也不表达或下调GDF3或TDGF相对于hESC的表达。

表征本文所公开的细胞群的另一种方式是通过标志物表达。因此，例如通过免疫染色测定，至少80％、85％或90％细胞表达Bestrophin1。根据一个实施方案，90-95％的细胞表达bestrophin。

根据另一个实施方案，如通过免疫染色测量，至少80％、85％、87％、89％或90％细胞表达小眼畸形相关转录因子(MITF)。例如，85-95％的细胞表达MITF。

根据另一个实施方案，如通过FACS测量，至少50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、87％、89％或90％细胞表达配对盒基因6(PAX-6)。

本文所述的细胞还可以根据其分泌因子的量和/或类型来表征。因此，根据一个实施方案，如ELISA测量，细胞优选分泌超过500、750、1000或甚至2000ng色素上皮衍生因子(PEDF)/ml/天(例如在培养14天后)。

将理解，本文制备的RPE细胞以极化方式分泌PEDF和血管内皮生长因子(VEGF)。根据一个具体的实施方案，顶端分泌PEDF:底端分泌PEDF的比例大于1。根据一个具体的实施方案，顶端分泌PEDF:底端分泌PEDF的比例大于2。根据一个具体的实施方案，顶端分泌PEDF:底端分泌PEDF的比例大于3。此外，底端分泌VEGF:顶端分泌VEGF的比例大于1。根据一个具体的实施方案，底端分泌VEGF:顶端分泌VEGF的比例大于1.5、2或2.5。

本发明的细胞分泌其他因子，包括例如血管生成素、免疫调节因子IL-6、sgp130、MIF、sTNF-R1、sTRAIL-R3、MCP-1和骨保护素、细胞外基质调节剂TIMP-1和TIMP-2以及蛋白质Ax1。

根据另一个方面，细胞群的至少80％细胞共表达前黑素小体蛋白(PMEL17)和细胞视黄醛结合蛋白(CRALBP)，且另一部分(至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％)的细胞分泌/脱落以下每一个：血管生成素、金属蛋白酶2的组织抑制剂(TIMP 2)、可溶性糖蛋白130(sgp130)和可溶形式的肿瘤坏死因子-α的普遍存在的膜受体1(sTNF-R1)。

将理解，在一些情况下，共表达前黑素小体蛋白(PMEL17)和细胞视黄醛结合蛋白(CRALBP)的所有细胞也分泌/脱落以下每一个：血管生成素、金属蛋白酶2的组织抑制剂(TIMP 2)、可溶性糖蛋白130(sgp130)和可溶形式的肿瘤坏死因子-α的普遍存在的膜受体1(sTNF-R1)。

在其他情况下，共表达前黑素小体蛋白(PMEL17)和细胞视黄醛结合蛋白(CRALBP)的大多数(超过50％、60％、70％、80％、90％)细胞也分泌/脱落以下每一个：血管生成素、金属蛋白酶2的组织抑制剂(TIMP 2)、可溶性糖蛋白130(sgp130)和可溶形式的肿瘤坏死因子-α的普遍存在的膜受体1(sTNF-R1)。

本文制备的RPE细胞优选以极化方式分泌血管生成素、TIMP2、sgp130和sTNF-R1。

根据一个具体的实施方案，顶端分泌sgp130:底端分泌sgp130的比例大于1。根据一个具体的实施方案，顶端分泌sgp130:底端分泌sgp130的比例大于2。根据一个具体的实施方案，顶端分泌sgp130:底端分泌sgp130的比例大于3。

此外，顶端sTNF-R1:底端sTNF-R1的比例大于1。根据一个具体的实施方案，顶端sTNF-R1:底端sTNF-R1的比例大于2。根据一个具体的实施方案，顶端sTNF-R1:底端sTNF-R1的比例大于3。

此外，底端分泌血管生成素:顶端分泌血管生成素的比例大于1。根据一个具体的实施方案，底端分泌血管生成素:顶端分泌血管生成素的比例大于1.5、2、2.5或3。

此外，顶端分泌TIMP2:底端分泌TIMP2的比例大于1。根据一个具体的实施方案，顶端分泌TIMP2:底端分泌TIMP2的比例大于2。根据一个具体的实施方案，顶端分泌TIMP2:底端分泌TIMP2的比例大于3。

细胞的稳定性是另一个表征特征。因此，例如，在2-8℃孵育6小时、8小时、10小时、12小时或甚至24小时后，细胞中PEDF的分泌量仍然稳定。此外，在2-8℃孵育6小时、8小时、10小时、12小时或甚至24小时后，PEDF和VEGF的极化分泌仍然稳定。此外，在2-8℃孵育6小时、8小时、10小时、12小时或甚至24小时后，细胞的TEER仍然稳定。

在另一个实施方案中，细胞通过其疗效来表征。因此，例如，本发明人已经证明，在视网膜下施用后，细胞群能够拯救RCS大鼠的视觉灵敏度。此外，在视网膜下施用后，细胞群能够拯救RCS大鼠的感光器(例如视锥细胞)长达180天(在一些实施方案中至少180天)。

本领域技术人员将理解，RPE细胞的衍生物具有很大的益处。它们可以用作用于开发新药物的离体模型，以促进RPE细胞存活、再生和功能。RPE细胞可用于高通量筛选对RPE细胞具有毒性或再生作用的化合物。它们可用于揭示对感光器细胞的发育、分化、维持、存活和功能重要的机制、新基因、可溶性或膜结合因子。

RPE细胞也可以作为用于移植、补充和支持视网膜退化中功能异常或退化的RPE细胞的RPE细胞的无限来源。此外，在移植后眼睛和视网膜中，遗传修饰的RPE细胞可以用作携带和表达基因的载体。

通过本公开的方法产生的RPE细胞可以用于这种细胞的大规模和/或长期培养。为此，本发明的方法将在适于大规模生产细胞的生物反应器和/或细胞培养系统中进行，其中根据本发明培养未分化的hSC。在生物反应器和/或细胞培养系统中培养细胞的一般要求是本领域技术人员所熟知的。

可以通过本领域已知的各种方法来收获细胞。非限制性实例包括机械解剖和用木瓜蛋白酶或胰蛋白酶(例如TrypLE Select)的分离。本领域已知的其他方法也适用。

如本文所述制备的RPE细胞可以植入受试者眼睛的各靶标位点。根据一个实施方案，RPE细胞移植到眼睛的视网膜下空间，其是RPE的通常解剖位置(在感光器外节段和脉络膜之间)。此外，取决于细胞的迁移能力和/或阳性旁分泌效应，可以考虑移植到另外的眼部隔室中，包括内部或外部视网膜、视网膜周围和脉络膜内。

可以用本文所述的RPE细胞治疗的视网膜疾病包括但不限于视网膜色素变性、视网膜息肉、格子样变性、Best疾病和年龄相关性黄斑变性(AMD)。

此外，移植可以通过本领域已知的各种技术进行。用于进行RPE移植的方法描述于例如美国专利号5,962,027、6,045,791和5,941,250，以及Eye Graefes Arch Clin ExpOpthalmol March 1997；235(3):149-58；Biochem Biophys Res Commun Feb.24,2000；268(3):842-6；Opthalmic Surg February 1991；22(2):102-8。用于进行角膜移植的方法描述于例如美国专利号5,755,785以及Eye 1995；9(Pt 6Su):6-12；Curr Opin OpthalmolAugust 1992；3(4):473-81；Ophthalmic Surg Lasers April1998；29(4):305-8；Ophthalmology April 2000；107(4):719-24；and Jpn J Ophthalmol November-December1999；43(6):502-8。如果主要使用旁分泌效应，也可将细胞递送并保持在包封于半透性容器内的眼睛中，这也将减少细胞暴露于宿主免疫系统(Neurotech USA CNTF deliverysystem；PNAS March 7,2006vol.103(10)3896-3901)。

根据一个实施方案，通过平行玻璃体切除手术，然后通过小视网膜开口将细胞递送至视网膜下空间或通过直接注射进行移植。或者，可以通过经巩膜、经脉络膜的方法将细胞递送至视网膜下空间。此外，可以直接经巩膜内注射到玻璃体空间或者递送到靠近睫状体的前视网膜周围。

可以各种形式移植RPE细胞。例如，可以以下形式将RPE细胞引入靶标位点：细胞悬浮液、或粘附到基质上、细胞外基质或底物如生物可降解的聚合物，或其组合。RPE细胞液可以和其他视网膜细胞例如感光器一起移植(共移植)。

因此，本发明还涉及本文所述的RPE细胞的药物组合物。组合物优选适用于植入眼睛。因此，例如，RPE细胞可以配制为眼内灌洗液，例如BSS plus^TM。

预期在从该申请成熟的专利的生命周期中，将开发许多相关技术用于制备RPE细胞，术语RPE细胞旨在先验地包括所有这些新技术。

如本文所用，术语“约”是指±10％。

术语“包含(comprise)”、“含有(comprising)”、“包括(include)”、“包括(including)”、“具有(having)”及其结合是指“包括但不限于”。

术语“由…组成”是指“包括且限于”。

术语“基本上由…组成”是指组合物、方法或结构可以包括其他成分、步骤和/或部分，但仅当所述其他成分、步骤和/或部分不会实质上改变要求保护的组合物、方法或结构的基本和新颖的特征时。

如本文所用，除非上下文清楚地另有说明，单数形式“一”、“一个(an)”和“一个(the)”包括复数形式。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可以包括多种化合物，包括其混合物。

贯穿本申请，本发明的各种实施方案可以以范围形式呈现。应当理解，这种范围形式的描述仅仅是为方便简要起见，不应当理解为对本发明范围的僵化限制。因此，应当认为对一个范围的描述具体地公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，应当认为对一个范围的描述如1-6具体地公开了子范围如1-3、1-4、1-5、2-4、2-6、3-6等，以及该范围内的单个数值例如1、2、3、4、5和6。无论范围的广度如何，这都适用。

