TW202039838A

TW202039838A - 一種單鏈dna合成方法

Info

Publication number: TW202039838A
Application number: TW108147968A
Authority: TW
Inventors: 葉露萌; 孫海燁; 李一凡; 吳政憲
Original assignee: 大陸商江蘇金斯瑞生物科技有限公司
Priority date: 2018-12-28
Filing date: 2019-12-27
Publication date: 2020-11-01
Also published as: TWI862533B; KR20210110790A; EP3904511A1; KR102819697B1; JP7550761B2; CN113227370A; WO2020135651A1; US12252722B2; JP2022515085A; US20220042059A1; IL283989A; CN113227370B; EP3904511A4

Abstract

提供了一種單鏈DNA合成方法，涉及基因合成領域，具體涉及一種無鹼基突變的單鏈DNA的製備工藝。具體地本發明提供一種通過尿嘧啶特異性減除酶(USER)介導的雙鏈DNA自動成環結合滾環複製來製備單鏈DNA的方法。

Description

一種單鏈DNA合成方法

本發明涉及生物工程領域，具體涉及無鹼基突變的單鏈DNA的製備工藝。

在基因修復和外援功能基因插入方面，單鏈DNA模板在各個方面顯示出了相較於雙鏈DNA模板的諸多優勢，比如編輯效率更高，對脆弱的哺乳動物細胞的細胞毒性更小，編輯錯誤/脫靶率更低，最後一點對於基因治療又至關重要。

但目前，由於技術難，成本高，產量低，造成單鏈DNA模板的價格及其昂貴，大大限制了利用此方法進行研究的成本。化學合成的單鏈有200鹼基的長度限制，且常規的配套下游純化方式並不能除去產品中含有的錯誤序列。常用的製備單鏈DNA樣品的方法有核酸外切酶消化法，不對稱PCR法，和磁珠吸附法。但以上這些方法均有不足之處：比如核酸外切酶會在消化反義鏈的同時非特異性地降解目的條帶，這樣無法提供與要求完全一致的產品；不對稱PCR是一種成本低廉的生產方法，但其生產效率對序列的要求尚不明確，使其生產效果不可控，不適用於穩定生產；生物素-鏈黴親和素磁珠吸附法雖操作簡單，產量穩定，但國外進口的高質量磁珠價格高，購買等待時間長久，使得把核心生產技術放在一款國外產品的做法變成一種高風險的隱患。

為了開發純度更高，使用量充裕且價格低廉的單鏈DNA模板樣品，發明人將尿嘧啶特異性減除酶(USER)介導的雙鏈DNA自動成環方法，經特殊序列設計而達到的單鏈DNA退火過程中自動折疊，可精准切割目的單鏈片段的II型限制性內切酶與恒溫擴增單鏈DNA的滾環複製結合起來，開發了一種通用，高效的長單鏈DNA製備工藝。

本發明的目的在於開發一種高劑量，高純度，高序列保真度的單鏈DNA製備工藝，以解決該類產品價格過高且產量不高問題。該工藝可將長於200nt的單鏈DNA的產量從幾μg提高到幾百μg，從而達到nmol級別；也可將1350nt長度的單鏈DNA的產量從幾μg提高到幾十μg。

作為示例，本發明的流程可包括以下步驟：

步驟一(序列分析流程)：對目標DNA序列(例如任何長度在150-2500 nt DNA序列)進行生物信息學分析，查看序列所包含的II型限制性內切酶識別切割位點。選取一個常用但不包含在目的序列中的II型限制性內切酶，比如BsaI，確定其酶切位點序列以備用於目的序列兩邊的適配序列和通用引物的設計；

步驟二(引物設計流程)：在目的序列兩端分別添加左適配序列和右適配序列，一併進行基因合成；其中，左適配序列從5’到3’端依次包括一段同源臂(至少4個核苷酸，較佳6-10個核苷酸，比如8個核苷酸)、一個T核苷酸，選定的II型限制性內切酶識別位點，以及任選的1個或數個核苷酸的附加序列，該附加序列與選定的II型限制性內切酶識別位點一起構成該II型限制性內切酶的切割位點(在某些實施例中，II型限制性內切酶識別位點與其切割位點相同，此時沒有附加序列)，使得該II型限制性內切酶可以在該附加殘基序列的3’端切割；而右適配序列從5’到3’端依次包含選定的II型限制性內切酶識別位點的反向互補序列和一段同源臂，該同源臂與左適配序列的同源臂相同，但3’端少1-3個核苷酸；且在所述識別位點的反向互補序列的5’端有任選的一個或幾個核苷酸的附加序列，該附加序列與該識別位點的反向互補序列一起構成該II型限制性內切酶的切割位點(在某些實施例中，II型限制性內切酶識別位點與其切割位點相同，此時沒有附加序列)。較佳地；左右適配序列長度相差1-4個鹼基。

