[go: up one dir, main page]

CN106637422A - 一种构建Hi‑C高通量测序文库的方法 - Google Patents

一种构建Hi‑C高通量测序文库的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106637422A
CN106637422A CN201611166469.8A CN201611166469A CN106637422A CN 106637422 A CN106637422 A CN 106637422A CN 201611166469 A CN201611166469 A CN 201611166469A CN 106637422 A CN106637422 A CN 106637422A
Authority
CN
China
Prior art keywords
dna
solution
pcr amplification
throughput sequencing
reaction
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201611166469.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106637422B (zh
Inventor
叶丙雨
何超
赵志虎
沈文龙
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Bioengineering Chinese Academy of Military Medical Sciences
Original Assignee
Institute of Bioengineering Chinese Academy of Military Medical Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Bioengineering Chinese Academy of Military Medical Sciences filed Critical Institute of Bioengineering Chinese Academy of Military Medical Sciences
Priority to CN201611166469.8A priority Critical patent/CN106637422B/zh
Publication of CN106637422A publication Critical patent/CN106637422A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106637422B publication Critical patent/CN106637422B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
    • C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2535/00—Reactions characterised by the assay type for determining the identity of a nucleotide base or a sequence of oligonucleotides
    • C12Q2535/122—Massive parallel sequencing

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了构建Hi‑C高通量测序文库的方法。本发明所提供的方法，具体可为方法一，依次包括如下步骤：(1)取解交联后的DNA，进行纯化和富集；(2)进行转座反应；(3)进行PCR扩增，获得文库。本发明所提供的方法，具体可为方法二，依次包括如下步骤：(1)取解交联后的DNA，进行纯化；(2)超声处理，进行富集；(3)进行转座反应；(4)进行PCR扩增，获得文库。实验表明，与常规方法相比，本发明提供的方法构建的Hi‑C高通量测序文库结果稳定可靠，而且数据质量更高，更易标准化，步骤更少，时间更短，更节约资源。因此，因此，本发明所提供的构建Hi‑C高通量测序文库的方法具有重要的应用价值。

