CN105164265B

CN105164265B - 用于产生和递送rna的组合物和方法

Info

Publication number: CN105164265B
Application number: CN201480024780.1A
Authority: CN
Inventors: J·A·鲍姆; A·T·克里斯琴; A·艾维多基莫维; F·莫施里; L·M·韦弗; 张海涛
Original assignee: Monsanto Technology LLC
Current assignee: Monsanto Technology LLC
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-03-13
Publication date: 2019-05-10
Anticipated expiration: 2034-03-13
Also published as: US20140271559A1; UA120349C2; US10334858B2; JP6522579B2; CN110229815B; CA2905961C; KR20210116681A; JP6935450B2; WO2014151581A1; EP3434777A1; EP2970990A1; US20190380348A1; MX2015013118A; KR20230066486A; AU2014233711A1; US10070652B2; US20160145630A1; EP3434777B1; CN105164265A; ES2691803T3

Abstract

提供了用于高效产生和递送双链RNA(dsRNA)的组合物和方法。描述了用于dsRNA的体外和体内表达的载体构建体。还描述了用于在活细胞中高效且具有成本效益地产生dsRNA的细胞表达系统以及用于向目标生物提供表达的dsRNA的方法和组合物。所描述的组合物和方法可用于产生用于筛选或其它用途的RNA分子，或扩增用于分析的RNA序列。

Description

用于产生和递送RNA的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2013年3月15提交的美国临时专利申请第61/793,506号(其通过引用整体并入本文)的权益。

序列表的并入

本申请含有通过EFS网络与其一起电子地提交的序列表，该序列表含有2014年3月10日创建的大小为11,512字节(于Windows XP中测得)的名为“P34118WO00_59609_2014_03_10_v2ST25.txt”的文件，并且该文件通过引用整体并入本文。

发明领域

提供了用于RNA的体外和体内表达的载体构建体。还提供了用于体内产生RNA和蛋白质的细胞表达系统。还提供了用于向目标生物提供体内转录的dsRNA的方法和组合物。

背景技术

经济作物往往是被病毒或害虫诸如昆虫或线虫攻击的目标。虫害和病毒感染可对作物产量具有显著的负面影响。化学农药已经非常有效地消灭虫害；然而，使用化学农药也存在不利方面。化学杀虫剂不具有选择性，并可能对益虫和其它生物以及目标害虫产生作用。化学杀虫剂长期存在于环境中，并且代谢(即使有的话)通常很缓慢。它们积聚在食物链中，特别是在高等食肉动物物种中，在所述动物中可断定它们是有负面作用的。化学杀虫剂的积累也导致对所述试剂的抗性产生。因此，需要用于控制或消除植物上或植物中的虫害的替代方法；具有选择性，环境惰性，非持久性，可生物降解，并且非常适合抗病虫害管理方案的方法。

已经显示双链RNA(dsRNA)分子通过称为RNA干扰(RNAi)的机制介导对各种生物中的特定靶基因的抑制。RNAi干扰利用了内源细胞途径，凭借该途径包含大体上对应于靶序列的有义和反义序列的互补核苷酸序列的双链RNA介导目标mRNA的降解或减少蛋白质从mRNA模板的翻译。RNAi途径的效应蛋白包括从原始dsRNA产生小的干扰RNA(siRNA)的切丁酶蛋白复合物，和使用siRNA引导来识别相应的mRNA并降解其或阻断从其的翻译的RNA诱导沉默复合物(RISC)。只有与siRNA互补的转录物受到影响，从而mRNA表达的敲低通常是序列特异性的。RNAi的基因沉默作用可以持续数天，在实验条件下，可在某些情况下导致90％或更多的目标转录物的丰度的减少，从而导致相应的蛋白质的水平的下降。蛋白水平也可在不显著影响mRNA转录水平的情况下通过阻断翻译来扰动。

虽然dsRNA分子显示作为用于控制或消除植物虫害的具有选择性、环境惰性的化学杀虫剂的替代物的希望，但对可通过常规体外和体内表达法来产生的dsRNA的量的限制和与产生和纯化dsRNA相关的成本呈现阻挡其用于控制作物植物的虫害和疾病的障碍。因此，需要用于生产商业规模量的dsRNA的高效且具有成本效益的方法。

发明概述

本文所述的几个实施例涉及用于RNA的体外和体内表达的载体构建体。在一些实施方案中，所述RNA是双链RNA(dsRNA)。在一些实施方案中，所述RNA编码蛋白。在一些实施方案中，所述RNA是调控RNA。还描述了用于在活细胞中高效且具有成本效益地产生RNA的细胞表达系统。还描述了用于在活细胞中高效且具有成本效益地产生蛋白质的细胞表达系统。还描述了用于在活细胞中高效且具有成本效益地产生dsRNA的细胞表达系统和用于向目标生物提供表达的dsRNA的方法和组合物。所描述的组合物和方法可用于生产用于商业制剂的RNA分子，以扩增用于分析、筛选和其它用途的RNA序列。

几个实施方案涉及用于通过细胞培养高效地生产商业量的RNA分子的组合物和方法。在一些实施方案中，RNA是双链RNA(dsRNA)。在一些实施方案中，所述RNA编码蛋白质。在一些实施方案中，所述RNA是调控RNA。一些实施例涉及包含启动子的工程化表达构建体；位于所述启动子的转录下游的RNA编码区域；和包含形成包含两个或更多个的发夹的二级结构的核酸序列的转录终止子；其中所述RNA编码区和转录终止子可操作地连接于启动子。在一些实施方案中，所述转录终止子包含形成包含至少3个发夹的二级结构的核酸序列。在一些实施方案中，每一个发夹包含5-30个碱基对。在一些实施方案中，每一个发夹包含9-18个碱基对。在一些实施方案中，每一个发夹包含具有少于3个未配对核苷酸的茎区。在一些实施方案中，发夹的茎区不包含未配对的核苷酸。在一些实施方案中，发夹间隔包含10个或更少的核苷酸的间隔区。在一些实施方案中，发夹间隔包含0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸的间隔区。在一些实施方案中，所述转录终止子包含选自SEQ ID NO:13、18和21-23的核酸序列。

几个实施方案涉及用于通过细胞培养高效地生产商业量的蛋白质的组合物和方法。一些实施例涉及工程化表达构建体，其包含启动子；位于所述启动子的转录下游的蛋白编码区；和转录终止子，其包含形成包含两个或更多个发夹的二级结构的核酸序列；其中所述蛋白质编码区和转录终止子可操作地连接于启动子。在一些实施方案中，所述转录终止子包含形成包含至少3个发夹的二级结构的核酸序列。在一些实施方案中，每一个发夹包含5-30个碱基对。在一些实施方案中，每一个发夹包含9-18个碱基对。在一些实施方案中，每一个发夹包含具有少于3个未配对核苷酸的茎区。在一些实施方案中，发夹的茎区不包含未配对核苷酸。在一些实施方案中，发夹间隔包含10个或更少的核苷酸的间隔区。在一些实施方案中，发夹间隔包含0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸的间隔区。在一些实施方案中，所述转录终止子包括选自SEQ ID NO:13、18和21-23的核酸序列。

本实施方案还涉及用于通过细胞培养高效地产生商业量的dsRNA分子并且将所表达的dsRNA分子递送至目标生物的组合物和方法。一些实施方案涉及工程化dsRNA表达构建体，其包含启动子；位于启动子的转录下游的dsRNA编码区，其中所述dsRNA编码包含大体上对应于靶序列的第一有义取向的核苷酸序列，与靶序列大体上互补的第二反义取向的核苷酸序列，和侧翼连接有第一和第二核苷酸序列并且编码RNA转录物的环-区的一个或多个核苷酸的第三核苷酸序列；位于dsRNA编码区的3’的第一转录终止子序列；和位于第一转录终止子的3’的第二转录终止子序列，其中所述dsRNA编码区、第一转录终止子和第二转录终止子可操作地连接于所述启动子。在一些实施方案中，所述第一有义取向的核苷酸序列位于所述第二反义取向的核苷酸序列的5’。在一些实施方案中，所述第一有义取向的核苷酸序列位于所述第二反义取向的核苷酸序列的3’。在一些实施方案中，所述工程化dsRNA表达构建体还包含位于所述第二转录终止子序列的3’的一个或多个锌指核酸酶(ZFN)、TAL-效应子核酸酶(TALEN)或大范围核酸酶限制性位点。在一些实施方案中，所述大范围核酸酶限制性位点选自由以下组成的组：I-Anil、I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-PanII、I-PanMI、I-SceII、I PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-LtrI、I-GpiI、I-GZeI、I-OnuI、I-HjeMI、I-MsoI、I-TevI、I-TevII和I-TevIII。在一些实施方案中，所述工程化dsRNA表达构建体还包含1、2、3、4、5、6个或更多个位于dsRNA编码区的3’的另外的转录终止子序列。在一些实施方案中，所述工程化dsRNA表达构建体包含两个或更多个不依赖于Rho的转录终止子序列，其各自独立地选自由以下组成的组：PTH-终止子、pET-T7终止子、终止子、pBR322-P4终止子、水泡性口膜炎病毒终止子、rrnB-Tl终止子、rrnC终止子和TTadc转录终止子，以使得所述启动子和转录终止子序列形成功能性组合。在一些实施方案中，所述转录终止子序列是酵母转录终止子序列。在一些实施方案中，所述工程化dsRNA表达构建体包含一个或多个Rho依赖性转录终止信号。在一些实施方案中，编码第一转录终止子和第二转录终止子的多核苷酸形成包含两个或更多个发夹的二级结构。在一些实施方案中，编码第一转录终止子和第二转录终止子的多核苷酸形成包含至少3个发夹的二级结构。在一些实施方案中，所述第一转录终止子是PTH并且所述第二转录终止子是PET。在一些实施方案中，所述工程化dsRNA表达构建体包含第一转录终止子、第二转录终止子、第三转录终止子和第四转录终止子。在一些实施方案中，所述第一转录终止子是rrn BT2，所述第二转录终止子是PET，所述第三转录终止子是PTH并且所述第四转录终止子是PET。在一些实施方案中，所述第一转录终止子、第二转录终止子、第三转录终止子和第四转录终止子是大肠埃希氏菌(E.coli)终止子。在一些实施方案中，所述第一转录终止子、第二转录终止子、第三转录终止子和第四转录终止子形成包含4个中等大小的发夹的二级结构。

几个实施方案涉及工程化表达构建体，其包含启动子；位于启动子的转录下游的RNA编码区；和位于RNA编码区的3’的位点特异性内切核酸酶限制性位点。在一些实施方案中，所述RNA是双链RNA(dsRNA)。在一些实施方案中，所述RNA编码蛋白质。在一些实施方案中，所述RNA是调控RNA。在一些实施方案中，所述RNA编码区编码dsRNA并且包含大体上对应于靶序列的第一有义取向的核苷酸序列，大体上与靶序列互补的第二反义取向的核苷酸序列，和侧翼连接有所述第一和第二核苷酸序列并且编码RNA转录物的环-区的一个或多个核苷酸的第三核苷酸序列。在一些实施方案中，所述第一有义取向的核苷酸序列位于所述第二反义取向的核苷酸序列的5’。在一些实施方案中，所述第一有义取向的核苷酸序列位于所述第二反义取向的核苷酸序列的3’。在一些实施方案中，所述工程化表达构建体包含选自由以下组成的组的位点特异性内切核酸酶限制性位点：锌指核酸酶(ZFN)限制性位点、TAL-效应子核酸酶(TALEN)限制性位点和大范围核酸酶限制性位点。在一些实施方案中，所述大范围核酸酶限制性位点选自由以下组成的组：I-Anil、I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-PanII、I-PanMI、I-SceII、I PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-LtrI、I-GpiI、I-GZeI、I-OnuI、I-HjeMI、I-MsoI、I-TevI、I-TevII和I-TevIII。在一些实施方案中，所述工程化表达构建体包含一个或多个位于RNA编码区的转录下游并且位于所述位点特异性内切核酸酶限制性位点的5’的转录终止子序列。在一些实施方案中，所述工程化表达构建体包含基本上由SEQ ID NO 2组成的dsRNA编码区。在一些实施方案中，所述工程化表达构建体包含噬菌体启动子。

几个实施方案涉及包含工程化表达构建体的载体，所述工程化表达构建体包含启动子；位于启动子的转录下游的RNA编码区；和位于所述RNA编码区的3’位点特异性内切核酸酶限制性位点。在一些实施方案中，所述RNA是双链RNA(dsRNA)。在一些实施方案中，所述RNA编码蛋白质。在一些实施方案中，所述RNA是调控RNA。在一些实施方案中，所述RNA编码区编码dsRNA并且包含大体上对应于靶序列的第一有义取向的核苷酸序列、大体上与靶序列互补的第二反义取向的核苷酸序列，和侧翼连接有所述第一和第二核苷酸序列并且编码RNA转录物的环-区的一个或多个核苷酸的第三核苷酸序列。在一些实施方案中，所述第一有义取向的核苷酸序列位于所述第二反义取向的核苷酸序列的5’。在一些实施方案中，所述第一有义取向的核苷酸序列位于所述第二反义取向的核苷酸序列的3’。在一些实施方案中，所述工程化表达构建体包含选自由以下组成的组的位点特异性内切核酸酶限制性位点：锌指核酸酶(ZFN)限制性位点、TAL-效应子核酸酶(TALEN)限制性位点和大范围核酸酶限制性位点。在一些实施方案中，所述大范围核酸酶限制性位点选自由以下组成的组：I-Anil、I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-PanII、I-PanMI、I-SceII、I PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-LtrI、I-GpiI、I-GZeI、I-OnuI、I-HjeMI、I-MsoI、I-TevI、I-TevII和I-TevIII。在一些实施方案中，所述工程化表达构建体包含位于所述RNA编码区的转录下游和位点特异性内切核酸酶限制性位点的5’的一个或多个转录终止子序列。在一些实施方案中，所述工程化表达构建体包含基本上由SEQ ID NO 2组成的dsRNA编码区。在一些实施方案中，所述工程化RNA表达构建体包含噬菌体启动子。在一些实施方案中，所述载体是质粒载体。

几个实施方案涉及工程化表达构建体，其包含：启动子；位于启动子的转录下游的第一核酸序列，其中所述第一核酸序列编码dsRNA、调控RNA或蛋白质；和位于所述第一核酸序列的3’的第二核酸序列，其中所述第二核酸序列形成包含2个或更多个发夹的二级结构；其中所述第一核酸序列和第二核酸序列可操作地连接于启动子。在一些实施方案中，所述第二核酸序列形成包含至少3个发夹的二级结构。在一些实施方案中，每一个发夹包含至少5个碱基对。在一些实施方案中，每一个发夹包含5-30个碱基对。

在一些实施方案中，每一个发夹包含9-18个碱基对。在一些实施方案中，所述发夹间隔包含10个或更少的核苷酸的间隔区。在一些实施方案中，所述发夹间隔包含0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸的间隔区。在一些实施方案中，所述第二核酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:13、18和21-23。在一些实施方案中，所述启动子是噬菌体启动子。在一些实施方案中，所述启动子选自由以下组成的组：T7、T3、SV40、SP6、T5、β-内酰胺酶启动子、大肠埃希氏菌半乳糖启动子、阿拉伯糖启动子、碱性磷酸酶启动子、色氨酸(trp)启动子、乳糖操纵子(lac)启动子、lacUV5启动子、trc启动子和tac启动子。在一些实施方案中，所述第一核酸序列包含大体上对应于靶序列的第一有义取向的核苷酸序列、大体上与靶序列互补的第二反义取向的核苷酸序列，和侧翼连接有所述第一和第二核苷酸序列并且编码RNA转录物的环-区的一个或多个核苷酸的第三核苷酸序列。在一些实施方案中，所述第一核酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:2、4、14、15和20。

几个实施方案涉及包含工程化dsRNA表达构建体的载体，所述表达构建体包含启动子；位于启动子的转录下游的dsRNA编码区，其中所述dsRNA编码区包含大体上对应于靶序列的第一有义取向的核苷酸序列、大体上与靶序列互补的第二反义取向的核苷酸序列，和侧翼连接有所述第一和第二核苷酸序列并且编码RNA转录物的环-区的一个或多个核苷酸的第三核苷酸序列；位于dsRNA编码区的3’的第一转录终止子序列；和位于第一转录终止子的3’的第二转录终止子序列，其中所述dsRNA编码区、第一转录终止子和第二转录终止子可操作地连接于启动子。在一些实施方案中，所述第一有义取向的核苷酸序列位于所述第二反义取向的核苷酸序列的5’。在一些实施方案中，所述第一有义取向的核苷酸序列位于所述第二反义取向的核苷酸序列的3’。在一些实施方案中，所述工程化dsRNA表达构建体还包含位于第二转录终止子序列的3’的一个或多个锌指核酸酶(ZFN)、TAL-效应子核酸酶(TALEN)或大范围核酸酶限制性位点。在一些实施方案中，所述大范围核酸酶限制性位点选自由以下组成的组：I-Anil、I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-PanII、I-PanMI、I-SceII、I PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-LtrI、I-GpiI、I-GZeI、I-OnuI、I-HjeMI、I-MsoI、I-TevI、I-TevII和I-TevIII。在一些实施方案中，所述工程化dsRNA表达构建体还包含1、2、3、4、5、6个或更多个位于dsRNA编码区的3’的另外的转录终止子序列。在一些实施方案中，所述工程化dsRNA表达构建体包含两个或更多个不依赖于Rho的转录终止子序列，所述转录终止子序列各自独立地选自由以下组成的组：PTH-终止子、pET-T7终止子、终止子、pBR322-P4终止子、水泡性口膜炎病毒终止子、rrnB-Tl终止子、rrnC终止子和TTadc转录终止子，以使得所述启动子和转录终止子序列形成功能性组合。在一些实施方案中，所述载体是质粒载体。在一些实施方案中，编码所述第一转录终止子和第二转录终止子的多核苷酸形成包含两个或更多个发夹的二级结构。在一些实施方案中，编码所述第一转录终止子和第二转录终止子的多核苷酸形成包含至少3个发夹的二级结构。在一些实施方案中，所述第一转录终止子是PTH并且所述第二转录终止子是PET。在一些实施方案中，所述工程化dsRNA表达构建体包含第一转录终止子、第二转录终止子、第三转录终止子和第四转录终止子。在一些实施方案中，所述第一转录终止子是rrn BT2，所述第二转录终止子是PET，所述三转录终止子是PTH并且所述第四转录终止子是PET。在一些实施方案中，所述第一转录终止子、第二转录终止子、第三转录终止子和第四转录终止子是大肠埃希氏菌终止子。在一些实施方案中，所述第一转录终止子、第二转录终止子、第三转录终止子和第四转录终止子形成包含4个中等大小的发夹的二级结构。