步驟三(模板擴增製備-自動成環)：用分別含有尿嘧啶(U)修飾的正向和反向引物對兩端含有左右適配序列的基因合成的片段進行PCR擴增，其中該U修飾位於引物序列中與同源臂對應的序列的3’。純化產物，用USER酶(New England BioLabs Inc.)對純化的產物進行消化，在所述尿嘧啶處切斷以產生粘性末端，再用T4 DNA連接酶(New England BioLabs Inc.)連接兩個粘性末端，使得擴增產物自身環化以產生帶缺口的dsDNA環，以用作滾環複製的底物。

其中，模板擴增為常規的PCR操作流程，反應體系依照具體使用的DNA 聚合酶及其配套緩衝液來決定，PCR反應的退火溫度依照具體的引物序列來決定，PCR反應的延伸時間依照具體的模板序列長度而定；

其中，用USER酶和T4 DNA連接酶製備帶缺口的環狀雙鏈DNA的自環化的反應體系為：100 ng純化的雙鏈DNA模板產物，1 μl 10xT4 DNA連接酶反應緩衝液，1 μl USER酶，1 μl T4 DNA連接酶，補足ddH₂ O至最終總反應體系10μl，37℃ 溫育30min, 20℃ 溫育30min, 然後降溫並保存在4℃；

步驟四(滾環複製)：在200 μl PCR管中，將100 ng 步驟三製備的帶缺口的環狀DNA樣本，加入10μl 10x擴增緩衝液(500 mM Tris-HCl, 50 mM MgCl₂ , 750 mM KCl, 40 mM DTT, pH 8.2，25℃)、10.0μl BSA(2mg/ml)、1.0μl dNTP(10 mM)、5μl phi29 DNA聚合酶(5U/μl)、補足 ddH₂ O至最終總反應體系100μl，30℃擴增4-8小時， 65℃處理10分鐘，冷卻至4℃；

步驟五(退火-自動折疊)：將進行滾環複製的PCR管放入PCR進行如下退火程序，以形成髮卡結構：80℃，5min， 0.1℃/s降至65℃, 65℃，5min, 0.1℃/s降至42℃, 42℃, 5 min, 37℃, 5min, 0.1℃/s降至4℃, 然後保存在4℃；

步驟六(限制性內切酶切割-釋放目標片段長單鏈單體)：在上述反應產物中加入15μl 10x限制性內切酶緩衝液，2μl 之前選定的II型限制性內切酶，加入ddH₂ O 至150μl 體積，放置在限制性內切酶的最適反應溫度60min，然後熱變性滅活。

步驟七(純化、濃縮)：限制性內切酶切割產物包含目的片段的單鏈DNA產物，髮卡結構，在目標片段大於300nt時還會含有其它不明DNA片段，製作者可以跟據實際生產和使用情況進行磁珠回收或瓊脂糖凝膠電泳切膠回收，並在回收後經凍幹或異丙醇沈澱進行濃縮。

