CH694905A5

CH694905A5 - Peptidi derivati dalla proteina HMGB1 per l'immunoterapia attiva nell'infiammazione sistematica letale.

Info

Publication number: CH694905A5
Application number: CH00514/03A
Authority: CH
Inventors: Roberto Ringhini
Original assignee: Marco Ostini
Priority date: 2003-03-25
Filing date: 2003-03-25
Publication date: 2005-09-15

Description

La presente invenzione riguarda il campo dell'immunologia clinica e in particolare quello della profilassi e terapia nelle malattie degenerative associate ad abnorme espressione di citochine pro-infiammatorie.

In particolare l'invenzione descrive la formulazione di un prodotto che può essere impiegato nella profilassi attiva di malattie associate ad un rilascio incontrollato della citochina TNF-a, come ad esempio la sepsi, lo shock tossico e lo shock emorragico.

La sepsi, o setticemia, è una sindrome sistemica che si sviluppa in seguito ad amplificazione e de-regolazione della corretta risposta immunologia ad una massiccia infezione batterica. La patologia si manifesta inizialmente con stato febbrile, confusione mentale, ipotensione momentanea, diminuzione della capacità urinaria e trombocitopenia, ed evolve spesso ad uno stadio clinico (sepsi grave) caratterizzato da ipotensione farmacologicamente non controllabile, alterazione della coagulazione e disfunzioni d'organo, principalmente a carico di rene e polmone.

Un recente studio epidemiologico ha calcolato per la sepsi una incidenza negli Stati Uniti di 3 casi ogni 1000 abitanti, equivalente a circa 750.000 casi annui, per i quali si riscontra un indice di mortalità del 29%, corrispondente a 215 000 decessi, che aumenta fino al 50% in presenza di shock settico (Angus D.C. et al., 2001, Crit. Care Med., 29:1303-1310). -Occorre sottolineare che questo inaccettabile tasso di mortalità è riferito a soggetti che hanno comunque accesso alle unità di terapia intensiva degli ospedali e sono sottoposti ad adeguato trattamento antibiotico, in assenza dei quali il valore dell'indice può superare la soglia del 90%.

Infezioni batteriche massicce possono essere contratte nelle strutture ospedaliere durante talune pratiche terapeutiche o in seguito ad esposizione involontaria nelle aree con intensa contaminazione microbica, ad esempio quelle coinvolte in conflitti di tipo batteriologico.

L'impiego di un modello sperimentale basato sulla somministrazione di lipopolisaccaridi (LPS), endotossine prodotte dai batteri gram-negativi, ha evidenziato che il meccanismo patogeno della sepsi, e delle malattie ad essa correlate, prevede l'attivazione incontrollata della cascata citochinica proinfiammatoria con rilascio elevato di TNF- alpha , IL-1 e altri fattori secreti dai monociti attivati, che sono considerati mediatori precoci dell'endotossemia acuta (Dinarello C.A., 1997, Chest, 112:321S-329S). In condizioni fisiologiche il sistema immunitario dell'ospite reagisce all'aggressione batterica con una risposta infiammatoria adeguata al suo contenimento, cui fa seguito una risposta anti-infiammatoria in grado di limitarne e modularne l'attività.

Nella sepsi, un'attivazione massiccia dei fagociti determina il rilascio incontrollato delle citochine infiammatorie nel torrente circolatorio, seguito dall'attivazione delle cellule endoteliali che, a loro volta, amplificano lo stato infiammatorio mediando l'adesione di neutrofili circolanti all'endotelio con conseguente danno ossidativo e perdita dell'integrità vascolare. L'alterazione della rete capillare in organi come il polmone e il rene, la formazione di un edema e la depressione delle funzioni miocardiche sono considerate le cause principali di decesso nella fase terminale dello shock settico (Cohen J., 2002, Nature, 420:885-891).