几个实施方案涉及包含含有工程化表达构建体的载体的细菌宿主细胞，所述工程化表达构建体包含：启动子；位于启动子的转录下游的第一核酸序列，其中所述第一核酸序列编码dsRNA、调控RNA或蛋白质；和位于所述第一核酸序列的3’的第二核酸序列，其中所述第二核酸序列形成包含两个或更多个发夹的二级结构；其中所述第一核酸序列和第二核酸序列可操作地连接于启动子。在一些实施方案中，所述第二核酸序列形成包含至少3个发夹的二级结构。在一些实施方案中，每一个发夹包含至少5个碱基对。在一些实施方案中，每一个发夹包含5-30个碱基对。在一些实施方案中，每一个发夹包含9-18个碱基对。在一些实施方案中，发夹间隔包含10个更少的核苷酸的间隔区。在一些实施方案中，发夹间隔包含0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸的间隔区。在一些实施方案中，所述第二核酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:13、18和21-23。在一些实施方案中，所述启动子为噬菌体启动子。在一些实施方案中，所述启动子选自由以下组成的组：T7、T3、SV40、SP6、T5、β-内酰胺酶启动子、大肠埃希氏菌半乳糖启动子、阿拉伯糖启动子、碱性磷酸酶启动子、色氨酸(trp)启动子、乳糖操纵子(lac)启动子、lacUV5启动子、trc启动子和tac启动子。在一些实施方案中，所述第一核酸序列包含大体上对应于靶序列的第一有义取向的核苷酸序列、大体上与靶序列互补的第二反义取向的核苷酸序列，和侧翼连接有所述第一和第二核苷酸序列并且编码RNA转录物的环-区的一个或多个核苷酸的第三核苷酸序列。在一些实施方案中，所述第一核酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:2、4、14、15和20。在一些实施方案中，所述细菌宿主细胞不表达RNA酶A。在一些实施方案中，所述细菌宿主细胞是大肠埃希氏菌细胞。在一些实施方案中，所述细菌宿主细胞死亡但未被裂解。在一些实施方案中，所述细菌宿主细胞可用于用于控制无脊椎动物虫害或抑制病毒病在植物群体中的扩散的组合物中。几个实施方案涉及用于控制无脊椎动物虫害的方法，其包括向植物施用死亡但未裂解的细菌。在一些实施方案中，将上述任何实施方案中的死亡但水裂解的细菌在用于抑制病毒病在植物群体的扩散的方法中施用于昆虫或线虫病毒载体的植物食物源。

几个实施方案涉及包含含有工程化dsRNA表达构建体的载体的细菌宿主细胞，所述表达构建体包含：启动子；位于启动子的转录下游的dsRNA编码区，其中所述dsRNA编码区包含大体上对应于靶序列的第一有义取向的核苷酸序列、大体上与靶序列互补的第二反义取向的核苷酸序列，和侧翼连接有所述第一和第二核苷酸序列并且编码RNA转录物的环-区的一个或多个核苷酸的第三核苷酸序列；和位于dsRNA编码区的3’的位点特异性内切核酸酶限制性位点。在一些实施方案中，所述第一有义取向的核苷酸序列位于所述第二反义取向的核苷酸序列的5’。在一些实施方案中，所述第一有义取向的核苷酸序列位于所述第二反义取向的核苷酸序列的3’。一些实施方案涉及包含含有工程化dsRNA表达构建体的载体的细菌宿主细胞，所述表达构建体包含启动子；位于启动子的转录下游的dsRNA编码区，其中所述dsRNA编码区包含大体上对应于靶序列的第一有义取向的核苷酸序列、大体上与靶序列互补的第二反义取向的核苷酸序列，和侧翼连接有所述第一和第二核苷酸序列并且编码RNA转录物的环-区的一个或多个核苷酸的第三核苷酸序列；位于dsRNA编码区的3’的第一转录终止子序列；和位于第一转录终止子的3’的第二转录终止子序列，其中所述dsRNA编码区、第一转录终止子和第二转录终止子可操作地连接于启动子。在一些实施方案中，所述第一有义取向的核苷酸序列位于所述第二反义取向的核苷酸序列的5’。在一些实施方案中，所述第一有义取向的核苷酸序列位于所述第二反义取向的核苷酸序列的3’。在一些实施方案中，编码第一转录终止子和第二转录终止子的多核苷酸形成包含两个或更多个发夹的二级结构。在一些实施方案中，编码第一转录终止子和第二转录终止子的多核苷酸形成包含至少3个发夹的二级结构。在一些实施方案中，所述第一转录终止子是PTH并且所述第二转录终止子是PET。在一些实施方案中，所述工程化dsRNA表达构建体包含第一转录终止子、第二转录终止子、第三转录终止子和第四转录终止子。在一些实施方案中，所述第一转录终止子是rrn BT2，所述第二转录终止子是PET，所述第三转录终止子是PTH并且所述第四转录终止子是PET。在一些实施方案中，所述第一转录终止子、第二转录终止子、第三转录终止子和第四转录终止子是大肠埃希氏菌终止子。在一些实施方案中，所述第一转录终止子、第二转录终止子、第三转录终止子和第四转录终止子形成包含4个中等大小的发夹的二级结构。在一些实施方案中，所述细菌宿主细胞不表达RNA酶A。在一些实施方案中，所述细菌宿主细胞是大肠埃希氏菌细胞。在一些实施方案中，所述细菌宿主细胞是死亡但未裂解的。在一些实施方案中，所述细菌宿主细胞可用于用于控制无脊椎动物虫害或抑制病毒病在植物群体中的扩散的组合物。几个实施方案涉及用于控制无脊椎动物虫害的方法，其包括向植物施用死亡但未裂解的细菌。在一些实施方案中，将上述任何实施方案中的死亡但未裂解的细菌在用于抑制病毒病在植物群体中扩散的方法中施用于昆虫或线虫病毒载体的植物食物源。

几个实施方案涉及用于RNA的体内合成的包含细菌宿主细胞和生长培养基的细胞培养系统，其中所述细菌宿主细胞包含含有工程化表达构建体的载体，所述表达构建体包含启动子；位于启动子的转录下游的第一核酸序列，其中所述第一核酸序列编码dsRNA、调控RNA或蛋白质；和位于第一核酸序列的3’的第二核酸序列，其中所述第二核酸序列形成包含两个或更多个发夹的二级结构。在一些实施方案中，所述第二核酸序列形成包含至少3个发夹的二级结构。在一些实施方案中，所述第二核酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:13、18和21-23。在一些实施方案中，所述生长培养基包含3.2％胰蛋白胨、2％酵母提取物、0.5％NaCl、1％甘油、0.1％葡萄糖、0.4％α-乳糖、50mM(NH4)2SO4、10mM KH2PO4、40mMNa2HPO4、2mM MgSO4。

几个实施方案涉及用于蛋白质的体内合成的包含细菌宿主细胞和生长培养基的细胞培养系统，其中所述细菌宿主细胞包含含有工程化表达构建体的载体，所述表达构建体包含启动子；位于启动子的转录下游的第一核酸序列，其中所述第一核酸序列编码目标蛋白质；和位于第一核酸序列的3’的第二核酸序列，其中所述第二核酸序列形成包含两个或更多个发夹的二级结构。在一些实施方案中，所述第二核酸序列形成包含至少3个发夹的二级结构。在一些实施方案中，所述第二核酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:13、18和21-23。在一些实施方案中，所述生长培养基包含3.2％胰蛋白胨、2％酵母提取物、0.5％NaCl、1％甘油、0.1％葡萄糖、0.4％α-乳糖、50mM(NH4)2SO4、10mM KH2PO4、40mM Na2HPO4、2mM MgSO4。

在一些实施方案中，提供了用于dsRNA的体内合成的细胞培养系统，所述培养系统包含含有包含工程化dsRNA表达构建体的载体的细菌宿主细胞和生长培养基，所述工程化dsRNA表达构建体包含启动子；位于启动子的转录下游的dsRNA编码区，其中所述dsRNA编码区包含大体上对应于靶序列的第一有义取向的核苷酸序列、大体上与靶序列互补的第二反义取向的核苷酸序列，和侧翼连接有所述第一和第二核苷酸序列并且编码RNA转录物的环-区的一个或多个核苷酸的第三核苷酸序列；和位于dsRNA编码区的3’的位点特异性内切核酸酶限制性位点。在一些实施方案中，提供了用于dsRNA的体内合成的细胞培养系统，所述细胞培养系统包含含有包含工程化dsRNA表达构建体的载体的细菌宿主细胞和生长培养基，所述工程化dsRNA表达构建体包含启动子；位于启动子的转录下游的dsRNA编码区，其中所述dsRNA编码区包含大体上对应于靶序列的第一有义取向的核苷酸序列、大体上与靶序列互补的第二反义取向的核苷酸序列，和侧翼连接有所述第一和第二核苷酸序列并且编码RNA转录物的环-区的一个或多个核苷酸的第三核苷酸序列；位于dsRNA编码区的3’的第一转录终止子序列；和位于第一转录终止子的3’的第二转录终止子序列，其中所述dsRNA编码区、第一转录终止子和第二转录终止子可操作地连接于启动子。在一些实施方案中，编码所述第一转录终止子和第二转录终止子的多核苷酸形成包含两个或更多个发夹的二级结构。在一些实施方案中，编码所述第一转录终止子和第二转录终止子的多核苷酸形成包含至少3个发夹的二级结构。在一些实施方案中，所述第一转录终止子是PTH并且所述第二转录终止子是PET。在一些实施方案中，所述工程化dsRNA表达构建体包含第一转录终止子、第二转录终止子、第三转录终止子和第四转录终止子。在一些实施方案中，所述第一转录终止子是rrn BT2，所述第二转录终止子是PET，所述第三转录终止子是PTH并且所述第四转录终止子是PET。在一些实施方案中，所述第一转录终止子、第二转录终止子、第三转录终止子和第四转录终止子是大肠埃希氏菌终止子。在一些实施方案中，所述第一转录终止子、第二转录终止子、第三转录终止子和第四转录终止子形成包含4个中等大小的发夹的二级结构。在一些实施方案中，所述生长培养基包含3.2％胰蛋白胨、2％酵母提取物、0.5％NaCl、1％甘油、0.1％葡萄糖、0.4％α-乳糖、50mM(NH4)2SO4、10mM KH2PO4、40mM Na2HPO4、2mM MgSO4。

几种实施方案涉及用于控制无脊椎动物虫害或抑制病毒病在植物群体中的扩散的包含含有工程化表达构建体的载体的细菌宿主细胞的裂解物，所述工程化表达构建体包含启动子；位于启动子的转录下游的RNA编码区，其中所述RNA编码区编码dsRNA、调控RNA或蛋白质；和位于RNA编码区的3’的位点特异性内切核酸酶限制性位点。

几个实施方案涉及用于控制无脊椎动物虫害或抑制病毒病在植物群体中的扩散的包含含有工程化RNA表达构建体的载体的细菌宿主细胞的裂解物，所述工程化表达构建体包含启动子；位于启动子的转录下游的RNA编码区，其中所述RNA编码区编码dsRNA、调控RNA或蛋白质；位于所述dsRNA编码区的3’的第一转录终止子序列；和位于所述第一转录终止子的3’的第二转录终止子序列，其中所述RNA编码区、第一转录终止子和第二转录终止子可操作地连接于启动子。在一些实施方案中，编码所述第一转录终止子和第二转录终止子的多核苷酸形成包含两个或更多个发夹的二级结构。在一些实施方案中，编码所述第一转录终止子和第二转录终止子的多核苷酸形成包含至少3个发夹的二级结构。在一些实施方案中，所述第一转录终止子是PTH并且所述第二转录终止子是PET。在一些实施方案中，所述工程化dsRNA表达构建体包含第一转录终止子、第二转录终止子、第三转录终止子和第四转录终止子。在一些实施方案中，所述第一转录终止子是rrn BT2，所述第二转录终止子是PET，所述第三转录终止子是PTH并且所述第四转录终止子是PET。在一些实施方案中，所述第一转录终止子、第二转录终止子、第三转录终止子和第四转录终止子是大肠埃希氏菌终止子。在一些实施方案中，所述第一转录终止子、第二转录终止子、第三转录终止子和第四转录终止子形成包含4个中等大小发夹的二级结构。在一些实施方案中，所述RNA编码区编码dsRNA并且包含大体上对应于靶序列的第一有义取向的核苷酸序列、大体上与靶序列互补的第二反义取向的核苷酸序列，和侧翼连接有所述第一和第二核苷酸序列并且编码RNA转录物的环-区的一个或多个核苷酸的第三核苷酸序列。几个实施方案涉及用于控制无脊椎动物虫害的方法，其包括向植物施用细菌裂解物。在一些实施方案中，将上述任何实施方案的细菌裂解物在用于抑制病毒病在植物群体中的扩散的方法中施用于昆虫或线虫病毒载体的植物食物源。

几个实施方案涉及包含形成包含两个或更多个发夹的二级结构的核酸序列的转录终止子。在一些实施方案中，所述核酸序列形成包含至少3个发夹的二级结构。在一些实施方案中，每一个发夹包含5-30个碱基对。在一些实施方案中，每一个发夹包含9-18个碱基对。在一些实施方案中，所述发夹间隔包含10个或更少核苷酸的间隔区。在一些实施方案中，所述发夹间隔包含0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸的间隔区。在一些实施方案中，每一个发夹包含具有少于3个未配对核苷酸的茎区。在一些实施方案中，每一个发夹包含无未配对的核苷酸的茎区。在一些实施方案中，所述核酸序列选自由以下组成的组：SEQ IDNO:13、18和21-23。

几个实施方案涉及调节从表达载体产生RNA的方法，其包括在表达载体中提供可操作地连接于启动子的转录终止子和RNA编码区，其中所述转录终止子形成包含选定数目的中等大小的发夹的二级结构，由此通过提供形成具有递增数目的中等大小的发夹的二级结构的转录终止子来增加RNA的产生。在一些实施方案中，所述转录终止子形成包含单个中等大小的发夹的二级结构。在一些实施方案中，所述转录终止子形成包含两个中等大小的发夹的二级结构。在一些实施方案中，所述转录终止子形成包含3个中等大小的发夹的二级结构。在一些实施方案中，所述转录终止子形成包含4个中等大小的发夹的二级结构。在一些实施方案中，所述转录终止子形成包含5个中等大小的发夹的二级结构。

几个实施方案涉及调节从表达载体产生蛋白质的方法，其包括在表达载体中提供可操作地连接于启动子的转录终止子和蛋白质编码区，其中所述转录终止子形成包含选定数目的中等大小的发夹的二级结构，由此通过提供形成具有递增数目的中等大小的发夹的二级结构的转录终止子来增加蛋白质的产生。在一些实施方案中，所述转录终止子形成包含单个中等大小的发夹的二级结构。在一些实施方案中，所述转录终止子形成包含两个中等大小的发夹的二级结构。在一些实施方案中，所述转录终止子形成包含3个中等大小的发夹的二级结构。在一些实施方案中，所述转录终止子形成包含4个中等大小的发夹的二级结构。在一些实施方案中，所述转录终止子形成包含5个中等大小的发夹的二级结构。

附图简述

图1A描绘以5’至3’方向包含可操作地连接于有义DNA片段的启动子、环编码区、互补反义DNA片段、第一转录终止子和第二转录终止子的工程化dsRNA表达构建体的图示。

图1B描绘以5’至3’方向包含可操作地连接于有义DNA片段的启动子、环编码区、互补有义DNA片段、第一转录终止子和第二转录终止子的工程化dsRNA表达构建体的图示。

图2A描绘pCPB-hp载体的图示。

图2B描绘pCPB-hp+2T载体的图示。

图2C显示pCPB-hp+2T载体的部分图谱。

图3A是显示从20uL在37℃(左边泳道)或25℃(右边泳道)下生长过夜的培养物分离的总RNA的琼脂糖凝胶的照片。标记有“1”的泳道显示从pUC19/HT115(DE3)细菌分离的总RNA。标记有“2”的泳道显示从pCPB-hp/HT115(DE3)细菌分离的总RNA。标记有“3”的泳道显示从pCPB-hp+2T/HT115(DE3)细菌分离的总RNA。标记有“4”的泳道显示从pUC19/HT115(DE3)+pLac-T7细菌分离的总RNA。标记有“5”的泳道显示从pCPB-hp/HT115(DE3)+pLac-T7细菌分离的总RNA。标记有“6”的泳道显示从pCPB-hp+2T/HT115(DE3)+pLac-T7细菌分离的总RNA。

图3B是显示RNA酶A处理的从20uL在37℃(左边泳道)或25℃(右边泳道)生长过夜的培养物分离的总RNA的琼脂糖凝胶的照片。标记有“1”的泳道显示从pUC19/HT115(DE3)细菌分离的总RNA。标记有“2”的泳道显示从pCPB-hp/HT115(DE3)细菌分离的总RNA。标记有“3”的泳道显示从pCPB-hp+2T/HT115(DE3)细菌分离的总RNA。标记有“4”的泳道显示从pUC19/HT115(DE3)+pLac-T7细菌分离的总RNA。标记有“5”的泳道显示从pCPB-hp/HT115(DE3)+pLac-T7细菌分离的总RNA。标记有“6”的泳道显示从pCPB-hp+2T/HT115(DE3)+pLac-T7细菌分离的总RNA。

图4是显示泳道1中无诱导的总细菌RNA和泳道2中具有诱导的总细菌RNA的琼脂糖凝胶的照片。M：大小标准(marker)。

图5A是显示在无RNA酶A消化的情况下细菌转录的RNA(泳道5-8)和体外转录的RNA(泳道9和10)的琼脂糖凝胶的照片。泳道4显示大小标准。泳道5显示改良SNAP纯化的RNA的10倍稀释物。泳道6显示改良SNAP纯化的RNA的50倍稀释物。泳道7显示30K旋转过滤改良SNAP纯化的RNA的10倍稀释物。泳道8显示30K旋转过滤改良SNAP纯化的RNA的50倍稀释物。泳道9显示从线性化的pCPB-hp+2T载体体外转录的RNA的100倍稀释物。泳道10显示从线性化的pCPB-hp+2T载体体外转录的RNA的500倍稀释物。

图5B是显示细菌转录的RNA(泳道5-8)和体外转录的RNA(泳道9和10)的RNA酶A消化的结果的琼脂糖凝胶的照片。泳道4显示大小标准。泳道5显示改良SNAP纯化的RNA的10倍稀释物。泳道6显示改良SNAP纯化的RNA的50倍稀释物。泳道7显示30K旋转过滤改良SNAP纯化的RNA的10倍稀释物。泳道8显示30K旋转过滤改良SNAP纯化的RNA的50倍稀释物。泳道9显示从线性化的pCPB-hp+2T载体体外转录的RNA的100倍稀释物。泳道10显示从线性化的pCPB-hp+2T载体体外转录的RNA的500倍稀释物。

图6显示在37、51、62或72℃下孵育30分钟后大肠埃希氏菌细胞的显微照片。

图7A是显示从在自动诱导培养基(AIM)(泳道5)、Super Broth+AIM培养基(泳道6)或质粒+AIM培养基(泳道7)中生长的pDV49细菌分离的总RNA的琼脂糖凝胶的照片。泳道4显示大小标准。DV49dsRNA条带由箭头指示。

图7B是显示从在Super Broth+培养基(泳道5)生长的pCPB-hp+2T细菌分离的总RNA的琼脂糖凝胶的照片。泳道4显示大小标准。CPB dsRNA条带由箭头指示。

图8描绘pDV49+2T载体的图示。

图9描绘包含插入在启动子的3'末端与核酸酶识别位点之间的有义DNA片段和互补反义DNA片段的质粒载体的图示。核酸酶的表达使载体线性化。

图10是显示从含有具有不同终止子或终止子的组合的RNA表达载体的大肠埃希氏菌细胞分离的总RNA的琼脂糖凝胶的照片。大小标准示于泳道“M”中。泳道1显示从pUC19-PET终止子/HT115(DE3)细菌分离的RNA。泳道2显示从pUC19-PTH1终止子/HT115(DE3)细菌分离的RNA。泳道3显示从pUC19-PTH2终止子/HT115(DE3)细菌分离的RNA。泳道4显示从pUC19-BT1终止子/HT115(DE3)细菌分离的RNA。泳道5显示从pUC19-BT2终止子/HT115(DE3)细菌分离的RNA。泳道6显示从pUC19-CJ终止子/HT115(DE3)细菌分离的RNA。泳道7显示从pUC19-B1002终止子/HT115(DE3)细菌分离的RNA。泳道8显示从pUC19-B1006终止子/HT115(DE3)细菌分离的RNA。泳道9显示从pUC19-PTH+PET终止子/HT115(DE3)细菌分离的RNA。

图11描绘如使用CLC Main Workbench(6.8.4版)测定的由终止子PTH+PET(SEQ IDNO.13)、CJ(SEQ ID NO.10)、rrn BT2(SEQ ID NO.9)、rrnBT1(SEQ ID NO.8)、PTH(SEQ IDNO.7)、PET(SEQ ID NO.13)、B1006(SEQ ID NO.12)和B1002(SEQ ID NO.11)形成的二级结构。所显示的二级结构的自由能可见于表5中。