具體地，本申請提供如下各項技術方案：

1. 一種製備目標單鏈DNA的方法，其包括： (1)獲得由第一鏈和與之反向互補的第二鏈組成的模板雙鏈DNA分子，其中第一鏈的序列結構如式(I) 所示：5’ 左適配 序列 - 目標單鏈 DNA 序列 - 右適配 序列 3’ 式 (I) ，其中，左適配序列的序列結構如下式所示：X_n TX_q X_A ；右適配序列的序列結構如下式所示：X_B X_q ’X_n _-m ，式中，X_n 為一段由n個核苷酸組成的核苷酸序列，其中5’核苷酸為A；n為至少4的任一整數； X_q 為一種II型限制性內切酶的識別位點序列，且X_q 在目標單鏈DNA序列中不存在；X_q ’為X_q 的反向互補序列；X_A 、X_B 分別為任選的0個至數個核苷酸，使得X_q X_A 、X_B X_q ’分別構成該II型限制性內切酶的切割位點，允許該II型限制性內切酶在X_q X_A 序列的3’端及X_B X_q ’序列的5’端切割； X_n _-m 為X_n 的自5’起n-m個核苷酸的序列，m為1-3的整數； A表示腺嘌呤核苷酸；T表示胸腺嘧啶核苷酸； (2)以模板雙鏈DNA分子為模板，用正向引物和反向引物進行PCR擴增，得到產物DNA雙鏈分子，其包含含有目標單鏈DNA序列的第一鏈以及與其反向互補的第二鏈；其中所述正向引物包含X_n UX_q X_A 的序列，所述反向引物包含X_n-m ’X_q X_B ’的序列，其中，X_n 、X_q 、X_A 、X_B 與(1)中的相同；X_n _-m ’為所述X_n _-m 的反向互補序列，但其中3’端的T用U代替；X_B ’為所述X_B 的反向互補序列；U為尿嘧啶核苷酸； (3)用尿嘧啶特異性切除試劑在產物DNA雙鏈分子兩條鏈中所含的U處分別切斷，以在產物DNA雙鏈分子的兩個末端產生粘性末端； (4)在連接酶存在下，令產物DNA雙鏈分子的兩個粘性末端相互連接，從而形成環狀雙鏈DNA，其中第一鏈含有缺口； (5)對步驟(4)得到的環狀雙鏈DNA進行滾環複製，其中複製以產物DNA雙鏈分子第一鏈的缺口為起始點，以其第二鏈作為模板，從而獲得包含多個串聯的下述式(II)所示序列結構的複製子：-X_n TX_q X_A - 目標單鏈 DNA 序列 -X_B X_q ’- 式 (II) ； (6)對複製子進行退火，使得複製子中相鄰的兩個目標單鏈DNA序列之間形成髮卡結構，較佳地，所述髮卡結構由X_q ’ X_n TX_q 的序列構成； (7)用所述II型限制性內切酶處理複製子，在相鄰的目標單鏈DNA序列之間的X_B X_q ’ X_n TX_q X_A 序列的5’端和3’端分別切割，從而釋放出多個目標單鏈DNA序列。

2. 根據項1所述的方法，其中所述II型限制性內切酶選自AlwI、BbsI、BbvI、BceAI、BCIVI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BspMI、BspQI、HphI、HpyAV、FokI、FauI、HgaI。

3. 根據項1-2任一項所述的方法，其中所述尿嘧啶特異性切除試劑是尿嘧啶特異性減除酶(USER^TM )。

4. 根據項1-3任一項所述的方法，其中，所述連接酶是T4 DNA連接酶。

5. 根據項1-4任一項所述的方法，其中，所述步驟(3)和(4)在同一反應體系中，在尿嘧啶特異性切除試劑和連接酶同時存在下進行。

6. 根據項1-5任一項所述的方法，其中，滾環複製使用有連續複製能力的DNA聚合酶，較佳phi29 DNA聚合酶進行。

7. 根據項1-6任一項所述的方法，其中所述II型限制性內切酶為BspQI。

8. 根據項7所述的方法，其中X_q X_A 的序列為GCTCTTCN，其中N為A，T，C或G，較佳A；且X_B X_q ’的序列為N₁ N₂ N₃ N₄ GAAGAGC，其中N₁ 、N₂ 、N₃ 、N₄ 獨立地選自A，T，C或G；更佳地，X_B X_q ’的序列為CCTT GAAGAGC。

9. 根據項1-8任一項所述的方法，其中n為6-10。

10. 根據項1-9任一項所述的方法，其中n為8。

11. 根據項1-10任一項所述的方法，其中m為1。

12. 根據項1-11任一項所述的方法，其中X_n 的序列為AACTATAC，且X_n _-m 的序列為AACTATA。

13. 根據項1-12任一項所述的方法，其中所述目標單鏈DNA的長度為150-2500 nt。

14. 根據項1-13任一項所述的方法，其中所述方法包括在製備模板雙鏈DNA分子之前對目標單鏈DNA序列進行序列分析，選擇在目標單鏈DNA序列中沒有切割位點的II型限制性內切酶。

