CN103566413B

CN103566413B - 一种温敏凝胶组合物及其应用

Info

Publication number: CN103566413B
Application number: CN201310522096.3A
Authority: CN
Inventors: 王鹏飞; 董家鸿; 李崇辉; 张爱群; 蔡守旺
Original assignee: Chinese PLA General Hospital
Current assignee: Chinese PLA General Hospital
Priority date: 2013-10-29
Filing date: 2013-10-29
Publication date: 2015-04-08
Anticipated expiration: 2033-10-29
Also published as: CN103566413A

Abstract

本发明涉及一种温敏凝胶组合物，其包括泊洛沙姆嵌段共聚物和吲哚菁绿；由其制成的温敏凝胶水溶液可以制成具有良好生物相容性、无毒副作用，能够暂时阻断目标肝段门静脉血流，并实现肝段和血管精准定位的血管内标记性阻断制剂。将该制剂用于用于外科手术临床，可以在阻断的同时，使待切除部位易于术中辨认，实现手术的精准定位，同时可以大大减少出血量，由此可以帮助医生完成更为简单、更为安全的切除手术，提高了手术安全性。将本发明组合物装载于一种用于配制上述温敏凝胶水溶液的试剂盒内，可以方便存储、运输，同时方便配制标记性阻断制剂用于外科手术，该试剂盒操作简便，成本低廉，使用安全方便。

Description

一种温敏凝胶组合物及其应用

技术领域

本发明属于温敏性凝胶制备及其医药应用技术领域，具体涉及一种温敏性凝胶组合物及其在外科手术中的应用。

背景技术

目前外科手术进入“精准”时代，理想的肝癌切除术不仅应完整的切除病灶，还应该切除病灶所在的这一肝段。然而人体的肝脏外观上是一块整体的实质脏器，根据其内部血管分布及血流供应可以人为地将其分为8个段，实现精准肝段/亚肝段切除的关键在于术中对目标肝段或亚肝段的边界进行标定，为了在手术过程中准确的划分某一肝段的边界，目前临床常用的方法有以下三种：(1)通过结合肝脏表面解剖标志和术中超声追踪肝静脉和门静脉分支在肝表面的投影来决定目标肝段的边界。该方法操作简单，但是要求对肝内解剖有足够的认识，并熟练掌握术中超声。往往采用这种方法切除的标本都是规则的形状，不是真正意义上的段或亚段切除，仅达到相对精准的程度；(2)通过解剖第一肝门，并向肝实质内解剖游离目标肝段的Glisson蒂后将其阻断，实现完全阻断目标肝段血供后，沿缺血边界实现肝段切除。然而实现第一肝门解剖并向肝实质内游离段的Glisson蒂较为困难，技术要求高，风险较大，限制了该技术的普及；(3)超声引导门静脉穿刺注射染色剂：它是由Makuuchi教授首先提出的，目前应用最为广泛。术中超声引导下穿刺门静脉分支后注入美兰，随即目标肝段表面发生蓝染，沿着蓝染边界即可完成肝段/亚肝段切除。该方法美中不足在于虽实现了精准标定肝段边界的目标，但是离断肝实质时大多仍需要采用Pringle法阻断第一肝门，不可避免对肝脏造成缺血再灌注损伤。上述方法无一不存在操作复杂、风险较大或是价格昂贵等缺点，因此很多外科医生目前实行肝切除术时仍然是不精准的“局部挖除”。

因此，目前存在的问题是需要研究开发一种具有良好生物相容性、无毒副作用，能够暂时阻断目标肝段门静脉血流，并实现肝段和血管精准定位的血管内标记性外科手术制剂。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供了一种由泊洛沙姆嵌段共聚物和吲哚菁绿组成的温敏凝胶组合物，由该温敏凝胶组合物制得的温敏凝胶组合物溶液具有温度敏感性、可逆、无毒和标记的特征，用于外科手术可以起到很好的阻断和标记作用，可以帮助外科医生完成更为简单、更为安全精准的肝段切除手术。