Il trattamento terapeutico della sepsi basato sulla inibizione dei fattori rilasciati precocemente, come TNF- alpha e IL-1, ha ottenuto un limitato successo in quanto sono presenti altri fattori a rilascio ritardato, in particolare la molecola HMGB1, che possono sostenere la patogenesi della malattia e favorirne l'evoluzione letale (Yang H. et al., 2001, Shock, 15:247-253).

La molecola HMGB1, altrimenti conosciuta come HMG-1 (Bustin M., 2001, Trends Biochem. Sci., 26:152-153) o Anfoterina (Parkkinen J. et. al., 1993, J. Biol. Chem., 107:19726-19738), è una proteina umana di 215 amino acidi, ha peso molecolare di circa 25 kDa e risulta altamente conservata nei mammiferi. Inserita nella superfamiglia denominata "HMG-box", ha una struttura organizzata in tre domini, due in grado di legare il DNA che sono indicati come HMG box-A e HMG box-B, e un terzo situato nella regione C-terminale che è formato da 30 residui di acido aspartico e glutammico. I domini che legano il DNA comprendono circa 80 amino acidi, dei quali 29% identici e 65% simili, e sono assemblati in tre strutture ad alpha -elica disposte a forma di L (Read et al., 1993, Nucleic Acids Res., 21:3427-3436).

La molecola HMGB1 è classificata come nucleoproteina cromosomica non istonica, risulta stabile in ambiente acido (acido perclorico 5%) e può essere separata dalla cromatina mediante estrazione salina con cloruro sodico 0,35 M. Presente in modo abbondante ed ubiquitario nel compartimento nucleare (approssimativamente 10<6> molecole per singolo nucleo), si lega al DNA con specificità strutturale, non sequenziale, e determina un ripiegamento caratteristico dell'elica che facilita la formazione di complessi nucleoproteici in grado di stabilizzarne la struttura e legare specifici fattori di trascrizione.

La proteina è stata inizialmente chiamata Anfoterina per la distribuzione dipolare delle cariche elettriche sulla sua superficie e rilevata nelle cellule cerebrali, non solo in sede nucleare e citoplasmatica ma anche nello spazio extracellulare dove partecipa ai processi di allungamento dei neuriti (Parkkinen J. et al., 1993, J. Biol. Chem., 268:19726-19738). L'interazione tra HMGB1 e sistema di attivazione del plasminogeno, in particolare la molecola tPA (tissue-type plasminogen activator), comporta a livello extracellulare un aumento della formazione di plasmina che determina in situ una degradazione proteica capace di permettere e/o favorire l'avanzamento della cellula (Parkinnen J., 1991, J. Biol. Chem., 266:16730-16735).

La molecola HMGB1 è stata anche localizzata sulla membrana plasmatica nelle cellule dell'eritroleucemia murina da cui viene rilasciata durante i processi di differenziazione (Passalacqua M. et al., 1997, FEBS Lett., 400:275-279).

Questa molecola è anche un legante del recettore multifunzionale dei prodotti finali di glicosilazione avanzata (RAGE, receptor of advanced glycosylation end-products) che viene espresso da molteplici tipi di cellule, tra cui quelle endoteliali, della muscolatura liscia, i fagociti mononucleati e i neuroni, e che risulta implicato in numerosi processi sia patologici, come diabete e aterosclerosi, che fisiologici, come infiammazione ed allungamento dei neuriti durante lo sviluppo embrionale (Hutten et al., 1999, J. Biol. Chem., 274:19919-19924).

L'inibizione del legame HMG1/RAGE blocca la crescita della massa tumorale e la formazione di metastasi poiché non consente l'attivazione degli enzimi MAP- chinasi e MMP che sono stati associati alla proliferazione dei tumori e alla loro invasione (Taguchi A. et al., 2000, Nature, 405:354-360).