15. 一種用於擴增目標DNA序列的套組，其包含：左適配子，其序列如下式所示：X_n TX_q X_A ；右適配子，其序列如下式所示：X_B X_q ’X_n _-m ，式中，X_n 為一段由n個核苷酸組成的核苷酸序列，其中5’核苷酸為A；n為至少4的任一整數，較佳6-8，更佳8； X_q 為一種II型限制性內切酶的識別位點序列，且X_q 在目標單鏈DNA序列中不存在；X_q ’為X_q 的反向互補序列；X_A 、X_B 分別為任選的0個至數個核苷酸，使得X_q X_A 、X_B X_q ’分別構成該II型限制性內切酶的切割位點，允許該II型限制性內切酶在X_A 的3’端及X_B 的5’端切割； X_n _-m 為X_n 的自5’起n-m個核苷酸的子序列，m為1-3的整數； A表示腺嘌呤核苷酸；T表示胸腺嘧啶核苷酸。

16. 項15所述的套組，其進一步包含：正向引物，其包含X_n UX_q X_A 的序列，反向引物，其包含X_n-m ’X_q X_B ’的序列，其中，X_n 、X_q 、X_A 、X_B 與所述適配子中的相同； X_n _-m ’為所述X_n _-m 的反向互補序列，但其中3’端的T用U代替；X_B ’為所述X_B 的反向互補序列；U為尿嘧啶核苷酸，其中正向引物和反向引物容許以目標DNA序列為模板進行PCR擴增。

17. 一種用於製備單鏈DNA的套組，其包含：適用於聚合酶鏈式反應的DNA聚合酶； DNA連接酶，較佳T4 DNA連接酶；尿嘧啶特異性切除試劑，較佳尿嘧啶特異性減除酶；適用於滾環擴增的DNA聚合酶，較佳phi29 DNA聚合酶；和 II型限制性內切酶。

18. 項16所述的套組，其還包含如項15中定義的左適配子和右適配子，以及如項16中定義的正向引物和反向引物。

19. 項17或18的套組，其中DNA連接酶和尿嘧啶特異性切除試劑置於同一容器中。

有益效果

本發明所開發的單鏈DNA製備工藝，形成了一套高質量單鏈DNA模板的方法。由於大部分操作步驟在恒溫孵育條件下進行，所以該工藝對生產設備和放大規模都有很高的適配性。且製備原料為常規的引物和酶製劑，無需昂貴的進口鏈黴親和素修飾磁珠，在製備大量(幾十μg)單鏈DNA時，其成本要低廉很多。

為了進一步瞭解本發明所闡述的方法，以下結合附圖及實例對本發明做進一步的闡述。

實例 1 ：

本實例採用此工藝製備了48 μg 長度為253 nt 長單鏈DNA, 純度為 91%，序列正確率為100%：

測試樣本為253nt長度的DNA序列(SEQ ID NO: 1)。

本實例單鏈DNA製備過程如下：

1)步驟一(序列分析流程)：經生物信息學軟體分析，得知序列裡不包含BspQI 酶切位點，遂選該酶用作最後的切割酶。

2)步驟二(引物設計流程)：在目的序列兩端分別加上序列5’-AACTATACT GCTCTTCA-3’ (SEQ ID NO:4)和 5’-CCTTGAAGAGCAACTATA-3’, (SEQ ID NO: 5)然後進行基因合成；PCR擴增引物為正向引物Pf： 5’-AACTATACUGCTCTTCA-3’ (SEQ ID NO: 5)和反向引物Pr：5’- TATAGTUGCTCTTCAAGG-3’ (SEQ ID NO:6)，合成上述引物。

3)步驟三(模板擴增製備-自動成環)：用帶有尿嘧啶修飾的引物(Pf、Pr)對合成的帶兩端接頭的片段進行擴增，PCR反應的體系為：

反應體系 (100μL):
試劑	體積
253 (288bp)	μL
5*phusion HF緩衝液	20
10mM dNTPs	2
100% DMSO	3
253 UF(50μM)	1
253 UR(50μM)	1
DNA模板	1
phusion U Hot Start DNA聚合酶	1
ddH2O	71