本发明还提供了一种上述温敏凝胶水溶液在制备用于外科手术的标记性阻断制剂中的应用。

为方便使用，本发明还进一步提供了含有温敏凝胶组合物的试剂盒。

为此，本发明第一方面提供了一种温敏凝胶组合物，包括泊洛沙姆嵌段共聚物和吲哚菁绿，其中，泊洛沙姆嵌段共聚物与吲哚菁绿的质量比为640∶1～800∶1。优选泊洛沙姆嵌段共聚物与吲哚菁绿的质量比为720∶1。

根据本发明，所述泊洛沙姆嵌段共聚物为聚氧乙烯-聚丙乙烯-聚氧乙烯三嵌段共聚物，其中聚氧乙烯与聚丙乙烯的摩尔比为7∶3。例如，所述泊洛沙姆嵌段共聚物为Poloxamer407(泊洛沙姆407)，其平均分子量为12000道尔顿。

本发明第二方面提供了一种含有上述的温敏凝胶组合物的温敏凝胶水溶液，其中，泊洛沙姆嵌段共聚物的含量为16％～20％(重量/体积)。优选泊洛沙姆嵌段共聚物的含量为18％(重量/体积)。

本发明中，所述水为无菌蒸馏水。

泊洛沙姆嵌段共聚物具有可逆的温敏特性，其可以单体的形式溶解，在超过CMC(临界胶束浓度)和CMT(临界胶束温度)时，其疏水链聚氧丙烯段失水聚合成为胶束，这些球形胶束内核是聚氧丙烯，外部是水合膨胀的聚氧乙烯链，继续升温，胶束有序排列形成固态凝胶。而低于CMC(临界胶束浓度)和CMT(临界胶束温度)时泊洛沙姆嵌段共聚物又重新自溶形成溶液。

例如，泊洛沙姆407(Poloxamer407)也具有可逆的温敏特性。与其他几种泊洛沙姆相比，泊洛沙姆407形成凝胶的浓度较低，25℃时形成凝胶的浓度为20％(重量/体积)。Poloxamer407浓度越高，凝胶黏度越高。胶凝温度越低，黏附作用力越强，当给以足够低的温度和充分的平衡时间后，Poloxamer407的表观黏度是可以恢复的。由上述可见，Poloxamer407水溶液具有低温时呈液态，温度升高即转变为固态凝胶，温度降低时再次转为液态的可逆温敏特性。并且，经过临床试验证实其在体内不发生生化反应，可以经尿以原形形式代谢，对人体无毒副作用。但是该Poloxamer407水溶液是无色透明的，手术过程中不具备标记或指示的作用，无法实现手术的精准定位。

基于泊洛沙姆嵌段共聚物的上述特性，本发明人尝试将Poloxamer407作为一种可逆阻断剂用于外科手术，为使其兼具标记的性能进而实现在手术中精准定位和阻断的功能，尝试将吲哚菁绿加入Poloxamer407水溶液，然而Poloxamer407临界胶束温度的影响因素较多，如同系物效应、盐析和盐溶效应等，加入ICG后其临界胶束温度可能也会发生变化，因此有必要研究P407-ICG温敏凝胶水溶液的临界胶束温度、溶解特性、稳定性，结果见表1：

表1 Poloxamer407-吲哚菁绿温敏凝胶水溶液的特性

浓度/％(重量/体积)	临界胶束温度/℃
		16	29
18	25
		20	22

从表1可以看出，这种Poloxamer407-吲哚菁绿温敏凝胶水溶液在其中Poloxamer407的浓度为18％(重量/体积)时在室温条件下为绿色透明溶液，当周围温度达到25℃以上时，例如在动物和人体体温条件下，就可能转变成为固相凝胶态，而当温度低于动物和人体体温时，其又重新自溶变成溶液，其进入血循环后因浓度远低于再次发生胶凝所需的15％(重量/体积)，所以不会再形成固态凝胶。该含有吲哚菁绿的Poloxamer407水溶液无毒副作用，可以原型形式经尿排泄。利用该特性，可以将这种含有吲哚菁绿的Poloxamer407水溶液用于制成标记性阻断制剂，用于辅助外科手术的实施。