Description

一种构建Hi-C高通量测序文库的方法
技术领域
本发明属于生物化学领域，具体涉及一种构建Hi-C高通量测序文库的方法。
背景技术
经典染色质构象捕获(Chromosome conformation capture，3C)技术是一种通过定量手段(PCR产物的有和无、产量的高和低)对DNA之间是否存在相互作用以及作用强度这一定性、定量问题进行研究的技术，其主要经过甲醛交联、酶切、连接、解交联、DNA纯化与PCR鉴定与定量等步骤。通过一对与选定的两段DNA分别配对的引物进行PCR扩增，根据PCR产物的有无、产量的高低等，就可以对是否存在相互作用以及相互作用的强弱进行判断。高通量染色质构象捕获技术(Hi-C技术)是染色质构象捕获的一种衍生技术，是指基于高通量测序进行全基因组染色质构象的捕获。在Hi-C技术中，以整个细胞核为研究对象，利用高通量测序技术，结合生物信息学方法，研究全基因组范围内整个染色质DNA在空间位置上的关系即空间三维高级结构；通过对染色质内全部DNA相互作用模式进行捕获，获得高分辨率的染色质三维结构信息，把基因表达调控引入到空间的、全局性的研究层面，为全面解析与DNA有关的生物学过程的机理开启新的契机。
Hi-C技术自从2009年问世以来，虽然经过了诸如从溶液中连接到原位连接等改进，但是目前仍然存在诸多不足，如不易于标准化、结果不稳定、建库步骤繁琐、建库时间长、数据质量较差等等。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何构建优质的Hi-C高通量测序文库。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了构建Hi-C高通量测序文库的方法。
本发明所提供的构建Hi-C高通量测序文库的方法，具体可为方法一，依次包括如下步骤：
(1)取解交联后的DNA，进行纯化和富集；
(2)进行转座反应；
(3)进行PCR扩增，获得文库。
本发明所提供的构建Hi-C高通量测序文库的方法，具体可为方法二，依次包括如下步骤：
(1)取解交联后的DNA，进行纯化；
(2)超声处理，进行富集；
(3)进行转座反应；
(4)进行PCR扩增，获得文库。
上述方法中，所述转座反应的反应体系可包括：完成上一步骤的DNA和转座酶。
所述完成上一步骤的DNA具体可为将解交联后的DNA进行纯化和富集，得到的DNA。
所述完成上一步骤的DNA具体可为将解交联后的DNA，进行纯化；然后超声处理，进行富集，得到的DNA。
上述方法一或方法二中，所述转座反应的反应体系可由完成所述富集的DNA、转座酶和转座酶缓冲液组成。
上述方法一或方法二中，所述转座反应的反应体系可由完成所述富集的DNA、转座酶和转座酶缓冲液和水组成。
所述转座酶可为Tagment DNA Enzyme。所述转座酶缓冲液可为2×Tagment DNAbuffer。所述2×Tagment DNA buffer和所述Tagment DNA Enzyme均为Nextra DNA prepkits中的组件；Nextra DNA prep kits为Illumina公司的产品，产品目录号为FC-121-1030。
25μL所述转座反应的反应体系由完成所述富集的DNA、12.5μL 2×Tagment DNAbuffer、1μL Tagment DNA Enzyme和11.5μL ddH2O组成。
上述方法一或方法二中，所述转座反应的条件可为：37℃3min。
上述方法一或方法二中，所述“进行转座反应”之后、所述“进行PCR扩增，获得文库”之前，还包括步骤(A)：从完成所述转座反应的体系中分离DNA。
上述方法一或方法二中，所述“进行PCR扩增，获得文库”的具体步骤可依次如下：
(a)制备反应体系甲；所述反应体系甲由缓冲液和ddH2O组成；
(b)取所述反应体系甲，95-100℃处理40-50s；
(c)制备反应体系乙；所述反应体系乙由完成步骤(b)的体系、上游引物、下游引物和从完成所述转座反应的体系中分离的DNA组成；
(d)取所述反应体系乙，进行PCR扩增。
所述步骤(a)中，所述缓冲液可为2×KAPA HiFi hotstart mix。38μL所述反应体系甲具体可由25μL 2×KAPA HiFi hotstart mix和13μL ddH2O组成。
所述步骤(b)具体可为：取所述反应体系甲，98℃处理45s。
所述步骤(c)中，所述上游引物可为Nextra Primer 1.0：5’
-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-3’，下游引物可为Nextra Primer 2.1：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCGCCTTAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT-3’或Nextra Primer 2.2：5’
-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAGTACGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT-3’。50μL所述反应体系乙具体可由38μL完成步骤(b)的体系、1μL浓度为25μM的Nextra Primer 1.0、1μL浓度为25μM的Nextra Primer 2.1或Nextra Primer 2.2、和10μL从完成所述转座反应的体系中分离的DNA的水溶液组成。
所述步骤(d)中，所述PCR扩增的反应程序为：72℃延伸5min；98℃变性30s；98℃变性15s，65℃退火30s，72℃延伸30s，共15个循环；72℃延伸1min。
上述方法二中，所述超声处理的参数可为：超声频率35％；超声1s，停1s，超声总时间可为200s。
上述方法一或方法二中，所述“解交联后的DNA”的制备方法依次包括如下步骤：
(1)用甲醛固定生物细胞核染色质；
(2)裂解所述生物细胞，收集细胞核；
(3)限制性内切酶酶切；
(4)加入生物素化的脱氧核糖核苷酸，连接；
(5)加入蛋白酶K，解交联。
所述生物可为细菌、植物或动物。所述细菌具体可为冰岛硫化叶菌REY15A。
所述限制性内切酶可为限制性内切酶HindIII。