PCR反應程序為：

反應條件
98℃	30s
98℃	10s
63 ℃	30s
72℃	8s
72℃	5min
4℃	長期

30個循環

PCR產物的電泳圖如圖1所示。

然後將該PCR產物回收，進行自成環反應。用USER酶和T4 DNA連接酶製備帶缺口的環狀雙鏈DNA的自環化的反應體系為：

PCR產物總量：	100ng
	μL
253-U	0.48
10*T4連接酶緩衝液	1
USER	1
T4連接酶	0.50
ddH2O	7.02

反應條件為：37℃，30min，20℃，30min，降溫至4℃保存。

4)步驟四(滾環複製)：在200 μl PCR管中，將100 ng 步驟三製備的帶缺口的環狀DNA樣本，滾環複製的反應條件為在30℃孵育4-8小時，然後80℃ 20min以將酶滅活。滾環複製的反應體系為

(以100 μL為例)：

試劑	μL
USER處理樣品	10
10*phi29 DNA聚合酶緩衝液	10
dNTP(10mM)	5
BSA(2mg/mL)	10
phi29 DNA聚合酶	5
ddH2O	60

5)步驟五(退火-自動折疊)：將上述滾環複製產物進行降溫退火以產生設計的髮卡結構，退火程序為：80℃，5min， 0.1℃/s降至65℃, 65℃，5min, 0.1℃/s降至42℃, 42℃, 5 min, 37℃, 5min, 0.1℃/s降至4℃, 然後保存在4℃；

6)步驟六(限制性內切酶切割-釋放目標片段長單鏈單體)：在上述反應產物中加入15μl 10x限制性內切酶緩衝液，2μl之前選定的II型限制性內切酶，加入ddH₂ O至150μl 體積，放置在限制性內切酶的最適反應溫度60min, 然後熱變性滅活。反應粗產物的電泳圖如圖2所示。

7)步驟七(純化、濃縮)：限制性內切酶切割產物包含目的片段的單鏈DNA產物，髮卡結構。由於該目的序列長度>300 nt, 所以採用磁珠進行高效純化。純化前後對比見圖3。其中泳道1為粗產物，泳道2為磁珠純化後產物，髮卡結構被有效去除，純度為91%。高通量測序技術(NGS)進行測序驗證，測得的序列結果見圖10，與SEQ ID NO: 1一致。

實例 2 ：

本實例採用此工藝製備了40 μg長度為1350 nt 長單鏈DNA (SEQ ID NO: 2)，純度為 97%, 序列正確率為100%：

測試樣本為1350nt長度的DNA序列。

本實例長單鏈DNA製備過程如下：

2)步驟二(引物設計流程)：在目的序列兩端分別加上序列5’-AACTATACTGCTCTTCA-3’和 5’-CCTTGAAGAGCAACTATA-3’,然後進行基因合成；PCR擴增引物為正向引物Pf：5’-AACTATACUGCTCTTCA-3’和反向引物Pr：5’- TATAGTUGCTCTTCAAGG-3’，然後進行引物合成。

反應體系 (100μl):
試劑	體積
1350	μL
5*phusion HF緩衝液	20
10mM dNTPs	2
100% DMSO	3
1350 UF(50μM)	1
1350 UR(50μM)	1
DNA模板	1
phusion U Hot Start DNA聚合酶	1
ddH2O	71

PCR反應程序為：

反應條件
98℃	30s
98℃	10s
63 ℃	30s
72℃	1min
72℃	5min
4℃	長期

30個循環

PCR 產物如圖5所示。

反應條件為：37℃，30min，20℃，30min，降溫至4℃保存。

4)步驟四(滾環複製)：在1.5 ml離心管中，將100 ng 步驟三製備的帶缺口的環狀DNA樣本，滾環複製的反應條件為在30℃孵育4-8小時，然後80℃ 20min以將酶滅活。滾環複製的反應體系為(8 ml 反應體系)：

試劑	μL
USER處理的樣品	800
10*phi29 DNA聚合酶緩衝液	800
dNTP(10mM)	400
BSA(2mg/mL)	800
phi29 DNA聚合酶	200
ddH2O	4800

5)步驟五(退火-自動折疊)：將上述滾環複製產物進行降溫退火以產生設計的髮卡結構，退火程序為：80℃，5min，0.1℃/s降至65℃, 65℃，5min, 0.1℃/s降至42℃, 42℃, 5 min, 37℃, 5min, 0.1℃/s降至4℃, 然後保存在4℃。