鉴于此，本发明第三方面提供了一种上述温敏凝胶水溶液在制备用于外科手术的标记性阻断制剂中的应用。

本发明中，所述外科手术包括精准肝段切除手术或亚肝段切除手术。

本发明中通过冷溶法配制温敏凝胶水溶液，其中吲哚菁绿可以与泊洛沙姆嵌段共聚物同时加入水中配制温敏凝胶水溶液，也可以在配制成泊洛沙姆嵌段共聚物水溶液后，再向其中加入吲哚菁绿并混合均匀配制成温敏凝胶水溶液。

将所配制的温敏凝胶水溶液或泊洛沙姆嵌段共聚物水溶液置于低温条件下冷藏后使用。所述低温条件为2～6℃，优选为4℃。所述冷藏的时间为5～10分钟，优选为5分钟。

在本发明的一个实施例中，当将上述标记性阻断制剂注入大鼠门静脉内(体温37℃)时，其立刻胶凝而变成固态实现术中标记及阻断，大约10分钟后，其在血管内即自发溶解，所形成的溶液进入血循环后因浓度远低于再次发生胶凝所需的浓度15％(重量/体积)，所以不会再形成固相凝胶。本品在体内不发生任何生化反应，具有良好的生物相容性，无毒副作用，最终以原型形式经尿排泄。同时因为自身为绿色，在手术中非常便于辨认，可以实现手术精准定位，大大提高了手术的安全性。

在本发明的又一具体实施例中，将上述标记性阻断制剂用于长白猪的肝段切除手术中：使用超声引导将上述标记性阻断制剂注入目标肝段的血管中，该上述标记性阻断制剂即刻由液态变为固态，阻断了血流，相应的肝段表面即可见到缺血边界，随即可以完成精准的肝段切除手术；在离断肝实质过程中，因为脉管内凝胶呈现绿色，有效引导医生断肝的方向，进一步提高了手术的安全性。

为方便使用，本发明第四方面提供了一种上述温敏凝胶组合物的试剂盒，其包括盒盖、盒体和设置于盒体内部的托垫，托垫表面设置有四个凹腔，其中，第一凹腔内装有含泊洛沙姆嵌段共聚物的第一试剂瓶，第二凹腔内装有含吲哚菁绿的第二试剂瓶，第三凹腔装有溶液配制装置，第四凹腔装有注射器。

根据本发明，所述第一试剂瓶中所含泊洛沙姆嵌段共聚物与第二试剂瓶中所含吲哚菁绿的质量比为640∶1～800∶1，优选为720∶1。

在本发明的一个实施例中，溶液配制装置为刻度瓶，其刻度容量以第一试剂瓶中所含泊洛沙姆嵌段共聚物的质量计为5～6.25ml/g，优选为5.56ml/g。

由本发明的泊洛沙姆嵌段共聚物与吲哚菁绿的凝胶组合物配制而成的泊洛沙姆嵌段共聚物与吲哚菁绿的温敏凝胶水溶液可以制成标记性阻断制剂用于外科手术中可以实现手术的标记性阻断和精准定位，大大提高了手术的安全性。

尤其是泊洛沙姆407-吲哚菁绿温敏凝胶水溶液，其在室温条件下为绿色透明溶液，当周围温度达到25℃以上时，就可以转变成为固相凝胶态，经过10分钟左右自发溶解，其进入血循环后因浓度远低于再次发生胶凝所需的15％(重量/体积)，不会再形成新的凝胶。以该温敏性凝胶组合物溶液制成的标记性阻断制剂具有温度敏感性、可逆和标记的特征无毒，特别是该标记性阻断制剂无毒副作用，可以原型形式经尿排泄。