所述生物素化的脱氧核糖核苷酸可为Bio-16-dCTP。Bio-16-dCTP具体可为Trilink公司的产品，产品目录号为N5002。
本发明还保护一种含有转座酶的试剂盒；该试剂盒可用于构建Hi-C高通量测序文库。所述转座酶可为所述Tagment DNA Enzyme。
实验表明，采用本发明提供的方法构建的Hi-C高通量测序文库的结果稳定可靠，而且数据质量更高(可用连接片段数均较多，酶切片段中可用连接片段数较多等等)，更易标准化，步骤更少(本发明所提供的方法构建Hi-C高通量测序文库只需经过转座反应即可进行PCR鉴定，而常规方法构建Hi-C高通量测序文库需经过末端补平、加“A”和连接接头等步骤才可进行PCR鉴定)，时间更短(采用常规方法构建Hi-C高通量测序文库的时间为1-2d，采用本发明所提供的方法构建Hi-C高通量测序文库的时间约3h)，更节约资源(采用常规方法构建Hi-C高通量测序文库的步骤较多，因此DNA样品损失也较多)。因此，本发明所提供构建Hi-C高通量测序文库的方法具有重要的应用价值。
附图说明
图1为DNA测序溶液甲中可用连接和冗余的片段数和比例。
图2为DNA测序溶液甲中基于酶切片段的比对统计情况。
图3为DNA测序溶液甲中片段比对后的统计情况。
图4为DNA测序溶液甲的分辨率。
图5为DNA测序溶液乙中可用连接和冗余的片段数和比例。
图6为DNA测序溶液乙中基于酶切片段的比对统计情况。
图7为DNA测序溶液乙中片段比对后的统计情况。
图8为DNA测序溶液乙的分辨率。
图9为DNA测序溶液丙中可用连接和冗余的片段数和比例。
图10为DNA测序溶液丙中基于酶切片段的比对统计情况。
图11为DNA测序溶液丙中片段比对后的统计情况。
图12为DNA测序溶液丙的分辨率。
图13为DNA测序溶液甲与DNA测序溶液丙的染色质覆盖度一致性分析。
图14为DNA测序溶液乙与DNA测序溶液丙的染色质覆盖度一致性分析。
图15为DNA测序溶液甲与DNA测序溶液乙的染色质覆盖度一致性分析。
图16为DNA测序溶液甲与DNA测序溶液丙的相互作用一致性分析。
图17为DNA测序溶液乙与DNA测序溶液丙的相互作用一致性分析。
图18为DNA测序溶液甲与DNA测序溶液乙的相互作用一致性分析。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
DSM88培养基：将(NH4)2SO4 1.300g、KH2PO4 0.280g、MgSO4·7H2O 0.250g、FeCl3·6H2O 0.020g、Na2MoO4·2H2O 0.025mg、CaCl2·2H2O 0.070g、Na2MoO4·2H2O 0.025mg、FeCl30.280mg、CuSO4 0.016mg、MnSO4·H2O 2.200mg、H3BO3 0.500mg、ZnSO4·7H2O0.500mg、CoCl2·6H2O 0.046mg、CaSO4·H2O 60.000mg、Tryptone 1.000g和Yeast extract 1.000g溶于1L蒸馏水，pH值调至3.5；121℃灭菌15min。
冰岛硫化叶菌REY15A记载于如下文献中：Li Guo.，et al.Genome Analyses ofIcelandic Strains of Sulfolobus islandicus，Model Organisms for Genetic andVirus-Host Interaction Studies.JOURNAL OF BACTERIOLOGY，Apr.2011，p.1672-1680.(文献中冰岛硫化叶菌REY15A的名称为S.islandicus strains REY15A)。公众可从中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所(即申请人处)获得，以重复本实验。
pH7.4、1×PBS缓冲液的制备方法为：向800mL去离子水中加入0.27g磷酸二氢钾、1.42g磷酸氢二钠、8.00g氯化钠和0.20g氯化钾，充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调节pH值至7.4，最后加入去离子水定容至1L。
限制性内切酶HindIII为NEB公司的产品。10×NEB2.1buffer、2×快速连接酶buffer和DNA快速连接酶均为NEB公司的产品，产品目录号分别为B7202S、B6058S和M2200S。10×T4DNA连接酶buffer、T4DNA连接酶和RNase A均为Thermo Fisher Scientific的产品。MyOneTM Streptavidin C1为Thermo Fisher公司的产品，产品目录号为65001。QIAGEN PCR纯化试剂盒、QIAGEN MinElute PCR纯化试剂盒和QIAGEN MinElute胶回收试剂盒均为QIAGEN公司的产品，产品目录号分别为28104、28004和28604。Ready-LyseTMLysozyme为Epicentre公司的产品，产品目录号为R1804M。6×loading buffer为TransGen公司的产品，产品目录号为GH101-01。测序仪为Illumina公司的产品，产品型号为HiSeq XTen。2×Tagment DNA buffer和Tagment DNA Enzyme均为Nextra DNA prep kits中的组件；Nextra DNA prep kits为Illumina公司的产品，产品目录号为FC-121-1030。2×KAPAHiFi hotstart mix为KAPABIOSYSTEMS公司的产品，产品目录号为KK2601。DNA聚合酶I(Klenow大片段)的商品名称为“DNA Polymerase I,Large(Klenow)Fragment”，具体为NEB公司的产品，产品目录号为M0210L。T4DNA聚合酶的商品名称为T4DNA Polymerase，具体为NEB公司的产品，产品目录号为M0203L。Klenow片段(3’→5’exo-)的商品名称为KlenowFragment(3’→5’exo-)，具体为NEB公司的产品，产品目录号为M0212L。Bio-16-dCTP为Trilink公司的产品，产品目录号为N5002。
