CN106336412A

CN106336412A - 作为cdk4/6抑制剂的2-(n-氧化芳环-2基氨基)-吡咯并嘧啶及嘌呤类化合物

Info

Publication number: CN106336412A
Application number: CN201510401904.XA
Authority: CN
Inventors: 向荣; 范艳; 李永涛; 郭庆祥; 杨爽
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Nankai University
Priority date: 2015-07-10
Filing date: 2015-07-10
Publication date: 2017-01-18

Abstract

作为CDK4/6抑制剂的2-(N-氧化芳环-2基氨基)-吡咯并嘧啶及嘌呤类化合物。本发明涉及具有式(I)的吡咯并嘧啶类以及嘌呤类化合物及其盐、包括可药用盐，及其药物组合物的制备方法和用途。本发明所述化合物是细胞周期蛋白依赖性激酶4/6（CDK4/6）抑制剂，可用于治疗受CDK4/6介导的疾病和紊乱，如癌症等。

Description

作为CDK4/6 抑制剂的2-( N-氧化芳环-2基氨基)-吡咯并嘧啶及嘌呤类化合物

技术领域

本发明涉及新的吡咯并嘧啶及嘌呤类化合物及其药物组合物、特别是作为CDK4/6 抑制剂的2-( N-氧化芳环-2基氨基)-吡咯并嘧啶及嘌呤类化合物及其药物组合物。本发明还涉及这些化合物和组合物在治疗CDK4/6过度增殖性紊乱如癌症中的用途。

背景技术

细胞的生命始于细胞周期，细胞周期的正常运行依赖于精细的调控机制。已发现细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinase, CDK）是细胞周期调控的核心。CDKs是一类丝氨酸（Ser）/苏氨酸（Thr）激酶，作为细胞内重要的信号转导分子，和周期素（cyclin）形成的CDK-cyclin复合物，参与细胞的生长、增殖、休眠或者进入凋亡。

研究发现细胞周期调控中CDKs的异常与肿瘤的发生、发展密切相关。约 90% 的肿瘤存在CDKs活性增强，因此，CDKs的调控异常成为肿瘤发生的一个标志。小分子CDK抑制剂可以有效的抑制多种肿瘤细胞的生长。也可以用于治疗心血管障碍以及多种感染剂导致的疾病，包括真菌、原生动物寄生虫和DNA与RNA病毒。同时，选择性CDK小分子抑制剂能够改善各种自身免疫障碍的后果等。因此，靶向CDK4/6蛋白激酶药物的研发是意义重大的领域。

关于细胞周期蛋白依赖性激酶小分子抑制剂已经有文献报道[Clinical Cancer Research, 2013, 19, 6173-6182]。本发明是在已有发现的基础上，设计合成的靶向CDK激酶的小分子抑制剂，该系列化合物具有治疗多种疾病的潜力。

发明内容

本发明的化合物是CDK4/6 抑制剂，可用于治疗受CDK4/6 介导的疾病和紊乱，例如癌症、包括套细胞淋巴瘤、脂肉瘤、非小细胞肺癌、黑素瘤、鳞状细胞食管癌和乳癌。本发明还涉及使用本发明的化合物或包含本发明的化合物的药物组合物来治疗与其有关的紊乱。

本发明涉及新的具有式(I) 的吡咯并嘧啶及嘌呤类化合物及其盐、包括可药用盐：

其中：

R¹选自、、、、、、、、、、烯基、炔基、杂环基、芳基、杂芳环，其中R⁴和R⁵分别是氢基、烃基、环烷基、杂原子环烷基、芳基或杂芳环；

R²是C₁-C₆烷基、C₃-C₇ 环烷基或C₃-C₇ 杂环环烷基，可选有1至3个卤素、OH或NH₂取代；任选被一个选自C_1-6 烷基、C(CH₃)₂CN 和OH 的取代基取代的苯基；任选被一个环丙基或C_1-6 烷基取代的哌啶基；任选被一个环丙基或C_1-6 烷基取代的四氢吡喃基；或二环[2.2.1] 庚烷基；