将该标记性阻断制剂用于治疗肝细胞癌中的有巨大优势为：(1)符合肿瘤根治的原则：同时把肿瘤及首先发生的段内播散的微转移同时切除，减少术后复发；(2)减少术中出血：肝段边界中没有大的Glisson蒂三联解剖结构，离断肝实质通过相对无血管界面可减少术中出血；(3)降低术后并发症发生率：由于不会破坏大血管和胆管，因而大大避免了术后胆漏、残肝出现缺血或淤血进而导致肝功能不全等并发症的发生；(4)降低肝癌细胞术中经门脉逆流播散转移的风险。

将该标记性阻断制剂用于外科手术可以起到很好的阻断和标记作用。将其用于临床，可以在阻断的同时，使带切除部位易于术中辨认，实现手术的精准定位，同时可以大大减少出血量，并避免术中胆漏或病变细胞迁移。由此，可以帮助外科医生完成更为简单、更为安全的切除手术，提高了手术安全性。

将本发明组合物装载于一种特殊设计的试剂盒内，可以方便存储、运输本发明组合物，同时方便将本发明组合物配制成标记性阻断制剂用于外科手术，操作简便，成本低廉，使用安全方便。

附图说明

图1为实施例2中的手术时间示意图；图中附图标记：SH组144.2±10.2min；PH组98.3±12.9min；P<0.05。

图2为实施例2中与手术时间相对应的出血量示意图；图中附图标记：SH组83.3±14.0ml；PH组119.2±18.6ml；P<0.05。

图3为实施例2中两组肝功能(谷丙转氨酶,ALT)变化曲线图。

图4为实施例2中两组肝功能(谷草转氨酶,AST)变化曲线图。

图5为实施例2中两组肾功能(尿素氮,BUN)变化曲线图。

图6为实施例2中两组肾功能(血肌酐,Scr)变化曲线图。

图7为实施例2中两组血脂(甘油三脂,TG)变化曲线图。

图8为实施例2中两组血脂(总胆固醇,TC)变化曲线图。

图9为实施例2中长白猪术后总胆红素(Tbil)变化曲线图。

图10为实施例2中长白猪术后谷氨酰胺转肽酶(γ-GT)变化曲线图。

图11为本发明试剂盒示意图。

具体实施方式

下面将结合实施例来详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。本发明所用试剂或器具除特别说明外均为常规医用试剂或器具。

本发明的用于配制温敏凝胶水溶液的试剂盒，其包括盒盖1、盒体2和设置于盒体2内部的托垫3，托垫3表面设置有四个凹腔，其中，第一凹腔11内装有含泊洛沙姆嵌段共聚物的第一试剂瓶101，第二凹腔12内装有含吲哚菁绿的第二试剂瓶102、第三凹腔13装有溶液配制装置103，第四凹腔14装有注射器104。

在上述试剂盒中，所述第一试剂瓶101中所含泊洛沙姆嵌段共聚物与第二试剂瓶102中所含吲哚菁绿的质量比为640∶1～800∶1，优选为720∶1。

在上述试剂盒中，溶液配制装置103为细口刻度瓶，其刻度容量以第一试剂瓶101中所含泊洛沙姆嵌段共聚物的质量计为5～6.25ml/g，优选为5.56ml/g。

在一个优选实施方式中，第一试剂瓶101中含有泊洛沙姆嵌段共聚物18g；第二试剂瓶102中含有吲哚菁绿25mg；溶液配制装置103为细口刻度瓶，其刻度容量为100ml。

在另一个优选实施方式中，第一试剂瓶101中含有泊洛沙姆嵌段共聚物9g；第二试剂瓶102中含有吲哚菁绿12.5mg；溶液配制装置103为细口刻度瓶，其刻度容量为50ml。

采用上述试剂盒通过冷溶法配制温敏凝胶水溶液，其中吲哚菁绿可以与泊洛沙姆嵌段共聚物同时加入水中配制温敏凝胶水溶液，也可以在配制成泊洛沙姆嵌段共聚物水溶液后，再向其中加入吲哚菁绿并混合均匀配制成温敏凝胶水溶液。