Il recettore RAGE è anche localizzato nella tunica media dei grandi vasi a livello delle cellule della muscolatura liscia (SMC) e assume particolare rilievo nei processi infiammatori in quanto consente la trans-migrazione nella tunica intima delle cellule danneggiate che hanno fenotipo modificato. L'inibizione del legame tra HMGB1 e RAGE permette di evitare, ritardare o bloccare questa migrazione che svolge un ruolo fondamentale nella fisiopatologia dell'aterosclerosi e della re-stenosi dopo angioplastica coronaria (Brevetto WO 02/074337).

Infine, la molecola HMGB1 viene secreta da macrofagi e cellule pituitariche, sia murine che umane, in seguito a stimolazione con endotossine batteriche (Wang H. et al., 1999, Science, 285:248-251). Descrizione dell'invenzione

La presente invenzione descrive la composizione di un prodotto farmaceutico che può essere usato nell'immunoterapia e nell'immunoprofilassi delle patologie associate ad un rilascio incontrollato di citochine pro-infiammatorie, quando questo rilascio viene promosso e mantenuto dalla presenza della proteina HMGB1. Un esempio non limitativo per l'invenzione di queste patologie è rappresentato dalla sepsi, dallo shock tossico, dallo shock emorragico e dalle malattie ad esse correlate.

In particolare il prodotto dell'invenzione contiene una quantità sufficiente di peptidi derivati dalla molecola HMGB1 in grado di determinare, dopo somministrazione, il rilascio nel soggetto trattato di anticorpi endogeni capaci di neutralizzare l'attività biologica delle molecole HMGB1 circolanti mediante inibizione della loro interazione con i recettori affini.

La presente descrizione comprende anche un metodo specifico per calcolare un indice di efficacia del trattamento profilattico che stabilisca il livello di protezione raggiunto dal soggetto in caso di esposizione a contaminazione batterica.

Il termine "molecola HMGB1" o "proteina HMGB1" è riferito ad una proteina che abbia una identità di sequenza di almeno 70%, preferibilmente maggiore di 80%, e più preferibilmente maggiore di 90% con la proteina indicata nel data-base NCBI-Entrez con numero di accesso P09429 (GI: 123369).

Il termine "peptide" è qui usato nel suo significato convenzionale, ovvero come sequenza di amino acidi che rappresenta una parte della proteina nativa, non limitata dal numero dei residui che la compongono o dalla presenza di modificazioni di tipo post-trascrizionale, come la glicosilazione, l'acetilazione, la fosforilazione e altre modificazioni conosciute allo stato dell'arte che possono essere prodotte per via naturale o artificiale. In particolare, i peptidi che interessano la presente invenzione sono sequenze di amino-acidi che contengono da 10 a 40 residui, preferibilmente da 10 a 30 residui, più preferibilmente da 10 a 20 residui, e che formano epitopi, ovvero determinanti antigenici responsabili delle proprietà immunologiche del peptide stesso, tali da rappresentare una porzione immunogenica della proteina HMGB1 da cui derivano.

Il termine "porzione immunogenica" identifica un frammento della molecola nativa immunologicamente reattivo, cioè capace di indurre nell'ospite una attività neutralizzante nei confronti del frammento somministrato, e per estensione della molecola da cui tale frammento deriva. Il livello di immunogenicità della porzione selezionata non deve risultare inferiore al 50%, preferibilmente al 70%, e più preferibilmente al 90% rispetto a quello mostrato dalla molecola nativa da cui deriva, sebbene in alcuni casi possa risultare uguale o superiore a quello espresso dalla molecola stessa.

Il termine "variante del peptide" indica un peptide che tipicamente differisce dal peptide descritto per una o più delezioni, sostituzioni o inserzioni di amino acidi. Varianti dei peptidi comprese nella presente invenzione sono quelle che tipicamente mostrano all'interno della loro lunghezza una identità di sequenza del 70%, preferibilmente del 80%, e più preferibilmente del 90% con i peptidi derivati dalla molecola nativa. Le sostituzioni prese in considerazione sono quelle definite "conservative", ovvero ottenute con lo scambio tra amino acidi che hanno proprietà simili, per cui sulla base delle attuali conoscenze della chimica dei peptidi, la struttura secondaria e l'idropaticità del peptide rimangono sostanzialmente immutate dopo la sostituzione.