图12描绘如使用CLC Main Workbench(6.8.4版)测定的由不同大小的RNA发夹和PTH+PET终止子形成的二级结构。图12A显示27聚体RNA发夹和PTH+PET终止子形成的二级结构。图12B显示240聚体RNA发夹和PTH+PET终止子形成的二级结构。图12C显示280聚体RNA发夹和PTH+PET终止子形成的二级结构。由PTH+PET终止子形成的结构用圆圈标记。

图13是显示获自27聚体RNA发夹/PTH+PET终止子、240聚体RNA发夹/PTH+PET终止子和280聚体RNA发夹/PTH+PET终止子表达构建体的每一个的RNA产率的图。

图14是显示从含有具有不同数目和组合的终止子的RNA表达载体的大肠埃希氏菌细胞分离的总RNA的琼脂糖凝胶的照片。泳道1显示从pUC19-PTH+PET 2终止子/HT115(DE3)细菌分离的总RNA。泳道2显示从pUC19-rrn BT2+PET+PTH+PET4终止子/HT115(DE3)细菌分离的总RNA。泳道3显示从pUC19-PET+rrn BT2+PTH+PET4终止子/HT115(DE3)细菌分离的总RNA。泳道4显示从pUC19-rrn BT2+PTH+PET3终止子/HT115(DE3)细菌分离的总RNA。

图15描绘如使用CLC Main Workbench(6.8.4版)测定的通过不同数目和组合的终止子形成的二级结构。图15A显示由2个终止子PTH+PET形成的二级结构。图15B显示由4个终止子rrn BT2+PET+PTH+PET形成的二级结构。图15C显示由4个终止子PET+rrn BT2+PTH+PET形成的二级结构。图15D显示由3个终止子rrn BT2+PTH+PET形成的二级结构。由终止子组合形成的中等大小的发夹结构用圆圈标记。

图16是显示从含有具有不同数目和组合的终止子的表达载体的BL21(DE3)细胞分离的总蛋白质的SDS-PAGE凝胶的照片。表达的蛋白质蛋白A具有21k的分子量。大小标准示于泳道“M”中。泳道“A”含有从含有pUC+PET终止子表达构建体的细胞分离的蛋白质。泳道“B”含有从含有pUC+rrn BT2终止子表达构建体的细胞分离的蛋白质。泳道“C”含有从含有pUC+PTH+PET终止子表达构建体的细胞分离的蛋白质。泳道“D”含有从含有pUC+rrn BT2+PET+PTH+PET终止子表达构建体的细胞分离的蛋白质。

图17描绘如使用CLC Main Workbench(6.8.4版)测定的由工程化终止子形成的二级结构。图17A显示由4个终止子rrn BT2+PET+PTH+PET(SEQ ID No.18)形成的二级结构。图17B显示由SEQ ID 21形成的二级结构。图17C显示由SEQ ID 22形成的二级结构。图17D显示由SEQ ID 23形成的二级结构。

发明详述

下面是提供用来帮助本领域普通技术人员实践本发明的本发明的详细说明。本领域普通技术人员可在不背离本发明的精神或范围的情况下对本文所述实施方案作出修改和变化。

A.定义

除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。当术语以单数形式提供时，除非另有说明，否则也包括该术语的复数形式。除非另有说明，否则本说明书的正文中的核酸序列相对于启动子以5'至3'的方向给出。

在下面的描述中，广泛地使用许多术语。下列定义被提供来帮助理解本发明实施方案。

如本文中所用，“一个/种(a或an)”可意指一个或一个以上。

如本文中所用，术语“约”表示数值包括用于测定数值的方法的固有误差变化或实验之间存在的变化。

应题解，尽管术语“第一”、“第二”等可在本文中用于描述各种要素，但这些要素应当不受这些术语限制。这些术语仅用于区分一个要素与另一个要素。

如本文中所用，术语“核酸”或“核酸分子”是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。核酸分子可由为天然存在的核苷酸(诸如DNA和RNA)，或天然存在的核苷酸的类似物(例如，天然存在的核苷酸的对应体形式)的单体或这两者的组合组成。经修饰的核苷酸可在糖部分和/或嘧啶或嘌呤碱部分具有改变。糖修饰包括，例如，用卤素、烷基、胺和叠氮基对一个或多个羟基替换，或糖类可被官能化为醚或酯。此外，整个糖部分可被立体化学和电子方面相似的结构诸如氮杂-糖类和碳环糖类似物替换。碱基部分的修饰的实例包括烷基化嘌呤和嘧啶、酰化嘌呤或嘧啶，或其它公知的杂环取代基。核酸单体可以通过磷酸二酯键或此种键联的类似物连接。磷酸二酯键联的类似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺基硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯(phosphoranilidate)、磷酰胺酯等。

“分离的核酸分子”是指未被整合在生物的基因组DNA中的核酸分子。例如，编码已从细胞的基因组DNA分离的受体的DNA分子是分离的DNA分子。分离的核酸分子的另一非限制性实例是未被整合在生物的基因组中的化学合成的核酸分子。分离的核酸分子的另一个非限制性实例是已从特定物种分离的比来自该物种的染色体的完整DNA分子小的核酸分子。

术语“载体”是指用作将外来遗传物质人工运送至宿主细胞(其中其可被复制和/或表达)内的媒介物的DNA分子。载体的DNA序列通常包括插入子(转基因)和用作“主链”的更大的序列。所述载体主链可含有一个或多个限制性内切酶识别位点(其允许以可确定的方式插入核酸分子而丧失该载体的基本生物学功能)、编码适合用于鉴定和选择用载体转导的细胞的标记基因的核苷酸序列和复制起点。表达载体(表达构建体)通常具有驱动转基因在宿主细胞中表达的启动子序列。适合根据本实施方案的用途的载体的实例包括，但不限于，质粒、粘粒、质体系、人工染色体和噬菌体。

术语“启动子”或“启动子序列”可以互换使用，并指当连接于目标核苷酸序列时能够控制目标核苷酸序列至RNA的转录的DNA序列。术语“启动子”和“启动子序列”包括最小启动子，其为由TATA盒和用于指定转录起始的位点或参与蛋白质因子(其控制响应生理条件的转录起始的效力)的结合的其它DNA序列组成的短的DNA序列。启动子可以是同源的，整体来源于宿主细胞的天然基因，或是异源的，整体或部分来源于另一个生物，或可由来源于自然界中发现的不同启动子的不同元件组成，或可由合成DNA区段组成。如本文中所用，启动子可以是组成型活性启动子或受调控的启动子。在一些实施方案中，该启动子可被阻遏。在其它实施方案中，启动子可被诱导。

当核苷酸序列的表达被置于启动子的控制下时，此种核苷酸序列被叙述为“可操作地连接于”启动子。类似地，如果调控元件调节核心启动子的活性，则调控元件与核心启动子是“可操作地连接的”。

术语“宿主细胞”是指能够复制和/或转录根据本发明实施方案设计的载体的任何细胞。用于本发明实施方案的宿主细胞可以是原核细胞，诸如大肠埃希氏菌，或真核细胞诸如真菌、植物、昆虫、两栖动物、禽类或哺乳动物细胞。载体至靶细胞内的插入通常称为细菌细胞的转化，真核细胞的转染，但病毒载体的插入通常被称为转导。

术语“表达”或“基因表达”是指基因产物的生物合成。例如，在功能性RNA的情况下，基因表达涉及该基因至RNA的转录。

如本文中所用，短语“基因表达的抑制”或“抑制靶基因的表达”或“基因抑制”或“抑制靶基因”是指在来自靶基因的蛋白质和/或mRNA产物的水平上的不存在(或可观察到的减少)。

如本文中所用，术语“RNA转录物”是指通过DNA序列的RNA聚合酶催化的转录得到的产物。当RNA转录物是所述DNA序列的完全互补拷贝时，其被称为初级转录物或其可以是从初级转录物的转录后加工衍生的RNA序列并被称作成熟RNA。

如本文中所用，术语“有义RNA”是指对应于当由目标生物产生时以mRNA的形式存在的，能够被目标生物翻译成蛋白质的序列或区段的RNA转录物。在一些实施方案中，目标生物是害虫。

如本文中所用，术语“反义RNA”是指通常在目标生物的细胞中产生的mRNA的全部或部分互补的RNA转录物。反义RNA的互补性可以是与特定基因转录物的任何部分(即，5'非编码序列、3'非翻译序列、内含子或编码序列上的部分)的互补性。在一些实施方案中，目标生物是害虫。

术语“参照序列”是指用作用于序列比较的基础的序列；参照序列可以是较大序列的子集，例如，作为列表中给定的全长cDNA序列的区段或可包含完整基因序列。一般地，参照序列的长度是至少20个核苷酸，时常为至少25个核苷酸，且通常为至少50个核苷酸。

如本文中所用，术语“靶序列”是指被靶向抑制的基因的核苷酸序列，其对应于dsRNA的双链体形成区。在此背景下，术语“基因”意指相当于遗传单位的基因组序列的可定位区域，其包括调控区、转录区和/或其它功能序列区。视情况而定，术语靶序列可指被靶向抑制的基因的全长核苷酸序列或被靶向抑制的基因的一部分的核苷酸序列。

当以5'至3'方向观察时第一核苷酸序列被叙述为以3'至5'方向观察的第二参照核苷酸序列“的互补序列”或与所述第二核苷酸序列“互补”，如果第一核苷酸的序列是参照核苷酸序列的反向互补序列的话。举例来说，核苷酸序列“CATTAG”对应于参照序列“CATTAG”并且与参照序列“GTAATC”互补。当以5’至3’阅读的序列之一的每一个核苷酸与当以3’至5’阅读的另一序列的每一个核苷酸互补时，核苷酸序列分子被叙述为显示“完全互补性”。

如本文中所用，"环"是指由核酸的单链形成的结构，其中侧翼连接特定单链核苷酸区的互补区以将互补区之间的单链核苷酸区从双链体形成或沃尔森-克里克碱基配对排除的方式杂交。环是具有任何长度的单链核苷酸区。

如本文中所用，术语“序列同一性”、“序列相似性”或“同源性”用于描述两个或更多个核苷酸序列之间的序列关系。两个序列之间的“序列同一性”的百分比通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列来测定，以使得比较窗口中的序列的部分可相较于参照序列(其不包含添加或缺失)包含添加或缺失(即，缺口)来进行两个序列的最佳比对。可通过如下方式测定所述百分比：测定在其上在两个序列中存在相同的核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配位置的数目，将匹配的位置的数目除以比较窗口中位置的总数，然后将结果乘以100而得到序列同一性的百分比。在与参照序列比较中在每一个位置上都相同的序列被叙述为与参照序列相同并且反之亦然。

如本文中所用，“比较窗口”是指具有至少6个连续位置，通常地约50至约100个，更通常地约100至约150个连续位置的概念性区段，其中在两个序列最佳比对后将序列与具有相同数目的连续位置的参照序列相比较。比较窗口相较于参照序列(其不包含添加或缺失)可包含约20％或更少的添加或缺失(即，缺口)以进行两个序列的最佳比对。本领域普通技术人员应当参考Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0,GeneticsComputer Group,575Science Drive Madison,Wis.,USA)中用于序列比对的详细方法或关于序列分析的详细论述参考Ausubel等人(1998)。

如本文中所用，术语“从……衍生的”是指可从具体指定的来源或物种获得的指定的核苷酸序列，但不一定直接来自该指定的来源或物种。

术语“内切核酸酶”或“限制性内切核酸酶”是指切割多核苷酸链内的磷酸二酯键的酶。

术语“大范围核酸酶”是指特征在于大的识别位点(12至40个碱基对的双链DNA序列)的内切脱氧核糖核酸酶，并且所述识别位点由于它们的识别位点的大小的原因，通常以极低频率存在(如果存在的话)于给定的基因组中。大范围核酸酶的实例包括，但不限于I-Anil、I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-PanII、I-PanMI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-LtrI、I-GpiI、I-GZeI、I-OnuI、I-HjeMI、I-MsoI、I-TevI、I-TevII和I-TevIII。

术语“TAL效应子核酸酶”(TALEN)是指包含与核酸酶结构域的TAL-效应子DNA结合结构域融合的核酸酶。TAL-效应子DNA结合结构域可被工程化来结合期望的靶并与核酸酶结构域，诸如Fok1核酸酶结构域融合，以衍生TAL效应子结构域-核酸酶融合蛋白。

术语“锌指核酸酶”(ZFN)是指包含与核酸酶结构域诸如Fok1核酸酶结构域融合的锌指DNA结合结构域的核酸酶。锌指结构域可被工程化来靶向期望的DNA序列并且这使得锌指核酸酶能够靶向复杂基因组内的独特序列。

术语“裂解”是指多核苷酸诸如DNA分子的共价主链的断裂。

如本文中所用，术语“害虫”是指普遍存在于人类环境中并且可摄入或接触一个或多个细胞、组织或由害虫宿主或共生体产生的液体的昆虫、蛛形纲动物、甲壳类动物、真菌、细菌、病毒、线虫、扁虫、蛔虫、蛲虫、钩虫、绦虫、锥虫、血吸虫、马蝇、蚤、蜱、螨和虱等。

如本文中所用，术语“抗虫性”是指害虫宿主或共生生物抵抗来自害虫的攻击的能力，所述害虫通常能够使害虫宿主或共生生物遭受损害或损失。如本文中所述，此类抗虫性可通过向害虫宿主或共生生物的表面提供dsRNA分子来实现，所述dsRNA分子部分由与从偏好以所述害虫宿主或共生生物为食的害虫内的DNA序列编码的对应RNA区段相同的RNA区段组成。目标害虫内的基因的表达被所述dsRNA抑制，并且目标害虫的基因的表达的抑制使得害虫宿主或共生生物具有抗虫性。

B.RNA的产生

本公开内容涉及用于高效且具有成本效益地产生和递送转录的RNA分子的组合物和方法。在一些实施方案中，所述转录的RNA分子编码蛋白质。在一些实施方案中，所述转录的RNA分子编码调控RNA。在一些实施方案中，所述转录的RNA分子是dsRNA。在一些实施方案中，所述转录的RNA分子包含形成稳定的至少一部分双链的RNA(dsRNA)分子，能够抑制靶基因的有义取向和反义取向的区段。在一些实施方案中，所述转录的RNA分子编码蛋白质。在一些实施方案中，所述转录的RNA分子是调控RNA。

dsRNA

本文中所述的几个实施方案涉及用于RNA分子的体内或体外产生的载体和系统，所述RNA分子包含通过第三RNA区段连接于大体上互补的第二RNA区段的第一RNA区段。所述第一和第二RNA区段存在于RNA分子的长度内并且彼此大体上反向重复，以使得第一与第二RNA区段之间的互补性导致两个区段在体内和体外杂交，以形成在第一和第二区段的每一个的一个末端通过第三RNA区段连接在一起的双链RNA茎的能力，所述第三RNA区段形成单链环。所述第一和第二区段分别对应于显示与被靶向抑制的核苷酸序列的显著同一性的序列的有义和反义序列。在一些实施方案中，所述RNA分子还包括至少第二茎-环形成区，其抑制至少第二靶序列。

在一些实施方案中，RNA双链体的有义链的长度可以为至少约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、900个或更多个核苷酸。类似地，在一些实施方案中，RNA双链体的反义链的长度可以为至少约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、900个或更多个核苷酸。RNA双链体的有义和反义链不必是完全互补的，并且双链RNA可含有内部非互补区。有义和反义链仅需是双链体或大体上互补以在生物条件下退火。在一些实施方案中，当双链RNA通过有义与反义链的互补碱基配对形成时，所得的双链体具有平端。在其它实施方案中，当双链RNA通过有义和反义链的互补碱基配对形成时，所述dsRNA具有不对称结构。在一些实施方案中，所述dsRNA在有义链上拥有具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个核苷酸的5’悬突。在其它实施方案中，所述dsRNA在反义链上拥有具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个核苷酸的5’悬突。在其它实施方案中，所述dsRNA在有义链上拥有具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个核苷酸的3’悬突。在其它实施方案中，所述dsRNA在反义链上拥有具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个核苷酸的3’悬突。

所述第三RNA区段可包含促进或允许所述第一RNA区段与第二RNA区段杂交并形成dsRNA的任何核苷酸序列。所述第三RNA区段可包含长度为至少约1-5个核苷酸，长度为5-10个核苷酸，长度为10-15个核苷酸，长度为15-20个核苷酸，长度为20-25个核苷酸，长度为25-30个核苷酸，长度为30-35个核苷酸，长度为35-40个核苷酸，长度为40-45个核苷酸，长度为45-50个核苷酸，长度为50-55个核苷酸，长度为55-60个核苷酸，长度为60-65个核苷酸，长度为65-70个核苷酸，长度为70-75个核苷酸，长度为75-80个核苷酸，长度为80-85个核苷酸，长度为85-90个核苷酸，长度为90-95个核苷酸，长度为95-100个核苷酸，长度为100-150个核苷酸，长度为150-200个核苷酸，长度为200-250个核苷酸，长度为250-400个核苷酸或长度为400-500个核苷酸的核苷酸序列。多种不同的序列可用作环序列。已证明在shRNA中起作用的特定环序列的实例包括UUCAAGAGA、CCACACC、AAGCUU、CTCGAG、CCACC和UUCG。在一些实施方案中，第三RNA区段的核苷酸序列大体上对应于被靶向抑制的基因的区段的有义或反义序列。例如，所述第三RNA区段可包含对应于位于被自我互补的第一和第二RNA区段靶向的基因区段的远端的有义或反义核苷酸的核苷酸序列。在其它实施方案中，第三RNA区段的核苷酸序列大体上对应于非靶向基因的区段的有义或反义序列。在一些实施方案中，第三RNA区段的核苷酸序列来源于微RNA(miRNA)的环区的核苷酸序列。在一些实施方案中，第三RNA区段的核苷酸序列来源于目标生物的天然微RNA(miRNA)的环区的核苷酸序列。在一些实施方案中，第三RNA区段的核苷酸是工程化核苷酸序列。在一些实施方案中，第三RNA区段的工程化核苷酸序列是通过改变GC含量从天然基因的核苷酸序列衍生的。在一些实施方案中，第三RNA区段的核苷酸序列编码适体。

任何基因可被根据本实施方案产生的dsRNA分子靶向抑制。使用如本文中所述的dsRNA分子对靶基因的抑制是序列特异性的，因为对应于dsRNA的双链体形成区的核苷酸序列被靶向进行RNAi介导的抑制。dsRNA的双链体形成区可对应于靶基因的初级转录产物或完全加工的mRNA的全长核苷酸序列，或dsRNA的双链体形成区可对应于靶基因的初级转录产物或完全加工的mRNA的一部分。对应于dsRNA的双链体形成区的被靶向抑制的基因的核苷酸序列可被称为“靶序列”。dsRNA的双链体形成区可对应于长度为至少约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、900或1,000个核苷酸的靶基因的一部分。在一些实施方案中，取决于靶基因的大小，dsRNA的双链体形成区可对应于超过约20-25个靶基因的核苷酸，超过约25-50个靶基因的核苷酸，超过约50-75个靶基因的核苷酸，超过约75-100个靶基因的核苷酸，超过约100-125个靶基因的核苷酸，超过约125-150个靶基因的核苷酸，超过约150-175个靶基因的核苷酸，或超过约175-200个靶基因的核苷酸，超过约200-250个靶基因的核苷酸，超过约250-275个靶基因的核苷酸，超过约275-300个靶基因的核苷酸，超过约300-325个靶基因的核苷酸，超过约325-350个靶基因的核苷酸，超过约350-400个靶基因的核苷酸，超过约400-450个靶基因的核苷酸，超过约450-500个靶基因的核苷酸，超过约500-550个靶基因的核苷酸，超过约550-600个靶基因的核苷酸，超过约600-700个靶基因的核苷酸，或超过约700-1,000个靶基因的核苷酸。双链体形成区的长度可取决于能够被目标生物例如昆虫摄入的dsRNA分子的长度，和能够在目标生物的细胞内被加工成指导RNA干扰的片段的dsRNA的长度。双链体形成区的长度还可受dsRNA合成方法影响。