1×B&W buffer为含2M NaCl和0.5mM EDTA的pH7.5、5mM Tris-HCl缓冲液。2×B&Wbuffer为含4M NaCl和1mM EDTA的pH7.5、10mM Tris-HCl缓冲液。终止反应缓冲液：含0.2％(0.2mg/mL)SDS和1mM EDTA的pH8.0、10mM Tris-HCl缓冲液。
实施例1、冰岛硫化叶菌REY15A的Hi-C高通量测序文库的两种构建方法的比较
一、采用本发明提供的方法构建冰岛硫化叶菌REY15A的Hi-C高通量测序文库
1、甲醛交联
(1)取冰岛硫化叶菌REY15A的菌液，接种(接种量为1％(v/v))至DSM88培养基，得到初始菌液(体积为50mL)；初始菌液中，冰岛硫化叶菌REY15A的浓度为1.0×105cfu/mL。
(2)取步骤(1)得到的初始菌液，78℃、220rpm振荡培养6h，得到OD600nm值为0.4-0.6的培养菌液。
(3)向步骤(2)得到的培养菌液中加入1.39mL 37％(v/v)甲醛水溶液，得到混合溶液甲(混合溶液甲中甲醛的浓度为1％(v/v))；然后置于78℃，静置10min，得到交联体系。
(4)向步骤(3)得到的交联体系中加入3.2mL浓度为2M的甘氨酸水溶液，得到混合溶液乙(混合溶液乙中甘氨酸的浓度为0.125M)；然后室温静置5min，得到终止体系。
(5)取步骤(4)得到的终止体系，室温、2500g离心10min，收集菌体并转移至康宁管(规格为15mL)。
(6)向完成步骤(5)后的康宁管中加入10mL pH7.4、1×PBS缓冲液，轻轻吹吸混匀，室温、2500g离心10min，弃上清。
(7)向完成步骤(6)后的康宁管中加入10mL pH7.4、1×PBS缓冲液，轻轻吹吸混匀，室温、2500g离心10min，弃上清。
(8)向完成步骤(7)后的康宁管中加入1mL pH7.4、1×PBS缓冲液进行重悬，得到重悬液。采用Bio-RAD细胞计数仪对重悬液中的细胞进行计数。
2、裂解
(1)取100μL步骤1中(8)得到的重悬液(含1×109个细胞)，室温，2500rpm离心去上清后，再用100μL的1×TE缓冲液(含1mM EDTA的pH8.0、10mM Tris-HCl缓冲液)溶解，得到待裂解菌体。
(2)向步骤(1)得到的待裂解菌体中加入1μL浓度为2000U/μL的Ready-LyseTMLysozyme，然后室温裂解15min，得到裂解体系甲。
(3)向裂解体系甲中加入2.5μL 20％(20g/100mL)SDS水溶液，得到裂解体系乙(裂解体系乙中，SDS的浓度为0.5％(0.5g/100mL))；然后室温裂解10min，得到裂解体系丙。
(4)取裂解体系丙，室温、2500g离心10min，收集沉淀。
3、酶切
(1)制备酶切体系。1mL酶切体系由步骤2中(4)收集的沉淀、100μL浓度为10％(10g/100mL)TX-100水溶液、100μL 10×NEB2.1buffer、40μL浓度为20000U/mL的限制性内切酶HindIII溶液和760μL ddH2O组成。
(2)完成步骤(1)后，取所述酶切体系，37℃、50rpm/min反应5h。
(3)取完成步骤(2)后的酶切体系，室温、2500g离心10min，收集沉淀。
4、Bio-DNA的获得
(1)制备反应体系。240μL反应体系由步骤3中(3)收集的沉淀、1.44μL浓度为10mM的dATP水溶液、1.44μL浓度为10mM的dGTP水溶液、1.44μL浓度为10mM的dTTP水溶液、2.88μL浓度为5mM的Bio-16-dCTP、24μL 10×NEB2.1buffer、8μL浓度为5000U/mL的DNA聚合酶I(Klenow大片段)溶液和200.8μL ddH2O组成。
(2)完成步骤(1)后，取所述反应体系，37℃、50rpm/min反应1.5h。
(3)向完成步骤(2)后的体系中加入6μL 20％(20g/100mL)SDS水溶液，得到终止体系(终止体系中，SDS的浓度为0.5％(0.5g/100mL))；然后室温静置10min，获得Bio-DNA。
5、连接
(1)制备连接体系。2.4mL连接体系由240μL浓度为10％(10g/100mL)TX-100水溶液、240μL 10×T4DNA连接酶buffer、240μL步骤4中(3)获得的Bio-DNA、12μL浓度为10mg/mL的BSA水溶液、80μL浓度为5weiss U/μL的T4DNA连接酶溶液和1588μL ddH2O组成。
(2)完成步骤(1)后，取所述连接体系，16℃静置反应8h。
(3)向完成步骤(2)后的体系中加入48μL浓度为10mg/mL的RNase A溶液，得到RNA处理体系(RNA处理体系中，RNase A的浓度为200μg/mL)；然后37℃处理45min。
6、解交联
向完成步骤5的体系中加入24μL浓度为20mg/mL的蛋白酶K水溶液，得到解交联体系(解交联体系中，蛋白酶K的浓度为200μg/mL)；然后65℃反应10h。
7、DNA纯化
(1)向完成步骤6的体系中加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(体积比为：25:24:1)，上下颠倒混匀，室温、5000g离心10min，得到上层水相甲和下层有机相甲。
(2)完成步骤(1)后，取一新的EP管，加入上层水相甲和等体积的氯仿，上下颠倒混匀，室温、5000g离心10min，得到上层水相乙和下层有机相乙。
(3)完成步骤(2)后，另取一新的EP管，加入10体积份的上层水相乙、1体积份的NaAc水溶液(pH值为5.2)和12体积份的异戊醇，上下颠倒混匀，然后-80℃沉降1h。
(4)完成步骤(3)后，取所述EP管，4℃、12000g离心20min，弃上清，向沉淀中加入500μL的75％(v/v)乙醇水溶液，上下颠倒混匀；然后4℃、12000g离心5min，弃上清，将沉淀在室温下晾干，然后加入95μL的ddH2O，得到DNA溶液。
(5)制备去除单片段体系。120μL去除单片段体系由95μL DNA溶液、12μL10×NEB2.1buffer、1μL浓度为10mg/mL的BSA水溶液、1μL浓度为10mM的dGTP水溶液、1μL浓度为10mM的dATP水溶液、3μL浓度为3000U/mL的T4DNA聚合酶和7μL ddH2O组成。
(6)完成步骤(5)后，取所述去除单片段体系，12℃反应2h。