6)步驟六(限制性內切酶切割-釋放目標片段長單鏈單體)：在上述反應產物中加入150μl 10x限制性內切酶緩衝液，20μl 之前選定的II型限制性內切酶，加入ddH₂ O至1500μl 體積，放置在限制性內切酶的最適反應溫度60min, 然後熱變性滅活。反應粗產物如圖5所示。

7)步驟七(純化、濃縮)：限制性內切酶切割產物包含目的片段的單鏈DNA產物，髮卡結構。由於該目的序列因長度>300 nt, 所以用瓊脂糖凝膠電泳來進行切膠回收純化。純化後終產物見圖6：其中泳道1為純化後產物，髮卡結構和雙鏈DNA污染均被有效去除，純度為97%，序列正確度為100%。高通量測序技術(NGS)進行測序驗證，測得的序列結果見圖11，與SEQ ID NO: 2一致。

實例 3 ：

本實例採用此工藝製備了10 μg長度為2350 nt 長單鏈DNA (SEQ ID NO: 3), 純度為 93%, 序列正確率為100%：

測試樣本為2350nt 長度的DNA序列。

本實例長單鏈DNA製備過程如下：

PCR反應程序為：

反應條件
98℃	30s
98℃	10s
63 ℃	30s
72℃	2min
72℃	5min
4℃	長期

30個循環

PCR產物的電泳圖見圖7。

反應條件為：37℃，30min，20℃，30min，降溫至4℃保存。

4)步驟四(滾環複製)：在1.5 ml離心管中，將100 ng步驟三製備的帶缺口的環狀DNA樣本，滾環複製的反應條件為在30℃ 孵育4-8小時，然後80℃ 20min以將酶滅活。滾環複製的反應體系為(終反應體系為4ml, 1 ml/管反應)

試劑	μL
USER處理的樣品	400
10*phi29 DNA聚合酶緩衝液	400
dNTP(10mM)	200
BSA(2mg/mL)	400
phi29 DNA聚合酶	200
ddH2O	2400

5)步驟五(退火-自動折疊)：將上述滾環複製產物進行降溫退火以產生設計的髮卡結構，退火程式為：80℃，5min， 0.1℃/s降至65℃, 65℃，5min, 0.1℃/s降至42℃, 42℃, 5 min, 37℃, 5min, 0.1℃/s降至4℃，然後保存在4℃。

6)步驟六(限制性內切酶切割-釋放目標片段長單鏈單體)：在上述反應產物中加入150 μl 10x限制性內切酶緩衝液，20μl之前選定的II型限制性內切酶，加入ddH₂ O至1500μl體積，放置在限制性內切酶的最適反應溫度60min, 然後熱變性滅活。反應粗產物的電泳圖如圖9所示。

7)步驟七(純化、濃縮)：用限制性內切酶切割產物包含目的片段的單鏈DNA產物中的髮卡結構。由於該目的序列長度>300 nt，所以用瓊脂糖凝膠電泳來進行切膠回收純化。純化後終產物的電泳圖如圖9所示。其中泳道1為純化前粗產物，泳道2為純化後產物，髮卡結構和雙鏈DNA污染均被有效去除，純度為95%，序列正確度為100%。高通量測序技術(NGS)進行測序驗證，測得的序列結果見圖12，與SEQ ID NO: 3一致。

如上述三個實例所示，本方法可以用來生產150-2500 nt長度的長單鏈DNA。該方法對各種長度的序列均通用，且對儀器設備要求低，易於放大生產。純化後的長單鏈DNA純度高，序列保真度為100%，適用於作為CRISPR基因編輯的高效基因敲入模板。