在一些实施方案中，dsRNA分子的双链体形成区与靶序列具有完全互补性(100％)。然而，dsRNA分子的双链体形成区与靶序列之间的绝对序列同一性不是所需的。可因基因突变、品系多态性或进化趋异而预期的序列变异被耐受，并且含有相对于靶序列具有插入、缺失和单点突变的双链体形成核苷酸的dsRNA可用于抑制靶基因。如本文中所述的dsRNA的双链体形成区的核苷酸序列与靶基因的对应部分可以是大体上互补的，例如，所述序列沿着被靶向的序列可共有至少约80％的同一性、至少约90％的同一性、至少约95％的同一性、至少约96％的同一性、至少约97％的同一性、至少约98％的同一性或至少约99％的同一性。如本文中描述的dsRNA的双链形成区也可在功能上被定义为能够与靶基因转录物的一部分杂交的核苷酸序列。增加的长度可补偿dsRNA分子的双链体形成区与其靶序列之间的较少的同源性。相同核苷酸序列的长度可以为至少约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500或至少约1000个碱基。

可针对任何靶序列，包括选自对于害虫或病原体是天然的基因的一个或多个靶序列设计dsRNA分子的双链体形成区。所述靶序列可选自对于真核生物或非真核生物是天然的基因。靶序列可包括来自任何物种的任何序列，所述物种包括，但不限于，细菌；病毒；真菌；植物，包括单子叶和双子叶植物，诸如农作物植物、观赏植物以及家养或野生植物；无脊椎动物诸如节肢动物、环节动物、线虫和软体动物；和脊椎动物诸如两栖类动物、鱼、鸟类或哺乳动物。

靶序列可以是可翻译(编码)序列，或可以是非编码序列(诸如非编码调控序列)，或这两者。非可翻译(非编码)靶序列的非限制性实例包括：5'非翻译区、启动子、增强子或其它非编码转录区、3'非翻译区、终止子和内含子。靶序列也可包括编码微RNA、小干扰RNA、核糖体或核酶的RNA组分、小核仁RNA和其它非编码RNA(参见，例如，在rfam.wustl.edu上公共提供的非编码RNA序列；Erdmann等(2001)Nucleic Acids Res.,29:189-193；Gottesman(2005)Trends Genet.,21:399-404；Griffiths-Jones等(2005)Nucleic Acids Res.,33:121-124，所述文献通过引用并入)的基因。可翻译(编码)靶序列的非限制性实例包括：编码转录因子的基因、编码受体的基因、编码激素的基因、管家基因和编码参与目标分子(例如，但不限于，氨基酸、脂肪酸和其它脂质、糖类和其它碳水化合物、生物聚合物和次级代谢产物，包括生物碱、萜类、聚酮、非核糖体肽和混合的生物合成来源的次级代谢产物)的生物合成或分解代谢的酶的基因。另外，靶核苷酸序列可以从其功能已在文献中被确定的任何植物、昆虫、病毒、细菌或真菌基因测定。可以预期的是，几个标准可用于靶基因的选择。例如，靶核苷酸序列可从在活力、生长、发育、繁殖和感染性方面起着重要作用的基因测定。这些基因可通过果蝇、线虫或其它生物中的致死敲除突变来鉴定。所述基因还可以是其蛋白质产物具有快速周转率，以使dsRNA抑制将导致蛋白质水平的迅速降低的基因。在某些实施方案中，有利的是选择其表达水平的少量下降导致对生物有害的作用的基因。

在一些实施方案中，所述靶序列选自对昆虫是天然的基因。在一些实施方案中，所述靶序列可选自对于任何昆虫物种是天然的基因，所述昆虫引起对作物植物的损害和随后产量损失(害虫)。害虫的非限定性实例包括：玉米叶蚜、草地贪夜蛾、非洲粘虫、棉铃虫、玉米叶蝉、玉米斑潜叶蝇、西方玉米根虫、北方玉米根虫、墨西哥玉米根虫、南方玉米根虫、地老虎、种蝇、金针虫、小麦秆蝇蛆、十一星瓜叶甲、绿蝽、褐蝽、大豆蚜和大豆螟虫。昆虫中的基因可在成熟(成体)、未成熟(幼虫)或产卵阶段被靶向。在一些实施方案中，被靶向抑制的基因可编码必需蛋白质，其所预测的功能选自以下组成的组：肌肉生成、保幼激素形成、保幼激素调节、离子调节和转运、消化酶的合成、细胞膜电位的维持、氨基酸的生物合成、氨基酸的降解、精子的形成、信息素的合成、信息素传感、触角形成、翼形成、腿的形成、发育和分化、卵形成、幼虫成熟、消化酶的形成、血淋巴的合成、血淋巴的维持、神经传递、细胞分裂、能量代谢、呼吸和细胞凋亡。当靶序列来源于对于昆虫的活力或感染性是必需的基因时，其下调导致昆虫存活和感染其宿主的能力下降。因此，此类下调导致对昆虫的维持活力和感染性的“有害作用”，因为其阻止或减弱昆虫以来源于宿主细胞的营养物为食和依靠所述营养物生存的能力。由于昆虫的活力和感染性的该降低，对昆虫感染的抗性和/或增强的对昆虫感染的耐受性得以提高。在一些实施方案中，所述靶序列选自其蛋白质产物具有快速周转率，以使得dsRNA抑制将导致蛋白质水平的快速降低的基因。在某些实施方案中，有利的是选择其表达水平的少量降低导致对于昆虫是有害的作用的基因。

在一些实施方案中，所述靶序列选自在昆虫肠中表达的基因。在一些实施方案中，所述靶序列选自与已知的肠表达的基因(其编码质膜质子V-ATP酶的蛋白质组分)的核苷酸序列共有显著同源性的基因(Dow等，1997,J.Exp.Biol.,200:237-245；Dow,Bioenerg.Biomemb.,1999,31:75-83)。该蛋白质复合物是上皮离子转运的唯一催渗剂，并且负责中肠腔的碱化。所述V-ATP酶也在马尔皮基氏管(以与哺乳动物的肾器官类似的方式在体液平衡和外来化合物的解毒中起作用的昆虫后肠的生长物)中表达。

在一些实施方案中，所述靶序列选自参与昆虫的生长、发育和生殖的基因。在一些实施方案中，所述靶序列选自编码CHD3基因的基因。黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)中的CHD3基因编码参与细胞核中染色质组装/解聚的具有ATP依赖性DNA解旋酶活性的蛋白质。已在多种生物诸如拟南芥(Arabidopsis thaliana)、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中发现类似序列。在一些实施方案中，所述靶序列选自编码β-微管蛋白基因的基因。β-微管蛋白基因家族编码作为细胞的细胞骨架的组成部分的微管相关蛋白。相关序列存在于诸如秀丽隐杆线虫和烟草天蛾(ManducaSexta)的多种生物中。

在一些实施方案中，所述靶基因可选自对于线虫类害虫是天然的基因。线虫类害虫的非限定性实例包括：哥伦比亚根结线虫、北方根结线虫、南方根结线虫、根结线虫、假根结线虫、玉米孢囊线虫、大豆孢囊线虫、马铃薯孢囊线虫、甜菜孢囊线虫、刺线虫、环线虫、螺旋线虫、矛线虫、短剑线虫、针线虫、坏死线虫、短粗根线虫、矮化线虫、金线虫、马铃薯腐烂线虫。在一些实施方案中、被靶向抑制的基因可编码必需蛋白质，其预测的功能选自由以下组成的组：肌肉形成、离子调节和转运、消化酶合成、细胞膜电位的维持、氨基酸生物合成、氨基酸降解、精子形成、发育和分化、卵形成、消化酶形成、神经传递、细胞分裂、能量代谢、呼吸和细胞凋亡。当所述靶序列来源于线虫的活力和感染性所必需的基因时，其下调导致降低的线虫存活和感染其宿主的能力。因此，此类下调导致对线虫的维持活力和感染性的“有害作用”，因为其阻止或降低线虫以来源于宿主细胞的营养物为食或依靠所述营养物生存的能力。由于线虫存活和感染性的该降低，对线虫感染的抗性和/或增强的对线虫感染的耐受性得以提高。在一些实施方案中，所述靶序列选自其蛋白质产物具有快速周转率，以使得dsRNA抑制将导致蛋白质水平的快速下降的基因。在某些实施方案中，有利的是选择其表达水平的少量下降导致对于线虫是有害的作用的基因。

在一些实施方案中，所述靶基因可选自对于真菌是天然的基因。真菌的非限定性实例包括：菜豆壳球孢菌(Macrophomina phaseolini)、玉米柄锈菌(Puccinia sorghi)、玉米柄锈菌(Ustilago maydis)、小柄凸脐蠕孢(Exserohilum pedicellatum)、轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioide)、串珠镰刀菌(Fusarium verticillioide)和丝轴黑粉菌(Sphacelotheca reiliana)。在一些实施方案中，被靶向抑制的基因可编码必需蛋白质，其预测的功能选自由以下组成的组：细胞分裂、能量代谢、细胞壁形成、孢子形成、菌丝形成和消化酶合成。当所述靶序列来源于真菌的活力或感染性所必需的基因时，其下调导致减弱的真菌存活和感染其宿主的能力。因此，此类下调导致对真菌的维持活力和感染性的“有害的作用”，因为其阻止和减弱真菌以来源于宿主细胞的营养物为食和依靠所述营养物生存的能力。由于真菌的活力和感染性的该降低，对真菌感染的抗性和/或增强的对真菌感染的耐受性得以提高。在一些实施方案中，所述靶序列选自其蛋白质产物具有快速周转率，以使得dsRNA抑制将导致蛋白质水平的快速降低的基因。在某些实施方案中，有利地的是选择其表达水平的少量下降导致对于真菌是有害的作用的基因。

在某些实施方案中，可能期望dsRNA在不止一种物种中抑制靶基因的表达。在一些实施方案中，可能期望在两个或更多个物种，例如玉米根虫物种中抑制靶基因的表达。在此类实施方案中，靶序列可选自在所选定的物种间高度保守的基因或基因的部分。例如，所述靶基因可选自在所选定的物种间具有至少约80％的同一性、至少约85％的同一性、至少约90％的同一性、至少约95％的同一性、至少约96％的同一性、至少约97％的同一性、至少约98％的同一性或至少约99％的同性的基因或基因的部分。

在某些实施方案中，可能期望dsRNA显示物种特异性活性。在一些实施方案中，靶序列可选自来自靶物种的天然基因或天然基因的部分，所述天然基因与其它物种中的对应基因具有低程度的序列同一性。在一些实施方案中，所述靶序列可选自其中与其它物种中的对应基因的序列同一性的程度低于约80％的基因或基因的部分。在其它实施方案中，所述靶基因可选自其中与其它物种中的对应基因的序列同一性的程度低于约70％的基因或基因的部分。在其它实施方案中，所述靶基因可选自其中与其它物种中的对应基因的序列同一性的程度低于约60％的基因或基因的部分。在某些实施方案中，所述靶基因可选自在单个昆虫物种之间或昆虫与其它生物之间保守性低的基因或基因的部分。在一些实施方案中，靶序列可选自在其它生物中没有已知的同源物的靶物种的天然基因。在一些实施方案中，靶序列可选自在植物或脊椎动物中没有已知的同源物的靶物种的天然基因。

载体和表达

本文中所述的几个实施方案涉及用于RNA的体内和体外转录的包含可操作地连接于RNA编码元件的启动子的工程化表达构建体。在一些实施方案中，所述RNA可以是dsRNA。在其它实施方案中，所述RNA可编码蛋白质或可以是调控RNA。本文中所述的工程化表达构建体可以有利地形成可复制载体的一部分。在本文中所述的实施方案中，从工程化RNA表达构建体产生RNA的效率通过阻止不期望的RNA从载体主链的转录或使所述转录降至最低来提高。设想了阻止不期望的载体主链的转录或使所述转录降至最低的几个方法，所述方法可被独立使用或组合使用。在一些实施方案中，两个或更多个转录终止子序列可操作地连接于位于RNA编码元件的3’末端下游的启动子。在一些实施方案中，形成两个或更多个相邻的中等大小的发夹的二级结构的核酸序列可操作地连接于RNA编码元件的3’末端下游的启动子。在一些实施方案中，在RNA编码元件的3’提供优选地未在宿主基因组中发现的一个或多个限制性位点。限制性位点上的裂解阻止切割位点下游的不期望的转录。在一些实施方案中，编码可通过互补碱基配对形成一个或多个茎-环结构的RNA转录物的合成核苷酸序列可操作地连接于RNA编码元件的3’末端下游的启动子。在一些实施方案中，在RNA编码元件的3’提供编码一个或多个dsDNA-结合蛋白的结合位点的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述工程化RNA表达构建体包含Rho依赖性终止信号。在一些实施方案中，减小载体主链的大小以使得不期望的转录降至最低。

在本文中所述的实施方案中，所述工程化表达构建体包含可操作地连接于dsRNA编码元件的启动子，所述dsRNA元件包含：与靶序列大体上相同的有义取向的核苷酸序列；与所述有义取向的核苷酸序列大体上互补的反义取向的核苷酸序列；和侧翼连接有互补的有义和反义核苷酸序列，编码从RNA转录物的互补区的双链体形成排除的一个或多个核苷酸的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述工程化RNA表达构建体包含可操作地连接于dsRNA编码元件的启动子，所述dsRNA编码元件以5'至3'方向包含：与靶序列大体上相同的有义取向的核苷酸序列；编码dsRNA分子的环-区的核苷酸序列；和与所述有义取向的核苷酸序列大体上互补的反义取向的核苷酸序列。在其它实施方案中，所述工程化RNA表达构建体包含可操作地连接于dsRNA编码元件的启动子，所述dsRNA编码元件以5'至3'方向包含：与靶序列大体上互补的反义取向的核苷酸序列；编码dsRNA分子的环-区的核苷酸序列；和与所述反义取向的核苷酸序列大体上互补的有义取向的核苷酸序列。编码dsRNA分子的环-区的核苷酸序列的取向可以是有义或反义的。在一些实施方案中，编码dsRNA分子的环-区的核苷酸序列与被所述dsRNA分子靶向抑制的基因的有义或反义序列的一部分大体上相同。在一些实施方案中，编码dsRNA分子的环-区的核苷酸序列与除被所述dsRNA分子靶向抑制的基因外的基因的有义或反义序列的一部分大体上相同。在一些实施方案中，编码dsRNA分子的环-区的核苷酸序列是工程化核苷酸序列。在一些实施方案中，编码dsRNA分子的环-区的核苷酸序列编码适体。

在一些实施方案中，所述工程化RNA表达构建体包含可操作地连接于dsRNA编码元件的启动子，所述dsRNA编码元件以5'至3'方向包含：与靶基因的至少一部分核苷酸序列大体上相同的有义取向的核苷酸序列和比所述有义取向的核苷酸序列短且与有义取向的核苷酸序列的5’末端大体上互补的反义取向的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述工程化RNA表达构建体包含可操作地连接于dsRNA编码元件的启动子，所述dsRNA编码元件以5'至3'方向包含：与靶基因的至少一部分核苷酸序列大体上相同的有义取向的核苷酸序列，和与靶基因的至少一部分核苷酸序列大体上互补并且在其3’末端上包含与有义取向的核苷酸序列大体上互补的核苷酸序列的较长的反义取向的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述工程化RNA表达构建体包含可操作地连接于dsRNA编码元件的启动子，所述dsRNA编码元件以5'至3'方向包含：与靶基因的至少一部分核苷酸序列大体上互补的反义取向的核苷酸序列，和比所述反义取向的核苷酸序列短并且与所述反义取向的核苷酸序列的5’末端大体上互补的有义取向的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述工程化RNA表达构建体包含可操作地连接于dsRNA编码元件的启动子，所述dsRNA编码元件以5'至3'方向包含：与靶基因的一部分核苷酸序列大体上互补的反义取向的核苷酸序列，和与靶基因的至少一部分大体上相同的且在其3’末端上包含与所述反义取向的核苷酸序列大体上互补的核苷酸序列的较长的有义取向的核苷酸序列。

在一些实施方案中，所述工程化RNA表达构建体包含可操作地连接于蛋白质编码元件的启动子。

在一些实施方案中，所述工程化RNA表达构建体包含可操作地连接于调控RNA编码元件的启动子。在一些实施方案中，所述调控RNA选自由以下组成的组：反义RNA、CRISPRRNA、长非编码RNA、微RNA、piwi-相互作用RNA、小干扰RNA和反式作用RNA。

用于所述工程化RNA表达构建体的启动子可基于预期所述工程化RNA表达构建体在其中起作用的表达系统(例如，原核或真核宿主细胞)的性质来选择。所述启动子可以是组成型或诱导型启动子。在一些实施方案中，噬菌体启动子例如T7、T3、SV40或SP6可用于所述工程化RNA表达构建体，因为它们提供高水平的仅依赖于适当的RNA聚合酶的结合的转录。当宿主细胞不表达适当的RNA聚合酶时，可在与所述工程化RNA表达构建体相同或不同的载体上提供可操作地连接于宿主细胞识别的启动子的编码T7、T3、SV40或SP6聚合酶的转基因。所述宿主细胞识别的启动子可以是诱导型启动子或组成型活性启动子。在一些实施方案中，被由宿主基因组表达的聚合酶识别的同源启动子可用于工程化RNA表达构建体。适合与细菌宿主一起使用的启动子的实例包括，但不限于，T5、β-内酰胺酶启动子、大肠埃希氏菌半乳糖启动子、阿拉伯糖启动子、碱性磷酸酶启动子、色氨酸(trp)启动子、乳糖操纵子(lac)启动子、lacUV5启动子、trc启动子和tac启动子。在一些实施方案中，用于所述工程化RNA表达构建体的启动子可以是RNA Pol I、RNA Pol II或RNA Pol III启动子。在某些实施方案中，用于所述工程化RNA表达构建体的启动子可以是Pol III启动子。Pol III启动子的实例包括，但不限于U6启动子、tRNA启动子、逆转录病毒LTR启动子、腺病毒VA1启动子、5SrRNA启动子、7SK RNA启动子、7SL RNA启动子和H1RNA启动子。在一些实施方案中，酵母识别的启动子，例如ADR1启动子、野生型α-因子启动子或ADH2/GAPD杂交启动子可用于所述工程化dsRNA表达构建体。

在一些实施方案中，所述工程化RNA表达构建体可任选地还包含有利地影响RNA编码元件的转录和/或所得转录物的稳定性的额外核苷酸序列。例如，所述工程化RNA表达构建体还可包含一个或多个增强子或多腺苷酸化序列。

称为不依赖于Rho和Rho依赖性终止的两个基本机制介导原核生物诸如大肠埃希氏菌中的转录终止。不依赖于Rho的终止信号，诸如下文中论述的转录终止序列，不需要外部转录终止因子，因为从这些序列转录的RNA中的茎-环结构的形成以及一系列尿苷(U)残基一起促进RNA链从转录复合物的释放。在另一方面，Rho依赖性终止在mRNA上需要称为Rho和顺式作用元件的转录终止因子。Rho的初始结合位点Rho利用(rut)位点是延伸的(～70个核苷酸，有时80–100个核苷酸)单链区，其特征在于高胞苷/低鸟苷含量和实际终止子序列上游的合成的RNA中的相对少的二级结构。当遇到聚合酶暂停位点时，终止发生，并且转录物通过Rho的解旋酶活性释放。

在一些实施方案中，所述工程化RNA表达构建体包含Rho依赖性终止信号。在一些实施方案中，所述Rho依赖性终止信号位于dsRNA转录物的环形成区内。在其它实施方案中，所述Rho依赖性终止信号位于dsRNA转录物的双链体形成区的有义或反义序列中。编码Rho依赖性终止信号的核酸序列在本领域中是已知的，并且还可在Rho依赖性终止的基因中被鉴定。在一些实施方案中，可将Rho依赖性终止信号与如下所述的不依赖于Rho的终止序列、编码茎-环形成RNA转录物的合成核苷酸序列、DNA结合蛋白的结合位点和位点特异性限制性内切核酸酶的一个或多个结合提供。可在表达Rho反式作用因子的宿主细胞中表达(Rho+细胞系)包含Rho依赖性终止信号的工程化RNA表达构建体。

在一些实施方案中，从所述工程化表达构建体转录RNA的效率可通过在RNA编码元件的末端的3’位置上提供包含两个或更多个发夹的二级结构的核酸序列来提高。不希望受特定理论束缚，所述二级结构使转录延伸复合物去稳定并且导致聚合酶与DNA模板解离，从而使非功能序列的非生产性转录降至最低并增加期望的RNA的转录。因此，可提供形成包含两个或更多个相邻发夹的二级结构的终止序列。通常地，发夹可通过可依靠自身折叠回来形成其臂通过单链环连接的配对茎区的回文核苷酸序列。在一些实施方案中，所述终止序列包含2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个相邻的发夹。在一些实施方案中，相邻发夹间隔0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个未配对核苷酸。在一些实施方案中，发夹茎在长度上包含4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个碱基对。在某些实施方案中，发夹茎的长度为12至30个碱基对。在某些实施方案中，所述终止序列包含两个或更多个具有包含约9至25个碱基对的茎区的中等大小的发夹。在一些实施方案中，所述发夹包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸的环形成区。在一些实施方案中，所述环形成区包含4-8个核苷酸。不希望受特定理论束缚，二级结构的稳定性可与终止效率相关。发夹稳定性由其长度、其所含的错配或凸起的数目以及配对区的碱基组成决定。鸟嘌呤与胞嘧啶之间的配对具有3个氢键且比只具有2个氢键的腺嘌呤-胸腺嘧啶配对更稳定。发夹形成回文核苷酸序列中的G/C含量可以是至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或更多。在一些实施方案中，发夹形成回文核苷酸序列中的G/C含量为至少80％。在一些实施方案中，所述终止序列来源于原核生物、真核生物或噬菌体来源的一个或多个转录终止子序列。在一些实施方案中，在所述终止序列的3’提供编码一系列4、5、6、7、8、9、10个或更多个腺嘌呤(A)的核苷酸序列。

在一些实施方案中，从工程化RNA表达构建体转录RNA的效率可通过在RNA编码元件的末端的3’位置上提供两个或更多个串联的转录终止序列来提高。参见图1。在一些实施方案中，从工程化RNA表达构建体转录RNA的效率可通过在RNA编码元件的末端的3’位置上提供3、4、5或更多个串联的转录终止序列来提高。转录终止序列可以是当置于编码开放阅读框架的核苷酸序列的转录下游时，引起开放阅读框架的转录终止的任何核苷酸序列。此类序列在本领域中是已知的并且可具有原核生物、真核生物或噬菌体来源。终止子序列的实例包括，但不限于，PTH-终止子、pET-T7终止子、终止子、pBR322-P4终止子、水泡性口膜炎病毒终止子、rrnB-Tl终止子、rrnC终止子和TTadc转录终止子，以及酵母识别的终止序列诸如Matα(α-因子)转录终止子、天然α-因子转录终止序列、ADR1转录终止序列、ADH2转录终止序列和GAPD转录终止序列。转录终止子序列的非穷举列表可见于iGEM登记名册中，其可在http://partsregistry.org/Terminators/Catalog获得。一系列2、3、4、5、6、7个或更多个的第一转录终止子序列可正好位于dsRNA编码元件的最终的核苷酸的3’或距离dsRNA编码元件的最终的核苷酸的3’至少1-5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45、45-50、50-100、100-150、150-200、200-300、300-400、400-500、500-1,000个或更多个核苷酸。串联转录终止子序列之间的核苷酸的数目可变化，例如，转录终止子序列可间隔0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45、45-50个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，所述转录终止子序列可基于如通过结构预测算法确定的它们的预测二级结构来选择。结构预测程序在本领域中是公知的并且包括，例如CLCMain Workbench。

转录终止序列可以是聚合酶特异性的或非特异性的，然而，被选择用于本发明实施方案的转录终止子应当与选定的启动子形成‘功能性组合’，意指终止子序列应当能够终止由特定类型的RNA聚合酶在所述启动子上起始的转录。例如，真核生物RNApol II启动子与真核生物RNA pol II终止子、T7启动子与T7终止子、T3启动子与T3终止子、酵母识别的启动子与酵母识别的终止序列等通常可形成功能性组合。还可基于从给定的启动子终止转录的效率选择所使用的转录终止序列的数目和身份。例如，可在RNA编码元件的转录下游提供至少2、3、4、5、6、7个或更多个同源或异源转录终止子序列来实现至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的从给定的启动子开始的终止效率。

几个实施方案涉及用于高效终止转录的以功能性组合包含启动子和两个或更多个转录终止子的工程化表达构建体。在一些实施方案中，T7启动子、PTH-终止子和pET-T7终止子形成功能性组合。在一些实施方案中，T7启动子、rrn BT2终止子、PET终止子、PTH-终止子和pET-T7终止子形成功能性组合。在一些实施方案中，所述终止子序列经修饰除去非发夹形成序列。在一些实施方案中，所述终止子序列经修饰除去发夹的茎区中的错配。在一些实施方案中，所述终止子序列经修饰增加发夹的G-C含量。在一些实施方案中，T7启动子、T5启动子、T3启动子或SP6启动子与一个或多个Rho依赖性终止信号和一个或多个不依赖于Rho的终止序列形成功能性组合。在一些实施方案中，T7启动子、T5启动子、T3启动子或SP6启动子与一个或多个Rho依赖性终止信号和TrpR阻遏物形成功能性组合。在一些实施方案中，T7启动子、T5启动子、T3启动子或SP6启动子与一个或多个不依赖于Rho的终止信号和TrpR阻遏物形成功能性组合。在一些实施方案中，T7启动子、T5启动子、T3启动子或SP6启动子与一个或多个Rho依赖性终止信号和TyrR阻遏物形成功能性组合。在一些实施方案中，T7启动子、T5启动子、T3启动子或SP6启动子与一个或多个不依赖于Rho的终止信号和TyrR阻遏物形成功能性组合。在一些实施方案中，T7启动子、T5启动子、T3启动子或SP6启动子与一个或多个Rho依赖性终止信号和LacI阻遏物形成功能性组合。在一些实施方案中，T7启动子、T5启动子、T3启动子或SP6启动子与一个或多个不依赖于Rho的终止信号和LacI阻遏物形成功能性组合。在一些实施方案中，T7启动子、T5启动子、T3启动子或SP6启动子与形成包含两个或更多个相邻的中等大小的发夹形成二级结构的合成终止序列形成功能性组合。

称为内在型终止的调控转录终止的一个机制包括在转录过程中在RNA链中形成发夹-环结构，这使转录延伸复合物(其包括模板、转录物与RNA聚合酶之间的相互作用)去稳定，并导致聚合酶与DNA模板解离。因此，合成寡核苷酸序列可被设计来编码形成一个或多个发夹环结构的RNA转录物，所述发夹环结构促进转录终止。在本文中所述的几个实施方案中，RNA转录的效率可通过在RNA编码元件的转录下游提供编码形成包含一个或多个发夹的二级结构的RNA的核苷酸序列来提高。通常地，发夹可由可依靠自身折叠回来形成其臂通过单链环连接的配对茎区的回文核苷酸序列形成。在一些实施方案中，所述合成核苷酸序列编码1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个RNA发夹。在一些实施方案中，所述合成核苷酸序列在发夹形成回文核苷酸序列的3’编码多聚T序列。发夹的稳定性可与终止效率相关，并且发夹稳定性由其长度、其所含的错配或凸起的数目以及配对区的碱基组成决定。鸟嘌呤与胞嘧啶之间的配对具有3个氢键且比只具有2个氢键的腺嘌呤-胸腺嘧啶配对更稳定。在一些实施方案中，由合成核苷酸序列编码的茎的长度为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个碱基对。在某些实施方案中，由合成核苷酸序列编码的茎的长度为12至30个碱基对。在某些实施方案中，发夹是具有包含约9至25个碱基对的茎区的中等大小的发夹。环形成区可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。在一些实施方案中，环形成区包含4-8个核苷酸。在某些实施方案中，环形成区包含4个核苷酸。发夹形成回文核苷酸序列的G/C含量可以为至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或更多。在一些实施方案中，发夹形成回文核苷酸序列的G/C含量为至少80％。在一些实施方案中，可在dsRNA编码元件的转录下游结合原核生物、真核生物或噬菌体来源的一个或多个转录终止子序列提供编码1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个RNA发夹的合成核苷酸序列。在一些实施方案中，在发夹编码序列的3’提供编码一系列4、5、6、7、8、9、10个或更多个尿嘧啶(U)的核苷酸编码序列。

在延伸过程中聚合酶的暂停被认为是Rho依赖性和不依赖于Rho的终止的重要组成部分。DNA结合蛋白可用作引起转录延伸复合物停顿的路障碍，其促进转录终止。在几个实施方案中，高效转录终止可通过在RNA编码元件的末端的3’提供一个或多个DNA结合蛋白的结合位点来促进。在一些实施方案中，可在转录终止序列附近提供一个或多个DNA结合蛋白的结合位点，以便提高终止效率。在一些实施方案中，可在编码形成发夹环的核苷酸的合成核苷酸序列附近提供一个或多个DNA结合蛋白的一个或多个结合位点。在一些实施方案中，可在Rho依赖性终止位点附近提供一个或多个DNA结合蛋白的结合位点。可使用当与DNA复合时引起转录延伸复合物的暂停和转录泡的去稳定的任何DNA结合蛋白。例如，可使用一个或多个TrpR阻遏物、LacI阻遏物或TyrR阻遏物的结合位点。可用作转录阻遏物的DNA结合蛋白的其它实例包括PRH、Eve、Krüppel、TGIF、Mad、IRF-2、RP58、E2F-6、MeCP2和MBD2。当宿主细胞不表达内源DNA结合蛋白时，可在包含工程化RNA表达构建体的载体上提供编码DNA结合蛋白的核苷酸序列，或可在不同载体上提供所述核苷酸序列以及在宿主细胞识别的启动子或噬菌体启动子诸如T7、T3或SP6的控制下使其表达。在几个实施方案中，所述工程化RNA表达构建体在RNA编码元件的3’包含一个或多个未在宿主基因组中发现的位点特异性内切核酸酶限制性位点，以便位点特异性内切核酸酶在宿主细胞中的表达通过切割工程化RNA表达构建体(而不破坏宿主细胞基因组)来阻止从限制性位点下游的工程化RNA表达构建体的不期望的转录。参见，例如，图8。所述位点特异性内切核酸酶可以是大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)或TAL-效应子核酸酶(TALEN)。大范围核酸酶的实例包括，但不限于，I-Anil、I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-PanII、I-PanMI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-LtrI、I-GpiI、I-GZeI、I-OnuI、I-HjeMI、I-MsoI、I-TevI、I-TevII和I-TevIII。可在包含程化RNA表达构建体的载体上提供编码位点特异性内切核酸酶的核苷酸序列，或可在不同载体上提供所述核苷酸序列。在一些实施方案中，可在编码RNA聚合酶例如T7、T3、SV40或SP6聚合酶的载体上提供编码位点特异性内切核酸酶的核苷酸序列，并且可任选地将所述核苷酸序列可操作地连接于宿主细胞识别的启动子。在一些实施方案中，所述工程化RNA表达构建体在一个或多个终止序列的3’包含一个或多个位点特异性内切核酸酶裂解位点。在一些实施方案中，所述工程化RNA表达构建体在一个或多个转录终止序列的3’包含一个或多个ZFN限制性位点、TALEN限制性位点或大范围核酸酶限制性位点，所述限制性位点选自由以下组成的组：I-Anil、I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-PanII、I-PanMI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-LtrI、I-GpiI、I-GZeI、I-OnuI、I-HjeMI、I-MsoI、I-TevI、I-TevII和I-TevIII，所述转录终止序列选自由以下组成的组：PTH-终止子、pET-T7终止子、终止子、pBR322-P4终止子、水泡性口膜炎病毒终止子、rrnB-Tl终止子、rrnC终止子、TTadc转录终止子、Matα(α-因子)转录终止子、天然α-因子转录终止序列、ADR1转录终止序列、ADH2转录终止序列和GAPD转录终止序列。

可使用本领域中公知的标准重组DNA技术，从组成序列元件构建本文中所述的工程化RNA表达构建体诸如SEQ ID NO:2、4、14、15和20中所示的那些并将其整合进适当的载体中。许多载体可用于该目的，并且适当的载体的选择将主要取决于待被插入载体的核酸的大小和待用所述载体转化的特定宿主细胞。适合按照本实施方案使用的载体的实例包括，但不限于，质粒、粘粒、质体系、细菌人工染色体、酵母人工染色体和噬菌体。所述载体主链可含有各种组分，这取决于载体的功能(DNA的扩增或DNA的表达)和与其相容的特定宿主细胞。例如，载体主链可含有一个或多个限制性内切核酸酶识别位点(所述识别位点允许以可确定的方式插入核酸分子而不失去载体的基本生物功能)、编码可选择标记的核苷酸序列诸如抗生素抗性基因(其适合用于利用所述载体转导的细胞的鉴定和选择)、驱动转基因在宿主细胞中表达的启动子序列和复制起始点。可获得的细菌载体的实例包括，但不限于，pUC19、pUC18、pBluescript、pDEST、pBAD、pGEM、pGEX、pACYC184和pBR322载体。

在一些实施方案中，将载体主链的大小减小至最小以减少可用于不期望的转录的模板的量。在一些实施方案中，适合按照本实施方案使用的最小载体不包含一个或多个基于蛋白质的可选择标记，诸如抗生素抗性标记、非必需间隔子和不编码确定功能的垃圾序列。在一些实施方案中，适合按照本实施方案使用的最小载体基本上由多克隆位点、可选择的标记基因和复制起始点组成。适合按照本实施方案使用的最小载体可少于3kb。在一些实施方案中，所述载体少于2.7kb。在一些实施方案中，所述载体少于2.6kb。在一些实施方案中，所述载体少于2.5kb。在一些实施方案中，所述载体少于2.4kb。在一些实施方案中，所述载体少于2.3kb。在一些实施方案中，所述载体少于2.2kb。在一些实施方案中，所述载体少于2.1kb。在一些实施方案中，所述载体少于2.0kb。在一些实施方案中，所述载体少于1.9kb。在一些实施方案中，可将一个或多个工程化RNA表达构建体和/或一个或多个RNA编码元件克隆进最小载体中以获得至少3kb的最小大小。

可在体外或在宿主细胞中体内合成由本文中所述的工程化表达构建体编码的RNA分子。宿主细胞的内源RNA聚合酶可介导体内转录，或克隆的RNA聚合酶诸如噬菌体RNA聚合酶(例如，T3、T7、SV40、SP6)可用于体内或体外转录。

可将一个或多个包含上述工程化表达构建体的载体引入许多种原核和真核微生物宿主中以产生RNA分子。本文中所述的几个实施方案涉及从被设计用于使非功能性序列的非生产性转录降至最低的工程化表达构建体表达RNA的宿主细胞。适当的宿主细胞包括，但不限于，真菌、丝状真菌、酵母、藻类和细菌。为了防止宿主细胞中转录的dsRNA分子降解，可使用RNA酶III缺陷型宿主。

在一些实施方案中，所述宿主细胞是真核细胞。适当的真核宿主细胞包括，但不限于，真菌细胞、藻类细胞、昆虫细胞和植物细胞。适当的真菌宿主细胞包括，但不限于，酵母细胞和丝状真菌细胞。

在一个实施方案中，所述真菌宿主细胞是酵母。在一个实施方案中，所述酵母来自以下属之一：念珠菌属(Candida)、汉逊酵母属(Ha nsenula)、酵母菌属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyc es)、毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)和子囊菌酵母属(Yarrowia)。在一些实施方案中，所述酵母细胞是巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、芬兰毕赤酵母(Pichia finlandica)、喜海藻糖毕赤酵母(Pichia trehalophila)、儿玉氏毕赤氏酵母(Pichia kodamae)、膜醭毕赤酵母(Pichiamembranaefaciens)、仙人掌毕赤酵母(Pichia opun tiae)、耐热毕赤酵母(Pichiathermotolerans)、柳毕赤酵母(Pichia sali ctaria)、栎树毕赤酵母(Pichia quercuum)、皮杰普毕赤酵母(Pichia pi jperi)、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanol ica)、安格斯毕赤酵母(Pichia angusta)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromy ces lactis)、白色念珠菌(Candida albicans)或解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)。

在其它实施方案中，所述宿主细胞是原核细胞。适当的原核细胞包括革兰阳性、革兰阴性和革兰可变的细菌细菌。适当的原核宿主细胞包括，但不限于以下属的种：土壤杆菌属(Agrobacterium)、脂酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、鱼腥藻属(Anabaena)、倒囊藻属(Anacystis)、不动杆菌属(Acinetobacter)、节杆菌属(Arthrobacter)、固氮菌属(Azobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)、布赫纳氏菌属(Buchnera)、Campestris、弯杆菌属(Camplyobacter)、梭菌属(Clostridium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、色菌属(Chromatium)、粪球菌属(Coprococcus)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、肠球菌属(Enterococcus)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、梭杆菌属(Fusobacterium)、柔嫩梭菌属(Faecalibacterium)、弗朗西斯氏菌属(Francisella)、黄杆菌属(Flavobacterium)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、嗜血菌属(Haemophilus)、螺杆菌属(Helicobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、泥杆菌属(Ilyobacter)、泥杆菌属(Microbacterium)、中间根瘤菌属(Mesorhizobium)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、奈瑟球菌属(Neisseria)、成团泛菌属(Pantoea)、假单胞菌属(Pseudomonas)、原绿球藻属(Prochlorococcus)、红杆菌属(Rhodobacter)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、红假单胞菌属、罗氏菌属(Roseburia)、红螺菌属(Rhodospirillum)、红球菌属(Rhodococcus)、珊列藻属(Scenedesmun)、链霉菌属(Streptomyces)、链球菌属(Streptococcus)、聚球藻属(Synnecoccus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、沙雷氏菌属(Serratia)、沙门菌属(Salmonella)、志贺菌属(Shigella)、热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacterium)、吸收障碍菌属(Tropheryma)、土拉弗氏菌属(Tularensis)、Temecula、嗜热聚球藻属(Thermosynechococcus)、热球菌属(Thermococcus)、脲解支原体属(Ureaplasma)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、木杆菌属(Xylella)、耶尔森氏菌属(Yersinia)和单胞发酵菌属(Zymomonas)。在一些实施方案中，所述细菌宿主细胞对于人是非致病性的。

在一些实施方案中，所述细菌宿主细胞具有芽孢杆菌属的种，例如，苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、环状芽胞杆菌(B.circulans)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、短小芽胞杆菌(B.brevis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、嗜热脂肪芽孢(B.stearothermophilus)和解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)。在一些实施方案中，所述细菌宿主细胞具有梭菌属的种，例如，丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)、破伤风梭菌E88(C.tetani E88)、象牙海岸梭菌(C lituseburense)、糖丁醇梭菌(C.saccharobutylicum)、产气荚膜梭菌(C.perfringens)和嗜乙酰乙酸棒杆菌(C.acetoacidophilum)。在一些实施方案中，所述细菌宿主细胞具有埃希氏菌属的种，例如，大肠埃希氏菌。在一些实施方案中，所述细菌宿主细胞是RNA酶III缺陷型大肠埃希氏菌菌株，例如大肠埃希氏菌HT115(DE3)。在一些实施方案中，所述细菌宿主细胞具有欧氏杆菌属的种，例如，噬夏孢欧文氏菌(E.uredovora)、胡萝卜软腐欧氏菌(E.carotovora)、凤梨欧文氏菌(E.ananas)、草生欧文氏菌(E.herbicola)、斑点艾美尔球虫(E.punctata)和土欧文氏菌(E.terreus)。在一些实施方案中，所述细菌宿主细胞具有泛菌属的种，例如，柠檬泛菌(P.citrea)和成团泛菌(P.agglomerans)。在一些实施方案中，所述细菌宿主细胞具有假单胞菌属的种，例如，恶臭假单胞菌(P.pudita)、还原酶假单胞菌(P.mevalonii)和假单胞菌某种D-0110。在一些实施方案中，所述细菌宿主细胞具有链球菌属的种，例如，类马链球菌(S.equisimilis)、酿脓链球菌(S.pyogenes)和乳房链球菌(S.uberis)。在一些实施方案中，所述细菌宿主细胞具有链霉菌属的种，例如，产二素链霉菌(S.ambofaciens)、阿维链霉菌(S.avermitilis)、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)、金霉素链霉菌(S.aureofaciens)、金黄色葡萄球菌(s.aureus)、杀真菌链霉菌(S.fungicidicus)、灰色链霉菌(S.griseus)和浅青紫链霉菌(S.lividans)。在一些实施方案中，所述细菌宿主细胞具有单胞发酵菌属的种，例如运动发酵单孢菌(Z.mobilis)和解脂发酵单胞菌(Z.lipolytica)。

在一些实施方案中，已知抑制许多种重要作物的叶面(植物叶的表面)和/或根际(围绕植物根的土壤)的微生物诸如细菌、藻类和真菌可以是用于dsRNA的产生和递送的期望的宿主细胞。为了防止宿主微生物中转录的dsRNA分子降解，可使用RNA酶III缺陷型宿主。最吸引人的是微生物，诸如细菌，例如芽孢杆菌属(包括种和亚种苏云金芽胞杆菌库斯塔克HD-1(B.thuringiensis kurstaki HD-1)、苏云金芽胞杆菌库斯塔克HD-73、苏云金芽孢杆菌猝倒亚种(B.thuringiensis sotto)、苏云金芽胞杆菌贝尔奈亚种(B.thuringiensis berliner)、苏云金芽孢杆菌苏云金亚种(B.thuringiensisthuringiensis)、苏云金芽孢杆菌多窝亚种(B.thuringiensis tolworthi)、苏云金芽胞杆菌松蜀亚种(B.thuringiensis dendrolimus)、苏云金芽孢杆菌阿莱亚种(B.thuringiensis alesti)、苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种(B.thuringiensis galleriae)、苏云金芽胞杆菌鲇泽亚种(B.thuringiensis aizawai)、苏云金芽胞杆菌亚毒亚种(B.thuringiensis subtoxicus)、苏云金芽孢杆菌杀虫亚种(B.thuringiensisentomocidus)、苏云金芽孢杆菌拟步行甲亚种(B.thuringiensis tenebrionis)和苏云金芽孢杆菌圣地亚哥亚种(B.thuringiensis san diego))；假单胞菌属、欧文氏菌属、沙雷氏菌属、克雷伯氏菌属、黄单胞属(Zanthomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、根瘤菌属(Rhizobium)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、嗜甲基杆菌属(Methylophilius)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、醋杆菌属(Acetobacter)、乳杆菌属、节杆菌属、固氮菌属(Azotobacter)、明串球菌属(Leuconostoc)和产碱杆菌属(Alcaligenes)；真菌，特别地酵母，例如酵母菌属、隐球菌属(Cryptococcus)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)、红酵母属(Rhodotorula)和短梗霉属(Aureobasidium)。特别关注的是此类植物圈细菌种类如丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、粘质沙雷菌(Serratia marcescens)、木质醋杆菌(Acetobacter xylinum)、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、苜蓿根瘤菌(Rhizobium melioti)、真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)和维涅兰德固氮菌(Azotobacter vinlandii)；和植物圈酵母种类诸如深红酵母(Rhodotorula rubra)、粘红酵母(R.glutinis)、海滨红酵母(R.marina)、橙红酵母(R.aurantiaca)、浅白隐球酵母(Cryptococcus albidus)、流散噬纤维菌(C.diffluens)、罗伦特假丝酵母菌(C.laurentii)、罗氏酵母(Saccharomyces rosei)、有孢酵母(S.pretoriensis)、酿酒酵母、玫瑰掷孢酵母(Sporobolomyces roseus)、香气掷抱酵母(S.odorus)、维罗纳克鲁维酵母菌(Kluyveromyces veronae)和正芽短梗霉(Aureobasidium pollulans)。

几个实施方案涉及用于从被设计来使非功能性序列的非生产性转录最至最低的工程化表达构建体产生具有提高的转录效率的dsRNA的细胞表达系统。在一个方面，提供了通过培养包含如本文中所述的工程化表达构建体的宿主细胞来产生dsRNA的方法。在一些实施方案中，所述宿主细胞从包含SEQ ID NO:2的工程化表达构建体表达dsRNA。在其它实施方案中，所述宿主细胞从包含SEQ ID NO:4的工程化表达构建体表达dsRNA。在其它实施方案中，所述宿主细胞从包含SEQ ID NO:14的工程化表达构建体表达dsRNA。在其它实施方案中，所述宿主细胞从包含SEQ ID NO:15的工程化表达构建体表达dsRNA。在其它实施方案中，所述宿主细胞从包含SEQ ID NO:20的工程化表达构建体表达dsRNA。在一些实施方案中，所述宿主细胞是细菌细胞，例如大肠埃希氏菌细胞，其为RNA酶III缺陷型。

使用重组DNA技术制备编码目标RNA分子的重组DNA构建体和载体，以及转化和产生转录RNA分子的宿主细胞的方法在本领域中是可容易获得的。

C.dsRNA的应用

几个实施方案涉及用于将从如上所述被设计用来使非功能序列的非生产性转录降至最低的工程化表达构建体转录的dsRNA递送至目标生物的组合物和方法。在一些实施方案中，从所述工程化表达构建体体外合成dsRNA并将其提供给目标生物。在其它实施方案中，在宿主细胞(体内)中从工程化表达构建体转录提供给目标生物的dsRNA。

某些实施方案涉及将dsRNA递送至目标生物的方法，其包括在宿主细胞中从如上所述的工程化表达构建体表达dsRNA和将宿主细胞转录的dsRNA提供给目标生物。在一些实施方案中，从宿主细胞分离宿主细胞转录的dsRNA，并在提供给目标生物之前将其纯化。例如，可通过利用溶剂或树脂、沉淀、电泳、层析或其组合提取从宿主细胞裂解物纯化dsRNA。或者，可将dsRNA与最低程度的纯化一起使用或不用纯化。例如，在一些实施方案中，将包含从工程化表达构建体转录的dsRNA的宿主细胞或从表达dsRNA的宿主细胞制备的裂解物提供给目标生物。在一些实施方案中，所述dsRNA抑制目标生物的必需基因。在其它实施方案中，所述dsRNA抑制目标生物的害虫或病原体的必需基因。例如，所述dsRNA可抑制病毒基因。

如上所述，可工程化宿主细胞诸如细菌或酵母以从如本文中所述的工程化表达构建体产生dsRNA。这些宿主细胞可被昆虫害虫或其它目标生物食用。当被摄入时，所述dsRNA可引发RNAi反应，从而导致靶mRNA的降解，并且当靶mRNA编码必需蛋白时，减弱或杀死摄食生物。如实施例3中所示，给CPB幼虫喂食包含科罗拉多马铃薯甲虫(CPB)RNA序列的体外转录的dsRNA分子、包含CBP RNA序列的细菌转录的dsRNA分子或包含从工程化dsRNA表达构建体转录的CPB RNA序列的细菌表达的dsRNA全都导致摄入所述dsRNA组合物的幼虫死亡或其发育和分化的抑制。所有CPB dsRNA制剂显示显著的抗CPB幼虫的显著活性，最低浓度(0.00002mg/mL)的表达CPB dsRNA的细菌制剂抑制87.5％的CPB生长。表达dsRNA的细菌在抑制目标生物的生长和发育中的活性表明可以例如通过喂饲给目标生物提供经工程化以高效表达如本文中所述的dsRNA的宿主细胞，以抑制靶基因的活性而无需另外的RNA纯化步骤。

宿主细胞(其在许多应用中为细菌、酵母或藻类细胞)优选应当在被提供给目标生物或目标生物的食物源之前被杀死。例如，当将表达dsRNA的细菌用作生物杀虫剂，或其中将表达dsRNA的工程化宿主细胞用于其中表达dsRNA的工程化宿主细胞用于其中与可能与人或其它哺乳动物接触的环境的另一种应用时。通过不导致dsRNA的显著降解的任何方法杀死表达dsRNA的宿主细胞。例如，可通过加热处理，通过化学处理例如苯酚或甲醛处理或通过机械破碎杀死宿主细胞。在一些实施方案中，杀死宿主细胞而无显著裂解。在一些实施方案中，将宿主细胞例如细菌细胞加热至足以杀死细胞而不引起裂解的温度。例如，可将宿主细胞加热至至少59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃或至少75℃的温度。

在一些实施方案中，裂解表达dsRNA的工程化宿主细胞并将细胞裂解物提供给目标生物或目标生物的食物源。可通过不导致dsRNA显著降解的任何方法裂解表达dsRNA的宿主细胞。例如，可通过冻融，通过用化学试剂例如去垢剂、甲苯或氢氧化钠处理，通过酶促处理或通过机械破碎(例如通过匀浆)来裂解宿主细胞。在一些实施方案中，将粗制裂解物提供给目标生物或目标生物的食物源。在其它实施方案中，将部分纯化的裂解物或分离的宿主表达的dsRNA提供给目标生物或目标生物的食物源。

另一个实施方案涉及用于预防或抑制目标生物例如哺乳动物、鸟类、节肢动物或鱼的病毒病。目标生物的特定实例包括但不限于猪、牛、野牛、马、山羊、鸡、鹌鹑、鸭、鹅、火鸡、虾、明虾、龙虾、蟹、蜜蜂、鲑鱼、罗非鱼、鲈鱼、鲤鱼和鲶鱼。在一个实施方案中，向目标生物施用包含与病毒基因的RNA转录物的至少一部分互补的核苷酸序列的dsRNA，以使得靶向病毒基因的表达被沉默。在一个实施方案中，将抗病毒dsRNA组合物掺入食物源或施用于食物源例如作物植物的表面，以被目标生物消费。在一个方面，抗病毒dsRNA组合物包含从如上所述被设计用来使非功能性序列的非生产性转录降至最低的工程化表达构建体转录的dsRNA分子。在另一个方面，所述抗病毒dsRNA组合物包含如上所述的被杀死的表达dsRNA的宿主细胞或其裂解物。在一些实施方案中，将包含如上所述的被设计用来使非功能性序列的非生产性转录降至最低的工程化表达构建体的未裂解的热灭活的细菌细胞饲喂选自由哺乳动物、鸟类、节肢动物或鱼组成的组的目标生物。在一个实施方案中，所述目标生物是虾或明虾，并且所述工程化表达构建体编码包含核苷酸序列的dsRNA，所述核苷酸序列与白斑综合征病毒、斑节对虾杆状病毒、杆状病毒中肠腺坏死病毒、造血组织坏死病毒、黄头病毒、桃拉综合症病毒、传染性肌坏死病毒、罗氏沼虾诺达病毒、林查-辛格(Laem-Singh)病毒或毛利病毒(Mourilyan virus)的基因的RNA转录物的至少一部分互补。在一个实施方案中，所述目标生物是鱼并且所述工程化表达构建体编码dsRNA，所述dsRNA包含与流行性造血组织坏死病毒、红海鲷虹彩病毒、锦鲤疱疹病毒、传染性造血组织坏死病毒、病毒性出血性败血病病毒、鲤春病毒血症病毒、传染性鲑鱼贫血病毒或病毒性神经坏死病毒的基因的RNA转录物的至少一部分互补的核苷酸序列。

几个实施方案涉及用于控制无脊椎动物虫害的组合物和方法。在一些实施方案中，提供了用于通过它们对含有dsRNA杀虫组合物的食物的暴露将dsRNA杀虫组合物递送至无脊椎动物害虫的递送系统。在一个实施方案中，将dsRNA杀虫组合物掺入害虫的食物源或施用于害虫食物源(例如，作物植物)的表面，以用于无脊椎动物害虫消费。在一个方面，所述dsRNA杀虫组合物包含纯化的从如上所述的被设计用来使非功能性序列的非生产性转录降至最低的工程化表达构建体转录的dsRNA分子。在另一个方面，所述dsRNA杀虫组合物包含如上所述的未裂解的被杀死的表达dsRNA的宿主细胞。在另一个方面，所述dsRNA杀虫组合物包含如上所述的表达dsRNA的宿主细胞的未纯化的或最低程度纯化的裂解物。所述组合物可以，除了dsRNA、宿主细胞或裂解物以外，还含有其它赋形剂、稀释剂或载体。

另一个实施方案涉及用于抑制病毒病在植物例如作物植物的群体中的扩散的方法和组合物。植物病毒通常通过节肢动物或线虫载体传递至植物。因此，病毒对植物的感染可通过抑制病毒基因在节肢动物或线虫载体中的表达来抑制。从而提供用于抑制病毒基因在节肢动物或线虫载体中表达的组合物和方法。一个实施方案涉及包括向节肢动物或线虫载体施用dsRNA，以使被靶向的病毒基因的表达被沉默的方法，其中所述dsRNA包含与来自植物病毒的基因的RNA转录物的至少一部分互补的核苷酸序列。被靶向的RNA转录物可来自苘麻花叶病毒、非洲木薯花叶病毒、苜蓿花叶病毒、南芥菜花叶病毒、大麦温和花叶病毒、大麦黄矮病毒、大麦黄花叶病毒、甜菜曲顶病毒、甜菜西方黄化病毒、菜豆金色花叶病毒、甜菜曲叶病毒、甜菜坏死黄脉病毒、甜菜土传病毒、甜菜西黄病毒、雀麦花叶病毒、木薯花叶双生病毒、花椰菜花叶病毒、黄瓜花叶病毒、黄瓜坏死病毒、瓜蚜传黄病毒、可可肿枝病毒、葡萄扇叶病毒、葡萄卷叶伴随病毒、葡萄病毒A、葡萄病毒B、花生环斑病毒、虹膜黄色斑病毒、约翰逊草花叶病毒、莴苣传染性黄病毒、莴苣花叶病毒、豌豆早褐变病毒、辣椒环斑病毒、马铃薯卷叶病毒、马铃薯帚顶病毒、水稻矮缩病毒、水稻齿叶矮缩病毒、土传小麦花叶病毒、南方菜豆花叶病毒、草莓潜环斑病毒、甘薯羽状斑驳病毒、烟草花叶病毒、烟草脆裂病毒、烟草环斑病毒、番茄黑环病毒、番茄褪绿斑病毒、番茄金色花叶病毒、番茄黄化曲叶病毒、番茄斑萎病毒、天鹅绒烟草花叶病毒或小麦条纹花叶病毒。在一个实施方案中，将抗病毒dsRNA组合物掺入食物源例如作物植物或施用至食物源的表面，以供病毒载体消费。在一个方面，所述抗病毒dsRNA组合物包含纯化的从如上所述的被设计用来使非功能性序列的非生产性转录降至最低的工程化表达构建体转录的dsRNA分子。在另一个方面，所述抗病毒dsRNA组合物包含如上所述的未裂解的，被杀死的表达dsRNA的宿主细胞。在另一个方面，所述抗病毒dsRNA组合物包含如上所述的表达dsRNA的宿主细胞的未纯化的或最低限度地纯化的裂解物。节肢动物载体可以是昆虫载体，例如，蚜虫、甲虫、飞虱、叶蝉、粉蚧、盲蝽象、螨虫、蓟马和粉虱。所述组合物可以，除了所述dsRNA、宿主细胞或裂解物以外，还含有其它赋形剂、稀释剂或载体。包含表达dsRNA的热灭活的微生物或其裂解物的组合物应该是足够稳定的，以使得即使当暴露于外部环境条件很长时间(其可以是数天或数周的时期)，所述dsRNA保持未被降解并且能够介导RNAi。

在本文中所述的实施方案中，dsRNA可由包含如上所述的被设计用来使非功能性序列的非生产性转录降至最低的工程化表达构建体的微生物表达，或可将所述微生物或其裂解物施用至植物或种子的表面上，或通过物理手段诸如注射剂，或在种子的情况下通过吸取将所述裂解物引入种子、根、茎或叶。例如，可通过喷雾应用将包含如本文中所述的工程化表达构建体的微生物递送至植物的表面。在一个实施方案中，并且可将培养物经工程化以产生和积累dsRNA的细菌或酵母，可将培养的产物，诸如热灭活的细菌或酵母或其裂解物配制为与普通农业实践相容的组合物。任何赋形剂的性质和组合物的物理形式可根据所处理的基底的性质而变化。例如，组合物可以是被刷至或喷洒至待处理的基底上或压印至其中的液体，或被施用至待处理的基底的涂层或粉剂。因此，在一个实施方案中，组合物以涂层的形式存在于合适的表面上，所述表面粘附至将与所述涂层接触的目标生物(诸如昆虫或线虫)并最终被其摄入。

用于作物植物的喷洒制剂可包含用于高效叶面覆盖的适当粘着剂和润湿剂以及阻止dsRNA被紫外线损害的紫外线保护剂。例如，可能希望具有热灭活的微生物的制剂，所述制剂可帮助将微生物分散至叶表面上的薄膜中，或将热灭活的微生物移入叶的细胞间隙，和/或可为微生物在潮湿环境条件下粘附至叶提供一定的稳定性(耐雨水冲刷)。此类添加剂通常用于生物杀虫剂工业并且对于本领域普通技术人员来说是公知的。同样地，用于土壤施用的制剂可包括用作土壤害虫诸如玉米根虫的幼虫的诱饵的颗粒制剂。可将此类应用与其它杀虫剂应用(基于生物的或不基于生物的)组合以增强植物免受昆虫取食伤害的保护作用。例如，当在害虫的食物中提供苏云金芽孢杆菌(Bt)蛋白质(一种用于控制虫害的作用模式)时。因此，几个实施方案涉及本文中所述的dsRNA组合物和方法与Bt方法和组合物的协同组合，其包括用于控制虫害的局部制剂和转基因方法。

可对其施用本文中所述的方法和组合物的植物的实例包括但不限于，苜蓿、茴香脑、苹果、杏、洋蓟、芝麻菜、芦笋、鳄梨、香蕉、大麦、豆类、甜菜、黑莓、蓝莓、西兰花、抱子甘蓝、卷心菜、油菜、香瓜、胡萝卜、木薯、菜花、芹菜、樱桃、香菜、柑橘、金钱橘、咖啡、玉米、棉花、黄瓜、花旗松、茄子、菊苣、菊苣、桉树、茴香、无花果、葫芦、葡萄、葡萄柚、蜜露、豆薯、猕猴桃、莴苣、韭菜、柠檬、酸橙、火炬松、芒果、甜瓜、蘑菇、坚果、燕麦、秋葵、洋葱、橙、观赏植物、木瓜、荷兰芹、豌豆、桃、花生、梨、花椒、柿子、松、菠萝、车前草、李子、石榴、白杨、马铃薯、南瓜、木瓜、辐射松、菊苣、萝卜、红莓、稻米、黑麦、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甘薯、枫香、红橘、茶叶、烟草、番茄、草、藤、西瓜、小麦、山药和西葫芦。

本文中所述的方法和组合物可以应用于任何单子叶或双子叶植物，或可通过药学上可接受的制剂施用于脊椎动物或无脊椎动物，以提供靶基因表达的一定水平的降低。靶基因表达的抑制可以通过测量内源靶RNA或通过靶RNA的翻译产生的蛋白质来定量，并且抑制的后果可通过检查靶向细胞或生物的外向表型来确认。用于定量RNA和蛋白质的技术对于本领域普通技术人员来说是公知的。在一些实施方案中，靶基因的表达被抑制至少10％、至少33％、至少50％或至少80％。在一些实施方案中，目标生物的细胞内的靶基因的表达被抑制至少90％、至少95％或至少99％，从而发生显著抑制。当对目标生物施用dsRNA导致可检测的表型(例如，幼虫生长的停止、瘫痪或死亡等)或对应于靶基因的内源RNA和/或蛋白质的可检测的减少时，可被叙述为发生显著抑制。虽然在一些实施方案中，抑制在目标生物的基本上所有细胞中发生，但在一些实施方案中，抑制可只在一个亚组的表达所述基因的细胞中发生。例如，如果靶基因在昆虫消化道细胞中起着重要作用，则这些细胞内的靶基因的抑制足以对昆虫施加所需的有害作用。

下列实施例被提供来用于举例说明并且不应当被解释为限制。

具体实施方式

实施例1

dsRNA产生载体的设计

靶序列SEQ ID NO 1的核苷酸30-309选自COPI外被体的假定的科罗拉多马铃薯甲虫(CPB)直系同源物。

SEQ ID NO 1:

>Ld_F38E11.5假定的COPI外被体直系同源物；别名Ld248；14810:1..379

CGTAACCGCGGTTTGTTTCCACCCTGAACTACCTGTGGCTCTCACAGGCAGCGAAGATGG

TACCGTTAGAGTTTGGCATACGAATACACACAGATTAGAGAATTGTTTGAATTATGGGTT

CGAGAGAGTGTGGACCATTTGTTGCTTGAAGGGTTCGAATAATGTTTCTCTGGGGTATGA

CGAGGGCAGTATATTAGTGAAAGTTGGAAGAGAAGAACCGGCAGTTAGTATGGATGCCAG

TGGCGGTAAAATAATTTGGGCAAGGCACTCGGAATTACAACAAGCTAATTTGAAGGCGCT

GCCAGAAGGTGGAGAAATAAGAGATGGGGAGCGTTTACCTGTCTCTGTAAAAGATATGGG

AGCATGTGAAATATACCCT

设计含有有义序列(SEQ ID NO 2的核苷酸4-283)的dsRNA编码元件，其对应于CPBCOPI外被体靶序列150个核苷酸的环编码序列(SEQ ID NO 2的核苷酸284-433)，和为CPBCOPI外被体靶序列的反向互补序列的反义序列(SEQ ID NO 2的核苷酸434-713)。

SEQ ID NO 2

GGGTACCTGTGGCTCTCACAGGCAGCGAAGATGGTACCGTTAGAGTTTGGCATACGAATACACACAGATTAGAGA

ATTGTTTGAATTATGGGTTCGAGAGAGTGTGGACCATTTGTTGCTTGAAGGGTTCGAATAATGTTTCTCTGGGGT

ATGACGAGGGCAGTATATTAGTGAAAGTTGGAAGAGAAGAACCGGCAGTTAGTATGGATGCCAGTGGCGGTAAAA

TAATTTGGGCAAGGCACTCGGAATTACAACAAGCTAATTTGAAGGCGCTGCCAGAAGGaagtactgcgatcgcgt

taacgctttatcacgataccttctaccacatatcactaacaacatcaacactcatcactctcgacgacatccact

cgatcactactctcacacgaccgattaactcctcatccacgcggccgcctgcaggagcCCTTCTGGCAGCGCCTT

CAAATTAGCTTGTTGTAATTCCGAGTGCCTTGCCCAAATTATTTTACCGCCACTGGCATCCATACTAACTGCCGG

TTCTTCTCTTCCAACTTTCACTAATATACTGCCCTCGTCATACCCCAGAGAAACATTATTCGAACCCTTCAAGCA

ACAAATGGTCCACACTCTCTCGAACCCATAATTCAAACAATTCTCTAATCTGTGTGTATTCGTATGCCAAACTCT

AACGGTACCATCTTCGCTGCCTGTGAGAGCCACAGGTA

使用pUC19克隆载体构建两个用于产生CPB dsRNA的质粒载体，所述克隆载体含有氨苄青霉素抗性基因、大肠埃希氏菌lac Z基因的N末端片段、多克隆位点和复制起始点。构建CPB-hp载体，以使得T7启动子可操作地连接于SEQ ID NO 2的dsRNA编码区。参见图2A，该图显示pCPB-hp载体的示意性图谱。为了防止T7RNA聚合酶对非-dsRNA编码区的通读和无用ssRNA从质粒主链的产生或使所述通读和产生减少至最少，通过将两个T7终止子序列(PTH-终止子和pET-T7终止子)置于dsRNA编码区的3’末端来构建pCPB-hp+2T载体。参见图2B和2C，所述图显示pCPB-hp+2T载体的示意性图谱。

大肠埃希氏菌菌株HT115(DE3)购自Caenorhabditis Genetics Center，University of Minnesota(HT115(DE3)的基因型为：F-、mcrA、mcrB、IN(rrnD-rrnE)1、rnc14：：Tn10(DE3溶原性细菌：lavUV5启动子-T7聚合酶)(RNA酶III-))。将大肠埃希氏菌HT115(DE3)细胞用pUC19(对照)、pCPB-hp或pCPB-hp+2T转化并在37℃或25℃下生长过夜。从20ul的培养物分离总RNA，将其直接在琼脂糖凝胶上进行电泳(图3A，标记有1(pUC19)、2(pCPB-hp)和3(pCPB-hp+2T)的泳道)，或在于琼脂糖凝胶上进行电泳之前将其用RNA酶处理(图3B标记有1(pUC19)、2(pCPB-hp)和3(pCPB-hp+2T)的泳道)。

用两种质粒转化大肠埃希氏菌HT115(DE3)细胞，一种质粒具有dsRNA模板(pUC19(对照)、pCPB-hp或pCPB-hp+2T)，而另一种质粒具有在诱导型元件控制下的T7RNA聚合酶(IPTG-诱导型T7聚合酶)。将转化细胞在37℃或25℃下生长过夜。从20ul的培养物分离总RNA，将其直接在琼脂糖凝胶上进行电泳(图3A，标有4(pUC19&pLac-T7)、5(pCPB-hp&pLac-T7)和6(pCPB-hp+2T&pLac-T7)的泳道)，或在于琼脂糖凝胶上进行电泳之前用RNA酶处理其(图3B标有4(pUC19&pLac-T7)、5(pCPB-hp&pLac-T7)和6(pCPB-hp+2T&pLac-T7)的泳道)。

如图3A和图3B中所示，在37℃下生长的转化细胞比在25℃下生长的细胞产生更多的RNA，dsRNA的产率通过在宿主细胞中表达T7聚合酶来提高，并且在dsRNA模板的3’包含两个终止子序列导致dsRNA产率的进一步增加。从表达T7RNA聚合酶和pCPB-hp+2TdsRNA构建体的大肠埃希氏菌细胞观察到30-50mg/L dsRNA的产率。(数据未显示)。

实施例2

科罗拉多马铃薯甲虫(CPB)dsRNA的体内产生

1.转化

如实施例1中所述将pCPB-hp+2T&pLac-T7质粒转化进大肠埃希氏菌菌株HT115(DE3)中。转化后，将大肠埃希氏菌细胞涂板并选择单个菌落。

2.培养条件

将单个菌落在37℃于3ml含有100ug/ml氨苄青霉素和12.5ug/ml四环素的LB培养基中生长6-8小时，以产生种子培养物。为了诱导dsRNA的表达，将200ul的种子培养物接种至具有含100ug/ml氨苄青霉素和12.5ug/ml四环素的50ml自动诱导培养基(AIM)(Studier,Protein Expression and Purification 41(2005)207–234)的250ml培养瓶中，随后进行孵育。通过在4℃以6000g离心10分钟来收获细胞。

3.RNA纯化

使用从Stead的SNAP方案(Stead等，Nucleic Acids Res.2012年11月1日；40(20):e156.)改造的方法(具有如下所述的对RNA提取缓冲液的修改)来纯化细菌RNA。将1毫升的细菌培养基物(～10⁸个细胞)以16,000g离心30秒，除后除去上清液。将细胞沉淀在干冰中贮存直至准备提取。随后通过剧烈地涡旋将细胞沉淀重悬浮于100μl的改良RNA提取液[18mM EDTA,0.025％SDS,5mM TCEP,95％甲酰胺(RNA等级)]中。用5mM TCEP替换用于Stead’s SNAP方案的RNA提取溶液中的1％2-巯基乙醇，因为TCEP相较于2-巯基乙醇具有低得多的毒性并且具有与2-巯基乙醇等同的功效(数据未显示)。

在重悬浮于经修饰的RNA提取溶液中后，通过在95℃下于水浴中孵育样品7分钟来裂解细胞。通过在室温下以16,000g离心温的样品5分钟来沉淀细胞碎片。将上清液小心地转移至新鲜的管而不扰动沉淀。

用H2O稀释从非诱导的(图4，泳道1)和诱导的(图4，泳道2)pCPB-hp+2T大肠埃希氏菌细胞分离的总RNA，将其在琼脂糖凝胶上进行电泳。如图4中所示，在诱导的pCPB-hp+2T大肠埃希氏菌细胞但非在非诱导的pCPB-hp+2T大肠埃希氏菌细胞中观察到对应于CPB dsRNA的条带。

实施例3

体内与体外转录的RNA的比较

将pCPB-hp+2T质粒线性化，并用作RNA的体外转录的模板。将体外转录的RNA(图5A，泳道9和10)与按照实施例1中描述的改良的SNAP方案纯化并直接在H2O中稀释的(图5A，泳道5和6)或在用H₂O(图5A，泳道5和6)稀释之前利用30K的分子截留膜(Amicon)过滤(以除去试剂诸如EDTA、SDS、TCEP和甲酰胺)的细菌转录的RNA一起在在琼脂糖凝胶上进行电泳，以测定RNA转录物的大小。观察到体外转录的RNA大于细菌转录的RNA(参见图5A)。

将体外和体内(经细菌)转录的RNA与RNA酶A(其消化单链而不消化双链RNA)一起孵育)。如图5B中所示，在RNA酶A消化后，体内(泳道5-8)和体外(泳道9和10)RNA转录产物的大小一致。这表明体外转录的RNA的增加的大小归因于单链发夹环的存在；其在细菌细胞中通过RNA加工除去。

实施例4

大肠埃希氏菌的热灭活

用于热灭活大肠埃希氏菌HT115(DE3)细胞而不裂解细胞的温度范围通过实验来测定。在从37℃至72℃的不同温度下孵育大肠埃希氏菌HT115(DE3)细胞30分钟。随后在显微镜下检查经热处理的细胞以确定裂解是否已发生并且在LB板上扩散，并且将细胞孵育过夜以测定热处理后的存活能力。如表1中所示，加热至59℃和更高的温度杀死所有细胞，然而对于高至72℃的任何测试温度均未观察到细胞裂解(参见图6)。

表1：热处理后的细胞裂解和存活能力

在不同温度下处理所有细胞30分钟。低OD为OD₆₀₀”0.2并且高OD为OD₆₀₀”2。

实施例5

最优化细菌dsRNA产率—生长培养基

测试3种丰富培养基自动诱导培养基(AIM)(Studier,Protein Expression andPurification 41(2005)207–234)、Super Broth(Atlas,R.M.Handbook ofmicrobiological media.1997.CRC Press,New York,USA)+培养基和质粒+AIM培养基，以确定细胞RNA产生的产率是否可通过培养基选择来提高。

自动诱导培养基(AIM)含有：1％N-Z-胺AS、0.5％酵母提取物、0.5％甘油、0.05％葡萄糖、0.2％α-乳糖、25mM(NH4)2SO4、5mM KH2PO4、20mM Na2HPO4、1mM MgSO4。

Super Broth+AIM培养基含有：3.2％胰蛋白胨、2％酵母提取物、0.5％NaCl、1％甘油、0.1％葡萄糖、0.4％α-乳糖、50mM(NH4)2SO4、10mM KH2PO4、40mM Na2HPO4、2mM MgSO4。

质粒+AIM培养基含有：质粒+培养基(Thomson Instrument Co.)、25mM(NH4)2SO4、5mM KH2PO4、20mM Na2HPO4、1mM MgSO4、0.5％甘油、0.05％甘油、0.2％α-乳糖(用于自动诱导)。

按照实施例2中描述的培养条件制备DV49大肠埃希氏菌HT115(DE3)细胞的种子培养物。用相同量的种子培养物接种3种不同的生产培养基，并按照实施例2中描述的条件进行孵育。在16小时的培养瓶培养后，收获细胞以进行产率测试。

在AIM中生长的DV49细胞产生40mg/L RNA。在Super Broth+培养基中生长的DV49细胞产生207mg/L RNA。在质粒+AIM培养基中生长的DV49细胞产生96mg/L RNA。基于来自3种培养基的细菌DV49RNA的产率，Super broth+产生最高产率的目标产物。参见图7A。

如上所述测试Super broth+培养基对CPB dsRNA产生的作用。在Super broth+培养基中培养的pCPB-hp+2T大肠埃希氏菌HT115(DE3)细胞产生66mg/L RNA。参见图7B。Superbroth+培养基中的产率相较于测试的其它培养基得以改善。

实施例6

dsRNA对科罗拉多马铃薯甲虫的生物功效

如上所述产生3种dsRNA样品未裂解的热灭活的pCPB-hp+2T大肠埃希氏菌HT115(DE3)、纯化的细菌转录的CBP dsRNA和体外转录的CBP dsRNA，以测试dsRNA制剂抗科罗拉多马铃薯甲虫(CPB)即马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)的生物功效。

使用13.2g/L琼脂糖(Serva 11393)、140.3g/L Bio-Serve预混合物(F9380B)、5ml/L KOH(18.3％w/w)和1.25ml/L福尔马林(37％)的人工食物进行利用CPB幼虫的生物测定。将所述食物以200uL等分试样分配到96孔板中，并且在样品应用之前进行短暂干燥。每孔应用二十(20)uL测试样品(未裂解的热灭活的pCPB-hp+2T大肠埃希氏菌HT115(DE3)、纯化的细菌转录的CBP dsRNA或体外转录的CBP dsRNA)的等分试样，将无菌水用作未处理的对照(UTC)。使板干燥后添加幼虫。利用细画笔每孔添加一只初生CPB幼虫。随后用聚脂薄膜密封板并使用插入钉通风。每次处理测试32只幼虫(32)。

将生物测定板在27℃、60％相对湿度(RH)于完全黑暗中孵育10-12天。随后对板的死亡率(表2)和幼虫生长迟缓(表3)进行评分。使用统计软件(SAS Institute,1995)分析数据，并用Dunnet’s检验进行全因子ANOVA以寻找相较于未处理对照的处理效果(P<0.05)。进行Tukey-Kramer事后检验以比较所有处理对(P<0.05)。

如表2和3中所示，所有CPB dsRNA制剂均显示显著的抗科罗拉多马铃薯甲虫活性。例如，87.5％的甲虫生长在测试的未裂解的热灭活的大肠埃希氏菌的最低浓度(0.00002mg/ml)上被抑制。

表2：CPB dsRNA死亡率生物测定

表3：CPB dsRNA生长迟缓生物测定

实施例7

DV49dsRNA的生物功效

构建具有驱动反义DV49+环+有义DV49+PTH-终止子+pET-T7终止子的表达的T7启动子的pUC主链质粒。参见图8。SEQ ID NO.4中提供了DV49表达构建体的核苷酸序列。

SEQ ID NO 4：

TAATACGACTCACTATAGGGATCCATGATATCGTGAACATCATCTACATTCAAAT

TCTTATGAGCTTTCTTAAGGGCATCTGCAGCATTTTTCATAGAATCTAATACAGCA

GTATTTGTGCTAGCTCCTTCGAGGGCTTCCCTCTGCATTTCAATAGTTGTAAGGGT

TCCATCTATTTGTAGTTGGGTCTTTTCCAATCGTTTCTTCTTTTTGAGGGCTTGGAG

TGCAACTCTTTTATTTTTCGACGCATTTTTCTTTGCaagtactgcgatcgcgttaacgctttatcacgat

accttctaccacatatcactaacaacatcaacactcatcactctcgacgacatccactcgatcactactctcacacgaccgattaactcct

catccacgcggccgcctgcaggagcGCAAAGAAAAATGCGTCGAAAAATAAAAGAGTTGCAC

TCCAAGCCCTCAAAAAGAAGAAACGATTGGAAAAGACCCAACTACAAATAGATG

GAACCCTTACAACTATTGAAATGCAGAGGGAAGCCCTCGAAGGAGCTAGCACAA

ATACTGCTGTATTAGATTCTATGAAAAATGCTGCAGATGCCCTTAAGAAAGCTCA

TAAGAATTTGAATGTAGATGATGTTCACGATATCATGGATAagcttgccatctgttttcttgcaag

atcagctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaaggaggaactatatccgga

核苷酸1-17编码T7启动子；核苷酸21-260编码与玉米根虫反义玉米根虫(玉米根叶甲(Diabrotica virgifera))基因的靶核苷酸序列大体上互补的反义序列；核苷酸261-410编码环形成区；核苷酸411-650编码与玉米根虫(玉米根叶甲)基因的靶核苷酸序列大体上相同的有义序列；核苷酸659-668编码PTH-终止子；核苷酸681-764编码pET-T7终止子。

利用两种质粒转化大肠埃希氏菌HT115(DE3)，一种质粒携载DV49dsRNA表达构建体而另一种质粒携载在诱导型元件控制下的T7RNA聚合酶(IPTG-诱导型T7聚合酶)。将细胞生长至期望的细胞密度并测定dsRNA产率。将表达dsRNA的DV49细胞加热至至少59℃的温度，进行30分钟以杀死细胞。滴定表达dsRNA的DV49细胞以提供具有递增浓度的dsRNA(例如，0.00002、0.001和0.005mg/ml)的组合物，并将含有热灭活的表达dsRNA的DV49细胞的组合物或热灭活的大肠埃希氏菌HT115(DE3)对照细胞提供于玉米根虫幼虫的食物中。评价幼虫死亡率和发病率，测定存活幼虫的质量。摄入热灭活的表达dsRNA的DV49细胞后玉米根虫幼虫相较于对照细胞的死亡、生长迟缓或其它抑制表明热灭活的表达dsRNA的DV49细胞的摄取对于控制玉米根虫虫害是有效的。

实施例8

裂解的对未裂解的细菌的生物功效

制备pCPB-hp+2T大肠埃希氏菌HT115(DE3)的培养物并如实施例4中所述热灭活细胞。随后通过化学、酶促、冻融或机械方式裂解热灭活的pCPB-hp+2T大肠埃希氏菌HT115(DE3)细胞的等分试样，以产生细胞裂解物。随后通过离心除去细胞碎片以部分纯化细胞裂解物的等分试样。随后如上文实施例6中所述，测试3个样品未裂解的热灭活的pCPB-hp+2T大肠埃希氏菌HT115(DE3)细胞、未纯化的细胞裂解物和部分纯化的细胞裂解物的抗科罗拉多马铃薯甲虫(CPB)即马铃薯甲虫的生物功效。另外将3个样品的等分试样经历不同的制备(诸如冻干或冷冻)和温度(诸如室温、4℃和0℃)，进行递增的时间长度，并且通过进行如上文实施例6中所述的生物测定来测定经历各种制备和贮存条件的样品的生物功效。比较不同生物制剂的生物功效，并选择显示高度的生物功效和稳定性的制剂。

实施例9

最优化dsRNA产率—终止子的数目和组合

通过在dsRNA编码序列的3’位置上插入2、3、4、5或6个转录终止序列(以便所述转录终止子序列与启动子形成功能性组合)来构建用于高效dsRNA产生的质粒载体，所述转录终止序列各自独立地选自由以下组成的组：PTH-终止子、pET-T7终止子、终止子、pBR322-P4终止子、水泡性口膜炎病毒终止子、rrnB-Tl终止子、rrnC终止子、TTadc转录终止子。

用工程化载体转化宿主细胞并诱导dsRNA编码序列从启动子的转录。测定转录终止序列的每一个数目和组合的终止效率。选择显示最高终止效率的终止序列的最小数目和组合，因为高终止效率使载体序列的非生产性通读最少化并且相较于低终止效率提高dsRNA的产率。

实施例10

最优化dsRNA产率—质粒的大小

通过将工程化dsRNA表达构建体插入不含基于蛋白质的可选择标记和/或非必需间隔子序列的最小质粒载体来构建用于高效dsRNA产生的质粒载体，所述工程化表达构建体包含启动子、dsRNA编码元件和两个或更多个终止序列。当含有工程化dsRNA表达构建体的载体的预期大小小于用于高效质粒复制的最小大小时，可将一个或多个另外的工程化dsRNA表达构建体或dsRNA编码元件插入载体以获得用于所得表达载体的高效复制的最小大小。用dsRNA表达载体转化宿主细胞。如果需要，共转化编码驱动dsRNA从dsRNA表达载体的转录的RNA聚合酶的载体。最小载体主链为非dsRNA编码序列的非生产性通读提供减少的模板，从而相较于具有更大百分比的载体主链的质粒提高dsRNA的产率。

实施例11

最优化dsRNA产率—线性化的模板

通过在位于可操作地连接于启动子的dsRNA编码序列的3’位置上插入不切割宿主细胞基因组的内切核酸酶(例如，I-Sce1，其不具有大肠埃希氏菌基因组中的任何位点、ZFN限制性位点或TALEN限制性位点)的限制性位点来构建用于高效dsRNA产生的质粒载体。参见，例如，图9。用dsRNA+内切核酸酶产生载体和编码识别所述限制性位点的内切核酸酶的载体共转化宿主细胞。在一些情况下，内切核酸酶的表达是可诱导的并且可在还编码驱动dsRNA产生的RNA聚合酶的载体上编码内切核酸酶。内切核酸酶的表达线性化dsRNA产生载体，从而消除载体序列的非生产性通读并相较于非线性化质粒提高dsRNA的产率。

实施例12

最优化RNA产率—终止子组合的比较

利用被克隆进相同表达质粒中的不同的终止子进行RNA产率的比较。

1.RNA产生载体的设计

使用pUC19克隆载体构建9个具有不同终止子或终止子的组合的质粒载体，所述克隆载体含有氨苄青霉素抗性基因、大肠埃希氏菌lac Z基因的N末端片段、多克隆位点和复制起始点。将如下表4中显示的终止子序列在T7启动子的下游克隆进pUC19载体中以产生9个不同的具有不同终止子或终止子的组合的载体。将编码CPB-hp的DNA序列(SEQ ID NO 2)在T7启动子的下游和终止子序列的上游插入载体。

表4：用于RNA产生载体的终止子的序列

2.培养条件

将质粒载体转化进入大肠埃希氏菌HT115(DE3)细胞中。选择各质粒载体的单个菌落，将其在3ml含有100ug/ml氨苄青霉素和12.5ug/ml四环素的LB培养基中于37℃下生长6-8小时以产生种子培养物。为了诱导dsRNA表达，将200ul的种子培养物接种至具有含100ug/ml氨苄青霉素和12.5ug/ml四环素的50ml自动诱导培养基(AIM)(Studier,ProteinExpression and Purification 41(2005)207–234)的250ml培养瓶中，随后进行孵育。通过在4℃以6000g离心10分钟来收获细胞。

3.RNA的纯化和测量。

按照实施例2中描述的方案从细菌细胞纯化总RNA，并将其在琼脂糖凝胶上进行电泳以测量产生的RNA的量。如图10中所示，从含有2个串联终止子(PTH和PET)的RNA产生载体观察到高水平的RNA产生。大多数含有单个终止子的RNA产生载体不产生可检测水平的RNA。不希望受特定理论束缚，单个终止子不能终止T7转录会导致少的RNA产生。含有PET或rrnBT2单个终止子的RNA产生载体产生可检测量的RNA，然而，来自PET和rrn BT2产生载体的产率相较于含有2个终止子的RNA产生载体相对较低(分别地为16％和40％)。参见图10。

4.结构比较

使用CLC Main Workbench(6.8.4版)来分析由终止子形成的二级结构。还测定二级结构的自由能。参见表5。如图11中所示，提供最高RNA产率的终止子(PET、rrn BT2和PTH；PET)具有相似的二级结构，所述结构是具有约10至20个碱基对的发夹结构。与来自RNA产生载体的极少RNA产生或无可检测的RNA产生相关的终止子具有太短或太长以致不能停止转录的发夹。发现2个终止子构建体PTH；PET具有相邻的小的和中等大小的发夹，与其它单个终止子构建体相比其得到最高产率。参见图11。

表5:二级结构的自由能

终止子	二级结构的自由能
		PET	ΔG＝-24.0kcal/mol
PTH	ΔG＝-9.5kcal/mol
		rrn BT1	ΔG＝-39.3kcal/mol
rrn BT2	ΔG＝-23.2kcal/mol
		CJ	ΔG＝-2.5kcal/mol
B1002	ΔG＝-15.5kcal/mol
		B1006	ΔG＝-18.5kcal/mol
PTH+PET	ΔG＝-38.6kcal/mol

实施例13

二级结构对RNA产率的作用的评价

利用不同的克隆进相同RNA产生载体中的延长的发夹编码序列进行RNA产率的比较。

将编码27聚体(27bp的茎+8bp的环)(SEQ ID NO.14)、240聚体(240bp的茎+150bp的环)(SEQ ID NO.15)或280聚体(280bp的茎+150bp的环)(SEQ ID NO.2)发夹RNA的DNA序列在PTH+PET终止子的上游和T7启动子的下游插入pUC19-PTH+PET载体中。使用CLC MainWorkbench(6.8.4版)来测定由RNA发夹和终止子形成的二级结构。参见图12。如可在图12A中看到的，27聚体RNA发夹展示与由PTH+PET终止子形成的二级结构(用圆圈标记)相似的二级结构。240聚体和280聚体发夹不展示终止子样二级结构。参见图12B和12C。

27聚体RNA发夹/PTH+PET终止子、240聚体RNA发夹/PTH+PET终止子和280聚体RNA发夹/PTH+PET终止子表达构建体转化进大肠埃希氏菌HT115(DE3)细胞中，并如实施例2所述诱导RNA产生。如可在图13中看到的，相较于更长的RNA发夹构建体，来自27聚体RNA发夹/PTH+PET终止子构建体的dsRNA产率显著更高。该结果表明27聚体RNA发夹/PTH+PET终止子构建体的额外的中等大小的发夹结构的存在可帮助T7转录的终止，这导致更高的RNA产率。

实施例14

终止子数目和二级结构对RNA产率的作用

利用多个不同的克隆进相同RNA产生载体中的终止子进行RNA产率的比较。

如上文的实施例12中所述，从含有2个终止子组合PTH+PET的RNA产生载体观察到提高的RNA表达。将另外的终止子序列克隆进pUC19-PTH+PET载体中以确定RNA产率是否随着终止子序列的数目增加而提高。由于观察到PET和rrn BT2终止子序列对于单个终止子RNA产生载体产生最大RNA产率，因此选择这些序列来克隆进pUC19-PTH+PET载体中。产生3个另外的RNA产生载体：pUC19-rrn BT2+PET+PTH+PET、pUC19-PET+rrn BT2+PTH+PET和pUC19-rrn BT2+PTH+PET。对所述质粒进行测序确认，随后将其转化进HT115(DE3)细胞中。培养细胞，如实施例12中所述分离总RNA。将总RNA在琼脂糖凝胶上电泳以测量产生的RNA的量。参见图14。

将从pUC19-PTH+PET载体产生的总RNA(图14，泳道1)用作基线RNA产率(100％)，并将来自pUC19-rrn BT2+PET+PTH+PET、pUC19-PET+rrn BT2+PTH+PET和pUC19-rrn BT2+PTH+PET表达载体的总RNA产率与基线相比较。令人惊讶地，RNA产率的增加不与终止子的数目严格相关，因为3个终止子表达载体pUC19-rrnBT2+PTH+PET产生52％的由2个终止子基线产生的总RNA，并且4个终止子表达载体pUC19-PET+rrn BT2+PTH+PET产生40％的由2个终止子基线产生的总RNA。参见图14和表6。然而，4个终止子表达载体pUC19-rrn BT2+PET+PTH+PET)的总RNA产率比2个终止子基线的RNA产率高35％。参见图14和表6。

使用CLC Main Workbench(6.8.4版)测定由终止子形成的二级结构。参见图15。如可在图15A中看到的，2个终止子的pUC19-PTH+PET基线RNA产生载体拥有具有2个相邻的中等大小的发夹的二级结构(用圆圈标记)。产生最高RNA产率的4个终止子表达载体pUC19-rrn BT2+PET+PTH+PET)显示具有3个相邻的中等大小的发夹的二级结构。参见图15B。如图15C和图15D中显示的，具有最低总RNA产率的RNA产生载体展示不具有相邻中等大小的发夹的二级结构。

表6：多个终止子

实施例15

相邻rrn BT2+PET+PTH+PET终止子提供增加的RNA产率

针对另外的基因进行PTH+PET与PET+rrn BT+PTH+PET终止子构建体的RNA产率的比较。

将编码来源于科罗拉多马铃薯甲虫的397聚体发夹的DNA序列(SEQ ID NO.20)在终止子的上游和T7启动子的下游插入pUC19-PTH+PET和pUC19-rrn BT2+PET+PTH+PET载体中。通过测序确认质粒序列，并将其转化进HT115(DE3)细胞中。如实施例12中所述进行细胞培养和总RNA提取。在18小时的培养后，具有含有PTH+PET终止子的表达载体的菌株达到OD₆₀₀ 5.78并且产生44mg/L的RNA产率，而具有含有rrn BT2+PET+PTH+PET终止子的表达载体的菌株达到OD₆₀₀ 5.55并且产生132mg/L的RNA产率。该结果表明额外的中等大小的发夹构建体rrn BT2+PET+PTH+PET终止子构建体的存在可帮助T7转录的终止，这导致更高的RNA产率。

实施例16

相邻rrn BT2+PET+PTH+PET终止子提供增加的蛋白质产率

将编码蛋白A(MW 21k)的DNA序列克隆进pUC19-PET终止子、pUC19-rrn BT2终止子、pUC19-PTH+PET终止子和pUC19-rrn BT2+PET+PTH+PET终止子载体中。确认质粒的序列并将其转化进BL21(DE3)细胞中。选择含有表达载体的细胞，随后培养在具有羧苄西林的LB培养基中。当将OD₆₀₀达到0.5时，将1mM IPTG添加至每一个培养物中。在4小时的孵育后收获细胞。通过将细胞在2X SDS-PAGE上样缓冲液中煮沸5分钟来从细胞分离总蛋白质。将5ul的每一个样品加载至SDS-PAGE凝胶上。如图16中所示，含有pUC19-PTH+PET和pUC19-rrn BT2+PET+PTH+PET表达质粒的细胞产生最高的靶蛋白产率。

实施例17

用于增加的RNA和蛋白质表达的合成终止子的设计

修饰rrn BT2+PET+PTH+PET终止序列(SEQ ID NO.18)以除去发夹形成区域内的非发夹形成序列和碱基对错配，所得的合成序列SEQ ID NO.21经CLC Main Workbench(6.8.4版)预测，形成具有3个相邻的在发夹形成区中无错配的中等大小的发夹的二级结构。参见图17B。合成包含SEQ ID NO.21的DNA多核苷酸。将包含SEQ ID NO.21的DNA多核苷酸在T7启动子下游克隆进pUC19载体中。

4个不同的假定的终止子序列被从大肠埃希氏菌鉴定并且以串联方式排列，从而产生合成序列SEQ ID NO.22。SEQ ID NO.22经CLC Main Workbench(6.8.4版)预测，形成具有4个相邻中等大小的发夹的二级结构，在发夹形成区内存在一些错配“(泡”)。参见图17C。合成包含SEQ ID NO.22的DNA多核苷酸，并将其在T7启动子下游克隆进pUC19载体中。

修饰SEQ ID NO.22以除去非发夹形成序列和发夹形成区内的碱基对错配，所得的合成序列SEQ ID NO.23经CLC Main Workbench(6.8.4版)预测，形成具有4个相邻的中等大小的在发夹形成区中无错配的发夹的二级结构。尝试化学合成包含SEQ ID NO.23的DNA多核苷酸，然而未获得产物。不希望受特定理论束缚，SEQ ID NO.23的二级结构可干扰合成。

表7：合成终止子

实施例18

最优化RNA产率—合成终止子

用包含与可操作地连接于编码目标RNA的序列的启动子功能性组合的如SEQ IDNO.21、22或23中描述的工程化终止子序列的工程化载体转化宿主细胞。诱导RNA编码序列从启动子的转录。测定每一个工程化终止子序列的终止效率。选择显示最高终止效率的工程化终止序列。RNA产率随着由工程化终止子序列形成的中等大小的发夹的数目增加而增加，因为相邻的中等大小的发夹减慢或停止转录，从而使载体序列的非生产性通读降至最少，并从而提高RNA的产率。

实施例19

通过在RNA编码序列的3’位置插入PET、PTH+PET或rrn BT2+PET+PTH+PET终止序列(以便转录终止子序列与启动子形成功能性组合)来构建用于RNA产生的质粒载体，所述启动子选自由以下组成的组：T3、SV40、SP6、T5、β-内酰胺酶启动子、大肠埃希氏菌半乳糖启动子、阿拉伯糖启动子、碱性磷酸酶启动子、色氨酸(trp)启动子、乳糖操纵子(lac)启动子、lacUV5启动子、trc启动子和tac启动子。

用工程化载体转化宿主细胞并诱导RNA编码序列从启动子转录。测定转录终止序列的每一个数目和组合的终止效率。PTH+PET终止载体的RNA产率相较于PET终止载体有所增加，并且BT2+PET+PTH+PET终止载体的RNA产率相较于PTH+PET(两个终止子)和PET(单个终止子)终止载体有所增加，因为由工程化终止子序列形成的中等大小的发夹的数目增加，因为PTH+PET和rrn BT2+PET+PTH+PET终止子具有减慢或停止转录的相邻中等大小的发夹，从而使载体序列的非生产性通读降至最少，并从而提高RNA的产率。

Claims

1.一种工程化表达构建体，其包含：

a.启动子；

b.位于所述启动子的转录下游的第一核酸序列，其中所述第一核酸序列编码dsRNA或蛋白质；和

c.位于所述第一核酸序列的3’的第二核酸序列，其中所述第二核酸序列从5’至3’包含含有SEQ ID NO：9的第一转录终止子、含有SEQ ID NO：5的第二转录终止子、含有SEQ IDNO：6的第三转录终止子和含有SEQ ID NO：5的第四转录终止子；

其中所述第一、第二、第三和第四转录终止子形成包含至少三个相邻中等大小的发夹的二级结构，其中所述第一核酸序列和第二核酸序列可操作地连接于所述启动子，且其中所述启动子和转录终止子序列是功能性组合。

2.根据权利要求1所述的工程化表达构建体，其中所述发夹间隔包含10个或更少的核苷酸的间隔区。

3.根据权利要求1或2所述的工程化表达构建体，其中所述第二核酸序列包含SEQ IDNO:18。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的工程化表达构建体，其中所述启动子是噬菌体启动子。

5.根据权利要求1-3中任一项所述的工程化表达构建体，其中所述启动子选自由以下组成的组：T7、T3、SV40、SP6、T5、β-内酰胺酶启动子、大肠埃希氏菌半乳糖启动子、阿拉伯糖启动子、碱性磷酸酶启动子、色氨酸(trp)启动子、乳糖操纵子(lac)启动子、lacUV5启动子、trc启动子和tac启动子。

6.根据权利要求1-3中任一项所述的工程化表达构建体，其中所述第一核酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:2、4、14、15和20。

7.一种提高RNA产量的方法，其包括向宿主细胞提供权利要求1-3中任一项的工程化表达构建体。

8.根据权利要求7所述的提高RNA产量的方法，其中所述宿主细胞是大肠埃希氏菌HT115(DE3)细胞。

9.一种提高蛋白质产量的方法，其包括向宿主细胞提供工程化表达构建体，其中所述工程化表达构建体包含：

a.启动子；

b.位于所述启动子的转录下游的第一核酸序列，其中所述第一核酸序列编码蛋白质；和

10.根据权利要求9所述的提高蛋白质产量的方法，其中所述宿主细胞是BL21(DE3)细胞。

11.一种载体，其包含权利要求1-3中任一项的工程化表达构建体，其中所述载体是质粒载体。

12.一种细菌宿主细胞，其包含权利要求11的载体。

13.根据权利要求12所述的细菌宿主细胞，其中所述细菌宿主细胞不表达RNA酶A。

14.根据权利要求12所述的细菌宿主细胞，其中所述细菌宿主细胞是大肠埃希氏菌细胞。

15.一种细胞培养系统，其用于dsRNA的体内合成，其包含细菌宿主细胞和生长培养基，其中所述细菌宿主细胞包含含有工程化表达构建体的载体，所述工程化表达构建体包含：

a.启动子；

b.位于所述启动子的转录下游的第一核酸序列，其中所述第一核酸序列编码dsRNA；和

16.根据权利要求15所述的细胞培养系统，其中所述生长培养基包含3.2％的胰蛋白胨、2％酵母提取物、0.5％NaCl、1％甘油、0.1％葡萄糖、0.4％α-乳糖、50mM (NH₄)₂SO₄、10mMKH₂PO₄、40mM Na₂HPO₄、2mM MgSO₄。

17.一种组合物，其用于控制无脊椎动物虫害，其包含权利要求12-14中任一项的细菌宿主细胞，其中所述细菌宿主细胞死亡但未裂解。

18.一种组合物，其用于控制无脊椎动物虫害，其包含权利要求12-14中任一项的细菌宿主细胞的裂解物。

19.一种方法，其用于控制无脊椎动物虫害，其包括向植物施用权利要求17的组合物。

20.一种组合物，其用于抑制病毒病在植物群体中的扩散，其包含权利要求12-14中任一项的细菌宿主细胞，其中所述细菌宿主细胞是死亡但未裂解的。

21.一种组合物，其用于抑制病毒病在植物群体中的扩散，其包含权利要求12-14中任一项的细菌宿主细胞的裂解物。

22.一种方法，其用于抑制病毒病在植物群体中的扩散，其包括向植物施用权利要求20的组合物。

23.一种包含核酸序列的转录终止子，所述核酸序列从5’至3’包含含有SEQ ID NO：9的第一转录终止子、含有SEQ ID NO：5的第二转录终止子、含有SEQ ID NO：6的第三转录终止子和含有SEQ ID NO：5的第四转录终止子，其中所述第一、第二、第三和第四转录终止子形成包含至少三个相邻中等大小的发夹的二级结构。

24.根据权利要求23所述的转录终止子，其中所述发夹间隔包含10个或更少的核苷酸的间隔区。

25.根据权利要求23所述的转录终止子，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:18。

26.一种控制无脊椎动物虫害的方法，包括向植物施用权利要求18所述的组合物。

27.一种抑制病毒病在植物群体中的扩散的方法，包括向植物施用权利要求21所述的组合物。