如本文所用，术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于化学、药理学、生物、生化和医学领域的从业者已知的或容易从已知的方式、手段、技术和程序开发的那些方式、手段、技术和程序。

如本文所用，术语“治疗”包括消除、基本上抑制、减缓或逆转疾病的进展，基本上缓解病症的临床或美学症状或基本上预防病症的临床或美学症状的出现。

将理解，为清楚而在不同实施方案的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方案中组合提供。反之，为简要而在单个实施方案的上下文中描述的本发明的各种特征可以分开提供，或以任何合适的子组合提供，或如适于本发明的任何其他所述的实施方案提供。各种实施方案的上下文中所描述的某些特征不应被认为是那些实施方案的必要特征，除非该实施方案在没有那些元素的情况下不能实施。

如上所述和如下权利要求部分所要求保护的本发明的各种实施方案和方面在以下实施例中找到实验支持。

具体实施方式

现在参考以下实施例，其与上述说明一起以非限制性的方式阐述本发明的一些实施方案。

通常，本文使用的命名法和本发明中使用的实验室程序包括分子、生化、微生物和重组DNA技术。此类技术在文献中有详细解释。参见例如，"Molecular Cloning:Alaboratory Manual"Sambrook et al.,(1989)；"Current Protocols in MolecularBiology"Volumes I-III Ausubel,R.M.,ed.(1994)；Ausubel等,"Current Protocols inMolecular Biology",John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal,"APractical Guide to Molecular Cloning",John Wiley&Sons,New York(1988)；Watson等,"Recombinant DNA",Scientific American Books,New York；Birren et al.(eds)"Genome Analysis:A Laboratory Manual Series",Vols.1-4,Cold Spring HarborLaboratory Press,New York(1998)；美国专利号4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中所示的方法；"Cell Biology:A Laboratory Handbook",VolumesI-III Cellis,J.E.,ed.(1994)；"Culture of Animal Cells-A Manual of BasicTechnique"by Freshney,Wiley-Liss,N.Y.(1994),Third Edition；"Current Protocolsin Immunology"Volumes I-III Coligan J.E.,ed.(1994)；Stites等(eds),"Basic andClinical Immunology"(8th Edition),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994)；Mishell andShiigi(eds),"Selected Methods in Cellular Immunology",W.H.Freeman and Co.,NewYork(1980)；可用的免疫测定在专利和科学文献中有广泛描述,参见例如美国专利号3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；"Oligonucleotide Synthesis"Gait,M.J.,ed.(1984)；"Nucleic AcidHybridization"Hames,B.D.,and Higgins S.J.,eds.(1985)；"Transcription andTranslation"Hames,B.D.,and Higgins S.J.,eds.(1984)；"Animal Cell Culture"Freshney,R.I.,ed.(1986)；"Immobilized Cells and Enzymes"IRL Press,(1986)；"APractical Guide to Molecular Cloning"Perbal,B.,(1984)and"Methods inEnzymology"Vol.1-317,Academic Press；"PCR Protocols:A Guide To Methods AndApplications",Academic Press,San Diego,CA(1990)；Marshak等,"Strategies forProtein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual"CSHLPress(1996)，所有这些都通过引用并入，如同在此完全阐述的那样。本文档中提供了其他一般参考。认为其中的程序在本领域中是众所周知的，并且为了读者的便利而提供。其中包含的所有信息通过引用并入本文。

实施例1

CRALBP/PMEL17双染色FACS方法的定量

本研究的目的是通过在至少3个测试日内的最少6次独立掺加试验(spikingassay)证明该方法的准确度和精确度来验证CRALBP/PMEL17双染色FACS方法。使用批次5C作为阳性对照细胞和HAD-C 102-hESC作为阴性对照细胞进行测定鉴定。将掺入hESC的已知量的RPE(5C)的校准曲线用于测试不同掺加点(spiking point)的准确度和精确度。所有点的预期准确度和精度都高达25％。

染色方案：根据赞助商的方案，将从冻存的hESC库取出的阴性对照hESC细胞在Nutristem(含有HSA)中解冻。根据赞助商的方案，将阳性对照RPE细胞母液：批次5C细胞(参考线)在20％HS-DMEM中解冻。将解冻的5C和HAD-C102 hESC离心，重悬于1ml PBS(-)，用35μM细胞过滤器过滤，并用台盼蓝计数。将PBS(-)中的细胞浓度调节为0.73x10⁶-10⁶个细胞/ml。将1μl/ml FVS450加入各细胞悬浮液，然后旋涡振荡，并在37℃孵育6分钟。将FVS450用0.1％BSA洗涤，并重悬于0.1％BSA-Fc-阻断液(在RT下5分钟)以阻断细胞上的所有Fc-表位。然后将细胞用PBS(-)洗涤，并在80％甲醇中固定(4℃下5分钟)。将固定的细胞用PBS(-)洗涤一次，用0.1％PBS-T洗涤一次，并用0.1％PBS-T透化(在RT下20分钟)。在RT下用10％正常山羊血清(NGS)阻断溶液(200,000个细胞/50μl)替换透化溶液至少30分钟(最多一个小时)。在孵育期间制备质量样品管(QS)，并在阻断结束时将细胞分开并免疫染色。将细胞与一级抗体孵育30分钟，然后用0.1％PBS-T洗涤三次，与二级抗体孵育30分钟，并用0.1％PBS-T洗涤三次。

阴性和阳性对照细胞用活力染色剂FVS450染色、固定、阻断和透化。然后，基于每个群体的台盼蓝活力细胞计数，产生阴性对照hESCs中4种浓度(hESC中的25％、50％、75％、95％RPE)的已知量的阳性对照RPE(5C)细胞的校准曲线。用RPE标志物CRALBP和PMEL17特异性的一级单克隆抗体对阴性和阳性对照细胞和混合群体进行免疫染色，然后用匹配的二级抗体(分别为抗小鼠-FITC和抗兔-Alexa Fluor 647)染色。用FACS分析染色细胞以测量活的单细胞门控CRALBP+MEL17+细胞的百分比。

结果

准确度：从4个水平的掺加RPE(25％、50％、75％和95％)的测试结果测定试验的准确度。RPE母液(5C)的准确度针对潜在的100％RPE细胞而测定。通过6次独立运行/测定来分析各水平值。

预期准确度达到25％的情况下，认为50％浓度水平是定量下限(50％水平的范围是-8.41至20.14；75％和99.5％水平的范围是-5.32至6.88)。

对于高达25％的相对偏差，这些结果符合预期结果，表明试验用于测定浓度范围为50-99.5％的CRALBP+PMEL17+双阳性细胞是准确的。由于5C产生99.5％CRALBP+PMEL17+双阳性RPE细胞，不能保证对于结果>99.5％，相对偏差小于25％。

表1

中间精确度：从一个操作者进行的6次测定的结果测定该试验的中间精确度。在各试验中，测定单个活RPE的百分比，并计算％CY。表2总结了测试结果。如示出的，所有浓度水平的％CY均低于20％，且可以用足够精确度测量。浓度水平25％、50％、75％、95％和100％RPE的％CY分别是16.14％、10.61％、5.10％、1.17％和0.34％。这些结果满足对于精确度的预期值。在所有浓度，测量的RPE百分比在预期值的20％之内。这些结果表明，该试验用于测定浓度范围为25-99.5％的RPE是精确的。

表2

重复性：在3次运行(#2、#3和#4)中测试样品的重复性，其中SC样品重复并排染色两次并获得。结果证实，实验内获得的样品身份是可重复的，且样品间是一致的。

线性/范围：如图1所示，用发现为准确且精确的数据测量线性。在测试的试验范围(50％-100％)，目标(掺加)和测量结果之间的回归系数是0.99。因此，显示可接受的准确度和精确度以及线性的方法的范围是50％至99.5％RPE细胞之间的范围，其涵盖测试样品的预期范围。

阳性对照细胞：CRALBP/PMEL17双阳性细胞的临时水平设定为等于或大于95％。

阴性对照细胞：hESC的CRALBP/PMEL17双阳性细胞的临时水平设定为等于或小于2％。

稳定性：结果表明，在1天和4天后，染色样品在4℃也是稳定的，且准确度维持在预期的可接受标准内，因此在样品制备的96小时内可以获取数据。

结论

本文所示的结果表明，所公开的方法是合格的，并且适合于在最终产品中以及在生产过程的不同阶段用于体外测定RPE纯度的预期用途，其中在50％-99.5％的RPE细胞范围内，相对偏差的准确度<25％，％CV精确度<20％。

实施例2

评估纯度的水平

开发了用于评估RPE细胞中人视网膜色素上皮细胞(RPE)纯度以及非RPE细胞杂质的水平的基于FACS的方法。视觉周期成分之一的细胞视黄醛结合蛋白(CRALBP)被生物信息识别为成熟RPE细胞的独特标志物。使用CRALBP特异性单克隆抗体的初步研究已经显示根据本文所述的方法产生的RPE细胞的纯度高于98％。这些结果进一步被RPE中发现的黑素体标志物PMEL17的免疫染色所支持。此外，与一些RPE特异性标志物不同，CRALBP在黑素细胞(可能的神经嵴细胞污染)中不表达。

测试样品和对照：人原代黑素细胞(ATCC,PCS-200-013)用作CRALBP的阴性对照，且用作PMEL17、黑素体中富集的I型跨膜糖蛋白(黑色素颗粒)的阳性对照。P29的HADC102-hESC(亲本系)用作CRALBP和PMEL17两者的阴性对照细胞。临床级的细胞(批次2A)和研究级的(在GMP中如模拟生产一样生产；模拟IV D16)用作测试样品。如实施例3所述制备细胞。

免疫染色和FACS分析：将细胞解冻，并用可固定活性染料(FVS450)(BD 562247)染色，用80％甲醇固定，用一级小鼠抗CRALBP(克隆B2,Abeam ab15051)或其同型对照的小鼠IgG2a(Abeam ab170191)以及兔抗人PMEL17(克隆EPR4864,Abeam ab137062)免疫染色，然后分别用二级抗体山羊抗小鼠(Dako F0479)和山羊抗兔(Jackson 111-606-144)免疫染色。