实施例

实施例1:大鼠门静脉注射实验

1.试剂和仪器

试剂：泊洛沙姆407(P407，德国BASF公司)；吲哚菁绿(ICG，丹东医创药业有限责任公司)。

仪器：集热式恒温加热磁力搅拌器(北京医疗设备厂)；501型超级恒温水浴仪(北京医疗设备厂)；激光灌注成像仪(英国Moor设备有限公司)；动物外科手术器械(上海医疗器械厂)。

2.实验动物

健康雄性SD大鼠10只，体重240-260g，由军事医学科学院实验动物中心提供。自由进食水，12小时照明，适应一周后开始实验。

3.新型温敏凝胶的制备及胶凝温度的考察

(1)P407溶液采用冷法制备：分别称取16％(重量/体积)、18％(重量/体积)、20％(重量/体积)三个不同浓度溶液所需的P407，于磁力搅拌下分次加入装有蒸馏水的玻璃西林瓶中，4℃冰水浴搅拌使其分散均匀，按每100ml溶液25mg的比例加入ICG进行着色，然后置4℃冰箱冷藏过夜，使凝胶充分溶胀分散均匀得到深绿色的P407-ICG温敏凝胶水溶液。

(2)将适量P407-ICG温敏凝胶水溶液放入玻璃西林瓶中，将其放入冰浴中，瓶的橡胶塞中间打孔并插入精度为0.1℃的精密温度计，温度计的水银球完全没入凝胶溶液中。用磁力搅拌子搅拌凝胶溶液，使溶液内部温度均匀，同时缓慢升高水浴温度，升温速度约为1℃/min。同时，将玻璃西林瓶不断倾斜90°，以溶液不发生流动时的温度为胶凝温度。连续测定3次，取其平均值为胶凝温度。

4.阻断门静脉效果研究

(1)使动物充分适应环境，术前12小时禁食，不禁水。用乙醚吸入麻醉成功后，将大鼠仰卧位固定在木制操作台上，用碘伏消毒。取上腹正中切口入腹，切口长约1.5cm，以自制拉钩将切口腹壁向两侧拉开，用无菌棉签将胃肠拨向尾侧，充分显露肝门结构。

(2)将实验组9只SD大鼠随机分为3个亚组A、B、C，每个亚组3只动物。用1ml注射器抽取P407-ICG溶液，准确穿刺门静脉主干后向内推注0.5ml，A、B、C三个亚组注入的溶液浓度分别是16％、18％、20％，观察阻断时间。对照组1只大鼠采用血管夹将门静脉单独阻断。采用激光灌注成像仪监测所有大鼠阻断前后肝脏的灌注情况，用以观察各组的阻断效果。

(3)直视下观察门静脉主干，等待其再通并用使用激光灌注成像仪确认肝脏灌流恢复到阻断前水平后关腹。

(4)术后自由进食水，观察其远期生存率及并发症。

冷法制备得到16％、18％、20％浓度的P407-ICG溶液其胶凝温度分别为29、26和22℃，见表2。所有大鼠术后均长期存活，未见任何并发症；实验组A、B、C与对照组门静脉阻断后大鼠肝脏灌注均显著下降，激光灌注成像仪监测显示灌注值下降平均为144PU、148PU、145PU和131PU，见表2；实验组内部阻断时限研究结果：A亚组(16％凝胶溶液)阻断时间5min，B亚组(18％凝胶溶液)阻断时间12min，C亚组(20％凝胶溶液)阻断时间15min，见表2；超过阻断时间后三个亚组大鼠肝脏灌注情况均恢复到阻断前水平。