(7)取完成步骤(6)后的体系，采用QIAGEN PCR纯化试剂盒进行DNA纯化，并用60μLddH2O洗脱，得到Bio-Hi-C DNA溶液。
8、超声处理液
(1)取40μL步骤7中(7)得到的Bio-Hi-C DNA溶液，加入560μL ddH2O，得到稀释液；将所述稀释液置于冰上，然后超声。超声的具体参数为：超声频率35％；超声1s，停1s，超声总时间为200s。
(2)取完成步骤(1)后的体系，采用QIAGEN PCR纯化试剂盒进行DNA纯化，并用40μLddH2O进行洗脱，得到超声处理液。
9、Bio-Hi-C DNA的富集
(1)取20μLMyOneTM Streptavidin C1，置于磁力架上1-2min，弃beads储液。
(2)完成步骤(1)后，取beads，用100μL含0.05％(0.05mg/100mL)Tween的1×B&Wbuffer清洗三次，然后弃上清。
(3)完成步骤(2)后，取所述beads，用100μL 1×B&W buffer清洗一次。
(4)完成步骤(3)后，向所述beads中加入20μL步骤7中(7)得到的Bio-Hi-C DNA溶液和20μL 2×B&W buffer，混匀，然后置于混匀仪上，室温反应15min；弃上清。
(5)完成步骤(4)后，取所述beads，先用100μL含0.05％(0.05mg/100mL)Tween的1×B&W buffer清洗一次；再用100μL 1×B&W buffer清洗一次；最后用预冷pH8.0、10mMTris-HCl缓冲液清洗一次。
10、转座反应
(1)制备转座反应体系。25μL转座反应体系由完成步骤9中(5)的所述beads、12.5μL 2×Tagment DNA buffer、1μL Tagment DNA Enzyme和11.5μL ddH2O组成。
(2)完成步骤(1)后，取所述转座反应体系，置于混匀仪上，37℃反应3min。
(3)完成步骤(2)后，弃上清，然后加入100μL终止反应缓冲液，反应2min。
(4)完成步骤(3)后，弃上清，然后加入预冷pH8.0、10mM Tris-HCl缓冲液清洗两次，将所述beads转移至新的EP管中，加入10μL ddH2O进行溶解，液相即为模板溶液。
11、PCR鉴定
(1)制备PCR扩增反应体系甲。38μL PCR扩增反应体系甲由25μL 2×KAPA HiFihotstart mix和13μL ddH2O组成。
(2)完成步骤(1)后，取所述PCR扩增反应体系甲，98℃处理45s。
(3)制备PCR扩增反应体系乙。50μL PCR扩增反应体系乙由38μL完成步骤(2)的体系、1μL浓度为25μM的Nextra Primer 1.0(核苷酸序列为：5’
-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-3’)、1μL浓度为25μM的Nextra Primer 2.1(核苷酸序列为：5’
-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCGCCTTAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT-3’)和10μL步骤10中(4)得到的模板溶液组成。
(4)完成步骤(3)后，取所述PCR扩增反应体系乙，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
PCR反应程序为：72℃延伸5min；98℃变性30s；98℃变性15s，65℃退火30s，72℃延伸30s，共15个循环；72℃延伸1min。
(5)完成步骤(4)后，取所述PCR扩增产物，采用QIAGEN MinElute PCR纯化试剂盒进行DNA纯化，并用20μL ddH2O进行洗脱，得到洗脱液。
(6)完成步骤(5)后，向20μL洗脱液中加入4μL 6×loading buffer，混匀，进行2％琼脂糖凝胶电泳(电压设置为100V，电泳时间为60min)。
(7)完成步骤(6)后，在紫外灯下切割条带大小为200-500bp的胶块，然后采用QIAGEN MinElute胶回收试剂盒进行回收，并用10μL ddH2O进行洗脱，得到DNA测序溶液甲。
步骤(4)获得PCR扩增产物即为采用本发明提供的方法构建的冰岛硫化叶菌REY15A的Hi-C高通量测序文库。
12、高通量测序
采用测序仪对步骤11中(7)得到的DNA测序溶液甲进行高通量测序，然后利用软件对Hi-C数据进行分析。
按照上述步骤9至11的方法，将步骤9中(4)的“步骤7中(7)得到的Bio-Hi-C DNA溶液”替换为“步骤8中(2)得到的超声处理液”，将步骤11中(3)的“Nextra Primer 2.1”替换为“Nextra Primer 2.2(核苷酸序列为：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAGTACGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT-3’)”，其它步骤均不变，得到DNA测序溶液乙；采用测序仪DNA测序溶液乙进行高通量测序，然后利用软件对Hi-C数据进行分析。
二、采用常规方法构建冰岛硫化叶菌REY15A的Hi-C高通量测序文库
1、同步骤一中1。
2、同步骤一中2。
3、同步骤一中3。
4、同步骤一中4。
5、同步骤一中5。
6、同步骤一中6。
7、同步骤一中7。
8、同步骤一中8。
9、末端补平
(1)制备末端补平体系。50μL末端补平体系由10μL(约100ng)步骤8得到的超声处理液、5μL 10×T4DNA连接酶buffer、0.5μL浓度为10mM的dATP、0.5μL浓度为10mM的dTTP、0.5μL浓度为10mM的dCTP、0.5μL浓度为10mM的dGTP、1μL浓度为5weiss U/μL的T4DNA聚合酶、1μL浓度为1U/μL的DNA聚合酶I(Klenow大片段)稀释液、1μL浓度为10U/μL的T4多聚核苷酸激酶和30μL ddH2O组成。
DNA聚合酶I(Klenow大片段)稀释液为用无菌水将DNA聚合酶I(Klenow大片段)稀释至5倍体积得到的。
(2)完成步骤(1)后，取末端补平体系，20℃反应30min。
(3)取完成步骤(2)后的末端补平体系，采用QIAGEN PCR纯化试剂盒进行DNA纯化，并用34μL ddH2O进行洗脱，得到末端补平溶液。