用验证的Navios流式细胞仪(Beckman Coulter)获取FACS数据，并使用FlowJo7.6进行分析。

结果

使用抗CRALBP单克隆抗体的初始FACS数据表明，的纯度水平高于98％。对于独特的RPE特异性标志物CRALBP，作为可能的神经嵴细胞污染的黑素细胞为阴性(1.7％)。如预期的，亲本系HADC102-hESC对于CRALBP为阴性(0.2％)。

用CRALBP和PMEL17双重染色后，的纯度水平仍然高于98％(图10)。如预期的，黑素细胞对于PMEL17染色为阳性，但对于双标记的群体则为阴性(-1％)。HADC102-hESC对于CRALBP和PMEL17染色为阴性(0.07％)。

实施例3

制备过程和过程控制的描述

从在经过辐射的无异种GMP级人脐带成纤维细胞饲养器生长的无异种GMP级HAD-C102hESC系制备临床级人成纤维细胞饲养细胞系(CRD008；MCB)和工作细胞库(WCB)在良好生产规范(GMP)和无异种条件下生产，经过适当测试、表征和保藏。然后将这些用于在GMP和无异种条件下从剩余人囊胚衍生临床级hESC系HAD-C102。

在生产的初始阶段，将hESC作为克隆在辐射的饲养器上扩增。然后将其转移至悬浮培养基以开始定向方式的分化。形成球状体(SB)，然后在连续定向分化条件下作为粘附培养物铺板，以向神经命运，随后向RPE细胞分化。在分化阶段结束时，物理切除非色素区域，并对色素细胞进行酶促收集、接种和扩增。在第2代收获纯化的hESC衍生的RPE细胞(DS)，并立即加工成DP。制备过程的持续时间取决于hESC的生长率(从解冻开始～2个月)，总计通常持续4-5个月。

以下简述制备过程的每一个步骤，包括过程中的质量控制(QS)。

步骤1-3：制备人脐带成纤维细胞饲养工作细胞库(WCB)。将第3-4代的一小瓶人脐带饲养母细胞库(MCB)(CRD008-MCB)解冻，在补充有20％人血清(14-498E,Lonza)且经辐射(γ细胞,220Exel,MDS Nordion 3500rads)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM,SH30081.01,Hyclone)上扩增，并在第7-8代冻存以制备工作细胞库(WCB)。冻存前，测试来自饲养细胞培养物的样品的无菌性、支原体和鲎阿米巴样细胞溶解物(LAL)、形态学、核型、细胞数量和活力。此外，解冻后，确认它们对于MCB的身份，它们无法增殖以及支持未分化的HAD-C102-hESC生长的能力。如果WCB通过所有QC测试，该库被释放用于扩增hESC。

生产步骤1-3如图12所示。

步骤4-5：扩增hESC。将单瓶人脐带成纤维细胞WCB(CRD008-WCB8或CRD008-WCB9)解冻，在补充有20％人血清(14-498E,Lonza)的DMEM(SH30081.01，Hyclone)中以70,000-100,000细胞/ml/板的浓度铺板至用重组人明胶(RhG 100-001，Fibrogen)覆盖的中心孔板中。将细胞在37℃、5％CO₂下孵育过夜以允许成纤维细胞粘附。1-4天后，将来自HAD-C102-hESC MCB的样品解冻，并于37℃、5％CO₂下在含有生长因子bFGF和TGF-β(05-102-1A,Biological Industries,Israel)的Nutristem"Plus"培养基(为GMP级且无异种)中铺板到饲养细胞上面6-7天。在第6-7天，机械破坏hESC培养物(使用无菌尖端或一次性无菌干细胞工具；14602 Swemed)，并以70,000-100,000个细胞/板的浓度传代至额外的新鲜制备的含有饲养细胞的板中。每周重复传代数次，达到必要量的hESC以启动分化(图13，步骤4-5)。使用之前，测试扩增HAD-C102-hESC的无菌性、支原体、LAL、核型以及对MCB的身份。此外，确认它们的多能形态外观和多能标志物(TRA-1-60、Oct4和碱性磷酸酶)的统一表达(图2，步骤5)。生产步骤4-5如图13所示。

步骤6-13：分化为RPE细胞。在6cm细胞培养板中，用胶原酶(4152,Worthington)酶促处理扩增的HAD-C102-hESC以再次扩增。然后将扩增的HAD-C102-hESC用于衍生DS。

通过以下启动各批次的分化：在补充有10mM烟碱(N-5535,Sigma)的Nutristem"Minus"培养基(其不含生长因子bFGF和TGF-β；06-5102-01-lA BiologicalIndustries,Special Order)存在下，将步骤6培养物的胶原酶A收获的HAD-C102-hESC簇机械转移至不含饲养器的非粘附6cm Hydrocell培养皿(图14，步骤7)。然后在低氧气氛围(5％)条件(37℃,5％CO₂)下，将板培养多达一周以允许制备球状体。然后收集悬浮液中的一周大的球状体，将其通过吹打温和分离，并转移至人核层蛋白(511,Biolamina)涂布的6孔板上，在补充有10mM烟碱的Nutristem"Minus"培养基存在下，在低氧气氛围(5％)下再生长一周(图14，步骤8)。将细胞在低氧气(5％)氛围下继续生长额外的4周：两周是在补充有10mM烟碱和140ng/ml激活素A(G-120-14E,Peprotech)的Nutristem"Minus"培养基存在下(图14，步骤9)；之后两周是在仅补充有10mM烟碱的Nutristem"Minus"培养基存在下(图14，步骤10)。当多角形细胞斑出现明显的轻度色素沉着区域时，将板转移回正常氧气(20％)氛围(37℃,5％CO₂)，并在含有10mM烟碱的Nutristem"Minus"培养基存在下生长多达2周(图14，步骤11)。多达2周后，具有特征性色素沉着的扩增多角形斑在非色素细胞区域内变得明显(图14，步骤12)，将剩余的色素细胞分离，并在用TrypLE Select(12563-011,Invitrogen)于37℃处理15分钟后手动收集(图14，步骤13)。生产步骤6-13如图14所示。

步骤14-17：扩增细胞。然后将色素细胞转移至6孔明胶涂布的板(0.5-lx10⁶个细胞/板；P0)，在补充有20％人血清(14-498E,Lonza)的DMEM(SH30081.01,Hyclone)存在下生长2-3天(图15，步骤14)。用Nutristem"Minus"培养基替换DMEM，将细胞生长2-3周，直到板被轻度着色的多角形细胞覆盖(图15，步骤14)。然后将这些P0细胞在明胶覆盖的烧瓶中扩增额外的两代(P1、P2)。在37℃的TrypLE Select处理后，收获P0和P1的细胞，洗涤，并在补充有20％人血清的DMEM存在下在明胶覆盖的烧瓶中培养2-3天。用Nutristem"Minus"培养基替换DMEM，将细胞生长2-3周，直到板被轻度着色的多角形细胞覆盖(图15，步骤15-16)。然后在37℃的TrypLE Select处理后，收获T175烧瓶中生长的P2细胞，重悬于补充有20％人血清的DMEM中，合并，并计数。

取各批次生长培养基的样品用于无菌性、支原体和LAL测试。观察并记录细胞形态(图15，步骤17)。生产步骤14-17如图15所示。

实施例4

过程控制点

图16示出了IPC点。以下描述选择用于评估生产过程中hESC杂质和RPE纯度的取样点：

IPC点1：在分化之前具有正常核型的机械扩增的HAD-C102hESC。这是预期hESC水平最高的起始材料。加入这个点以评估分化前的最高hESC水平。

IPC点2：分化前胶原酶扩增的HAD-C102hESC。在该阶段，预期一些分化，从而表达Oct3和TRA-1-60的细胞的水平和GDF3和TDGF的表达水平降低。加入这个点以评估非定向分化阶段期间的hESC杂质。

IPC点3：在烟碱存在下，在无饲养器条件下诱导hESC分化后一周产生的球状体。在该分化的早期阶段，预期分化期间hESC杂质为最高水平，从而预期这一评估将表明安全问题的最高水平。

IPC点4：激活素A处理结束时的细胞。激活素A指导分化为RPE细胞。在这个点，预期HESC杂质大幅降低且RPE标志物表达大量增加。加入这个点以监测hESC分化为RPE。

IPC点5-7：从色素区(IPC点7)分离非色素区(IPC点6)之前和之后的分化过程结束时的细胞。预期IPC点5和6含有细胞杂质，而样品7代表其扩增前分化过程结束时的产物。在样品6中发现的细胞污染物可能在样品7中少量存在，并且在产物中可能更少量存在。

IPC点8：P0色素细胞。扩增2-3周的在分化过程结束时的色素细胞。这些细胞代表在生产过程结束之前两个阶段的产物。

IPC点9：P1色素细胞。扩增2-3周的P0细胞。这些细胞代表在生产过程结束之前一个阶段的产物。

IPC点10：冻存前的P2色素细胞。收集并合并扩增2-3周的P1细胞。这些细胞代表冻存前的原料药(DS)。

IPC点11：冻存的P2色素细胞。这些细胞代表药物产品(DP)。贯穿生产，在所有取样点，收集细胞培养基用于评估已知从RPE细胞分泌的色素上皮衍生因子(PEDF)的分泌。

结果

定量TRA-l-60₊Oct4₊hESC：用高灵敏的强大Oct4/TRA-1-60双染色FACS方法测定在生产过程中收集的各样品的hESC水平。在移除饲养器和支持多能细胞生长的生长因子(TGFβ和bFGF)后一周，在支持早期神经/眼球分化的生长条件下，仅有0.0106-2.7％的TRA-1-60₊Oct4₊细胞(IPC点3,球状体)。添加促进RPE分化的激活素A之后，TRA-1-60₊Oct4₊细胞的水平进一步降低至0.00048-0.0168％(IPC点4,激活素结束时)，在非色素细胞切除后分化结束时，TRA-1-60+Oct4+细胞的水平为0.00033-0.03754％(IPC点7,色素细胞)。在生产过程结束前两个阶段的P0，检测到TRA-1-60₊Oct4₊细胞的水平为0.00009-0.00108％(低于LOD-接近LLOQ)(IPC点8)。在P1(IPC点9)、冻存前的P2(原料药；IPC点10)和冻存后的P2(DP；IPC点11)的TRA-1-60₊Oct4₊细胞的水平低于分析LLOQ(即分别为0.00004-0.00047％、0.00000-0.00016％和0.00000-0.00020％)。