無

圖1：實例1中用尿嘧啶修飾的引物對合成的帶兩端接頭的片段進行PCR擴增獲得的產物的瓊脂糖凝膠電泳結果。圖2：實例1中BspQI限制性內切酶切割髮卡結構後釋放的目標片段長單鏈單體的瓊脂糖凝膠電泳結果。圖3：實例1中對用BspQI限制性內切酶切割髮卡結構後獲得的產物進行磁珠純化前後的產物的瓊脂糖凝膠電泳結果。其中泳道1為純化前的粗產物，泳道2為磁珠純化後產物。圖4：實例2中用尿嘧啶修飾的引物對合成的帶兩端接頭的片段進行PCR擴增獲得的產物的瓊脂糖凝膠電泳結果。圖5：實例2中BspQI限制性內切酶切割髮卡結構後釋放的目標片段長單鏈單體的瓊脂糖凝膠電泳結果。圖6：實例2中對用BspQI限制性內切酶切割髮卡結構後獲得的產物進行磁珠純化後的產物的瓊脂糖凝膠電泳結果。圖7：實例3中用尿嘧啶修飾的引物對合成的帶兩端接頭的片段進行PCR擴增獲得的產物的瓊脂糖凝膠電泳結果。圖8：實例3中BspQI限制性內切酶切割髮卡結構後釋放的目標片段長單鏈單體的瓊脂糖凝膠電泳結果。圖9：實例3中對用BspQI限制性內切酶切割髮卡結構後獲得的產物進行磁珠純化後的產物的瓊脂糖凝膠電泳結果。圖10：實例1製備產物經高通量測序技術(NGS)測得的序列。圖11：實例2製備產物經高通量測序技術(NGS)測得的序列。圖12：實例3製備產物經高通量測序技術(NGS)測得的序列。

Claims

一種製備目標單鏈DNA的方法，其包括： (1)獲得由第一鏈和與之反向互補的第二鏈組成的模板雙鏈DNA分子，其中第一鏈的序列結構如式(I)所示： 5’左適配序列-目標單鏈DNA序列-右適配序列3’ 式(I)，其中，左適配序列的序列結構如下式所示：X_n TX_q X_A ；右適配序列的序列結構如下式所示：X_B X_q ’X_n _-m ，式中，X_n 為一段由n個核苷酸組成的核苷酸序列，其中5’核苷酸為A；n為至少4的任一整數， X_q 為一種II型限制性內切酶的識別位點序列，且X_q 在目標單鏈DNA序列中不存在；X_q ’為X_q 的反向互補序列；X_A 、X_B 分別為任選的0個至數個核苷酸，使得X_q X_A 、X_B X_q ’分別構成所述II型限制性內切酶的切割位點，允許所述II型限制性內切酶在所述X_q X_A 序列的3’端及所述X_B X_q ’序列的5’端切割； X_n _-m 為X_n 的自5’起n-m個核苷酸的序列，m為1-3的整數； A表示腺嘌呤核苷酸；T表示胸腺嘧啶核苷酸；以模板雙鏈DNA分子為模板，用正向引物和反向引物進行PCR擴增，得到產物DNA雙鏈分子，其包含含有目標單鏈DNA序列的第一鏈以及與其反向互補的第二鏈； (2)其中所述正向引物包含X_n UX_q X_A 的序列，所述反向引物包含X_n-m ’X_q X_B ’的序列，其中，X_n 、X_q 、X_A 、X_B 與(1)中的相同；X_n _-m ’為所述X_n _-m 的反向互補序列，但其中3’端的T用U代替；X_B ’為所述X_B 的反向互補序列；U為尿嘧啶核苷酸； (3)用尿嘧啶特異性切除試劑在產物DNA雙鏈分子兩條鏈中所含的U處分別切斷，以在產物DNA雙鏈分子的兩個末端產生粘性末端； (4)在連接酶存在下，令產物DNA雙鏈分子的兩個粘性末端相互連接，從而形成環狀雙鏈DNA，其中第一鏈含有缺口； (5)對步驟(4)得到的含缺口的環狀雙鏈DNA進行滾環複製，其中複製以產物DNA雙鏈分子第一鏈的缺口為起始點，以其第二鏈作為模板，從而獲得包含多個串聯的下述式(II)所示序列結構的複製子： 5’-X_n TX_q X_A -目標單鏈DNA序列-X_B X_q ^’ -3’ 式(II) ； (6)對複製子進行退火，使得複製子中相鄰的兩個目標單鏈DNA序列之間形成髮卡結構，較佳地，所述髮卡結構由X_q ’ X_n TX_q 的序列構成； (7)用所述II型限制性內切酶處理複製子，在相鄰的目標單鏈DNA序列之間的X_B X_q ’ X_n TX_q X_A 序列的5’端和3’端分別切割，從而釋放出多個目標單鏈DNA序列。
如申請專利範圍第1項所述的方法，其中所述II型限制性內切酶選自AlwI、BbsI、BbvI、BceAI、BCIVI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BspMI、BspQI、HphI、HpyAV、FokI、FauI、HgaI。
如申請專利範圍第1項至第2項中任一項所述的方法，其中所述尿嘧啶特異性切除試劑是尿嘧啶特異性減除酶(USER^TM )。
如申請專利範圍第1項至第3項中任一項所述的方法，其中，所述連接酶是T4 DNA連接酶。
如申請專利範圍第1項至第4項中任一項所述的方法，其中，所述步驟(3)和(4)在同一反應體系中，在尿嘧啶特異性切除試劑和連接酶同時存在下進行。
如申請專利範圍第1項至第5項中任一項所述的方法，其中，滾環複製使用有連續複製能力的DNA聚合酶，較佳phi29 DNA聚合酶進行。
如申請專利範圍第1項至第6項中任一項所述的方法，其中所述II型限制性內切酶為BspQI。
如申請專利範圍第7項所述的方法，其中X_q X_A 的序列為GCTCTTCN，其中N為A，T，C或G，較佳A；且X_B X_q ’的序列為N₁ N₂ N₃ N₄ GAAGAGC，其中N₁ 、N₂ 、N₃ 、N₄ 獨立地選自A，T，C或G；更佳地，X_B X_q ’的序列為CCTT GAAGAGC。
如申請專利範圍第1項至第8項中任一項所述的方法，其中n為6-10。
如申請專利範圍第1項至第9項中任一項所述的方法，其中n為8。
如申請專利範圍第1項至第10項中任一項所述的方法，其中m為1。
如申請專利範圍第1項至第11項中任一項所述的方法，其中X_n 的序列為AACTATAC，且X_n _-m 的序列為AACTATA。
如申請專利範圍第1項至第12項中任一項所述的方法，其中所述目標單鏈DNA的長度為150-2500 nt。
如申請專利範圍第1項至第13項中任一項所述的方法，其中所述方法包括在製備模板雙鏈DNA分子之前對目標單鏈DNA序列進行序列分析，選擇在目標單鏈DNA序列中沒有切割位點的II型限制性內切酶。
一種用於擴增目標DNA序列的套組，其包含：左適配子，其序列如下式所示：X_n TX_q X_A ；右適配子，其序列如下式所示：X_B X_q ’X_n _-m ，式中，X_n 為一段由n個核苷酸組成的核苷酸序列，其中5’核苷酸為A；n為至少4的任一整數，較佳6-8，更佳8； X_q 為一種II型限制性內切酶的識別位點序列，且X_q 在目標單鏈DNA序列中不存在；X_q ’為X_q 的反向互補序列；X_A 、X_B 分別為任選的0個至數個核苷酸，使得X_q X_A 、X_B X_q ’分別構成所述II型限制性內切酶的切割位點，允許所述II型限制性內切酶在X_A 的3’端及X_B 的5’端切割； X_n _-m 為X_n 的自5’起n-m個核苷酸的子序列，m為1-3的整數； A表示腺嘌呤核苷酸；T表示胸腺嘧啶核苷酸。
如申請專利範圍第15項所述的套組，其進一步包含：正向引物，其包含X_n UX_q X_A 的序列，反向引物，其包含X_n-m ’X_q X_B ’的序列，其中，X_n 、X_q 、X_A 、X_B 與所述適配子中的相同； X_n _-m ’為所述X_n _-m 的反向互補序列，但其中3’端的T用U代替；X_B ’為所述X_B 的反向互補序列；U為尿嘧啶核苷酸，其中所述正向引物和所述反向引物容許以目標DNA序列為模板進行PCR擴增。
一種用於製備單鏈DNA的套組，其包含：適用於聚合酶鏈式反應的DNA聚合酶； DNA連接酶，較佳T4 DNA連接酶；尿嘧啶特異性切除試劑，較佳尿嘧啶特異性減除酶；適用於滾環擴增的DNA聚合酶，較佳phi29 DNA聚合酶；和 II型限制性內切酶。
如申請專利範圍第17項所述的套組，其還包含如請求項15中定義的左適配子和右適配子，以及如申請專利範圍第16項中定義的所述正向引物和所述反向引物。
如申請專利範圍第17項至第18項中任一項所述的套組，其中DNA連接酶和尿嘧啶特異性切除試劑置於同一容器中。