表2不同浓度P407-ICG溶液胶凝浓度及阻断大鼠门脉时限

可以看出，本实验采用冷溶法制备了16％、18％、20％三种不同浓度的P407-ICG温敏凝胶水溶液，结果显示其胶凝温度分别为29℃、26℃和22℃，将其注入大鼠门静脉内(36.5℃)都可以立刻形成稳定的绿色凝胶阻断入肝血流，使用激光灌注成像仪监测肝脏灌注水平发现，它们与传统的动脉夹阻断方法效果相同。在实验过程中，我们体会溶液浓度越高，推注的阻力越大，阻断的时间越长，但是浓度为20％的P407-ICG溶液胶凝温度为22℃，这给温敏型凝胶存储和使用都带来了一定的问题和困难，而16％的溶液虽然室温下可以保持液态(胶凝温度为29℃)，但是因其浓度接近临界胶凝浓度(15％)造成阻断时间过短的不足(仅有5min)，因此我们选择浓度为18％的P407-ICG溶液进行下一步的大动物实验，这样不但溶液在室温下可保持液态，便于储存和使用，同时也阻断了较为理想的时长，便于后续手术操作。本实验术后大鼠均长期存活，未见任何并发症等异常，该结果与其他文献报道一致，证明了P407-ICG温敏凝胶水溶液经门静脉注射的安全性。

实施例2：长白猪的肝段切除实验

1.试剂和仪器

常规腹部手术器械(中国上海)；SERIE 7200呼吸机(美国)；监护仪(美国)；SIMENZ超声机(美国)；超声探头L5-12(美国)；穿刺针(美国)；光学显微镜(日本)；血生化自动分析仪(德国)；TS-12F生物组织自动脱水机(中国湖北)；CS-Ⅳ型摊片烤片机(中国湖北)LEICA RM2016石蜡切片机(中国上海)LEICA EG1120组织包埋机(中国上海)；KD-BL包埋机冷冻台(中国浙江)

2.实验动物

健康雄性长白猪18只，体重35～40Kg，由解放军总医院实验动物中心提供并在昼夜节律、室温自动控制条件下单笼饲养。精制标准猪饲料定时(9:00和16:00)喂食，自由饮水，适应环境一周后开始实验，术前一天禁食不禁水，所有手术均在解放军总医院标准动物手术室完成。

3.可行性及有效性研究

3.1动物分组

将12头长白猪随机分为两组，每组6头：肝段切除组(segmental hepatectomy,SH组)和肝部分切除组(partial hepatectomy,PH组)

3.2动物模型建立

(1)实验动物麻醉：肌注10mg/kg盐酸氯胺酮给予诱导麻醉，耳缘静脉建立通路后予以0.5ml/kg1％戊巴比妥钠，气管插管成功后连接呼吸机。调节呼吸机潮气量10ml/kg，呼吸频率16次/分，FIO2:0.4，呼气末正压保持在4cmH₂O。通过套夹猪舌用监测仪监测血氧及心率，保持血氧在95％以上，心率60～100次/分。术中通过耳缘静脉建立的通路给予生理盐水和葡萄糖注射液补充液体丢失并于术前及手术结束后分别给予320万u青霉素静脉输注。

(2)SH组动物手术过程

根据猪肝的肝段解剖特征，我们对每头试验动物均进行肝Ⅲ(左外叶下段)、Ⅳb(左内业下段)段切除。具体步骤如下：

(ⅰ)动物采用仰卧位，右肋缘下J形切口逐层切开止血入腹，结扎切断肝圆韧带；

(ⅱ)术中超声探头于肝脏膈面扫查全肝，辨认出Ⅲ段的门静脉分支(ⅲ)选择超声图像中沿着门静脉分支长轴的面，超声引导下采用16G的穿刺针进入门静脉，拔除针芯，回抽见血证实确在门静脉内后，用螺纹注射器经穿刺针推注5mlP407-ICG溶液。