多能hESC标志物GDF3和TDGF的相对表达：分析生产过程中各IPC点的多能基因GDF3和TDGF的相对表达。存在GDF3和TDGF的表达水平的逐渐降低，这与分化过程中TRA-1-60+Oct4+细胞的数量逐渐减少有关。在生产过程结束前两个阶段的P0、P1以及冻存之前(原料药)和之后(药物产品)的P2，GDF3和TDGF的表达水平与阴性对照5C细胞中观察的表达水平相似。

定量CRALBP₊PMEL17₊细胞：分别在分化阶段结束时、在P0和P2(IPC点8和11)进行测量RPE纯度的CRALBP₊PMEL17₊细胞评估。如表3和图17所示，在生产过程结束前两个阶段的P0(IPC点8)的CRALBP₊PMEL17₊RPE纯度为98.53-98.83％。在冻存之后的P2检测到类似水平的RPE纯度(99.61-99.76％；IPC点11)(表3)。

表3

DP，药物产品。*测试冻存后的IPC点8。掺入hESC(HAD-C 102,阴性对照)的内部测定对照RPE细胞(5C,阳性对照)证明准确度误差<25％。

在模拟生产运行4和5时，Bestrophin 1、MITF和CRALBP免疫染色细胞的共聚焦成像：在分化阶段结束时(IPC点7)、在扩增阶段结束时(IPC点10，DS)和冻存后(IPC点11，DP)免疫染色细胞的RPE标志物Bestrophin 1、MITF、ZO-1和CRALBP。将手动分离的非色素细胞(IPC点6)铺板用于免疫染色，但其在固定期间从板脱落，因而不能被染色。铺板12天(仅在模拟5中，与正在进行生产的P0细胞平行)和28天的选择色素细胞(IPC点7)的所有测试RPE标志物染色均为阳性，且表达Bestrophin 1和MITF的细胞百分比分别为93％和93.3-96.5％。在以下阶段检测到类似水平的Bestrophin 1和MITF阳性细胞：P0(分别为94.9％和95.9％，仅在模拟4中测试)、冻存前P2、原料药(分别为92.2-92.75％和93.7-95.5％)，和冻存后P2、药物产品(分别为91.1-95.7％和83.8-94.9％，在模拟5中降低的MITF免疫染色表明随机选择的分析区的离群值)。在所有IPC7、10和11样品中检测到CRALBP(以及ZO-1)表达(图18)。

在模拟生产2、4和5时，RPE标志物Bestrophin 1、CRALBP和RPE65的相对表达：测量生产过程中各IPC点的RPE基因Bestrophin1、CRALBP和RPE65的相对表达。在生产过程中，存在Bestrophin1、CRALBP和RPE65的相对表达水平的逐渐升高。在指导向RPE细胞分化的激活素A处理结束时(IPC点4)，Bestrophin 1、CRALBP和RPE65的相对水平分别为685、36和325，与分化前机械传代的hESC中它们的相对水平相比高几倍(IPC点1；模拟4)。从分化阶段结束(IPC点5)至P1阶段(IPC点9)，Bestrophin 1、CRALBP和RPE65的相对表达水平达到峰值。在这些阶段，表达水平分别为5838-11841、211-299和5708-8687，与分化前机械传代的hESC中的水平相比高几倍(IPC点1)。

在模拟生产4和5时的形态评估：分析分化阶段结束时(IPC点5)的细胞形态以评估色素细胞的相对面积，并分析扩增阶段P0-P2(IPC点8-10)的细胞形态以验证融合的多角形形态。在切除非色素区域前的分化阶段结束时(IPC点5)评估的色素细胞相对面积在模拟4中为32.5％+13.5％(平均值+SD,n＝6孔板中的7个孔)，在模拟5中为60％+13％(平均值+SD,n＝6孔板中的7个孔)(参见图11的代表性图像)。选择并扩增色素细胞的区域。在扩增阶段结束时的P0(IPC点8)、P1(IPC点9)和P2(IPC点10)的形态表明密集培养物具有典型的多角形性状的上皮单层形态(图11)。

在模拟生产4和5的PEDF分泌和功效测量：在模拟生产4和5的各IPC点测量细胞培养基中已知从RPE细胞分泌的色素上皮衍生因子(PEDF)。如表4所示，hESC(IPC点1和2)和球状体(IPC点3；具有烟碱的第一周结束时)分泌的PEDF水平非常低，为4-79ng/mL/天。在指导向RPE细胞分化的激活素处理结束时(IPC点4)，分泌的PEDF水平为682-1038ng/mL/天，与球状体分泌的水平相比高31-37倍。在含有烟碱的正常氧气条件下孵育细胞之后(IPC点5)，观察到PEDF分泌进一步增加(2.2-4.6倍)至1482-4746ng/mL/天。在扩增阶段(P0-P2，分别是IPC8-10)，PEDF分泌水平为2187-8681ng/mL/天，在P0-P1达到峰值。

表4：在模拟生产4和5的PEDF分泌。

ND，未进行；NA，不适用；DS，原料药；DP，药物产品。

在RPE细胞之间产生的紧密连接可以产生血液-视网膜屏障和极化的PEDF和VEGF分泌。PEDF分泌至其作为抗血管生成和神经营养生长因子的顶侧。VEGF主要分泌至底侧，其中它作为脉络膜内皮上的促血管生成生长因子。在转移孔系统中测量P0结束时(IPC点8)、冻存前P2结束时(IPC点10)和冻存后P2结束时(IPC点11)的RPE极化(屏障功能和极化PEDF和VEGF分泌)。如表5所示，在所有IPC点证明屏障功能/跨上皮电阻(TEER)以及PEDF和VEGF的极化分泌。

表5

ND，未进行；DS，原料药；DP，药物产品。通过ELISA测量PEDF和VEGF。在其12孔板培养期间从细胞收集第14天的PEDF。然后将细胞转移至转移孔并培养6周，在此期间测量TEER以及在转移孔底侧和顶侧的VEGF和PEDF的分泌。

在模拟运行4和5中产生的RPE细胞的批次出厂试验：为验证在模拟运行4和5中产生的与GMP产生的相当，进行包括以下的小型批次出厂试验：在冻存前P2结束时的形态测试(IPC点10，DS)，以及在冻存后P2结束时(IPC点11，DP)的活力、总细胞数/冷冻瓶、身份(Bestrophin 1和MITF的表达)、hESC杂质和核型分析。模拟运行4和5中产生的通过了批次出厂标准。模拟运行2中产生的没有冻存，因而不能测试。

结论

在研究级条件下，用相同的GMP生产方法、无异种GMP级细胞(在经辐射的CRD008饲养器上生长的HAD-C 102 hESC)、无异种GMP级试剂和用于临床批次的GMP生产的GMP级实验室用品进行三次模拟生产运行(模拟运行2、4和5)。模拟生产2、4和5旨在评估生产中的hESC杂质水平，且模拟生产4和5还旨在鉴定过程中质量控制的重要性。

使用合格的TRA-1-60/Oct4双染色FACS方法(LOD为0.0004％,1/250,000且LLOQ为0.001％,1/100,000)和合格的流式细胞仪，在阴性选择的色素细胞中，在模拟5生产过程结束前三个阶段的分化阶段结束时观察到低于测定LOD的HESC杂质水平。在模拟运行2和4中，在使用核心设备流式细胞仪检测资质之前进行，hESC的杂质水平在生产过程结束前两个阶段低于测定LOD。为支持这一数据，定量RT-PCR分析显示多能hESC基因GDF3和TDGF的表达下调至与生产过程结束前两个阶段的阴性对照(5C细胞)相似的水平。

在生产结束前三个阶段(色素细胞的分离)进行的身份测试证实了分别由93％和96.5％的免疫染色细胞表达Bestrophin 1和MITF，以及表达CRALBP和ZO-1(未定量)。在阴性选择色素细胞的一个扩增周期之后，在一个阶段后(即P0，生产过程结束前2个阶段)通过FACS进行的RPE纯度测试表明>98.5％的细胞为CRALBP₊PMEL17₊双阳性。在药物产品中也检测到相似水平的RPE纯度(即>99.6％)。这些结果由以下支持：形态测试显示典型的多角形上皮单层形态，且定量RT-PCR分析显示RPE基因Bestrophin 1、CRALBP和RPE65的表达上调至与阳性对照(5C细胞)相似的水平。

在模拟运行4和5的生产过程的各阶段测量细胞培养基中已知从RPE细胞分泌的PEDF。在之前由Idelson等2009表明指导向RPE细胞分化的激活素A处理结束时(IPC点4)，分泌的PEDF水平相对于之前的生产步骤(诱导球状体)大量增加(模拟4中31倍，模拟5中37倍)。PEDF分泌水平持续增加，在P0-P1达到峰值(相对于激活素A后的水平增加1.7-5.8倍)。在分化过程结束时(IPC点5)评估色素细胞的相对面积被鉴定为用于评估RPE分化的另一个重要的质量控制措施。使用该测量值，观察到模拟4和5运行中色素细胞产量有2倍差异(模拟4中为32.5％，模拟5中为60％)，这与该阶段中观察到的PEDF分泌的类似差异有关(模拟4中为1482ng/ml/天，模拟5中为4746ng/ml/天)。

总之，早在生产过程结束之前的3个阶段就没有观察到TRA-1-60₊Oct4₊hESC杂质。这与以下有关：GDF3和TDGF的表达水平低，Bestrophin 1、CRALBP和RPE65的表达水平高，Bestrophin 1和MITF单个阳性细胞水平高，以及高的CRALBP+PMEL17+双阳性细胞(一个阶段后测试)。在关键生产阶段鉴定了重要安全性和功效IPC。