10、加“A”反应
(1)制备加“A”体系。50μL加“A”体系由34μL末端补平溶液、5μL10×NEB2.1buffer、10μL浓度为1mM的dATP和1μL浓度为5U/μL的Klenow片段(3’→5’exo-)组成。
(2)完成步骤(1)后，取加“A”体系，37℃反应30min。
(3)取完成步骤(2)后的加“A”体系，采用QIAGEN PCR纯化试剂盒进行DNA纯化，并用9μL ddH2O进行洗脱，得到末端加“A”溶液。
11、连接接头
(1)制备接头反应体系。25μL接头反应体系由9μL末端加“A”溶液、12.5μL2×快速连接酶buffer、1μL adaptor混合物稀释液和2.5μL DNA快速连接酶组成。
adaptor混合物稀释液为用水将adaptor混合物稀释至20倍体积得到的。adaptor混合物为引物Top adapter：5′-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC-3’和引物Bottomadapter：5′-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGGAATGCCGAG-3’组成的混合物。adaptor混合物中，引物Top adapter和引物Bottom adapter的浓度均为25μM。引物Top adapter和引物Bottomadapter均由Invitrogen公司合成。
(2)完成步骤(1)后，取接头反应体系，22℃反应15min。
(3)取完成步骤(2)后的接头反应体系，采用QIAGEN PCR纯化试剂盒进行DNA纯化，并用10μL ddH2O进行洗脱，得到洗脱液。
(4)完成步骤(3)后，向10μL洗脱液中加入4μL 6×loading buffer，混匀，进行2％琼脂糖凝胶电泳(电压设置为100V，电泳时间为60min)。
(5)完成步骤(4)后，在紫外灯下切割条带大小为200-500bp的胶块，然后采用QIAGEN MinElute胶回收试剂盒进行回收，并用20μL ddH2O进行洗脱，得到末端连接接头溶液。
12、Bio-Hi-C DNA的富集
(1)取20μLMyOneTM Streptavidin C1，置于磁力架上1-2min，弃beads储液。
(2)完成步骤(1)后，取beads，用100μL含0.05％(0.05mg/100mL)Tween的1×B&Wbuffer清洗三次，然后弃上清。
(3)完成步骤(2)后，取所述beads，用100μL 1×B&W buffer清洗一次。
(4)完成步骤(3)后，向所述beads中加入20μL末端连接接头溶液和20μL2×B&Wbuffer，混匀，然后置于混匀仪上，室温反应15min；弃上清。
(5)完成步骤(4)后，取所述beads，先用100μL含0.05％(0.05mg/100mL)Tween的1×B&W buffer清洗一次，再用100μL 1×B&W buffer清洗一次，最后用预冷pH8.0、10mMTris-HCl缓冲液清洗一次。
(6)完成步骤(5)后，将所述beads转移至新的EP管中，加入10μL ddH2O进行溶解，液相即为模板溶液。
13、PCR鉴定
(1)制备PCR扩增反应体系。50μL PCR扩增反应体系由25μL 2×KAPA HiFihotstart mix、1μL浓度为25μM的Illumina Primer 1.0(核苷酸序列为：5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’)、1μL浓度为25μM的Illumina Primer Index 12(核苷酸序列为：5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCTTGTAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’)、10μL步骤12中(6)得到的模板溶液和13μL ddH2O组成。
(2)完成步骤(1)后，取所述PCR扩增反应体系，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
PCR反应程序为：98℃变性2min45s；98℃变性15s，65℃退火30s，72℃延伸30s，共15个循环；72℃延伸5min。
(3)完成步骤(2)后，取所述PCR扩增产物，采用QIAGEN MinElute PCR纯化试剂盒进行DNA纯化，并用20μL ddH2O进行洗脱，得到洗脱液。
(4)完成步骤(3)后，向20μL洗脱液中加入4μL 6×loading buffer，混匀，进行2％琼脂糖凝胶电泳(电压设置为100V，电泳时间为60min)。
(5)完成步骤(4)后，在紫外灯下切割条带大小为200-500bp的胶块，然后采用QIAGEN MinElute胶回收试剂盒进行回收，并用10μL ddH2O进行洗脱，得到DNA测序溶液丙。
步骤(2)获得PCR扩增产物即为采用常规方法构建的冰岛硫化叶菌REY15A的Hi-C高通量测序文库。
14、高通量测序
采用测序仪对步骤13中(5)得到的DNA测序溶液丙进行高通量测序，然后利用软件对Hi-C数据进行分析。
DNA测序溶液甲、DNA测序溶液乙和DNA测序溶液丙的Hi-C数据分析结果见图1至图18。结果表明，与DNA测序溶液丙的Hi-C数据相比，DNA测序溶液甲和DNA测序溶液乙的可用连接片段数均较多(即冗余片段数较少)，酶切片段中可用连接片段数均较多(即不可用连接片段数较少)；“DNA测序溶液甲与DNA测序溶液乙”的染色质覆盖度一致性和相互作用一致性均高于“DNA测序溶液甲与DNA测序溶液丙”和“DNA测序溶液乙与DNA测序溶液丙”。
上述结果表明，采用本发明提供的方法构建Hi-C高通量测序文库的结果稳定可靠，而且数据质量更高，更易标准化，步骤更少(本发明所提供的方法构建Hi-C高通量测序文库只需经过转座反应即可进行PCR鉴定，而常规方法构建Hi-C高通量测序文库需经过末端补平、加“A”和连接接头等步骤才可进行PCR鉴定)，时间更短(采用常规方法构建Hi-C高通量测序文库的时间为1-2d，采用本发明所提供的方法构建Hi-C高通量测序文库的时间约3h)，更节约资源(采用常规方法构建Hi-C高通量测序文库的步骤较多，因此DNA样品损失也较多)。