(ⅳ)观察肝脏膈面及脏面颜色变化，根据缺血线边界用电刀进行标记。

(ⅴ)沿着电刀标记线钳夹法离断肝实质，较大静脉予以可靠结扎后离断。肝蒂近端缝扎，远端离断后可见残留凝胶流出，继续离断肝实质直至完整切除目标肝段。

(ⅵ)同样的方法，运用术中超声辨认Ⅳb段门静脉分支后予以精准穿刺，推注5mlP407-ICG溶液，根据缺血边界予以完整切除目标肝段。

(ⅶ)温热生理盐水1000ml冲洗腹腔，观察剩余肝脏特别是切缘周围未见任何缺血或淤血改变，确认腹腔内无活动性出血后分层关腹。

(3)pH组动物手术过程

(ⅱ)由于无法获知目标肝段的边界，采用电刀于大概位置处标记规则的几何图形。

(ⅲ)沿着电刀标记线采用钳夹法离断肝实质，较大管道予以结扎后离断，创面仔细止血，完成部分肝切除手术。

(ⅳ)温热生理盐水1000ml冲洗腹腔，确认腹腔内无活动性出血后分层关腹。

3.3术后动物的处理

所有动物术后待清醒后送回，单笼饲养，自由进食水，严密观察其一般情况及并发症。并于术前、术后即刻、术后3天、术后7天四个时间点抽血进行血常规及肝功能、肾功能、血脂检查。术后7天再次开腹，观察其肝脏特别是肝断面情况，查明是否有缺血、淤血或者胆漏等并发症。静脉推注氯化钾处死动物后，彻底查探腹腔、胸腔，留取心、肺、肾、肝行大病理切片检查后福尔马林固定，行HE染色病理学检查。

4.安全性研究

众多文献已经表明P407有良好的生物相容性，且国外已将其应用于心血管外科领域，而ICG也是临床上广泛应用的显色剂。但本实验依然选用了6头长白猪将18％的P407-ICG溶液分别注入肝实质、肝静脉和胆道，对其进行了安全性研究。手术操作过程如下：

(1)动物采用仰卧位，右肋缘下J形切口逐层切开止血入腹，结扎切断肝圆韧带；

(2)逆行法切除胆囊，通过胆囊管残端向胆总管内推注3mlP407-ICG溶液，超声确认胆道完全阻断。

(3)超声引导下分别向左外叶和左内叶肝实质内推注5ml溶液。

(4)超声引导下分别向左内叶及左外叶回流静脉推注5ml溶液，全程使用超声探头监测肝静脉内凝胶溶解情况，记录溶解时间T(v)。

(5)检查腹腔无异常后分层关腹，术毕清醒后送回，单笼饲养，自由进食水，严密观察。

(6)术后第3天随机选取3头再次开腹，探查腹腔情况。

(7)横断胆总管，向胆管近端逆行注入3mlP407-ICG溶液，可见即刻发生胶凝现象造成胆道堵塞，以直视下胆汁复流为标准记录胆道再通的时间T(b)。

(8)切取左外叶、左内叶待术后行病理检查，观察初次手术时肝实质内P407-ICG残留情况。

(9)静脉推注氯化钾处死动物，留取胆总管、心、肺、肾行病理检查。

(10)术后第7天将剩余的3头长白猪行第二次手术，操作与术后第3天相同。

选取术前、术后即刻、术后3天、术后7天四个时间点抽血行血常规及肝功能、肾功能、血脂检查，所有标本均在大病理切片观察后福尔马林浸泡，便于日后行HE染色病理学检查。

5.标本处理

所有血液标本(3ml静脉血)抽取后立刻送我院生化检验科采用全自动生化分析仪(德国Cobas-Mira Plus,Roche)监测丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、血清白蛋白(ALB)、总胆红素(Tbil)、直接胆红素(Dbil)、γ-谷氨酰基转移酶(γ-GT)、碱性磷酸酶(ALP)、血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)，同时也送临床检验科(2ml静脉血)行血常规检查红细胞(RBC)、白细胞(WBC)、中性粒细胞(NPC)、嗜酸性粒细胞(EPC)、嗜碱性粒细胞(BPC)、血小板(PLT)、血红蛋白(Hb)。

所有器官组织均使用10％福尔马林浸泡固定。其中肝段组织块均垂直于其肝蒂血管长轴方向进行连续切片取材，每块组织厚度为0.5cm，将标本用石蜡包埋，蜡块切成4μm厚蜡片，放入49℃温水中展开，捞片，烘干，放入75℃烘箱中除蜡30min左右，然后依次放入二甲苯(1)5min→二甲苯(2)5min→无水酒精2min→95％酒精2min→85％酒精2min脱蜡置水。Harrsi苏木素染色5min左右→自来水冲洗→75％盐酸酒精分化10秒→自来水冲洗→温水反蓝5min→自来水冲洗→95％酒精1min→酸化伊红酒精染液2min→自来水冲洗→95％酒精(1)1min→95％酒精(2)1min→无水酒精1min二甲苯(1)1min→二甲苯(2)1min→中性树胶封片。光镜下观察组织情况。