实施例5

功效评估

实验设置：本发明人检查了视网膜下移植如实施例4所述制备的RPE细胞是否能够延迟皇家外科医学院(RCS)大鼠模型中的RDD进展。

将25000、100000或200000个RPE细胞植入出生后第(P)21-23天(在感光器开始死亡之前)的RCS大鼠的一只眼睛的视网膜下空间；BSS+(Alcon)处理的和天然未处理动物作为对照。各组分为4个存活年龄：出生后第P60天、第P100天、第P150天和第P200天。眼底照相用于鉴别水泡形成并监测注射质量。还在P60、P100、P150和P200进行眼底镜检查。视觉跟踪用来测量所有动物在所有时间点(P60、P100、P150和P200)的视觉灵敏度。

在P60和P100评估所有研究组的焦点和全场ERG。在各动物的预定处死日，移除两只眼睛，在4％多聚甲醛中固定、冻存、并包埋在最佳切割温度化合物(OCT)中并冷冻切片。使用甲酚紫染色来鉴定和列举感光器结构的拯救。使用免疫荧光染色(IF)来鉴定移植细胞，评估它们的命运、它们的增殖以及它们吞噬感光器外节段的能力。此外，使用免疫荧光来测量宿主锥细胞的拯救。

以下表6总结了研究设计。

表6

材料和方法

细胞计数：在等分成合适的剂型浓度之前计数细胞。所有注射时间点的注射前细胞活力平均为94.0％+0.03。注射后的细胞活力平均为92.4％+0.02。

手术：使用逐渐减小的穿刺针：18、22、25和30通过结膜和巩膜进行小切口。使用角膜侧边缘穿刺来降低眼内压，减少注射细胞的出血。然后将玻璃移液管插入视网膜下空间，注射2μl悬浮液。然后缝合巩膜切口。首先通过人工观察视网膜下水泡，其随后通过使用眼底照相机(Micron III)拍照来确认细胞或单独的缓冲液(BSS+)的成功注射。

视动跟踪阈值：盲法测量并记录视动跟踪阈值。用重复测量的具有Fisher's LSD事后分析的ANOVA或单因素ANOVA来分析OKT数据。

视网膜电图(ERG)：测量两种形式的ERG：探索形式的焦点ERG(其中使用小的光点来刺激视网膜的局部区域)以及刺激整个视野的标准样式的全场ERG。

组织学和免疫组化：收获来自各动物的两只眼睛、固定、冷冻保护、包埋并冷冻。将冷冻块以12μm冷冻切片。获得约60张玻片，每张玻片含有4个切片。

甲酚紫：检查甲酚紫染色的切片：1)注射位点和缝合，2)感光器拯救的证据，3)移植细胞的证据，4)不良病理。对于各玻片，也记录大外核层厚度用于定量拯救。

免疫荧光(IF)：从在视网膜下空间含有与移植的人细胞的大小和形态相一致的细胞的甲酚紫染色切片选择用于IF的RPE细胞处理的眼睛玻片。此外，对宿主ONL的保护用作二级标准。所有IF染色均作为双重染色，其中DAPI用作背景细胞核染色。对于各次运行，使用至少一张来自每个细胞处理的动物的玻片。

用兔单克隆抗黑色素瘤gp100(PMEL17,克隆EPR4864；人特异性的,Abeam cat#abl37062)和小鼠单克隆抗细胞核标志物(HuNu,Clone 3E1.3,Millipore,cat#MAB4383)的共染色进行运行#1，用于检测人RPE和非RPE细胞。

用兔单克隆抗Ki67(Ki67；克隆EPR3610,人特异性的,Abeam,cat#ab92742)和抗细胞核标志物进行运行#2，用于检测人增殖细胞。

用兔多克隆抗大鼠锥细胞Arrestin(Millipore cat#abl5282)进行运行#3，以评估用于锥细胞计数的切片(参见小节6.8.3)。此外，用小鼠单克隆抗视紫红质(Clone Rho1D4,Millipore,MAB5356)和PMEL17染色选择的玻片，以鉴定含有宿主视紫红质/外节段的移植人细胞作为其吞噬活性的量度。

锥细胞计数：从所有细胞移植的眼睛和从年龄匹配的盐水注射对照获得的视网膜切片获取共焦z叠图像。在使用先前评估的甲酚紫染色切片评估的感光器拯救区域中选择细胞注射的眼睛的切片。通过3位观察者盲法计数锥细胞。然后将三个计数平均，并在剂量组和年龄之间比较计数。

视紫红质摄入：移植细胞采用的潜在拯救机制是摄入感光器外节段和脱落的碎片。移除碎片区降低了对感光器的毒性应激，从而有助于维持感光器存活。本文中，本发明人选择了特定动物用于评估基于细胞存活和感光器保护指数的RPE细胞的视紫红质摄入。该评估用免疫荧光进行。

结果

眼底成像：在细胞处理的眼睛尸检中收集的眼底图像显示视网膜的高度和低度色素区域，其对应于在手术期间形成视网膜下水泡的位置；细胞沉积在视网膜下空间的位置(图19A-C)。这些斑块区在BSS+注射或未注射的眼睛中不明显。

视动跟踪阈值：OKT阈值在所有年龄的所有细胞处理的组中被拯救(图20)。细胞处理组在所有年龄段优于未手术或盐水注射的眼睛。在低剂量(25K)和两个较高剂量(100K(p<0.0001)和200K(p<0.0001))之间有显著的剂量依赖效应，尤其是在较老的年龄，但没有观察到高剂量(200K)的OKT超过中间(100K)剂量的明显益处(p＝0.5646)。尽管OKT阈值在所有细胞处理组中被拯救，绝对视觉灵敏度值随时间缓慢下降。未处理和盐水注射动物的OKT阈值在研究过程中持续下降。BSS+注射眼睛和天然未处理组(p＝0.6068)以及未处理的眼睛没有区别。

焦点ERG：测量～P60的所有(n＝252)实验大鼠的焦点ERG。如图21A所示，用RPE细胞处理的个体动物表现良好，显著优于对照。

全场ERG：测量P60的125只RCS大鼠和P100的63只RCS大鼠的全场ERG。如图21B所示，用RPE细胞处理的个体动物表现良好，显著优于对照。

甲酚紫染色：图22A示出了甲酚紫染色切片的示例性照片。图22B示出了BSS+注射和细胞处理的(来自多个组的图像)眼睛的代表性图像。

测量外核层厚度(ONL)作为感光器拯救的主要指标。数据记录为各年龄的每个剂量组中存在的感光器核的最大数目(图23)。细胞处理组在P60、P100和P150的ONL厚度显著高于BSS+处理眼睛(全部p<0.0001)。在具有感光器拯救证据的动物百分比方面，P60的76-92％动物，P100的80-90％、P150的72-86％和P200的0-18％具有感光器证据。

免疫荧光：通过免疫荧光在各存活年龄的动物中阳性鉴定移植的RPE细胞(图24)。然而，具有鉴定的细胞的动物数量随年龄增加而降低。在最初未显示移植细胞的动物中重复染色额外的玻片导致鉴定出具有阳性细胞的额外动物，但不是在所有情况下。

尽管通过IF分析没有在所有动物中发现移植细胞，ONL厚度测量结果表明70-90％的细胞处理动物具有显著的感光器拯救，用OKT拯救证实，这表明大多数处理眼睛在一些点含有移植细胞。增殖标志物Ki67用于鉴定增殖的人细胞。没有观察到Ki67阳性人细胞(图24)。

锥细胞计数：接受细胞移植的动物中锥细胞计数显著优于对照眼睛(图25；对于各比较p＝<0.0001)。总之，在低剂量、中等剂量和高剂量细胞的锥细胞计数之间没有差异。图24示出了各年龄的代表性图像。

视紫红质摄入：在测试的各情况中(n＝6)，在移植的RPE细胞内观察到荧光标记的视紫红质(图26A-J)。这证实在移植后移植细胞确实摄入外节段碎片。

结论

当植入RCS大鼠的视网膜下空间时，在所有的测试年龄，RPE细胞相对于对照拯救RCS大鼠的视觉灵敏度。当移植物足够大或在可进行评估的视网膜区域时，ERG应答得到保护。移植后，在移植物区域中的杆状和锥状感光器被拯救长达180天。总而言之，这一数据表明，可长期维持宿主视网膜的功能和结构完整性。

因此，具有治疗人RPE细胞疾病如RP和AMD的巨大潜力。

实施例6

RPE细胞的稳定性

短期稳定性

制备BSS plus中的配制RPE细胞(如实施例4所述制备)，最终体积为600-1000μl/瓶。在时间点0、4、8和24小时测试短期稳定性。发现在所有时间点细胞均稳定。

对于所有剂量制剂，8小时孵育时间点的RPE细胞活力和细胞浓度是稳定的；以下浓度的平均活力百分比(+SD)如下：

-低浓度(70x10³/100μl BSS plus)，从时间点0小时的93％±5变化至时间点8小时的91％±1，降低不显著；

-高浓度(70x10³/100μl BSS plus)，从时间点0小时的92％±3变化至时间点8小时的91％±2，降低不显著.