R³选自NR⁶R⁷、C₁-C₆烷基、C₃-C₇ 环烷基、C₁-C₈烷氧基、C₁-C₈烷氧基烷基、C₁-C₈卤代烷基，可选有卤素、OH、NH₂、烷氧基或烷氨基；

R⁶和R⁷分别是氢基、烃基、环烷基、杂原子环烷基、芳基或杂芳环；或者当R⁶和R⁷连接同一个C、N或O原子，形成杂环，形成环原子包含3-8个原子，如哌啶、哌嗪和吗啉等，杂环可被1-3 个独立地选自卤素、烷基、环烷基、烷氧基、羟基、三氟甲基、氨烷基、氨基、氰基、1-2个烷氨基或烷羰基取代；

A¹ – A⁴分别是N或CR⁸，其中R⁸选自H、F、Cl、CH₃、CFH₂、CF₂H 或CF₃；

L 是价键、C(O) 、O或S(O)_1~2。

本发明所述吡咯并嘧啶及嘌呤类化合物可以根据常规药物配制技术与药物载体或赋形剂(例如药学上可接受的载体和赋形剂)混合形成药物制剂。可以将所述吡咯并嘧啶化合物作为活性成分混合在任何常用的口服剂型中，所述口服剂型包括片剂、胶囊剂和液体制剂(例如酏剂和混悬剂)，其中包含着色剂、矫味剂、稳定剂和掩盖味道的物质。对于混合口服剂型来说，所述吡咯并嘧啶化合物作为活性成分可以与各种普通片剂材料(例如淀粉、碳酸钙、乳糖、蔗糖和磷酸二钙)混合以助于压片和装入胶囊。可以将所述吡咯并嘧啶化合物在药学上可接受的无菌液体载体例如无菌水、无菌有机溶剂或者两者的混合物中溶解或混悬。液体载体可以是适合注射剂的载体，比如生理盐水、丙二醇或者聚乙二醇水溶液。在其他情况下，还可以将微粉化的活性成分分散在淀粉或羧甲基纤维素钠的水溶液中或分散在适当的油(例如花生油)中来制得。液体药物制剂(指无菌溶液或混悬剂)可以用于静脉注射、肌肉注射、腹膜内注射或者皮下注射。

本发明还提供了一种药物组合物，该药物组合物包含至少一种作为活性成分的本发明所述吡咯并嘧啶及嘌呤类化合物。除此之外，所述药物组合物还可以包含一种或多种无机或有机、固体或液体的药学上可接受的载体或者赋形剂。术语“药学上可接受的”是指当给药至动物例如哺乳动物(例如人类)时生理学上可耐受且通常不会产生过敏或类似的不良反应(例如头晕等)的添加剂或组合物。药物载体和赋形剂可以包括但不限于稀释剂，例如乳糖、葡萄糖、甘露糖和/或甘油；润滑剂；聚乙二醇；粘合剂，例如硅酸铝镁、淀粉、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮；并且，如果需要的话，还包括崩解剂，例如淀粉、琼脂、海藻酸或其盐如海藻酸钠；和/或吸附剂、着色剂、防腐剂、稳定剂、矫味剂和甜味剂。

具体实施方式

下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。

本文所用的缩略语通常为本领域技术人员所熟知的，或者可以是根据基础知识易于理解的。

在本发明化合物的制备中所采用的起始原料是已知的、能够根据已知方法制备的或者可商购获得的。

本发明还涉及新的中间体和/或起始原料。特别优选与实施例中提到的那些相同或者相似的反应条件和新中间体。

中间体和终产物都可以根据常规方法进行后处理和/或纯化，所述常规方法包括调节 pH、萃取、过滤、干燥、浓缩、色谱法、研磨、结晶等。

另外，本发明化合物还可以通过本领域已知的各种方法或者本文所述方法的变通方法进行制备。

下列实施例仅用于举例说明本发明，不以任何方式对本发明进行限制。

实施例1 2-((7-环戊基-6-二甲基氨甲酰基-7H-吡咯并[2，3-d] 嘧啶-2-基氨基)-5-(哌嗪-1-基)吡啶- 1-氧化物的制备。

步骤1.1：5-(4-(叔丁氧羰基)哌嗪-1-基)-2-((7-环戊基-6-二甲基氨甲酰基-7H-吡咯并[2，3-d] 嘧啶-2-基氨基)吡啶- 1-氧化物的制备。

在100 mL两口瓶中加入2- 氯-7- 环戊基-N，N- 二甲基-7H- 吡咯并[2，3-d] 嘧啶-6- 甲酰胺（835 mg，2.85 mmol），2-氨基-5-(4-叔丁氧羰基哌嗪-1-基) 氮氧化吡啶（840 mg， 2.85 mmol），醋酸钯（16 mg，0.071 mmol），BINAP（89 mg，0.143 mmol），碳酸铯（1.39 g，4.3 mmol），抽真空置换氩气三次，然后加入二氧六环20 mL，加热至100℃，反应过夜。TLC检测，反应完毕后加入乙酸乙酯300mL，依次用饱和碳酸氢钠水溶液，水，饱和食盐水洗涤，有机相干燥，过滤，减压除去有机溶剂，残余物通过柱层析纯化，得棕黄色固体1.067 g，产率 = 68%。¹H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 9.63 (s, 1H), 8.73 (d, J = 1.3 Hz, 1H), 8.65 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 7.95 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 7.05 (dd, J = 9.5, 2.5 Hz, 1H), 6.46 (d, J = 1.3 Hz, 1H), 4.86 – 4.72 (m, 1H), 3.59 (t, J = 5.0 Hz, 4H), 3.15 (s, 6H), 3.06 (t, J = 5.0 Hz, 4H), 2.66 – 2.43 (m, 2H), 2.15 – 1.96 (m, 4H), 1.85 – 1.64 (m, 2H), 1.48 (s, 9H)。¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ 163.83, 154.53, 153.19, 151.76, 151.55, 141.72, 139.75, 132.98, 126.73, 118.85, 113.68, 113.18, 100.74, 80.24, 58.01, 49.49, 39.42, 35.20, 30.20, 28.41, 24.61。

步骤1.2： 5-(哌嗪-1-基)-2-((7-环戊基-6-二甲基氨甲酰基-7H-吡咯并[2，3-d] 嘧啶-2-基氨基)吡啶- 1-氧化物的制备。

在50 mL单口瓶中加入5-(4-(叔丁氧羰基)哌嗪-1-基)-2-((7-环戊基-6-二甲基氨甲酰基-7H-吡咯并[2，3-d] 嘧啶-2-基氨基)吡啶- 1-氧化物（700 mg，1.27 mmol）及四氢呋喃10 mL，放入0℃下搅拌15分钟，滴加浓盐酸6 mL，滴加完毕后移至室温搅拌2小时。反应完毕后，用饱和碳酸钠水溶液调节pH > 8，除去溶剂，用无水乙醇溶解产品，除去乙醇，残余物通过柱层析纯化，得淡黄色固体510.2 mg，产率 = 89%。¹H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 9.60 (s, 1H), 8.72 (s, 1H), 8.63 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 7.99 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 7.03 (dd, J = 9.5, 2.4 Hz, 1H), 6.45 (s, 1H), 4.77 (p, J = 8.9 Hz, 1H), 3.29 – 3.17 (m, 8H), 3.14 (s, 6H), 2.94 (s, 1H), 2.86 (s, 1H), 2.60 – 2.45 (m, 2H), 2.14 – 1.91 (m, 4H), 1.83 – 1.62 (m, 2H)。

实施例2 5-(N-甲基哌嗪-1-基)-2-((7-环戊基-6-二甲基氨甲酰基-7H-吡咯并[2，3-d] 嘧啶-2-基氨基)吡啶- 1-氧化物的制备。

在50mL两口瓶中加入5-(哌嗪-1-基)-2-((7-环戊基-6-二甲基氨甲酰基-7H-吡咯并[2，3-d] 嘧啶-2-基氨基)吡啶- 1-氧化物(200 mg, 0.44 mmol)及甲醇5 mL。加入甲醛水溶液（37%, 330uL），搅拌10分钟后加入氰基硼氢化钠(195 mg, 3.1 mmol)。室温搅拌过夜。反应完毕后，去除溶剂，残余物通过柱层析纯化的淡黄色固体88.5 mg，产率 = 43%。¹H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 9.62 (s, 1H), 8.71 (s, 1H), 8.60 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 7.93 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 7.01 (dd, J = 9.4, 2.5 Hz, 1H), 6.45 (s, 1H), 4.77 (p, J = 9.0 Hz, 1H), 3.23 – 3.06 (m, 11H), 2.59 (t, J = 5.0 Hz, 4H), 2.56 – 2.48 (m, 2H), 2.35 (s, 2H), 2.12 – 1.96 (m, 4H), 1.78 – 1.62 (m, 2H)。¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ 163.88, 153.36, 151.78, 151.63, 141.75, 139.32, 132.80, 126.27, 117.87, 113.55, 113.04, 100.74, 57.98, 54.61, 49.12, 46.01, 39.41, 30.17, 24.59。

实施例3 2-{[7-环戊基-6-(恶唑-5-基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-基]氨基}-5-(哌嗪-1-基)吡啶- 1-氧化物的制备。

步骤3.1：5-(2-氯-7-环戊基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-6-基)恶唑的制备。

在50 mL单口瓶中加入2-氯-7-环戊基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-6-甲醛（100 mg），对甲基苯磺酰甲基异腈（86 mg, 0.44 mmol），碳酸钾（72 mg, 0.52 mmol）及甲醇5 mL，加热至65℃，搅拌4小时。反应结束后除去溶剂，加入100 mL饱和碳酸氢钠水溶液，用二氯甲烷萃取3次，合并有机相，饱和食盐水洗涤一次，无水硫酸镁干燥，过滤，除去有机溶剂，残余物通过柱层析纯化得淡黄色固体109.9 mg，产率 = 95%。¹H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 8.81 (d, J = 1.1 Hz, 1H), 8.06 (s, 1H), 7.38 (s, 1H), 6.76 (s, 1H), 4.93 (p, J = 8.5 Hz, 1H), 2.50 – 2.36 (m, 3H), 2.17 – 2.00 (m, 4H), 1.78 – 1.61 (m, 2H)。¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ 153.53, 152.86, 151.80, 151.43, 143.20, 129.59, 126.69, 117.57, 101.82, 57.83, 31.01, 24.96。

步骤3.2：5-(4-叔丁氧羰基哌嗪-1-基)-2-((7-环戊基-6-(恶唑-5-基)-7H-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-基)氨基)氮氧化吡啶的制备。

方法同步骤1.1，产率62 %。¹H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 9.11 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.56 (d, J = 1.4 Hz, 1H), 7.31 (s, 1H), 7.08 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 6.68 – 6.58 (m, 2H), 6.53 (s, 1H), 4.68 (t, J = 6.9 Hz, 1H), 3.57 (t, J = 5.2 Hz, 4H), 3.02 (t, J = 5.2 Hz, 4H), 2.26 – 2.01 (m, 2H), 2.03 – 1.90 (m, 4H), 1.90 – 1.76 (m, 2H), 1.47 (s, 9H)。¹³C NMR (125 MHz, Common NMR Solvents) δ 178.26, 158.97, 154.80, 151.62, 151.59, 150.83, 149.42, 140.54, 128.51, 127.19, 126.29, 122.52, 118.79, 116.08, 105.92, 79.29, 60.32, 47.61, 45.83, 33.50, 28.27, 26.20。

步骤3.3 2-{[7-环戊基-6-(恶唑-5-基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-基]氨基}-5-(哌嗪-1-基)吡啶- 1-氧化物的制备。

方法同1.2，产率 = 75%，¹H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 9.10 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.56 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 7.30 (s, 1H), 7.07 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 6.83 (dd, J = 7.5, 1.5 Hz, 1H), 6.62 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 6.50 (s, 1H), 4.66 (td, J = 8.9, 8.0, 5.7 Hz, 1H), 3.57 (t, J = 5.1 Hz, 4H), 2.89 (t, J = 5.1 Hz, 4H), 2.22 – 2.03 (m, 2H), 1.94 (dddd, J = 13.8, 9.0, 4.8, 2.0 Hz, 4H), 1.80 (ddd, J = 8.9, 5.8, 3.4 Hz, 2H)。¹³C NMR (125 MHz, Common NMR Solvents) δ 178.26, 158.97, 151.62, 151.59, 150.83, 149.42, 140.54, 128.51, 127.19, 126.29, 122.52, 118.79, 116.08, 105.92, 60.32, 49.57, 45.55, 33.50, 26.20。

CDK4/6 酶活性测定。

采用Caliper Mobility Shift Assay方法测试化合物对CDK4/6酶的抑制活性，该技术将毛细管电泳的基本理念应用到微流体环境中，在不加入中止试剂的情况下检测酶学实验。用于实验的底物是带有荧光标记的多肽，在反应体系中酶的作用下，底物转变为产物，其所带的电荷也发生了相应的变化， Mobility-Shift Assay利用底物和产物所带电荷的不同，将二者进行分离，并分别进行检测。