6.统计方法

实验数据以均数土标准差(M土SD)表示。采用SPSS13.0统计软件作t检验，以P<0.05为差异性显著。

7.结果分析

(1)可行性及有效性

所有动物都按照计划完成了手术，术中无意外死亡发生。术后第一天即可站立行走并进食水，第二天后活动自如，反应灵敏。其中SH组手术时间(从游离肝脏开始到断面止血结束)较PH组长(144.2±10.2min，98.3±12.9min；P<0.05)，见图1；但是出血量(按如下方法测定：出血量＝纱布湿重+引流量-纱布干重-冲洗生理盐水)较PH组少(83.3±14.0ml，119.2±18.6ml；P<0.05)，见图2；同时二次开腹时探查发现SH组未见胆漏(0/6)，而PH组可见2头猪肝断面存在胆漏(2/6)。两组动物术后肝功能在第3天基本都恢复正常，术后所有动物肾功能、血脂均未见异常，组别之间无差异，其中术后肝功能见图3和图4，术后所有动物肾功能见图5和图6，术后血脂见图7和图8。

(2)安全性结果

术中超声全程检测发现注入肝静脉的P407-ICG溶液即刻发生胶凝现象，15-20min之内完全溶解；注入胆道的3ml溶液15min后完全溶解胆道再通，术后第3天所有动物的肝功能基本恢复正常，未见胆红素升高等异常，见图9和图10；注入肝实质的凝胶术后第3天2次手术时病理检查已经完全吸收，胆道、肝实质、肾脏、心脏、肺术后第3天、7天时病理检查均未见异常。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种含有温敏凝胶组合物的温敏凝胶水溶液，所述温敏凝胶组合物包括泊洛沙姆嵌段共聚物和吲哚菁绿，其中，泊洛沙姆嵌段共聚物的含量为18％(重量/体积)；泊洛沙姆嵌段共聚物与吲哚菁绿的质量比为640∶1～800∶1。

2.根据权利要求1所述的温敏凝胶水溶液，其特征在于，泊洛沙姆嵌段共聚物与吲哚菁绿的质量比为720∶1。

3.根据权利要求1或2所述的温敏凝胶水溶液，其特征在于，所述泊洛沙姆嵌段共聚物为聚氧乙烯-聚丙乙烯-聚氧乙烯三嵌段共聚物，其中聚氧乙烯与聚丙乙烯的摩尔比为7∶3。

4.一种权利要求1-3中任意一项所述的温敏凝胶水溶液在制备用于外科手术的标记性阻断制剂中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述外科手术包括精准肝段切除手术或亚肝段切除手术。

6.一种用于配制权利要求1-3中任意一项所述的温敏凝胶水溶液的试剂盒，其包括盒盖(1)、盒体(2)和设置于盒体(2)内部的托垫(3)，托垫(3)表面设置有四个凹腔，其中，第一凹腔(11)内装有含泊洛沙姆嵌段共聚物的第一试剂瓶(101)，第二凹腔(12)内装有含吲哚菁绿的第二试剂瓶(102)、第三凹腔(13)装有溶液配制装置(103)，第四凹腔(14)装有注射器(104)。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，溶液配制装置(103)为刻度瓶，其刻度容量以第一试剂瓶(101)中所含泊洛沙姆嵌段共聚物的质量计为为5.56ml/g。

8.根据权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于，所述第一试剂瓶(101)中所含泊洛沙姆嵌段共聚物与第二试剂瓶(102)中所含吲哚菁绿的质量比为640∶1～800∶1。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述第一试剂瓶(101)中所含泊洛沙姆嵌段共聚物与第二试剂瓶(102)中所含吲哚菁绿的质量比为720∶1。