对于测试的培养基浓度(250x10³/100μl BSS plus)，在各时间点之间没有显著变化。

对于所有时间点和配制剂量，从时间点0小时至8小时的总范围为88％-97％，当平均从时间点0小时(93％±3)和时间点8小时(91％±1)的所有结果时，发现降低2％。

在各时间点或配制剂量没有观察到细胞浓度的显著变化。细胞浓度在所有3个研究中没有变化，处理在一个批次的高剂量观察到少量降低。

不同剂量制剂的外观在所有测试时间点没有变化；细胞悬浮液不含外源颗粒和未分离的聚集体。

各配制的RPE细胞剂量的身份和纯度在所有测试的时间点稳定长达24小时，且在批次出厂标准内。在8小时(对于所有配制的RPE细胞剂量)，MITF和Bestrophin阳性细胞的水平范围分别为86-97％和90-94％，CRALBP₊PMEL17₊双阳性细胞的水平范围为98.35-99.64％。

配制的RPE细胞剂量在所有测试的时间点(4、8、24小时)维持其效力，两者均分泌高水平的PEDF并形成极化的RPE单层，其中PEDF的极化分泌主要是在顶侧，VEGF在底侧。测试的时间点8小时的结果：TEER为376-724ohms，PEDF的顶端对底端比例为2.77-5.70，VEGF的底端对顶端比例为2.04-3.88。

在所有孵育时间点，所有细胞剂量制剂保持无菌性。

这些结果支持当保存于2-8℃时，最终制剂中的细胞在所有临床剂量保持稳定至少8小时。基于收集的部分数据(身份、无菌性和中等剂量效力)，存在长达24小时的安全范围。

下表7总结了短期稳定性分析的结果。

表7

长期稳定性：将三个批次的RPE细胞在汽相液氮中冷冻。在冷冻日之后开始冻存中的长期稳定性测试。冷冻三年之后提供结果。测试以下参数：活力、细胞数、RPE身份(％Bestrophin 1和％MITF阳性细胞)、RPE纯度(FACS％CRALBP+PMEL17+RPE细胞)、效力(极化和PEDF分泌)、核型分析和无菌性。在各时间点，将所需数量的小瓶解冻，如本文所述制备分析所需的细胞。

下表8总结了长期稳定性分析的结果。

表8

结果

在三年期间，活力、总细胞数/瓶和RPE身份得到保持。此外，如所示的，数据证明效力和纯度水平与在保存前收集的细胞相似。

冻存后4年观察到正常核型。这表明目前为止，汽相中的长期储存对RPE基因组稳定性没有任何有害影响。

通过测试3个月的所有临床批次中不存在细菌/真菌生长来证明样品的无菌性。另一个批次在冻存后4年测试为阴性。基于这些一致的可接受的稳定性结果，目前为止覆盖三年的稳定性测试时间段，结论是当在汽相液氮中储存于<-180℃的温度时，RPE细胞产品保持稳定至少3年。

实施例7

安全性和生物分布

本研究的目的是评估向雄性和雌性OD-SCID小鼠视网膜下施用后，在6个月的研究时间内，RPE细胞(如实施例4所述制备)的存活、生物分布和安全性。

向NOD-SCID小鼠(NOD.CB 17-Prkdcscid)注射(注射时间为5-6周龄)BSS Plus(介质对照)或悬浮于1μl BSS Plus的两个剂量的RPE细胞：50x10³个细胞或100x10³个细胞(最大可行剂量)。用33G Hamilton针通过经玻璃体途径(建议的临床施用途径)施用RPE至视网膜下。向一只眼睛注射单剂量的50x10³个细胞或100x10³个细胞，另一只眼睛作为内部对照。每次给药期间包含来自各组的小鼠(雄性和雌性)。将预测试后纳入本研究的小鼠随机分配至各测试组。进行两次随机化。在施用介质/测试品之前，将按重量计的测量值随机化程序用于放入处理组。施用后，使用将其置于最终处理组中的顺序随机化将适合用于研究的动物转移到目标研究中。研究中排除了在预测试时具有眼部异常、异常临床观察或体重小于16克的小鼠和经历视网膜下RPE注射不成功的小鼠。

研究测量：本研究中RPE安全性的评估基于动物死亡率、临床观察、体重、眼科检查、临床病理学(血液学和血液化学)、大体病理学宏观评估、器官重量(绝对和相对于身体和脑重量)、眼睛和各种器官的组织病理学评估。通过眼睛和各种器官的组织病理学和荧光免疫染色评估和qPCR分析进行RPE的生存和生物分布的评估。进行以下测量：

-临床观察；

-体重；

-眼科检查(包括宏观和生物显微镜检查)；

-使用LEICA M80立体显微镜(眼底镜)进行视网膜下注射质量的手术显微镜检查；

-全血细胞计数和血液化学；

-尸检和大体病理学；

-器官重量(绝对和相对于身体和脑重量)；

-收集、固定和石蜡包封处理和未处理的对侧眼(包括视神经)；

-眼睛和组织(具有骨髓的胸骨、脑、心、肾、肝、肺、下颌淋巴结、脊髓、脾、胸腺、肿块和大体病变)的盲法H&E组织病理学；

-H&E染色玻片中色素细胞的盲法半定量；

-盲法免疫染色与代表性H&E玻片相邻的显示眼睛中色素细胞移植的选择玻片的人标志物(人细胞核)和RPE标志物(人PMEL17)并评估人RPE和非RPE细胞，人标志物(人细胞核)和增殖标志物(人Ki67)并评估人和非人增殖细胞，以及RPE标志物(RPE65)和增殖标志物(人Ki67)并评估RPE和非RPE人增殖细胞；

-盲法免疫染色与代表性H&E玻片相邻的显示畸胎瘤、肿瘤、异常细胞和病变的选择玻片的人标志物(人细胞核)以排除人来源；

-从以下收集并提取基因组DNA，并qPCR分析人β球蛋白：血液、骨髓(从股骨收集)、脑、具有视神经的左眼和右眼、心脏、左右肾、肝、肺、下颌淋巴结、卵巢、骨骼股二头肌、脊髓、脾、睾丸和胸腺；

-对相同组和时间点的动物中发现人β球蛋白阳性的组织(不同于上述)进行H&E组织病理学。

结果

在生命检查中没有RPE相关的毒理学结果，其中包括详细的临床观察、体重、眼科检查和临床病理学(包括血液学和血清临床化学)。在详细的临床观察和眼科检查中，在用两种剂量水平的色素RPE细胞处理的小鼠中观察到具有白化背景的左眼中“眼睛变色，黑暗”。存活动物的眼科检查表明，这一观察结果由玻璃体中间的黑色色素病灶组成。色素病灶沿着从时间晶状体囊后部延伸到鼻视网膜表面的线随机分布。这些病灶被解释为在注射后从眼睛移除注射套管时从注射套管逸出的RPE细胞，这被以下支持：在注射期间观察到的玻璃体回流或视网膜下植入术后RPE细胞泄漏到玻璃体液中。

在本研究中观察到的所有眼部病变被认为是继发于麻醉、外科手术注射程序、或伴随年龄相关变化。在玻璃体内发现多个色素病灶表明RPE细胞可能在玻璃体内是可行的。在微观水平证实了一些RPE处理动物的玻璃体中色素细胞的存在。

对于通过用一组人β球蛋白基因探针/引物的qPCR评估的在2周、2个月和6个月间隔的生物分布，用100x10³个细胞处理的左眼在8/12、11/12和16/16只动物中为RPE DNA阳性，组平均水平分别为38、47和249个拷贝/μg总眼DNA，表明随时间增加的趋势。雄性和雌性之间没有显著区别。在这些动物中，在未处理右眼和非眼组织(包括血液、股骨骨髓、脑、心脏、肾、肝、肺、下颌淋巴结、卵巢、骨骼股二头肌、脊髓、脾、睾丸和胸腺)中没有检测到RPE DNA，除了一只2周雄性动物的脊髓(27个拷贝/μg DNA)和一只2周雌性动物的骨骼肌(16个拷贝/μg DNA)和脊髓(低于定量水平)(可能是由于从这些组织提取DNA期间外源人DNA的无意污染)。

RPE相关的宏观变化仅限于2个月和6个月间隔的几只动物左眼中的黑色变色或黑色病灶，这与生命临床观察和/或眼科检查一致。这些变化与色素细胞有关，且通过对高剂量组中的存活动物以及两个剂量组中紧急实施安乐死并发现死亡的动物进行显微镜检查确定不认为这是有害的。在高剂量组(在2周、2个月和6个月间隔，在11/12、12/12和16/16只的视网膜下空间)的各时间点检查的几乎所有存活小鼠的经处理的左眼中存在色素细胞，这在低剂量和高剂量两组中紧急实施安乐死并发现死亡的动物中一样。免疫染色人细胞和RPE特异性生物标志物证实，色素细胞的最常见位点是视网膜下空间和玻璃体。在视网膜下空间，色素细胞倾向于在较早时间点限于注射位点，而在较后时间点，它们存在与远离注射位点的位置，表明局部细胞扩散。在雄性中，与2周或2个月时间点相比，6个月时间点的每只眼的平均色素细胞总数略微增加。这种人来源色素细胞的数量增加由qPCR分析支持。

图27A阐述了RPE细胞的长期植入。在移植后9个月，在NOD-SCID视网膜下空间，色素细胞的人细胞核和PMEL17染色为阳性。

图27B是示出在注射后的水泡处聚集的照片。图27C是示出注射后细胞随后扩散到单层中的照片。

RPE与任何器官重量变化无关。在本研究中检查的未处理右眼和非眼器官(包括脑、心脏、肾、肝、肺、下颌淋巴结、脊髓、脾和胸腺)中没有宏观和微观变化。在高剂量组检查的动物中，在2周、2个月和6个月时间点，分别在64％、36％和73％的测试左眼观察到抗人细胞核生物标志物抗体染色(人细胞核)。

在视网膜下空间的色素细胞群中观察到人细胞核的最高检测水平，随后是玻璃体。在大多数测试的动物中观察到抗人RPE特异性生物标志物PMEL17，而另一个RPE特异性生物标志物RPE65在不同时间点具有不同的检测水平。这些RPE特异性生物标志物大多数在视网膜下空间检测到，较少在玻璃体中。仅在少量动物的几个细胞中检测到人细胞增殖生物标志物Ki67，主要在玻璃体内的色素细胞中，较少在视网膜下空间。Ki67阳性的发生率随时间而下降，6个月时只有一只动物。Ki67阳性细胞与任何异常形态无关。

在所有时间点和所有研究组的注射位点注意到一些微观变化，认为这与外科手术注射程序有关。其中一些变化在6个月的高剂量组检查动物中略显突出。例如，在一只动物中观察到视网膜脱离，并且与介质对照组相比，视网膜变性/萎缩或纤维增生的发生率或严重程度略有增加。