Il modello animale di shock endotossico basato sulla somministrazione di lipopolisaccaride (LPS) è considerato un modello sperimentale adeguato per lo studio fisiopatologico della sepsi in quanto riproduce nell'animale i sintomi, il quadro ematico e l'evoluzione finale della patologia umana. In questo modello la somministrazione intraperitoneale di una dose di 25 mg LPS/kg in un topo Balb/C maschio di 20-25 gr. induce uno stato di letargia, erezione pilifera e diarrea seguito da decesso nelle 48 ore successive al trattamento. L'analisi ematica evidenzia nel topo un aumento del livello serico della citochina TNF-a che assume valori di concentrazione massimi 90 minuti dopo il trattamento per poi decrescere a livelli non significativi nelle 10 ore seguenti (Van der Poli T. et al., 1999, Infect. Dis. Clin. North Am. 13:413-426).

Differente risulta invece in questo modello la modulazione della proteina HMGB1 che compare nel siero 8 ore dopo la somministrazione dell'endotossina ed aumenta la sua concentrazione sono a raggiungere un plateau tra 16 e 32 ore dall'evento scatenante (Wang H. et al., 2001, Am. J. Crit. Care Med. 164:1768-1773).

Nel modello cellulare in vitro basato sulla linea macrofagica murina RAW 264.7 (ATCC, Cat.N. TIB-71) l'aggiunta di LPS al terreno di coltura (100 ng/mL) determina il rilascio e l'accumulo nel medium della proteina HMGB1 dopo 8 ore dal trattamento con endotossina batterica, attività simile a quella ottenuta utilizzando la citochina TNF-a come agente stimolante in sostituzione di LPS (Wang H. et al., 1999, Science 285:248-251).

La molecola HMGB1 ottenuta per via endogena nello shock endotossico è in grado di modulare il rilascio della citochina TNF- alpha in maniera dose-dipendente da parte delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sia in vitro che in vivo, effetto che non può essere ottenuto impiegando i peptidi derivati dalla sua frammentazione al posto della molecola intera (Anderson U. et al., J. Exp. Med. 192:565-570). Sebbene non sia completamente conosciuto il meccanismo dell'interazione tra HMGB1 e cellule mononucleate, esistono evidenze sperimentali che suggeriscono il coinvolgimento del recettore RAGE nell'attivazione cellulare che determina il rilascio di TNF- alpha (Schmidt A.N. et al., J. Clin. Invest. 108:949-955).

Sulla base delle considerazioni esposte è possibile ipotizzare che l'evoluzione letale dello shock endotossico sia in parte dovuta alla presenza in circolo di una quantità eccessiva di TNF- alpha sostenuta dalla presenza di HMGB1 che agisce come fattore stimolante la produzione cellulare della citochina, la quale a sua volta promuove il rilascio del fattore stesso. Questa ipotesi trova riscontro nella presenza di livelli ematici elevati di HMGB1 nei pazienti con sepsi, con valori direttamente proporzionali alla severità della patologia, e nella impossibilità di rilevare questa stessa molecola nel siero di soggetti normali (Wang H. et al., 1999, Science 285:248-251).

E noto allo stato dell'arte che in presenza di anticorpi anti-HMGB1 l'attività biologica della proteina HMGB1 viene neutralizzata in quanto si inibisce la sua interazione con il recettore RAGE, condizione necessaria per l'attivazione del meccanismo citochinico che sostiene il processo flogistico. I dati sperimentali dimostrano che nella sepsi è possibile ridurre e/o eliminare l'evoluzione clinica avversa mediante somministrazione di anticorpi esogeni anti-HMGB1 (immuno-terapia passiva) mentre il trattamento diretto con HMGB1 aumenta la letalità di questa patologia (Van der Poll T., 2001, Lancet Infectious Dis- eases 1:165-174).