Claims (10)

1.一种构建Hi-C高通量测序文库的方法，依次包括如下步骤：
(1)取解交联后的DNA，进行纯化和富集；
(2)进行转座反应；
(3)进行PCR扩增，获得文库。
2.一种构建Hi-C高通量测序文库的方法，依次包括如下步骤：
(1)取解交联后的DNA，进行纯化；
(2)超声处理，进行富集；
(3)进行转座反应；
(4)进行PCR扩增，获得文库。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述“转座反应”的反应体系包括：完成上一步骤的DNA和转座酶。
4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述转座反应的条件为：37℃3min。
5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述“进行转座反应”之后、所述“进行PCR扩增，获得文库”之前，还包括步骤(A)：从完成所述转座反应的体系中分离DNA。
6.如权利要求1至5任一所述的方法，其特征在于：所述“进行PCR扩增，获得文库”的具体步骤依次如下：
(a)制备反应体系甲；所述反应体系甲由缓冲液和ddH2O组成；
(b)取所述反应体系甲，95-100℃处理40-50s；
(c)制备反应体系乙；所述反应体系乙由完成步骤(b)的体系、上游引物、下游引物和从完成所述转座反应的体系中分离的DNA组成；
(d)取所述反应体系乙，进行PCR扩增。
7.如权利要求2至6任一所述的方法，其特征在于：所述超声处理的参数为：超声频率35％；超声1s，停1s，超声总时间为200s。
8.如权利要求1至7任一所述的方法，其特征在于：所述“解交联后的DNA”的制备方法依次包括如下步骤：
(1)用甲醛固定生物细胞核染色质；
(2)裂解所述生物细胞，收集细胞核；
(3)限制性内切酶酶切；
(4)加入生物素化的脱氧核糖核苷酸，连接；
(5)加入蛋白酶K，解交联。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述生物为细菌、植物或动物。
10.含有转座酶的试剂盒；该试剂盒用于构建Hi-C高通量测序文库。
CN201611166469.8A 2016-12-16 2016-12-16 一种构建Hi-C高通量测序文库的方法 Active CN106637422B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611166469.8A CN106637422B (zh) 2016-12-16 2016-12-16 一种构建Hi-C高通量测序文库的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611166469.8A CN106637422B (zh) 2016-12-16 2016-12-16 一种构建Hi-C高通量测序文库的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106637422A true CN106637422A (zh) 2017-05-10
CN106637422B CN106637422B (zh) 2023-10-13