对动物死亡率和存活率没有RPE依赖性影响。

结论

在以高达100000个细胞/ul/眼的剂量水平单次注射RPE后的6个月研究期间，在NOD/SCID动物模型中未观察到局部或全身毒性、致死或致瘤作用。RPE细胞的生物分布限于经处理的左眼，其中局部视网膜下细胞从视网膜下注射位点随时间扩散。在2周、2个月和6个月间隔检查的大多数高剂量组动物中，RPE细胞主要存在于视网膜下空间，随后是玻璃体，在针对人细胞核和/或人RPE特异性生物标志物的抗体的免疫染色中具有可变阳性。RPE细胞在眼中的持续性估计至少为6个月，其中细胞增殖非常有限。有限的增殖大多数在玻璃体中发生，且没有有害作用。有证据表明经处理的眼睛中的RPE细胞数随时间增加，尽管这伴随着检查的视网膜下群体的增殖发生率降低。两个RPE特异性标志物RPE65和PMEL17的表达主要在视网膜下空间内的RPE细胞中，与其中发现大多数Ki67阳性细胞发生率的玻璃体内相反。后者表明，RPE细胞随时间的增加限于玻璃体空间，以及特异性RPE65和PMEL17 RPE标志物的表达可能受微环境的调节。总之，基于以上所示的数据，与介质对照组相比，注射本文所述的RPE细胞没有严重的安全问题。

实施例8

RPE细胞中Pax-6的表达

目的：开发基于FACS的方法，用于评估人视网膜色素上皮(RPE)细胞中PAX-6的水平。

材料和方法

将冷冻的RPE细胞(如实施例4所述制备)解冻、离心、重悬于1ml PBS minus，用35μM细胞过滤器过滤，并用NC-200细胞计数器计数。将PBS minus中的细胞浓度调节为～1x10⁶个细胞/ml。向每ml细胞悬浮液加入1μl/ml FVS450，然后旋涡振荡并在37℃孵育6分钟。用0.1％BSA(-Ig)-PBS minus淬灭FVS450，并重悬于0.1％BSA(-Ig)-Fc-阻断液(RT下5分钟)以阻断细胞上的所有Fc-表位。然后将细胞固定，并用抗Pax-6抗体(AF647Cat#562249)染色。

结果

如图29所示，P0和P2细胞为PAX6阳性(P0为81.5％-82.5％，P2为91.3％-96.1％)。P2是生产过程结束时的代，P0是早两个扩增阶段。如图29和30所示，数据显示在批次之间是一致的。此外，本发明人通过FACS分析表明，RPE细胞双重染色PAX-6和CRALBP(图31)。

实施例9

鉴定RPE细胞分泌的蛋白质

目的：鉴定可用作批次出厂效力测定以及过程控制测定的由(RPE细胞)分泌的蛋白质(已知且新的)标签。

从RPE细胞(如实施例3所述制备)收集上清液，所述RPE细胞在以下所述不同培养条件下培养。然后根据制造商的说明，在上清液与相关阵列孵育过夜后使用G6和G7RayBiotech阵列筛选上清液。

1.在12孔板上培养4天和14天的解冻后的RPE药物产品细胞(第3代的0.5x10⁶个细胞/孔)(本文称为)。

2.在12孔板上培养14天然后在转移孔上培养3周(根据AM-RPE-15)且显示TEER>500Ω的解冻后的RPE药物产品细胞。从顶室和底室取上清液。

3.根据实施例3所述的方案制备的在激活素A处理之前(QC3)和之后(QC4)细胞。

4.不添加TGFβ和FGF的Nutristem培养基(Nut-)。

还从以下细胞培养物收集上清液，并通过ELISA测试：

1.在12孔板上培养14天然后在转移孔上培养3周(如AM-RPE-15)且分别显示TEER为355Ω和505Ω的解冻后的药物产品细胞。从第14天起(第3代)，从顶室和底室取上清液。

2.在12孔板上培养14天的解冻后的RPE 7细胞(第3代的0.5x10⁶个细胞/孔)。

3.在核层蛋白521上生长然后酶促或机械分离的生产过程第1代结束时的模拟VI细胞(如实施例3所述)。根据AM-RPE-15测试这些细胞的效力，并从以下细胞收集上清液：第14天的12孔板的细胞(第2代)和3周后在来自顶室和底室的转移孔上的细胞。

4.在第4天和第14天的第3代的胎儿HuRPE细胞(0.5x10⁶个细胞/孔)。

根据与各ELISA试剂盒有关的制造商的说明进行ELISA测试验证。在各方案中，与上清液孵育过夜。

研究设计：从不同培养条件下培养的细胞收集上清液，并保存于-80℃。蛋白质阵列分析之后，通过ELISA测量命中(hit)的验证。

结果

下表9给出G7阵列的结果。

表9

下表10给出G6阵列的结果。

表10

RPE分泌的蛋白质可以分为3个功能组：1)血管生成蛋白如VEGF和血管生成素，2)细胞外基质调节剂如TEVIP-1和TIMP-2，和3)免疫调节蛋白如IL-6、MIF、sgp130、sTNF-R1、sTRAIL-R3、MCP-1和骨保护素。还发现受体酪氨酸激酶Ax1由RPE细胞分泌。选择显示高水平分泌和/或显示极化分泌(顶端/底端)模式的6个蛋白用于ELISA验证(血管生成素、TEVIP-2、MIF、sgp130、sTNF-Rl和sTRAIL-R3)。阵列数据还显示如极化测定中所观察到的VEGF分泌。

血管生成素：蛋白质阵列数据显示血管生成素分泌沿着生产过程增加(表9和10)。这些结果被表明以下的ELISA证实：在添加激活素A之前用烟碱处理的分化细胞分泌的血管生成素水平为0.52ng/mL，而在烟碱和激活素A处理2周后，血管生成素分泌水平增加至0.91ng/mL(图32A)。在12孔板中培养2周的解冻后的RPE细胞(0.5x10⁶个细胞/孔；第3代)分泌血管生成素(图32B)。极化的RPE细胞(在转移孔上第3周；TEER>350Ω,PEDF顶端/底端和VEGF底端/顶端比例>1)以极化方式分泌血管生成素至底侧，而低分泌或不分泌至顶侧(底端血管生成素水平为0.1-0.25ng/mL，顶端血管生成素水平为0.05-0.12ng/mL；图32B)。根据Idelson等，2009制备的RPE7细胞不能在转移孔系统中产生屏障(TEER低于100Ω)，尽管其能分泌VEGF和PEDF。当铺板至12孔板14天时，测试RPE7细胞分泌血管生成素的能力。RPE7在培养第14天分泌的血管生成素水平在如本文所述制备的RPE细胞的范围内(图32C)。

TIMP-1和TIMP-2的分泌：蛋白质阵列筛选表明从极化和非极化RPE细胞分泌TIMP-1和TIMP-2(图33A-E)。有趣的是，阵列数据显示TIMP-2极化分泌至顶侧，而TIMP-1极化分泌至底侧(图33A)。ELISA数据证实，TIMP-2由目前为止所测试的所有RPE批次主要分泌至顶侧(图33C-D，顶端范围为69.9-113.3ng/mL，底端范围为11.9-43.7ng/mL)。TIMP-2也由非极化细胞分泌，其水平与正常人胎儿RPE细胞(HuRPE,ScienCell)分泌的水平相似(图33C-E)。有趣的是，在QC3和QC4检查点的生产过程中检测到非常低水平的TIMP-2(图33B)。

细胞分泌的sgp130：蛋白质阵列数据显示，如在IPC/QC检查点3和4中可以看出，沿着生产过程，sgp130的分泌增加(表9和10)。ELISA数据证实了与添加激活素A之前烟酰胺处理后细胞分泌的水平(IPC/QC3；0.68ng/mL)相比，激活素A处理2周后sgp130分泌水平(IPC/QC4；1.64ng/mL)更高(图34A)。在12孔板中培养2周的解冻后的细胞(0.5x10⁶个细胞/孔；第3代)分泌sgp130(图34B-C)。在相似条件下培养的RPE7细胞分泌sgp130的水平在细胞的范围内(第14天为1.0ng/mL；图34D)。胎儿HuRPE细胞在第4天和第14天均分泌低水平的sgp130。

极化的细胞以极化方式分泌sgp130至顶侧，而低分泌或不分泌至底侧(顶端sgp130分泌水平为0.93-2.06ng/mL，底端sgp130水平为0-0.2ng/mL；图34B-C)。

脱落sTNF-R1：通过ELISA在用烟碱和激活素A处理2周之前(IPC/QC3 0.01ng/mL)和之后(IPC/QC4 0.02ng/mL)的分化细胞上清液中检测到非常低水平的脱落sTNF-R1(图35A)。在12孔板中培养2周的解冻后的细胞(0.5x10⁶个细胞/孔；第3代)在培养14天的上清液中含有sTNF-R1(图35B-C)。在相似条件下培养的HuRPE细胞在其培养物上清液中具有相似水平的sTNF-R1，而RPE7细胞显示相对低的sTNF-R1水平(图35D)。

极化的细胞以较高水平向顶侧分泌脱落sTNF-R1(顶端和底端sTNF-R1水平分别为0.22-1.83ng/mL和0.01-0.11ng/mL；图35C-D)。

sTRAIL-R3：蛋白质阵列数据在细胞的上清液中检测到sTRAIL-R3(表9和10)。ELISA证实了在生产过程中sTRAIL-R3的存在(在QC3中为493pg/mL，在QC4中为238pg/mL)。在胎儿HuRPE培养物中没有sTRAIL-R3，在RPE7培养物中sTRAIL-R3水平非常低(4pg/mL)。

MIF的检测：蛋白质阵列数据在细胞的上清液中检测到MIF(表9和10)。ELISA证实了在生产过程中MIF的存在(在QC3中为100.3pg/mL，在QC4中为44.7pg/mL)。极化的细胞显示在顶侧的MIF水平较高(顶端MIF说为26.6-138.3ng/mL，底端为1.9-30.5ng/mL)。