E altresì noto allo stato dell'arte che la somministrazione sottocutanea di HMGB1 induce nell'uomo la formazione di anticorpi specifici circolanti con attività citotossica nei confronti delle cellule tumorali, come rivendicato nel brevetto EP 1 079 849.

Queste informazioni depongono a favore della possibilità di ridurre e/o annullare l'effetto letale presente nella fase terminale della sepsi, e delle malattie ad essa correlate, mediante somministrazione di una o più dosi di proteina HMGB1 secondo un protocollo capace di indurre nel soggetto ricevente la formazione di anticorpi circolanti che possono neutralizzare l'effetto del rilascio ritardato di questa proteina nelle sindromi considerate.

La presente invenzione suggerisce l'impiego dei peptidi associati alle porzioni immunogeniche della molecola HMGB1 in sostituzione della molecola stessa, seppure utilizzata in quantità limitata, al fine di evitare durante il trattamento un effetto collaterale negativo dovuto all'impiego della molecola intera, o della sua espressione ricombinante, costituito da un maggiore rilascio della citochina TNF- alpha nel torrente circolatorio.

Un altro aspetto per l'utilizzazione del prodotto è la necessità di individuare i peptidi della molecola HMGB1 capaci di produrre anticorpi circolanti che interagiscano con la molecola nativa. La selezione dei peptidi utili è stata effettuata mediante analisi dei profili di antigenicità e idropaticità della sequenza aminoacidica molecolare generati dal software ANTHEPROT 2000 v5.2 (Institut de Biologie et Chimie des Protéines UMR 5086 CNRS-UCBL, Lyon, France) e dal database pubblico ExPASy - ProtScale (Swiss Institute of Bioinformatics, Basel University, Basel, Switzerland). I risultati ottenuti hanno permesso di identificare alcuni peptidi che con elevata probabilità possiedono i requisiti utili per essere impiegati come induttori della risposta immunitaria e le loro sequenze amino-acidiche sono riportate in Appendice.

Queste sequenze identificano solo alcuni dei possibili peptidi immunogenici della molecola HMGB1 che possono essere impiegati nella presente invenzione e questo elenco è proposto a titolo di esempio e non limita il numero complessivo dei peptidi utilizzabili, né la quantità o la tipologia dei residui amino-acidici che potrebbero contenere. Ai fini dell'invenzione possono inoltre essere impiegati i peptidi ottenuti da sequenze considerate varianti di quelle presenti nella molecola nativa.

La presente invenzione riguarda la composizione del prodotto da somministrare che prevede l'associazione della sostanza immunogenica con una sostanza immunostimolante in grado di potenziare la risposta immune (sessile o circolante) indotta dalla sostanza immunogenica stessa (Powell M.F., Newman M.J., 1995. "Vaccine Design. The subunit and adjuvant approach." Plenum Press Ed., New York).

La sostanza immunogena è rappresentata da una formulazione accettabile dei peptidi della molecola HMGB1 in forma naturale o variante, presenti in singolo o in associazione, al limite dall'intera molecola ottenuta con tecniche ricombinanti (HMGB1r). Per formulazione accettabile si intende l'impiego della sostanza in una forma che sulla base delle attuali conoscenze farmaceutiche sia idonea per l'inserimento in prodotti che possono essere iniettati, inalati o ingeriti da una specie animale, preferibilmente dalla specie umana.

