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CN106456697A - 具有纤维化抑制活性的肽和含有其的组合物 - Google Patents

具有纤维化抑制活性的肽和含有其的组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及纤维化抑制用组合物，更具体地，涉及纤维化抑制用组合物，其中所述组合物通过含有来源于端粒酶的肽而有效地抑制组织细胞的纤维化。本发明的肽显示出抑制各种纤维化的进展的效果，所述纤维化包括由于癌症的发生引起的纤维化，由于施用化学疗法抗癌药引起的纤维化，由于暴露于辐射引起的纤维化，或者组织的进展性纤维化，包括TGF‑β信号传导过程，因此可以提供用于抗纤维化或抑制纤维化的组合物和用于治疗由纤维化引起的疾病的方法。

Description

具有纤维化抑制活性的肽和含有其的组合物
技术领域
本发明涉及具有抗纤维化效果的肽及含有其的组合物，更具体地，涉及抗纤维化组合物，该组合物包含端粒酶衍生肽，从而有效抑制各种类型组织细胞纤维化的发生。
背景技术
纤维化是由成纤维细胞导致的引起疾病的细胞外基质的异常形成、积累和沉淀的疾病，并且是指由损伤或炎症引起的胶原基质的异常积累，其改变了各种类型组织的结构和功能。不管纤维化发生在何处，纤维化的大多数病因包括代替正常组织的胶原基质的过度积累。特别地，发生在肾、肝、肺、心脏、骨或骨髓以及皮肤中的纤维化诱导器官衰竭，并最坏情况下导致死亡。成纤维细胞通过在正常状态下产生细胞外基质前体来形成纤维组织。细胞外基质是结缔组织中的细胞之间的材料，以纤连蛋白、层粘连蛋白、软骨素或胶原蛋白等蛋白质的形式存在。
同时，TGF-β在由成纤维细胞、细胞增殖、炎症和癌细胞转移引起的细胞外基质的异常形成和积累中起到多种作用，并且已经鉴定了许多细胞信号传导途径和靶。因此，在许多疾病模型中，已经研究了TGF-β，并且其中关于TGF-β的研究和相关药物的开发最活跃的领域可能就是纤维化疾病和癌症。
在TGF-β机制中，通常，TGF-β结合TGF-β受体以诱导细胞质中Smad蛋白的磷酸化，并通过与各种Smad蛋白的相互作用转移信号。此处通常涉及Smad2和Smad3，而Smad1和Smad5参与骨形态发生蛋白(BMP)信号传导。此外，Smad4已知是涉及激活素和BMP以及TGF-β的常见信号传导物质(Heldin，CH et al.Nature，1997，390，465-471；MassagueJ.Annu.Rev.Biochem.1998，67，753-791)。
由于通过抑制TGF-β信号传导机制来调节肿瘤侵入和上皮-间充质转化(EMT)的抑制，因此可以预期优异的抗癌治疗效果。此外，考虑到TGF-β是细胞增殖和分化调节中的关键细胞因子，作为抗癌治疗的主要副作用而提起的由辐射线引起的用于预防纤维化的治疗方法也受到关注(Zhang et al.J Radiat Res.2013，54，630-636)。
近来，由FDA批准(2014年10月15日)的作为特发性肺纤维化的治疗剂的(吡非尼酮)是已知抑制TGF-β形成作为主要作用机制的TGF-β抑制剂。另外，据报道，TGF-β是细胞增殖调节因子，其诱导或抑制细胞增殖，因此在包括癌症、心脏病和糖尿病的各种疾病的发病中起重要作用，并且其各种生理活性也已经报告。例如，(吡非尼酮)用作针对TGF-β合成的抑制剂(抑制形成细胞增殖调节因子)、TGF-β拮抗剂(干扰TGF受体，信号传导障碍)、PDGF(血小板衍生的生长因子)拮抗剂(抑制血管生成诱导因子)、p38MAP激酶抑制剂(抑制细胞增殖信号传导酶)和抗炎剂(抑制TNF-α和MAPK的形成)。因此，如果能够开发出有效直接抑制TGF-β或阻断TGF-β相关信号传导过程并且甚至没有副作用的新药物组合物，这种药物组合物可以预防和治疗由纤维化引起的各种疾病和衰老。
特别地，在癌症环境中，存在各种纤维化引起因素，例如癌组织、抗癌剂和辐射治疗，因此纤维化抑制在癌症环境中具有更重要的意义。已知目前最流行的抗癌治疗、辐射治疗和化疗会显著削弱患者的生活质量，并且由于纤维化等引起的副作用而严重恶化抗癌治疗的预后。
因此，需要开发用于抑制癌相关的TGF-β信号传导机制的治疗剂，其不仅将用于开发抗癌疫苗，而且是用于将常规抗癌治疗效果最大化的新治疗剂和方法。例如，在抗癌治疗中，由癌组织、抗癌剂或辐射线照射引起的纤维化通过阻断抗癌免疫细胞向癌性区域的转移从而干扰设计为当抗癌剂递送至癌性区域时表现出抗癌效果的药物的递送和功效，并且阻止有效的抗癌治疗。因此，如果新药物组合物对人体没有副作用并且能够抑制由癌组织、化疗剂或辐射线暴露引起的纤维化，那么可以更有效地进行抗癌治疗。
[现有技术文献]
[专利文献]
(专利文献0001)KR1019930001915A
(专利文献0002)KR1020040107492A
发明内容
技术问题
在上述背景下，本发明人试图开发具有优异效果而没有副作用的抗纤维化组合物，从而完成了本发明。
本发明的目的是提供有效的抗纤维化组合物。
技术方案
在一个方面，本发明提供了抗纤维化组合物，其包括选自由以下组成的组的至少一种：包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽(以下称为“PEP1”)，与所述氨基酸序列具有80％以上的序列同源性的肽，以及它们的片段。
在根据本发明的组合物中，肽的片段可以是由三个以上氨基酸组成的片段。