实施例10

和RPE1&RPE7的比较

目的：将(RPE细胞)与根据Idelson等，2009的方法制备的RPE细胞进行比较。

材料和方法

如实施例3所述制备(RPE细胞)。

根据Idelson等，2009的方法制备RPE细胞，称为RPE1和RPE7。

转移孔系统(如图28所示)用于能够开发具有稳定屏障特性和极化PEDF和VEGF分泌的极化RPE单层。跨上皮电阻(TEER)测量用于评估RPE单层的屏障功能，和酶联免疫吸附测定(ELISA)用于评估极化的PEDF和VEGF分泌。将细胞解冻，并在烟碱存在下培养14天。在第7天和第14天测试PEDF分泌。然后将细胞转移至转移孔(Costar 3460,0.4μm)再培养4周，期间测量TEER并每周从转移孔上室和下室收集培养基(用于评估细胞因子分泌)直到4周。当细胞极化时，TEER应当高于100Ω，且顶端对底端PEDF分泌以及底端对顶端VEGF分泌的比例应当大于1。

测试的所有批次显示能够产生屏障功能(TEER为368-688Ω)，且以极化方式分泌PEDF和VEGF(顶端/底端PEDF比例为3.47-8.75，底端/顶端VEGF比例为1.39-2.74)(参见表11)。

表11

ND：未测定，因为TEER低于100Ω且在培养物中可见大孔。

在3个独立研究中，根据Idelson等(2009)在GMP条件下产生的RPE1和RPE7不能产生屏障功能(TEER<100Ω)。在转移孔上接种的细胞不能产生均匀的封闭多角形单层，且可以看见大孔(图36)。尽管细胞不能产生屏障功能，RPE1和RPE7能够以与相似的水平分泌PEDF(参见表11)和VEGF(数据未显示)，且它们的CRALBP⁺PMEL17⁺纯度水平分别为99.91％和96.29％，与类似(图37)。

基于这些数据，可以得出结论，RPE1和RPE7在产生紧密连接的能力方面有缺陷。

虽然已经结合本发明的具体实施方案描述了本发明，但是显而易见的是，许多替代、修改和变化对于本领域技术人员是显而易见的。因此，意欲包括落在所附权利要求的精神和广泛范围内的所有这样的替代、修改和变化。

本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请的全文通过引用并入本说明书中，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体和单独地指明通过引用并入本文。此外，本申请中引用或标识的任何参考文献不应被解释为承认该参考文献可用作本发明的现有技术。在使用章节标题的范围内，不应将其解释为必然的限制。

Claims (46)

1.人多角形RPE细胞群，其中至少95％的所述细胞共表达前黑素小体蛋白(PMEL17)和细胞视黄醛结合蛋白(CRALBP)，其中所述细胞群的跨上皮电阻大于100ohms。

2.人多角形RPE细胞群，其中至少80％的所述细胞共表达前黑素小体蛋白(PMEL17)和细胞视黄醛结合蛋白(CRALBP)，且其中所述群的细胞分泌以下的每一个：血管生成素、金属蛋白酶2的组织抑制剂(TIMP2)、可溶性糖蛋白130(sgp130)和可溶形式的肿瘤坏死因子-α的普遍存在的膜受体1(sTNF-R1)。

3.权利要求1所述的细胞群，其中所述群的细胞分泌以下的每一个：血管生成素、金属蛋白酶2的组织抑制剂(TIMP2)、可溶性糖蛋白130(sgp130)和可溶形式的肿瘤坏死因子-α的普遍存在的膜受体1(sTNF-R1)。

4.权利要求2或3所述的细胞群，其中所述细胞以极化方式分泌所述血管生成素、所述TIMP2、所述sgp130或所述sTNF-R1。

5.权利要求2或3所述的细胞群，其中所述细胞以极化方式分泌所述血管生成素、所述TIMP2、所述sgp130和所述sTNF-R1中的每一个。

6.权利要求4或5所述的细胞群，其中顶端分泌sgp130:底端分泌sgp130的比例大于1。

7.权利要求4或5所述的细胞群，其中顶端分泌sTNF-R1:底端分泌sTNF-R1的比例大于1。

8.权利要求4或5所述的细胞群，其中底端分泌血管生成素:顶端分泌血管生成素的比例大于1。

9.权利要求4或5所述的细胞群，其中顶端分泌TIMP2:底端分泌TIMP2的比例大于1。

10.权利要求1或2所述的细胞群，其中所述群中Oct4⁺TRA-1-60⁺细胞的数量低于1:250,000。

11.权利要求1-10任一项所述的细胞群，其中通过免疫染色测量，至少80％的细胞表达Bestrophin 1。

12.权利要求1-11任一项所述的细胞群，其中通过免疫染色测量，至少80％的细胞表达小眼畸形相关转录因子(MITF)。

13.权利要求1-12任一项所述的细胞群，其中通过FACS测量，超过50％的细胞表达配对盒基因6(PAX-6)。

14.权利要求1-13任一项所述的细胞群，其中所述细胞分泌超过750ng色素上皮衍生因子(PEDF)/ml/天。

15.权利要求1-14任一项所述的细胞群，其中所述细胞以极化方式分泌PEDF和血管内皮生长因子(VEGF)。

16.权利要求15所述的细胞群，其中顶端分泌PEDF:底端分泌PEDF的比例大于1。

17.权利要求16所述的细胞群，其中在2-8℃孵育8小时后，所述比例仍然大于1。

18.权利要求2所述的细胞群，其中所述细胞群的跨上皮电阻大于100ohms。

19.权利要求1或18所述的细胞群，其中在2-8℃孵育8小时后，所述细胞的所述跨上皮电阻仍然大于100ohms。

20.权利要求15或16所述的细胞群，其中底端分泌VEGF:顶端分泌VEGF的比例大于1。

21.权利要求20所述的细胞群，其中在2-8℃孵育8小时后，所述比例仍然大于1。

22.权利要求1-21任一项所述的细胞群，能够在视网膜下施用后拯救RCS大鼠的视觉灵敏度。

23.权利要求1-21任一项所述的细胞群，能够在视网膜下施用后拯救RCS大鼠的感光器至少180天。

24.权利要求1-23任一项所述的细胞群，通过人胚胎干细胞的离体分化制备。

25.权利要求1-24任一项所述的细胞群，其通过以下制备：

(a)在含有烟碱的培养基中培养人胚胎干细胞以制备分化细胞，其中所述培养基不含激活素A；

(b)在含有烟碱和激活素A的培养基中培养所述分化细胞以制备进一步分化为RPE谱系的细胞；和

(c)在含有烟碱的培养基中培养所述进一步分化为RPE谱系的细胞，其中所述培养基不含激活素A。

26.权利要求25所述的细胞群，其中所述胚胎干细胞在含有bFGF和TFGβ的培养基中增殖。

27.权利要求25所述的细胞群，其中所述胚胎干细胞在人脐带成纤维细胞上培养。

28.权利要求25-27所述的细胞群，其中步骤(a)-(c)在其中环境氧气水平小于约10％的条件下进行。

29.权利要求28所述的细胞群，其中所述方法在步骤(c)之后进一步包括在其中环境氧气水平大于约10％的条件下，在烟碱存在下，在培养基中培养所述已分化的细胞。

30.包含作为活性剂的权利要求1-29任一项所述的细胞群和药学上可接受的载体的药物组合物。

31.权利要求1-30任一项所述的细胞群用于治疗视网膜变性的用途。

32.用于制备RPE细胞的方法，包括：

(a)在含有分化剂的培养基中培养多能干细胞以制备分化细胞，其中所述培养基不含转化生长因子β(TGFβ)超家族的成员；

(b)在含有所述转化生长因子β(TGFβ)超家族的成员和所述分化剂的培养基中培养所述分化细胞以制备进一步分化为RPE谱系的细胞；

(c)在含有分化剂的培养基中培养所述进一步分化为RPE谱系的细胞以制备RPE细胞，其中所述培养基不含转化生长因子β(TGFβ)超家族的成员，其中步骤(a)-(c)在其中环境氧气水平小于约10％的条件下进行。

33.权利要求32所述的方法，其中步骤(a)在非粘附条件下进行。

34.权利要求33所述的方法，其中所述非粘附条件包含非粘附培养板。

35.权利要求32所述的方法，其中步骤(a)包括：

i)在非粘附条件下且不存在激活素A下，在含有烟碱的培养基中培养所述培养的人多能干细胞群，产生包含分化细胞的细胞簇；随后；

ii)在粘附条件下且不存在激活素A下，在含有烟碱的培养基中培养(i)的所述分化细胞。

36.权利要求35所述的方法，在步骤(ii)之前进一步包括分离所述细胞簇以制备细胞团或细胞的单细胞悬浮液。

37.权利要求32所述的方法，在步骤(c)之后进一步包括在分化剂存在且其中环境氧气水平大于约10％的条件下在培养基中培养所述已分化的细胞。

38.权利要求32所述的方法，其中所述转化生长因子β(TGFβ)超家族的成员选自TGFβ1、TGFβ3和激活素A。

39.权利要求32所述的方法，其中步骤(a)的所述分化剂和步骤(c)的所述分化剂相同。

40.权利要求32所述的方法，其中步骤(a)的所述分化剂是烟碱(NA)或3-氨基苯甲酰胺。

41.权利要求32所述的方法，在步骤(c)之后进一步包括选择多角形细胞。

42.权利要求41所述的方法，进一步包括增殖所述多角形细胞。

43.权利要求42所述的方法，其中所述增殖在粘附表面上进行。

44.权利要求32所述的方法，其中所述多能干细胞包含胚胎干细胞。

45.权利要求44所述的方法，其中所述胚胎干细胞在含有bFGF和TGFβ的培养基中增殖。

46.权利要求44所述的方法，其中所述胚胎干细胞在人脐带成纤维细胞上培养。