La sostanza immunostimolante impiegata in questa invenzione è classificabile nella categoria degli adiuvanti, in cui rientrano sia le sostanze che proteggono l'antigene da un rapido catabolismo, come l'idrossido di alluminio o l'olio minerale, sia quelle che stimolano la risposta immune in modo generico, come il lipide A o le proteine derivate dal microrganismo Bortadella Pertussis. Essa può essere scelta nell'ambito degli adiuvanti commerciali che hanno impiego farmaceutico, tra i quali si ricordano, senza intenti limitativi per la formulazione del prodotto di questa invenzione, sostanze come ISA-51 e ISA-720 (Seppie, Francia), SAF e MF-59 (Chiron, USA), SBAS-2 e SBAS-4 (Smith Kline Beecham, Belgio), Detox e RC-529 (Corica, USA). Limpiego dell'adiuvante ImmunEasy (Quiagen, Svizzera) è invece limitato ai soli modelli sperimentali murini.

Il prodotto farmaceutico oggetto di questa invenzione può inoltre contenere tamponi fisiologici, carboidrati, mannitolo, proteine stabilizzanti, antiossidanti, batteriostatici, agenti chelanti o altre sostanze contemplate nelle Farmacopee Internazionali che sono generalmente utilizzate nella preparazione di farmaci o vaccini per animali a sangue caldo, preferibilmente ad uso umano.

Nella presente invenzione la quantità di sostanza immunogenica inserita nella composizione farmaceutica deve essere in grado di produrre un beneficio clinico al soggetto ricevente, ossia determinare un rilascio di anticorpi circolanti sufficiente a neutralizzare l'attività biologico/recettoriale della molecola HMGB1. La definizione della dose dipende dalla specie animale trattata, essendo per la specie umana accettabile una dose di immunogeno solitamente compresa tra 5 mu g e 2 mg per chilo di peso corporeo, preferibilmente tra 20 mu g e 500 mu g per chilo, e ancor più preferibilmente tra 50 mu g e 100 mu g per chilo, mentre nel topo sono utilizze dosi comprese tra 50 mu g e 8 mg per chilo di peso corporeo, preferibilmente tra 100 mu g e 4 mg per chilo, e ancor più preferibilmente tra 400 mu g e 1 mg per chilo.

Il volume finale di una dose somministrata per via intramuscolare è solitamente compreso tra 50 mu l e 1 mL, preferibilmente tra 100 mu l e 0,5 mL, ma volumi differenti potrebbero essere richiesti dalle altre vie di somministrazione.

Una valutazione di efficacia del trattamento di immunoprofilassi attiva associato all'uso del prodotto descritto può essere effettuata mediante determinazione del livello di citochina pro-infiammatoria rilascia dalle cellule competenti dopo stimolazione con HMGB1 in presenza del siero del soggetto trattato, confronto con il livello misurato in assenza di siero e calcolo di un indice parametrico che definisca la validità del trattamento. Il razionale del metodo proposto si basa sulla capacità degli anticorpi prodotti di inibire l'interazione tra la molecola HMGB1 ed il recettore RAGE presente sulla superficie delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) e sulla conseguente possibilità di evidenziare l'evento inibitorio mediante una misura quantitativa del rilascio di citochine pro-infiammatorie promosso dalla stimolazione recettoriale.

La separazione delle cellule PBMC dal sangue fresco di un donatore umano viene effettuata mediante tecniche di centrifugazione comunemente note allo stato dell'arte, come quella descritta in Esempio 2. Dopo separazione una quantità costante di cellule, preferibilmente 5 x 10<5> cellule, viene incubata con 55 ng di HMGB1r e con un volume fisso, preferibilmente 100 mu L, di siero scomplementato (riscaldamento a 56 DEG C per 30 minuti) ottenuto da un soggetto trattato con il prodotto oggetto di questa invenzione. La presenza nel siero di anticorpi anti-HMGB1 impedisce alla molecola ricombinante esogena di interagire con i recettori RAGE presenti sulle cellule mononucleate ed inibisce il rilascio della citochina TNF- alpha nel mezzo extracellulare.

L'efficacia del modello descritto è verificata impiegando un siero iper-immune non specifico, che consente il massimo rilascio di TNF- alpha (Controllo Positivo), o evitando l'aggiunta di HMGB1r al sistema in modo da impedire il rilascio della citochina (Controllo Negativo). La fase successiva del protocollo analitico comporta la determinazione quantitativa della citochina presente nel mezzo di crescita cellulare mediante un metodo immunometrico commerciale. Esso prevede la rimozione di una frazione delle molecole TNF- alpha presenti nel terreno di coltura mediante interazione con anticorpi specifici adsorbiti ad una fase solida e la rivelazione delle molecole rimosse attraverso la reazione con un altro anticorpo specifico coniugato ad un opportuno tracciante.

La misura analitica quantitativa è ottenuta per confronto dosando nelle stesse condizioni un campione con contenuto noto di citochina. Un esempio, non limitante, di dosaggio immunometrico commerciale adatto per lo scopo sopra indicato è rappresentato dal kit human TNF- alpha Immunoassay Quantikine prodotto da R&D SYSTEM (Cat.N. DTA50).

La quantità massima di TNF- alpha rilasciata nel terreno di coltura è misurabile nel campione ottenuto in seguito all'aggiunta del siero iper-immune aspecifico, etichettato come Controllo Positivo (CP), mentre i campioni analitici (CA) in cui sono presenti quantità variabili e crescenti di anticorpo anti-HMGB1 esprimono concentrazioni decrescenti della citochina. Il rapporto tra la concentrazione di TNF- alpha presente nel campione in analisi (CA) e quella riferita al controllo positivo (CP) definisce un parametro numerico continuo (rapporto CA/CP) con intervallo di esistenza compreso tra 0 e 1. La classificazione di questo parametro mediante una scala a punteggio permette di assegnare al campione analitico un indice che definisce la sua capacità neutralizzante.

I valori di questo indice sono stabiliti sulla base del seguente criterio: un rapporto CA/CP maggiore o uguale a 0,9 corrisponde all'indice 0; un rapporto CA/CP maggiore o uguale a 0,75 e minore di 0,9 corrisponde all'indice +1; un rapporto CA/CP maggiore o uguale a 0,5 e minore di 0,75 corrisponde all'indice +2; un rapporto CA/CP maggiore o uguale a 0,25 e minore di 0,5 corrisponde all'indice +3; un rapporto CA/CP inferiore a 0,25 corrisponde all'indice +4.

L'efficacia del trattamento di immunoprofilassi, intesa come capacità indotta di contrastare l'evoluzione fatale della sepsi e delle malattie ad essa correlate, viene stabilita in base all'indice assegnato al campione analitico ed è considerata nulla per un indice 0, scarsa per un indice +1, accettabile per un indice +2, buona per un indice +3 e ottima per un indice +4.

La possibilità di utilizzare il trattamento proposto nella presente invenzione come profilassi per una infezione batterica severa da microrganismi Gram negativi è dimostrata nel modello murino dello shock endotossico. Gli animali sono preliminarmente immunizzati mediante somministrazione di tre dosi di peptide (25 mu g), o molecola intera (10 mu g), con frequenza bisettimanale e successivamente ricevono una quantità letale di LPS (1 mg) in grado di provocarne il decesso entro tre giorni dal trattamento con endotossina. Il confronto della sopravvivenza tra animali immunizzati e animali che hanno ricevuto il solo adiuvante evidenzia una differenza tra i due gruppi maggiore o uguale a 50% a favore del gruppo immunizzato.

Sono di seguito riportati alcuni esempi utili per illustrare la presente invenzione ma non limitativi per essa. Esempio 1 Protocollo di immunizzazione.

Questo esempio descrive la procedura adottata per l'immunoprofilassi attiva di topi Balb/C da impiegare in un modello sperimentale in vivo della sepsi.

16 topi Balb/C maschi di 6-7 settimane (20-25 gr) sono iniettati in sede intramuscolare con un composto che contiene la proteina HMGB1r (SIGMA-ALDRICH, Cat. N. H-4652) o alternativamente il peptide identificato come SEQ. ID. No. 1 in Appendice. Il peptide è prodotto con metodi e tecnologie ben conosciute, e di pubblico dominio, da società commerciali mediante sintesi automatica su un "core" di lisina in modo da formare una macromolecola, in seguito denominata MAP (Multiple Antigenic Protein). Questa molecola è composta da 8 peptidi a sequenza nota, covalentemente ancorati alla struttura interna di lisina che non è immunologicamente reattiva.