在根据本发明的组合物中，纤维化可以是由选自由癌症、抗癌剂的施用、辐射线照射组成的组中的至少一种诱发的纤维化。
在根据本发明的组合物中，所述组合物可以抑制选自由胰腺癌、结肠直肠癌、胃癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、黑素瘤和卵巢癌组成的组的癌细胞组织的纤维化。
在根据本发明的组合物中，组合物可以与化疗剂或辐射疗法组合使用以抑制癌组织的纤维化。化疗剂可以是选自脱氧核苷类似物和氟嘧啶中的至少一种，其中脱氧核苷类似物可以是吉西他滨，并且氟嘧啶可以是5-氟尿嘧啶或卡培他滨。
在根据本发明的组合物中，组合物可以是还包含药学上可接受的赋形剂和添加剂的药物组合物。
在根据本发明的组合物中，组合物可以是参与TGF-β信号传导过程并因此抑制皮肤组织纤维化的抗纤维化组合物。
在根据本发明的组合物中，组合物可以进一步包括可接受的赋形剂、润滑剂和添加剂，并且可以是化妆品组合物。
在另一方面，本发明提供了用于治疗和预防纤维化疾病的方法，其包括向需要治疗的受试者施用抗纤维化组合物。
有益效果
根据本发明，包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽，与所述氨基酸序列具有80％以上的序列同源性的肽，或者它们的片段，包含这些的组合物，以及使用这些的方法具有优异的抗纤维化效果而没有副作用。因此，可以有效地抑制由TGF-β信号传导过程引起的组织纤维化，特别是由癌症组织引起的纤维化或由抗癌剂或暴露于伴随抗癌治疗的辐射引起的纤维化等，并且非常有用于预防和/或治疗纤维化疾病。
附图说明
图1是说明制备异种移植模型的整个实验过程的图，其中裸小鼠用AsPCI细胞接种，然后从10天后开始对小鼠施用PEP1和吉西他滨。
图2是显示其中未接受任何处理的接种了AsPC1细胞的裸小鼠的对照的每只小鼠的重量，其中在接种后10天开始对接种了AsPC1细胞的裸小鼠施用PEP1和吉西他滨中每一种的组中每只小鼠的重量，以及在接种后10天至施用后24天对接种了AsPC1细胞的裸小鼠施用PEP1和吉西他滨的组合的组中每只小鼠的重量，以检测PEP1和吉西他滨的体内抗癌作用。
图3显示了其中未经任何处理的用AsPC1细胞接种的裸小鼠的对照的细胞图像。
图4显示了从接种后10天开始，每天一次对接种了AsPC1细胞的裸小鼠皮下施用PEP1的组的细胞图像。
图5显示了从接种后10天开始，每3天一次向接种了AsPC1细胞的裸小鼠腹膜内施用吉西他滨的组的细胞图像。
图6显示从接种后10天开始，对接种了AsPC1细胞的裸小鼠施用PEP1(每天一次，皮下)和吉西他滨(每三天一次，腹膜内)的组的细胞图像。
图7是显示在不对HepG2细胞系进行任何处理的对照中，和其中HepG2细胞系在TGF-β1处理之后未用任何物质处理的实验组中，其中对HepG2细胞系中施用SB431542的阳性对照中，和其中以不同浓度(1、5和10μM)对HepG2细胞系施用PEP1的实验组中，通过qRT-PCR评价的相对Sma2表达的图。
图8是显示其中HepG2细胞系用TGF-β1处理，然后用不同浓度(1、5和10μM)的PEP1处理的每个实验组中Smad2抑制率(％)的图。
图9是显示在不对HepG2细胞系进行任何处理的对照中，和其中HepG2细胞系在TGF-β1处理之后未用任何物质处理的实验组中，其中对HepG2细胞系中施用SB431542的阳性对照中，以及其中以不同浓度(1、5和10μM)对HepG2细胞系施用PEP1的实验组中，通过qRT-PCR评价的相对Smad4表达的图。
图10是显示其中TGF-β1处理后，将PEP1以不同浓度(1、5和10μM)施用于HepG2细胞系的实验组中的Smad4抑制率(％)的图。
图11是显示在不对HepG2细胞系进行任何处理的对照中，和其中HepG2细胞系在TGF-β1处理之后未用任何物质处理的实验组，其中对HepG2细胞系施用SB431542的阳性对照中，和其中以不同浓度(1、5和10μM)对HepG2细胞系施用PEP1的实验组中，通过qRT-PCR评价的相对纤连蛋白表达的图。
图12是显示在用SB431542处理HepG2细胞系的阳性对照中，和在TGF-β1处理后对HepG2细胞系施用不同浓度(1、5和10μM)的PEP1的实验组中纤连蛋白抑制率(％)的图。
图13显示了在各组中一个暴露于辐射(6Gy，电离辐射(IR))而各组中另一个未经暴露10天之后，在其中用安慰剂(假手术)处理正常人表皮角化细胞(NHEK)的对照中和用1mM PEP1处理的实验组中的细胞培养状态。
图14是显示了在各组中一个暴露于辐射(6Gy，电离辐射(IR))而各组中另一个未经暴露1天和10天之后，在其中用安慰剂(假手术)处理NHEK的对照的细胞中和用1mM PEP1处理的实验组的细胞中GRHL2、p63、N-Cad和P-Akt表达的电泳图像。
图15是显示在暴露于辐射(6Gy，IR)后用安慰剂(假手术)处理的对照的细胞中和用1mM PEP1处理的实验组的细胞中p-Smad2/3、Smad4、FN、Snai1和N-Cad表达的蛋白印迹图像。
具体实施方式
在下文中，将参考示例性实施例更详细地描述本发明。然而，本发明不限于具体公开内容，并且应当理解，本发明包括在本发明的技术思想和范围内的所有修改、等同物和替代物。为了解释本发明，当确定其可能模糊本发明的要点时，将省略对本领域中已知的相关技术的详细描述。
端粒，其是位于染色体的每个末端的重复遗传材料，已知其防止对相应染色体的损伤或偶联到不同染色体。端粒随着细胞分裂而逐渐缩短，在细胞分裂一定次数之后变得非常短，并且细胞最终停止分裂并死亡。另一方面，已知端粒的延长可延长细胞的寿命。例如，已知在癌细胞中分泌称为端粒酶的酶以防止端粒的缩短，导致癌细胞的稳定增殖而不死亡。本发明人鉴定了衍生自端粒酶的肽在抑制纤维化方面有效，从而完成了本发明。
在本发明的一个方面，SEQ ID NO：1的肽，其片段或与所述肽序列具有80％以上序列同源性的肽包括端粒酶，特别是衍生自智人(Homo sapiens)端粒酶的肽。
本说明书中公开的肽可以包括具有80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上，或99％以上的序列同源性的肽。此外，本说明书中公开的肽可以包括SEQ ID NO：1的肽，其片段，和其中至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个氨基酸被修饰的肽。
在本发明的一个方面，可以对使SEQ ID NO：1的肽的物理化学特性发生变化的肽中的一些氨基酸在本发明的范围内进行修饰。例如，可以修饰氨基酸以允许肽具有增强的热稳定性、改变的底物特异性和改变的最佳pH。
本文使用的术语“氨基酸”不仅包括天然整合到肽中的22种标准氨基酸，而且包括D-异构体和转化的氨基酸。因此，在本发明的一个方面，本文的肽包括具有D-氨基酸的肽。另一方面，在本发明的另一方面，肽可以包括非标准氨基酸，例如已经进行翻译后修饰的那些。翻译后修饰的实例包括磷酸化、糖基化、酰化(包括乙酰化、肉豆蔻酰化和棕榈酰化)、烷基化、羧化、羟基化、糖化、生物素化、泛素化、化学性质的转化(例如β-去除脱酰亚胺化、脱酰胺)和结构转化(例如二硫键的形成)。翻译后修饰还包括当与交联剂偶联以形成肽缀合物时由于化学反应而发生的氨基酸的改变，例如发生在氨基、羧基或侧链处的氨基酸的改变。
本文公开的肽可以是从天然来源鉴定和分离的野生型肽。同时，本说明书中公开的肽可以是包含与SEQ ID NO：1的肽的片段相比，取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列的人工变体。野生型多肽以及人工变体中氨基酸的改变包括保守氨基酸的取代，其对蛋白质的折叠和/或活性没有显著影响。保守性取代可以在由以下组成的组的范围内进行：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和甲硫氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸)。通常，不改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的。最常发生的交换发生在Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly，反之亦然。保守性取代的其他实例示于下表1中。
表1
原始氨基酸 示例性残基取代 优选残基取代
Ala(A) val；leu；ile Val
Arg(R) lys；gln；asn Lys
Asn(N) gln；his；asp，lys；arg Gln
Asp(D) glu；asn Glu
Cys(C) ser；ala Ser
Gln(Q) asn；glu Asn
Glu(E) asp；gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) asn；gln；lys；arg Arg
Ile(I) leu；val；met；ala；phe；正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸；ile；val；met；ala；phe Ile
Lys(K) arg；gln；asn Arg
Met(M) leu；phe；ile Leu
Phe(F) leu；val；ile；ala；tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) tyr；phe Tyr
Tyr(Y) trp；phe；thr；ser Phe
Val(V) ile；leu；met；phe；ala；正亮氨酸 Leu
在肽的生物学性质方面，通过选择在以下方面具有显著不同效果的取代部分进行实质性修饰：(a)在取代区域中保持多肽的主链结构，例如折叠或螺旋状三维结构，(b)在靶位点保持分子的电荷或疏水性，或(c)保持侧链的体积。基于侧链的一般性质，将天然残基分类为以下组：
(1)疏水性：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；
(2)中性亲水性：cys、ser、thr；
(3)酸性：asp、glu；
(4)基本：asn、gln、his、lys、arg；
(5)影响链构象的残基：gly、pro；和
(6)芳香族：trp、tyr、phe。
非保守性取代可以通过将一个组的成员与另一个组的成员交换来进行。与维持肽的正确三维结构无关的任何半胱氨酸残基通常可以被取代为丝氨酸，从而增加分子的氧化稳定性并防止不适当的交联，并且相反地，可以通过向肽添加半胱氨酸键实现增强的稳定性。
通过改变抗体的糖基化模式来制备肽的不同类型的氨基酸变体。本文使用的术语“变化”是指在肽上发现的一个或多个碳水化合物残基的缺失和/或在肽中不存在的一个或多个糖基化位点的添加。
肽中的糖基化通常是N-或O-连接的糖基化。本文所用的术语“N-连接的糖基化”是指碳水化合物残基与天冬酰胺残基的侧链的连接。作为三肽序列，天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是任何氨基酸，不包括脯氨酸)是用于将碳水化合物残基酶促连接到天冬酰胺侧链的识别序列。因此，当这些三肽序列之一存在于多肽中时，产生潜在的糖基化位点。本文所用的“O-连接糖基化”是指将一种糖，例如N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖连接到羟基氨基酸，最典型地连接到丝氨酸或苏氨酸，但是也可以使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
通过改变氨基酸序列以含有上述三肽序列(对于N-连接的糖基化位点)，方便地进行将肽糖基化位点添加到肽中。这种改变可以通过向第一抗体序列中添加一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基或通过取代这些残基之一(对于O-连接的糖基化位点)来进行。
此外，根据本发明的一个方面的包含SEQ ID NO：1的肽或其片段或与所述肽序列具有80％以上序列同源性的肽具有低细胞毒性和高体内稳定性。在本发明中，SEQ ID NO：1代表端粒酶衍生肽，其由如下16个氨基酸组成。
SEQ ID NO：1所描述的肽显示在表2中。给出以下表2中的“名称”以区分一种肽与另一种肽。在本发明的一个方面，SEQ ID NO：1所描述的肽代表人端粒酶的整个肽。在本发明的另一方面，包含SEQ ID NO：1的肽或其片段或与所述肽序列具有80％以上序列同源性的肽包括由存在于选自端粒酶中包括的肽的相应位置的肽合成的“合成肽”。SEQ ID NO：2表示端粒酶的全长氨基酸序列。
表2
在一个方面，本发明提供了药物组合物，其包括作为活性成分的具有抗纤维化作用的肽，例如包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽，与所述氨基酸序列具有80％以上序列同源性的肽，或者它们的片段。
根据本发明的一个方面的抗纤维化药物组合物可以包括包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽，与所述氨基酸序列具有80％以上的序列同源性的肽，或者它们的片段，其含量为0.01mg/kg至0.1mg/kg、1mg/kg或10mg/kg，并且当根据含量存在效果差异时，可以适当地调节含量。当组合物包括在上述范围或更小范围内的肽时，它适合于显示本发明的指定效果，并且能够满足组合物的稳定性和安全性要求。此外，上述范围在成本效益方面可能是适当的。
在一个方面，本发明提供了包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽，与所述氨基酸序列具有80％以上的序列同源性的肽，或者它们的片段用以制备上述任一种用于抑制纤维化的组合物的用途。
根据本发明的一个方面的组合物可以应用于所有类型的动物，包括人、狗、鸡、猪、牛、羊、豚鼠和猴。
在本发明的一个方面，组合物可以是包含具有抗纤维化作用的肽(例如，包含SEQID NO：1的氨基酸序列的肽，与所述氨基酸序列具有80％或更多序列同源性的肽，或者它们的片段)的药物组合物。根据本发明的一个方面的药物组合物可以口服、直肠、经皮、静脉内、肌内、腹膜内、髓内、鞘内或皮下施用。
用于口服施用的剂型可以是但不限于片剂、丸剂、软或硬胶囊、颗粒、粉末、溶液或乳液。用于胃肠外施用的剂型可以是但不限于注射剂、滴剂、洗剂、软膏、凝胶、霜剂、悬浮剂、乳剂、栓剂、贴剂或喷雾剂。
根据需要，本发明的药物组合物可以包括添加剂，如稀释剂、赋形剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、缓冲剂、分散剂、表面活性剂、着色剂、调味剂或甜味剂。根据本发明的一个方面的药物组合物可以通过本领域中使用的常规方法制备。
根据本发明的一个方面的药物组合物的活性成分可根据患者的年龄、性别、体重、病理状况和严重性、施用途径或处方者的判断而变化。本领域普通技术人员基于这些因素确定施用剂量，药物组合物的日剂量可以是例如0.1μg/kg/天至1g/kg/天，具体地，1μg/kg/天至100mg/kg/天，更具体地，10μg/kg/天至10mg/kg/天，更具体地，50μg/kg/天至1mg/kg/天，但是当根据剂量存在效果差异时，可以适当地调节剂量。根据本发明的一个方面的药物组合物可以每天施用一次至三次，但是本发明不限于此。
在本发明的一个方面，组合物可以是抗纤维化组合物，其包括包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽，与该氨基酸序列具有80％以上的序列同源性的肽，或者它们的片段作为有效成分。
在本发明的一个方面，组合物可以是用于抑制纤维化的组合物，所述纤维化由癌组织，特别是胰腺癌、胃癌、肾细胞癌、前列腺癌、喉癌、食管癌、甲状腺癌、肺癌、乳腺癌、大小肠癌、子宫癌、子宫颈癌、子宫体癌、膀胱癌、泌尿生殖器癌、膀胱癌和皮肤癌组织引起。
根据本发明的一个方面的组合物可以以片剂、颗粒、粉末、液体或固体的形式制备。对于每种形式，根据本领域普通技术人员的使用形式或目的，可以容易地混合在相应领域中常规使用的除活性成分以外的成分，并且当与不同的基材同时使用时可具有协同效应。
活性成分的施用剂量由本领域普通技术人员确定，药物组合物的日剂量可以是例如具体为1μg/kg/天至100mg/kg/天，更具体地为10μg/kg/天至10mg/kg/天，更具体地为50μg/kg/天至1mg/kg/天，并且当根据含量存在效果差异时，可以适当调节剂量，并可以根据各种因素而变化，包括受试者的年龄、健康状况、并发症等。
说明书中使用的术语仅用于解释具体示例，而不是用于限制本发明。在其前面没有数字的名词不限制数量，并且指示由名词描述的至少一个物品存在。术语“包括”，“具有”和“含有”被解释为开放术语(即，意味着“包括但不限于”)。
数值范围的提及仅仅只是因为它是一种简单的方法来对包含在范围内的每个值替换为另外的值。除非另外特别公开，每个值被并入本文，就好像它是本说明书中单独提及。在所有范围的端值包括在每个范围的，并且可以独立地组合。
除非另外公开或与上下文明显矛盾，否则本文提及的所有方法可以以合适的顺序执行。任何或所有实施例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用不仅更好地描述本发明，而且还限制本发明的范围。说明书中的语言不应被解释为指示未要求保护的组件对于实现本发明是必要的。除非另有定义，本文使用的技术或科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。
本发明的示例性实施例包括发明人已知的用于实现本发明的最佳模式。通过阅读以上描述，本领域普通技术人员可以清楚地理解示例性实施例的变型。本发明人期望本领域普通技术人员适当地利用这些变化，并进一步期望本发明以与说明书中描述的模式不同的模式来实现。因此，如专利法所允许的，本发明包括所附权利要求中提及的本发明的要旨的等同物和所有修改。此外，除非另有说明或与上下文明显矛盾，否则所有可能变化中提到的组分的所有组合都包括在本发明中。参考示例性实施例详细描述了本发明，但是本领域普通技术人员将很好地理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，本发明可以在形式和细节上进行各种改变如由所附权利要求限定。
在下文中，将参考实施例和实验实施例更详细地描述本发明的构造和效果。尽管下面的实施例和实验实施例仅用于帮助理解本发明，但是本发明的范围和范围不限于此。
实施例
实施例1：肽的合成
1.肽的合成
SEQ ID NO：1的肽(以下称为“PEP1”)根据常规已知的固体肽合成制备。具体地，通过使用ASP48S(Peptron，Inc.，Daejeon，Korea)通过Fmoc固相肽合成(SPPS)从C末端逐个偶联氨基酸来合成肽。本文所用的连接肽C-末端的第一个氨基酸的树脂如下：
NH2-Lys(Boc)-2-氯-三苯甲基树脂
NH2-Ala-2-氯-三苯甲基树脂
NH2-Arg(Pbf)-2-氯-三苯甲基树脂
在肽合成中使用的所有氨基酸组分中，N末端被Fmoc保护，并且所有残基都被Trt、Boc、叔丁基酯(t-Bu)或2，2，4，6，7-五甲基二氢-苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)，其从酸中除去。这种氨基酸组分如下：
Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ahx-OH、Trt-巯基乙酸。
作为偶联试剂，使用2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基铵六氟磷酸盐(HBTU)/N-羟基苯并三唑(HOBt)/4-甲基吗啉(NMM)。对于Fmoc脱保护，使用DMF中的20％哌啶。为了从树脂分离合成的肽并除去残基的保护基，使用切割混合物(cocktail)[TFA(三氟乙酸)/TIS(三异丙基硅烷)/EDT(乙二硫醇)/H2O＝92.5/2.5/2.5/2.5]。
通过重复用偶联至固相支架的氨基酸保护基偶联的起始氨基酸保护相应的氨基酸、用溶剂洗涤和脱保护的方法合成每个肽。在从树脂上切下合成的肽后，通过HPLC纯化肽，通过MS评估以验证合成，然后冻干。
如通过高效液相色谱法评价的，实施例中使用的所有肽具有95％以上的纯度。
制备肽PEP1的详细步骤如下。
1)偶联
将溶解在DMF中的经保护的氨基酸(8当量)和偶联剂HBTU(8当量)/HOBt(8当量)/NMM(16当量)加入到NH2-Lys(Boc)-2-氯-三苯甲基树脂中，反应混合物在室温下反应2小时，然后依次用DMF、MeOH和DMF洗涤。
2)Fmoc脱保护
在加入在DMF中20％哌啶后，将反应混合物在室温下反应5分钟，两次，然后依次用DMF、MeOH和DMF洗涤。
3)重复进行反应1和2以制备肽的碱性主链，例如NH2-E(OtBu)-A-R(Pbf)-P-A-L-L-T(tBu)-S(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf)-F-I-P-K(Boc)-2-氯-三苯甲基树脂。
4)切割：将切割混合物加入到之前合成的肽树脂中以将肽与所述树脂分离。
5)向所得混合物中加入冷却的二乙醚后，使通过离心得到的肽沉淀。
6)通过制备型HPLC纯化后，通过LC/MS分析肽以检查分子量并冻干以获得粉末。
实施例2：在AsPC1细胞异种移植模型中PEP1抑制纤维化
为了验证PEP1和吉西他滨对胰腺癌的体内抗癌作用，使用AsPC1细胞系进行异种移植实验。本文使用的异种移植方法如下。
试剂和材料的制备
用于实验的试剂和材料如下。将粉末状PEP1溶于0.2μm过滤的无菌水中后，将等分试样储存于-70℃，然后在使用前溶解，将吉西他滨溶于100％盐水中。将5-氟尿嘧啶溶于DMSO中。
细胞系的制备
作为实验中使用的细胞系的AsPC1细胞系(细胞#6×105细胞/100ml)是购自美国典型细胞培养物(ATCC，Rockville，MD)的人胰腺癌转移细胞。将细胞系在37℃下培养，在含有10％胎牛血清(FBS)、50U/ml青霉素和50μg/ml链霉素的Roswell Park MemorialInstitute(RPMI 1640)培养基中得到1×106～2×106的细胞密度。
实验方法
将AsPC1细胞注射到各裸鼠实验组①至④中。在实验中使用的试剂和材料以及细胞系培养方法与实施例1中描述的相同。
将培养的5×106AsPC1细胞皮下注射到裸鼠(BALB/c-nu/nu裸鼠，购自JoongangLaboratory animal，首尔，韩国)中。进行注射直到癌生长至100mm3的尺寸(约10天)。在癌移植后，将小鼠分成组，每组具有相似的平均重量，然后根据以下四个实验组中的每一个的条件，将吉西他滨和Pep1中的任一个或两者皮下和腹膜内注射到小鼠中(参考图1)。用卡尺测量癌体积，并通过下式计算[宽度2×长度×0.52]。
在移植后，将Pep1和吉西他滨中的任一个或两者施用于四个实验组中的每一个。
①AsPC1移植对照
②AsPC1移植+PEP1 2mg/kg(每日一次，s.c)施用组
③2mg/kg移植+吉西他滨125mg/kg(每三天一次，i.p)施用组
④2mg/kg移植+PEP1 2mg/kg(每天一次，s.c)+吉西他滨125mg/kg施用组(每三天一次，i.p)
然后，每次定量每只小鼠的体重。此外，进行癌症组织样品制备和细胞增殖标志物(PCNA)/凋亡标志物(TUNEL)染色。
对于实验结果的分析，通过学生t检验评估几个实验组之间的平均值。统计学显著性的标准设定为p＝0.0002。
实验结果
根据各个实验组的分析，可以看出，当施用吉西他滨和PEP1的组合和吉西他滨时，小鼠的体重在施用后第20天最小(参见图2)。
图3-图6显示了各实验组的细胞。
在AsPC1细胞接种对照(组①；参照图3)中，显示染成蓝色的胶原部分(对应于图3中的深灰色部分))在染成红色的癌细胞(对应于图3中的浅灰色部分)之间增加。也就是说，可以看出由于癌症，纤维化显著发展。
在用PEP1处理AsPC1细胞的组②(参照图4)中，与图3相比未示出染成蓝色的部分(对应于图4中的深灰色部分)。这表明胶原减少，因此，纤维化被PEP1显著抑制。
同时，在用吉西他滨处理AsPC1细胞的组③(参照图5)中，可以看到染成红色的部分(对应于图5中的黑色部分)显著减少，染成蓝色的部分(对应于图5中的浅灰色部分)增加。这表明癌细胞被吉西他滨杀死，但是纤维化显著发展。
这里，剩余的红色细胞可能是针对CD133+癌症干细胞的抗癌剂。在胰腺癌中，已知CD133+癌干细胞对作为抗癌剂的吉西他滨具有抗性，并且这些细胞周围的纤维化的发展表明药物递送没有良好地进行。
然而，与图5相比，在用PEP1和吉西他滨处理AsPC1细胞的组④中(参照图6)，观察到染成蓝色的部分(对应于图6中的浅灰色部分)减少。可以看出，PEP1显著抑制了纤维化，因此由纤维化引起的药物递送的抑制显著降低，这表明可以更容易发生作为抗癌剂的吉西他滨的细胞内递送。
实施例3：PEP1在HepG2细胞系中的TGF-β抑制作用
为了验证被认为是纤维化的主要原因的PEP1的TGF-β抑制作用，如下进行用于确认HepG2细胞系中的TGF-β信号传导抑制作用的实验。
试剂和材料的制备
实验中使用的试剂和材料如下。将粉末状PEP1溶于0.2μm过滤的无菌水中后，将等分试样储存于-70℃，然后在使用前溶解。作为细胞系，使用HepG2(ATCC HB-8065；美国典型培养物保藏中心)，将重组人TGF-β1溶解在4mM HCl中，制备10μg/mL原液。在10mM储备液中制备用作阳性对照的SB431542(Sigma)。
细胞系的制备
将2x106HepG2细胞(ATCC HB-8065)接种到60mm陪替氏培养皿中并在CO2温育箱中培养16小时。然后，将培养基转移到无血清培养基(SEM)中，然后将细胞进一步培养24小时。随后，向培养基中加入10ng/ml的TGF-β1，然后将各种浓度的PEP1(0.1、1、5、10μM)处理至培养基，随后培养72小时。将各处理组在37℃于CO2培养箱中进一步培养1小时。
分析TGF-β抑制相关基因表达的实验
根据制造商的方案使用 Plus Mini Kit(Qiagen)从肽处理的细胞中提取RNA。对提取的RNA进行定量，然后使用逆转录系统(Promega)从1μg总RNA合成cDNA。之后，使用CFX96实时系统(Bio-rad)进行qRT-PCR。作为TGF-β相关生物标志物，分析纤连蛋白(FN)、Smad2和Smad4的mRNA表达，并且使用GAPDH作为参照基因。对于PCR，如下构建各基因的引物。使用下表3的引物用40个循环(95℃，15秒；57℃，30秒；72℃，30秒)实时扩增基因。引物的核苷酸序列如下。
表3
实验结果
通过qRT-PCR评价PEP1的TGF-β抑制作用。在TGF-β存在下将PEP1培养48小时后，测量TGF-β相关基因如Smad2和Smad4的mRNA表达水平，并与参考基因GAPDH进行比较(参见图7、8、9和10)。与未处理对照相比，在TGF-β处理组中Smad2和Smad4表达增加，并且在阳性对照SB431542中，与TGF-β处理组相比，随着PEP1浓度的增加，作为TGF-β生物标志物的Smad2和Smad4被浓度依赖性地抑制。
此外，通过比较纤连蛋白和GAPDH的mRNA表达水平，评价在TGF-β存在下PEP1培养48小时后显示的作为TGF-β相关纤维化基因的纤连蛋白的表达降低(参照图11)。与未处理的阴性对照相比，在TGF-β处理组中，纤连蛋白表达增加。同时，在阳性对照SB431542中，与TGF-β处理组相比，当PEP1的浓度增加时，PEP1处理组显示纤连蛋白抑制。阳性对照(SB431542)显示抑制率为60.7％，PEP1显示抑制率为22.8％～47.5％(参照图12)。
这种结果可以表明PEP1具有抑制作为参与TGF-β信号传导机制的下游基因的Smad2和Smad4的表达的直接效果，并且抑制由TGF-β诱导的纤连蛋白表达，因此具有作为用于预防和治疗纤维化的试剂的可能性。
实施例4：PEP1在暴露于辐射的NHEK细胞系中的TGF-4抑制作用
为了证实PEP1对用于抗癌治疗和其它肿瘤治疗的辐射暴露诱导的纤维化的影响，进行了确认PEP1在辐射暴露的NHEK中的TGF-β抑制作用的实验。
试剂和细胞系的制备
制备根据实施例1合成的PEP1和作为对照的安慰剂(假手术)。将正常人表皮角化细胞(NHEK)以单层培养以用于辐射暴露实验。对于辐射暴露实验，使用强度为6Gy的电离辐射。
实验方法
为了根据辐射暴露检查NHEK细胞系的细胞分化，各自用安慰剂和1mM PEP1处理NHEK，然后分为暴露于辐射的组和未暴露的组，然后培养10天(参考图13)。
此外，为了检查由于辐射暴露的NHEK细胞系的生物标志物的表达水平的变化，各自用安慰剂和1mM的PEP1处理NHEK，并分为未暴露的组(-)和辐射暴露的组(+)，然后在辐射暴露后第1天和第10天检查生物标志物的表达水平(参见图14)。在测量生物标志物的表达水平时，使用GAPDH作为参照对照。
此外，为了在辐射暴露后连续培养NHEK时精确观察PEP1对TGF-β信号传导的抑制，将细胞分成其中经辐射(6Gy，IR)暴露的NHEK用安慰剂(假手术)处理的组，和1μM PEP1治疗组，然后培养10天。通过对TGF-β和纤维化相关生物标志物进行蛋白质印迹来观察各标志物的表达水平(参考图15)。
蛋白质印迹方法如下。肽处理的细胞用PBS洗涤两次，使用细胞刮刀收集到1.5mL离心管中，然后离心(1,000rpm，4℃，2分钟)。除去得到的上清液后，向NHEK中加入100μLRIPA缓冲液。将细胞在冰上培养40分钟，并每10分钟进行涡旋(预先在4℃冷却的微型离心机)，然后使用1ml注射器将样品搅拌40至50次。最后，将样品在13,000rpm下离心15分钟，得到上清液。
通过8％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)将30g蛋白转移至PVDF膜(Millipore)。PVDF膜用5％脱脂乳封闭，并与特异性一抗温育。实验中使用的抗体如下：纤连蛋白(285kDa，5％BSA 1∶3000，ab2413，Abcam)，N-钙粘蛋白(140kDa，5％BSA 1∶1000，#4061，Cell Signaling)，Smad4(70kDa，5％BSA 1∶1000，#9515，Cell Signaling)，Smad 2/3(60，52kDa，5％BSA 1∶1000，#3102，Cell Signaling)，P-Akt(60kDa，5％BSA 1∶1000，#9271，Cell Signaling)，pSmad 2/3(Cell Signaling#3102)，GRHL2(Abcam#ab15532)，GAPDH(37kDa，5％BSA1∶1000，#2118，Cell Signaling)。随后，用含有0.1％Tween-20(TBST)的tris缓冲盐水洗涤PVDF膜，并与HRP缀合的抗兔抗体(Jackson Immuno ResearchLaboratories，INC。)反应。然后，进行ECL检测(Amersham Pharmacia Biotech)，并使用图像分析仪(GE Healthcare，ImageQuant LAS 4000)分析获得的图像。
实验结果
在根据辐射暴露的NHEK细胞系中的细胞分化的实验中，在辐射暴露后，对照显示分化(纤维化发展)，但是即使在辐射暴露后，PEP1处理组几乎没有显示分化。这些结果表明，由辐射暴露引起的纤维化的进展可以通过PEP1施用来抑制。
在观察根据辐射暴露的NHEK细胞系中生物标志物的表达水平变化的实验中，在每个实验组中观察到辐射暴露后10天生物标志物GRHL2、p63和N-Cad的增加的表达水平。这表明具有TGF-β信号传导抑制作用的生物标志物GRHL2和p63的表达水平在安慰剂处理组中降低，在PEP1处理组中升高。这些结果表明，PEP1增加了GRHL2和p63的表达，所述GRHL2和p63在辐射暴露后对参与纤维化发展的TGF-β信号传导具有抑制作用。
同时，在纤维化组织中表达的生物标记物N-Cad的表达水平在安慰剂(假手术)处理组中增加，在PEP1处理组中降低。在PEP1处理组中，作为表示细胞存活程度的生物标志物的P-Akt的表达水平(Akt(蛋白激酶B)的磷酸化)增加。这些结果表明，PEP1不仅可以通过辐射暴露抑制纤维化发展，而且还可以参与细胞存活机制。
从实验的结果，PEP1提高GRHL2和p63的表达以抑制TGF-β信号传导过程，因此纤维化能够被由辐射暴露引起的TGF-β信号传导抑制。因此，可以看出PEP1具有作为用于预防或治疗由辐射暴露和组织细胞的纤维化引起的纤维化的药物的可能性。
实施例5：PEP1的体外和体内辐射防御效应和组织纤维化抑制作用的验证
试剂、细胞系和实验动物的制备
制备根据实施例1合成的PEP1和用作对照的安慰剂(假手术)。将NHEK以单层培养以制备体外辐射暴露实验。对于体外、原位和体内辐射暴露实验，在0至10Gy(0、2、4、6、8和10Gy)的各种强度下使用电离辐射。
同时，将实验动物分成两个动物模型。第一个模型是口腔粘膜炎模型，其通过将头部和颈部暴露于辐射(6Gy，IR)连续5天诱导每个C3H小鼠的舌头的溃疡来制备。第二模型是皮肤纤维化模型，其通过诱导局部硬皮病来制备，即通过皮下注射0.1cc的在0.9％NaCl水溶液中的博莱霉素(已知是肺纤维化原因)稀释液，浓度为0.5mg/ml，每天一次，持续24至28天。
实验方法和结果
在NHEK细胞系上进行体外和原位实验以证实PEP1对辐射暴露损伤的防御效应，并且显示当将NHEK分成组，每组用安慰剂或PEP1处理，然后暴露于范围从0至10Gy(0、2、4、6、8和10Gy)的各种强度辐射时，确认了表现出由辐射诱导早衰(RIPS)、DNA损伤反应(DDR)蛋白以及衰老相关异染色质病灶(SAHF)的标志物表示的辐射暴露损伤的标记物的表达水平。使用qRT-PCR、蛋白质印迹和免疫荧光染色测量每个标记的表达水平。为了测量这些水平，使用衰老相关的β-半乳糖苷酶(SAβ-Gal)、p16INK4A、p-p53Ser15、p-ATM、γ-H2AX、53BP1、H3K9me3、HP1γ和HMGA2作为标记物。
同时，为了通过体外实验证实在NHEK细胞系中通过TGF-β或博来霉素处理诱导的组织纤维化的PEP1抑制作用，用安慰剂和PEP1中的每一种处理NHEK，使最终浓度为10μg/ml，培养，每48小时用TGF-β和博来霉素处理，然后使用qRT-PCR和蛋白质印迹测量纤连蛋白(FN)和1型胶原(Col 1α1)的表达水平。
对于体内实验，首先，在第一口腔粘膜炎模型中，将C3H小鼠分组，每组用安慰剂或PEP1进行腹膜内处理，得到最终剂量为1mg/kg并暴露于辐射(6Gy，IR)连续五天以诱导对应于口腔粘膜炎的舌头溃疡。10天后，处死小鼠以收集舌组织，用甲苯胺蓝染色并通过H&E染色，以进行活检。此外，使用用雷帕霉素以5mg/kg/天的剂量处理5天的比较对照，进行了相对检查PEP1作用的实验。
同时，在第二皮肤纤维化模型中，将C3H小鼠分组，每组用安慰剂或PEP1进行腹膜内处理，以得到50mg/kg的最终剂量，并以在实验动物制备中提及的博莱霉素浓度进行皮下处理24至28天。28天后，处死小鼠以检测硬皮病，随后进行使用Masson三色染色检查纤维化扩散的实验。
根据体外和体内动物模型实验，可以看出PEP1处理对辐射暴露损伤表现出防御效应。具体而言，根据体外实验，可以看出通过标记表达的抑制表明，PEP1具有RIPS抑制作用，并且根据体内实验，可以看出通过活检表明，PEP1针对暴露于辐射和诱导组织纤维化具有防御效应。
根据实验实施例，可以看出，根据本发明的PEP1和包含PEP1的组合物具有预防或治疗由于各种原因(包括TGF-β信号传导、由癌症引起的组织纤维化、用抗癌剂治疗和辐射暴露)在各种区域中发生的与细胞纤维化有关的衰老和疾病的作用。因此，可以得出结论，能够使用根据本发明的PEP1和包含PEP1的组合物开发用于预防或治疗纤维化相关衰老和疾病的治疗剂或治疗方法。

Claims (12)

1.一种抗纤维化组合物，其包含：
选自由包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽、与所述氨基酸序列具有80％以上的序列同源性的肽，以及它们的片段组成的组中的至少一种。
2.如权利要求1所述的抗纤维化组合物，其中所述片段由三个以上氨基酸构成。
3.如权利要求1所述的抗纤维化组合物，其中所述纤维化由选自由癌症、抗癌剂施用和暴露于辐射组成的组中的至少一种诱发。
4.如权利要求3所述的抗纤维化组合物，其中所述组合物抑制癌细胞组织的纤维化，所述癌细胞选自由胰腺癌、结肠直肠癌、胃癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、黑素瘤和卵巢癌组成的组。
5.如权利要求1所述的抗纤维化组合物，其中所述组合物与化疗剂或辐射疗法组合使用以抑制癌细胞组织的纤维化。
6.如权利要求5所述的抗纤维化组合物，其中所述化疗剂是选自脱氧核苷类似物和氟嘧啶中的至少一种。
7.如权利要求6所述的抗纤维化组合物，其中所述脱氧核苷类似物是吉西他滨，所述氟嘧啶是5-氟尿嘧啶或卡培他滨。
8.如权利要求1所述的抗纤维化组合物，其中所述组合物还包含药学上可接受的赋形剂和添加剂。
9.如权利要求1所述的抗纤维化组合物，其中所述组合物参与TGF-β信号传导过程以抑制皮肤组织的纤维化。
10.如权利要求9所述的抗纤维化组合物，其中所述组合物还包含可接受的赋形剂、润滑剂和添加剂，并且是化妆品组合物。
11.一种治疗和预防纤维化疾病的方法，包括：
对需要治疗的受试者施用权利要求1至10中任一项所述的抗纤维化组合物。
12.包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽、与所述氨基酸序列具有80％以上的序列同源性的肽，以及它们的片段在制造权利要求1至10中任一项所述的抗纤维化组合物中的应用。
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