实验材料：CDK4/CycD3 (Carna, Cat.No 04-105, Lot. No 10CBS-0429 C, GST-CDK4(1-303end)/GSTCycD3(1-292end)); Peptide FAM-P8 (GL Biochem, Cat. No. 112396, Lot. No. P100804-XZ112396); ATP (Sigma, Cat. No. A7699-1G, CAS No. 987-65-5); DMSO (Sigma, Cat. No. D2650, Lot. No. 474382)；EDTA (Sigma, Cat. No. E5134, CAS No. 60-00-4); 96-well plate (Corning, Cat. No. 3365, Lot. No. 22008026); 384-well plate (Corning, Cat. No. 3573, Lot. No. 12608008)。

实验方法：测定Mobility Shift上的ATP表观Km, 384微孔板中加入5μL/孔的2× enzyme & peptide混合液。加入5μL/孔三倍梯度稀释的2×ATP溶液，启动反应。室温离心1min，放入23°C培养箱反应60min后，加入5 uL/孔3×stop buffer（100 mM HEPES, pH 7.5；0.015% Brij-35；0.2% Coating Reagent #3；50 mM EDTA）终止反应，置于Caliper EZ Reader I上进行检测；在96微孔板中对化合物在5μM浓度进行4倍梯度稀释, 加入100μL ,100％DMSO作为无化合物无激酶对照组，取10μL化合物加入到一个新的96孔微孔板，再加入90μL, 1×kinase base buffer (20 mM HEPES, pH 7.5 ; 0.01% Triton X-100; 10 mM MgCl₂; 2 mM DTT )，将该板放置在摇床上10分钟以将化合物混匀；每孔取5μL混合液加入到384孔微孔板中。384孔微孔板各孔中加10μL，2.5×enzyme solution。室温下孵育10分钟后再在各孔中再加10μL, 2.5×的多肽溶液(1×kinase base buffer中加入FAM-labeled peptide 和 ATP）。激酶反应，指定时间停止，孵育30℃。加25μL stop buffer终止反应。置于Caliper EZ Reader I上进行检测。

表1为化合物对CDK4激酶的抑制效力。

表2为化合物对CDK6激酶的抑制效力。

表1

表2

Claims

1.式(I)化合物或其可药用盐

其中：

R¹ 选自、、、、、、、、、、烯基、炔基、杂环基、芳基、杂芳环，其中R⁴和R⁵分别是氢基、烃基、环烷基、杂原子环烷基、芳基或杂芳环；

R⁶和R⁷分别是氢基、烃基、环烷基、杂原子环烷基、芳基或杂芳环；或者当R⁶和R⁷连接连接同一个C、N或O原子，形成杂环，形成环原子包含3-8个原子，如哌啶、哌嗪和吗啉等，杂环可被1-3 个独立地选自卤素、烷基、环烷基、烷氧基、羟基、三氟甲基、氨烷基、氨基、氰基、1-2个烷氨基或烷羰基取代；

A¹-A⁴分别是N或CR⁸，其中R⁸选自H、F、Cl、CH₃、CFH₂、CF₂H 或CF₃；

L 是价键、C(O) 、O或S(O)_1~2。

2.根据权利要求1 的式 (I) 化合物，R¹ 选自、、、、；R²选自环戊基；R³选自、、、、、；L 是价键。

3.治疗与CDK4/6 抑制作用相关的疾病、障碍或综合征的方法，所述方法包括给需要其的个体施用根据权利要求1-2 的任意一项的化合物或其前药或包含式I 化合物或其前药及药学上可接受的赋形剂的药物组合物。

4.如权利要求3 中所述的治疗方法，其中所述疾病、障碍或综合征是在个体中过度增殖性的，选自癌症与炎症，其中个体是包括人的动物。

5.抑制细胞周期蛋白依赖激酶( 例如，CDK4/6) 的方法，所述方法包括所述激酶与根据权利要求1 至2 的任意一项的抑制激酶的化合物接触。

6.调控细胞过程( 例如，细胞分裂) 的方法，其通过使用根据权利要求1 至12 的任意一项的化合物抑制细胞周期蛋白依赖的激酶的活性。

7.根据权利要求1 至2 的任意一项的化合物，用于如本文所述的疾病状态的预防或治疗。

8.根据权利要求1 至2 的任意一项的化合物用于药物制备的用途，其中所述药物是用于本文定义的任意一种或多种用途。

9.药物组合物，包含上述权利要求任一项的化合物或其可药用盐以及包含可药用的载体或赋形剂。

10.在需要其治疗的患者中治疗癌症的方法，该方法包括有效量的上述权利要求任一项的化合物或其可药用盐。