Family

ID=58822754

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201611166469.8A Active CN106637422B (zh) 2016-12-16 2016-12-16 一种构建Hi-C高通量测序文库的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106637422B (zh)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109056078A (zh) * 2018-09-18 2018-12-21 武汉菲沙基因信息有限公司 一种适用于细菌的Hi-C高通量测序建库方法
WO2019006975A1 (zh) * 2017-07-07 2019-01-10 清华大学 极小量细胞原位全基因组染色质构象捕获方法
CN109735900A (zh) * 2019-03-20 2019-05-10 嘉兴菲沙基因信息有限公司 一种适用于Hi-C的小片段DNA文库构建方法
CN110527715A (zh) * 2019-09-16 2019-12-03 中国科学院遗传与发育生物学研究所农业资源研究中心 一种功能基因组克隆子库的测序方法
CN110607352A (zh) * 2019-08-12 2019-12-24 安诺优达生命科学研究院 构建dna文库的方法及其应用
CN111364105A (zh) * 2020-04-30 2020-07-03 华中农业大学 一种简便有效的植物长片段in situ DLO Hi-C测序文库的构建方法
CN116755692A (zh) * 2023-08-18 2023-09-15 山东为农信息科技有限公司 涉及安卓系统的无限层级选择方法及系统

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103710323A (zh) * 2012-10-01 2014-04-09 安捷伦科技有限公司 用于dna断裂和标记的固定化的转座酶复合体
CN103938277A (zh) * 2014-04-18 2014-07-23 中国科学院北京基因组研究所 以痕量dna为基础的二代测序文库构建方法
CN104561362A (zh) * 2015-02-03 2015-04-29 北京诺禾致源生物信息科技有限公司 高通量测序文库及其构建方法
CN105525357A (zh) * 2014-09-30 2016-04-27 深圳华大基因股份有限公司 一种测序文库的构建方法及试剂盒和应用
CN105839196A (zh) * 2016-05-11 2016-08-10 北京百迈客生物科技有限公司 一种真核生物DNA的Hi-C高通量测序建库方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103710323A (zh) * 2012-10-01 2014-04-09 安捷伦科技有限公司 用于dna断裂和标记的固定化的转座酶复合体
CN103938277A (zh) * 2014-04-18 2014-07-23 中国科学院北京基因组研究所 以痕量dna为基础的二代测序文库构建方法
CN105525357A (zh) * 2014-09-30 2016-04-27 深圳华大基因股份有限公司 一种测序文库的构建方法及试剂盒和应用
CN104561362A (zh) * 2015-02-03 2015-04-29 北京诺禾致源生物信息科技有限公司 高通量测序文库及其构建方法
CN105839196A (zh) * 2016-05-11 2016-08-10 北京百迈客生物科技有限公司 一种真核生物DNA的Hi-C高通量测序建库方法

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019006975A1 (zh) * 2017-07-07 2019-01-10 清华大学 极小量细胞原位全基因组染色质构象捕获方法
CN109056078A (zh) * 2018-09-18 2018-12-21 武汉菲沙基因信息有限公司 一种适用于细菌的Hi-C高通量测序建库方法
CN109735900A (zh) * 2019-03-20 2019-05-10 嘉兴菲沙基因信息有限公司 一种适用于Hi-C的小片段DNA文库构建方法
CN110607352A (zh) * 2019-08-12 2019-12-24 安诺优达生命科学研究院 构建dna文库的方法及其应用
WO2021027236A1 (zh) * 2019-08-12 2021-02-18 安诺优达基因科技(北京)有限公司 构建dna文库的方法及其应用
CN110527715A (zh) * 2019-09-16 2019-12-03 中国科学院遗传与发育生物学研究所农业资源研究中心 一种功能基因组克隆子库的测序方法
CN111364105A (zh) * 2020-04-30 2020-07-03 华中农业大学 一种简便有效的植物长片段in situ DLO Hi-C测序文库的构建方法
CN111364105B (zh) * 2020-04-30 2021-09-07 华中农业大学 一种简便有效的植物长片段in situ DLO Hi-C测序文库的构建方法
CN116755692A (zh) * 2023-08-18 2023-09-15 山东为农信息科技有限公司 涉及安卓系统的无限层级选择方法及系统
CN116755692B (zh) * 2023-08-18 2023-11-24 山东为农信息科技有限公司 涉及安卓系统的无限层级选择方法及系统

Also Published As

Publication number Publication date
CN106637422B (zh) 2023-10-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106637422B (zh) 一种构建Hi-C高通量测序文库的方法
WO2012159564A1 (zh) 甲基化高通量检测方法
WO2013104106A1 (zh) 用于构建血浆dna测序文库的方法和试剂盒
CN109593757B (zh) 一种探针及其适用于高通量测序的对目标区域进行富集的方法
CN112251821A (zh) 一种快速高效的构建二代测序文库的试剂盒
CN111893170B (zh) 一种在全基因组范围内体外检测CRISPR-Cas脱靶效应的方法
CN112941635A (zh) 一种提高文库转化率的二代测序建库试剂盒及其方法
WO2023202030A1 (zh) 一种小分子rna的高通量测序文库构建方法
CN108265104B (zh) 染色体构型捕捉文库及其构建方法
CN110951827B (zh) 一种转录组测序文库快速构建方法及其应用
CN103820467A (zh) 一种牡丹sine类转录转座子序列的分离方法
WO2023116718A1 (zh) 酶法靶序列随机sgRNA文库的制备方法
CN110158157B (zh) 基于模板材料合成长度固定和特定末端序列dna文库的方法
CN115851876A (zh) 一种同时获取全基因组转录和蛋白-dna结合信息的测序方法
CN104561244A (zh) 基于二代测序技术的微生物单细胞转录组分析方法
CN116218953B (zh) 一种连接核酸片段与接头的方法
CN116179650B (zh) 一种高通量组织样本染色质免疫共沉淀合并染色质构象捕获方法
CN105861486A (zh) 从混合核酸中获得目标核酸的方法
TW202039838A (zh) 一種單鏈dna合成方法
CN118185922A (zh) 一种富集胎儿游离dna的血浆核酸提取方法
JP2002253237A (ja) ノーマライズ／サブトラクトされたｃＤＮＡライブラリーの作成方法
CN118048436B (zh) 用于微量细胞的靶向染色质互作捕获ULI-eHiChIP建库方法及应用
WO2018214036A1 (zh) 基于滚环扩增的基因组目标区域富集方法及其应用
CN113005178A (zh) 一种rna文库的构建方法及试剂盒
WO2020135650A1 (zh) 一种基因测序文库的构建方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB03 Change of inventor or designer information
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Zhao Zhihu

Inventor after: Shen Wenlong

Inventor after: Ye Bingyu

Inventor after: He Chao

Inventor before: Ye Bingyu

Inventor before: He Chao

Inventor before: Zhao Zhihu

Inventor before: Shen Wenlong

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant