CN105106975B - 一种造影剂所致的急性肾损伤动物模型的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种造影剂所致的急性肾损伤动物模型的构建方法，本发明所述构建方法中使用临床上常用的低渗造影剂，在相对较短的时间内制作稳定的CI‑AKI动物模型，有效避免其它混杂因素的干扰，为进一步进行CI‑AKI的病理生理机制、分子细胞学、分子生物学等研究提供基础，同时为更早地预防及治疗临床患者CI‑AKI的发生提供依据。
Description
技术领域
本发明涉及一种动物模型的构建方法，尤其涉及一种造影剂所致的急性肾损伤动物模型的构建方法。
背景技术
随着使用造影剂的增强CT和介入诊疗术在临床中的广泛应用，国内使用造影剂的人群每年达到2-3千万人，造影剂所致急性肾损伤(Contrast-Induced acutekidneyinjury，CI-AKI)发生率在1％-5％，每年发生CI-AKI约20-100万例，CI-AKI显著增加病死率，高达9.7-14％，住院时间更长，医疗费用增加，为社会带来了巨大的经济与社会负担。2013年全国介入治疗注册病例数据显示PCI例数已经超过45万，冠脉诊疗术患者接近200万，但平均百万人口的PCI例数为309.42例，而美国约为1800例/百万人，因此我国冠脉介入诊疗术病例会继续增长，CI-AKI风险仍在不断增加，另外，有研究发现，对于合并高危因素的人群，如合并基础肾功能不全、糖尿病、充血性心力衰竭、高血压、高龄等，CI-AKI的发生率进一步升高，但目前CI-AKI发生的病理生理机制仍未完全清楚，而且尚无有效的治疗措施。
所以新的CI-AKI的防治措施的研究显得尤其重要。然而，新的防治措施的研究依赖于对CI-AKI发生发展的病理生理机制更深入的研究。另外，建立与临床实践中患者发生CI-AKI相吻合的稳定可靠动物模型，对于CI-AKI的发生机制研究极为重要。令人遗憾的是，既往关于CI-AKI的基础研究大部分基于相同的CI-AKI动物模型，通过联合脱水、非甾体类药如吲哚美辛、高渗造影剂如泛影葡胺，或者注射肾毒性药物(如甘油吲哚美辛、N-硝基-L-精氨酸甲基酯等)、外科肾部分切除方法，建立大鼠的CI-AKI模型，这些都与真实临床实践中CI-AKI的发生机制相差甚远。
Colbay等通过对大鼠禁水24小时后，按照术前大鼠体重静脉注射泛影葡胺7ml/kg，持续时间5分钟，48小时后通过取血样及肾脏组织，通过检测血样中肌酐的变化。最后发现，单独造影剂组血肌酐较其他组显著性升高(1.2mg/dl；range 0.9-1.2；P＝0.006)。同时，肾脏组织病理学检查发现，发生CI-AKI组可明显看到肾小球损伤、肾小管液泡状坏死、间质浸润水肿，最终导致肾小球滤过率降低。而ARI等研究者则先对大鼠静脉内注射吲哚美辛(10mg/kg)，15分钟再静脉内注射N-硝基-L-精氨酸甲基酯(NO合酶抑制剂)预处理，15分钟后尾静脉注射高渗造影剂(6ml/kg)来制作CI-AKI模型。
Al-Otaibi等通过使用甘油对SD大鼠模型进行预处理来制作CI-AKI模型。SD大鼠经过24小时禁水后，肌肉内注射甘油(10ml/kg)，之后不限制饮水及饮食。24小时后股静脉注射碘海醇(8ml/kg)，时间大于2分钟。3天后处死大鼠，通过心腔内取血进行血肌酐及尿素氮水平测定。结果发现，使用甘油预处理后再进行造影剂干预组较其他组血清肌酐水平显著性升高；此外，光学显微镜发现，使用甘油及造影剂组肾小管显著扩张、空泡形成及肾小管坏死。
Liu等则主要采用外科肾部分切除手术预处理的方法来制作CI-AKI模型。对实验大鼠采取外科切除5/6肾脏组织的预处理，之后连续于术后1、2、4、6、8、10周的时间对于血肌酐进行监测，发现术后6周时肾功能相对稳定。之后采用术后6周时的大鼠制作CI-AKI模型，48小时后尾静脉注射造影剂碘克沙醇(10ml/kg)，药物注射后不予以禁食禁水，24小时后取血及肾脏组织，测定血肌酐、尿素氮水平及运用HE染色、免疫组化方法评估肾脏损伤情况，最后发现，与对照组相比，CI-AKI组血肌酐、尿素氮及肾损伤组织学评分显著性升高。(Scr：1.21±0.11vs.0.82±0.09mg/dL；BUN：78.40±14.99vs.56.40±6.88mg/dL)。
上述各个基础研究中涉及的CI-AKI模型中，需要通过手术的方式建立CI-AKI模型的方法，手术操作复杂，且为有创性，手术后等待时间长，不利于普遍推广；另外，基于联合脱水，注射非甾体类药如吲哚美辛和高渗造影剂建立的CI-AKI模型，虽然优于手术方法的模型，但是，目前临床相关的指南已明确建议，患者在接触造影剂前停用肾毒性药物，包括非甾体类药物和氨基糖苷类抗生素等。同时，造影剂的种类的选择应该避免使用高渗造影剂，而建议使用低渗造影剂。目前比较公认的CI-AKI发病机制为使用造影剂干预后，全身血流动力学改变导致的肾髓质缺血缺氧和造影剂对肾小管上皮细胞的直接损伤。而使用高渗造影剂或肾毒性药物预处理动物后，肾小管显著扩张、空泡形成及肾小管坏死，肾小球滤过率同样会发生明显下降，这严重干扰了对于造影剂肾病组织病理学研究，对于临床实践的指导意义也值得商榷。
本发明设计的CI-AKI动物模型立足于临床，与临床患者发生CI-AKI的机制类似，直接采用临床上常用的低渗对比剂作为药物干预因素，有效避免了上述各种混杂因素的干扰，为我们进一步研究CI-AKI发病机制、分子机制等提供了条件。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供了一种新型的以低渗造影剂诱导的急性肾损伤动物模型的构建方法，本发明还提供给了采用所述方法构建的动物模型，这种动物模型最大限度地贴近真实临床实践中患者发生CI-AKI的机制，避免不必要的混杂因素干扰，为进行CI-AKI的基础及临床研究提供真实的疾病模型载体，为研究CI-AKI的病理生理机制提供有利的动物实验基础。
为实现上述目的，所采取的技术方案：一种造影剂所致的急性肾损伤动物模型的构建方法，所述构建方法包括：
(1)给动物施用速尿，然后将所述动物禁水；
(2)给步骤(1)中禁水后的动物施用碘普罗胺，得到所述急性肾损伤动物模型。
优选地，所述步骤(1)中动物为大鼠。
优选地，所述步骤(1)中动物为成年SD大鼠。
优选地，所述步骤(1)中动物为雄性。
优选地，所述步骤(1)中施用方式为肌肉注射；所述步骤(2)中施用方式为尾静脉注射。
优选地，所述步骤(1)中速尿的用量为每千克体重200mg速尿。
优选地，所述步骤(1)中动物禁水时间为6h。
优选地，所述步骤(2)中碘普罗胺的用量为每千克体重15～20ml浓度为370mg I/mL的碘普罗胺注射液。
优选地，所述步骤(2)中注射时间为10分钟。
本发明所述的构建方法中不引入新的影响肾功能观察的干预因素，减少了混杂因素干扰，使实验结果更为可靠，而现有实验方案引入的高渗性造影剂、肾毒性药物预处理、外科肾部分切除术等均对基础肾功能产生较大影响。
本发明所述的构建方法中使用低渗造影剂制作动物模型，符合临床实际，更有助于造影剂肾病发病机制研究，而现有实验方案对于机制研究不确切，存在干扰因素。
本发明所述的构建方法中不需要预先对实验动物进行外科肾部分切除术预处理，操作简单，模型建立时间短，而现有实验方案模型制备前需行外科手术预处理，为有创性操作，模型建立时间长。
本发明还提供了一种急性肾损伤动物模型，所述急性肾损伤动物模型是采用上述所述方法构建而成的。本发明构建的动物模型不仅从肾损伤标志物(血肌酐及胱抑素C水平)反映CI-AKI组发生的变化，同时从组织病理、免疫组化等微观层面反映CI-AKI组的病理改变。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种造影剂所致的急性肾损伤动物模型的构建方法，该构建方法具有以下特点：使用临床上常用的低渗造影剂，在相对较短的时间内制作稳定的CI-AKI动物模型，有效避免其它混杂因素的干扰，为进一步进行CI-AKI的病理生理机制、分子细胞学、分子生物学等研究提供基础，同时为更早地预防及治疗临床患者CI-AKI的发生提供依据。
附图说明
图1为本发明所述的实施例1中动物模型构建实验分组及其实验流程图；
图2为本发明所述的实施例1中动物模型的效果评价，其中图2A为体重变化图，
图2B为血清肌酐(SCr)含量变化图，图2C为血清胱抑素C(cys-c)含量变化图，图2D为肾脏损伤评分图；
图3为本发明所述的实施例1中CI-AKI组和对照组的HE染色图，其中图3A-3C为CI-AKI组的HE染色图，图3D-3F为对照组的HE染色图；
图4为本发明所述的实施例1中CI-AKI组和对照组电镜扫描图，其中图4左为CI-AKI组的电镜扫描图，图4右为对照组的电镜扫描图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：CI-AKI动物模型建立及其效果评价
一、成年SD雄性大鼠40只，体重200-220g，适应环境24h后随机分为5组，每组8只，分别进行称重，进行如下处理：
1、生理盐水(Normal saline,NS)+生理盐水(Normal saline,NS)组(NS+NS组)：按照每千克体重20ml生理盐水的用量，在该组大鼠肌肉注射生理盐水，然后将该组大鼠禁水，禁水6h后，按照每千克体重3ml质量浓度为10％的水合氯醛的用量，在该组大鼠腹腔注射水合氯醛进行麻醉，每只大鼠眼眶静脉丛取血0.8-1ml，按照每千克体重20ml生理盐水的用量，在大鼠尾静脉注射生理盐水，注射时间约10min；
2、生理盐水(Normal saline,NS)+造影剂(Contrast media，CM)组(15ml/kg)(NS+CM15组)：按照每千克体重给予20ml生理盐水的用量，在该组大鼠肌肉注射生理盐水，然后将该组大鼠禁水，禁水6h后，按照每千克体重3ml质量浓度为10％的水合氯醛的用量，在该组大鼠腹腔注射水合氯醛进行麻醉，每只大鼠眼眶静脉丛取血0.8-1ml，按照每千克体重15ml浓度为370mg I/mL的碘普罗胺注射液，在大鼠尾静脉注射碘普罗胺，注射时间约10min；
3、速尿(Fursemide，FM)+生理盐水(Normal saline,NS)组(FM+NS组)：按照每千克体重20ml浓度为10mg/ml的速尿注射液，在该组大鼠肌肉注射速尿，然后将该组大鼠禁水，禁水6h后，按照每千克体重3ml质量浓度为10％的水合氯醛的用量，在该组大鼠腹腔注射水合氯醛进行麻醉，每只大鼠眼眶静脉丛取血0.8-1ml，按照每千克体重10ml生理盐水的用量，在大鼠尾静脉注射生理盐水，注射时间约10min；
4、速尿(Fursemide，FM)+造影剂(Contrast media，CM)组(10ml/kg)(FM+CM10组)：按照每千克体重20ml浓度为10mg/ml的速尿注射液，在该组大鼠肌肉注射速尿，然后将该组大鼠禁水，禁水6h后，按照每千克体重3ml质量浓度为10％的水合氯醛的用量，在该组大鼠腹腔注射水合氯醛进行麻醉，每只大鼠眼眶静脉丛取血0.8-1ml，按照每千克体重10ml浓度为370mg I/mL的碘普罗胺注射液，在大鼠尾静脉注射碘普罗胺，注射时间约10min；
5、速尿(Fursemide，FM)+造影剂(Contrast media，CM)组(15ml/kg)(FM+CM15组)：按照每千克体重20ml浓度为10mg/ml的速尿注射液，在该组大鼠肌肉注射速尿，然后将该组大鼠禁水，禁水6h后，按照每千克体重3ml质量浓度为10％的水合氯醛的用量，在该组大鼠腹腔注射水合氯醛进行麻醉，每只大鼠眼眶静脉丛取血0.8-1ml，按照每千克体重15ml浓度为370mg I/mL的碘普罗胺注射液，在大鼠尾静脉注射碘普罗胺，注射时间约10min；
二、上述5组大鼠尾静脉注射操作完毕后，饮水和进食不给予限制，24h后按照每千克大鼠体重给予3ml质量浓度为10％的水合氯醛的用量，在各组大鼠腹腔注射水合氯醛进行麻醉，每只大鼠眼眶静脉丛取血0.8-1ml，；
三、各组取血完毕后，将每组中的8只大鼠进行胸-腹联合开放手术，分离心包膜，于左心室刺入输血针，予0.9％生理盐水灌洗，同时剪开右心房，观察双肾表面颜色，可见双肾由深红色变浅；
四、生理盐水灌注30min后，剪断肾蒂组织，将肾脏转移至纱布上，仔细分离双肾表面包膜后，纵行切开肾脏，以PBS漂洗后，其中每组中的4只大鼠双肾以4％多聚甲醛固定，后续进行HE染色及免疫组化染色；每组中另各4只肾脏投入戊二醛溶液保存，后续进行电镜检查；
五、以上实验过程中取血后标本置于4℃冰箱中保存6h后，于离心机设定温度20℃，以速度2500r离心15min，分别离心两次后，提取上层血清，采用肌氨酸氧化酶法及胶乳增强透射免疫比浊法检测血肌酐及胱抑素C水平。
六、对于肾脏标本进行HE染色、免疫组化染色及电镜观察，同时各组间进行肾脏损伤评分。
七、实验结果：
(1)图1为实验分组情况。研究发现第5组模型，无论是以肌酐还是胱抑素C为定义，均达到CI-AKI的诊断标准，初步说明模型建立成功(图2B和图2C)。为进一步验证肾脏损伤情况，本发明分别做了肾脏组织病理切片(HE染色)和电镜下观察肾脏组织的显微结构。将第5组命名为CI-AKI组，将FM+NS组设为对照组，CI-AKI组的肾脏损伤评分显著高于对照组(图2D)。
(2)分别对CI-AKI组和对照组进行HE染色：结果显示：CI-AKI组(图3A-3C)肾小管损伤严重，管腔充血水肿，闭塞甚至坏死。而对照组(图3D-3F)肾小管及肾小球情况良好。
(3)为进一步观察CI-AKI组和对照组两组肾脏组织的超微结构，本发明分别对CI-AKI组和对照组进行电镜扫描观察：结果显示：CI-AKI组(图4左)肾小管基底膜增厚，大量空泡形成。线粒体严重肿胀，界脊排列紊乱，甚至消失，肾小管管腔的微绒毛缩短甚至脱落。而对照组肾小管及肾小球结构基本正常，线粒体界脊排列有序(图4右)。
从以上实验结果可知，通过采用第5组模型的构建方法能够成功构建出CI-AKI动物模型。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (3)
1.一种造影剂所致的急性肾损伤动物模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：
(1)给动物施用速尿，然后将所述动物禁水；
(2)给步骤(1)中禁水后的动物施用碘普罗胺，得到所述急性肾损伤动物模型；
所述步骤(2)中碘普罗胺的用量为每千克体重15ml浓度为370mg I/mL的碘普罗胺注射液；
所述步骤(1)中动物为成年SD大鼠，所述步骤(1)中动物为雄性；
所述步骤(1)中速尿的用量为每千克体重200mg速尿；
所述步骤(1)中动物禁水时间为6h。
2.根据权利要求1所述的造影剂所致的急性肾损伤动物模型的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中施用方式为肌肉注射；所述步骤(2)中施用方式为尾静脉注射。
3.根据权利要求1所述的造影剂所致的急性肾损伤动物模型的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中注射时间为10分钟。
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