Il composto da iniettare viene preparato aggiungendo 10 mu g di HMGB1r (35 mu l Soluzione Fisiologica) o 25 mu g di MAP (50 mu l Tampone Fosfato Salino) a 50 mu l di ImmunEasy Mouse Adjuvant (QIAGEN AG, Basel). I reagenti sono miscelati accuratamente e lasciati incubare 5 minuti a temperatura ambiente (18-25 DEG C) prima di essere trasferiti in una siringa ed iniettati, come singola dose, nell'animale in sede intramuscolare a livello del quadricipite. Metà degli animali ricevono la proteina intera (Gruppo 1) mentre i restanti sono immunizzati con il complesso peptidico (Gruppo 2).

Il protocollo di trattamento prevede per entrambe i Gruppi tre somministrazioni con cadenza bisettimanale, rispettivamente 38 giorni (primer), 24 giorni (primo richiamo) e 10 giorni (secondo richiamo) prima di effettuare il prelievo per la valutazione della capacità neutralizzante degli anticorpi (vedi Esempio 2) o di indurre lo shock settico mediante inoculazione di endotossine batteriche (vedi Esempio 3). Il campione di controllo è costituito da 8 topi Balb/C maschi di identica età e peso (Gruppo 3) trattati secondo il medesimo protocollo con 50 mu l di ImmunEasy Mouse Adjuvant. Esempio 2

Valutazione della capacità neutralizzante degli anticorpi anti-HMGB1.

Questo esempio illustra il metodo adottato per valutare in vitro la capacità neutralizzante degli anticorpi ottenuti con la somministrazione di HMGB1r o del complesso MAP, e per calcolare l'indice di efficacia del trattamento di immunoprofilassi. La procedura si basa sulla determinazione quantitativa della citochina TNF- alpha rilasciata dalle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC), preferibilmente monociti, come risposta alla stimolazione con HMGB1r.

I monociti sono ottenuti addizionando 5 mL di Tampone Fosfato Salino a 3 mL di sangue venoso umano raccolto in eparina o EDTA, miscelando per inversione e stratificando la sospensione in una provetta da centrifuga di 15 mL contenente 3 mL di Histopaque-1077 (SIGMA-ALDRICH, Cat.N. H-8889). Dopo centrifugazione a 400 x g per 30 minuti lo strato superiore è rimosso con una pipetta sino al limite del sottostante strato opaco che contiene le cellule mononucleate. Si trasferisce quindi lo strato opaco in una provetta da centrifuga vuota e si aggiunge 10 mL di Tampone Fosfato Salino miscelando per inversione. Dopo centrifugazione per 10 minuti a 250 x g, il supernatante viene aspirato e il precipitato cellulare sospeso in 5 mL di Tampone Fosfato Salino mediante gentile aspirazione con una pipetta.

Dopo ripetizione del lavaggio il precipitato è sospeso 1 mL di terreno di coltura RPMI 1640 (IRVINE, Cat.N. 9024) addizionato con 10% di Siero Fetale Bovino (SIGMA-ALDRICH, Cat.N. F2442), le cellule sono diluite alla concentrazione di 10<6> cellule/mL di terreno coltura e 0,5 mL della sospensione finale sono trasferiti nei pozzetti di una piastra sterile da 24 unità, calcolando sei pozzetti per i campioni da analizzare e due pozzetti per i campioni di controllo negativo e positivo. Dopo incubazione in termostato per 1 ora a 37 DEG C (5% MO 2 ) il terreno di coltura di ciascun pozzetto é rimosso per eliminare i linfociti in sospensione e sostituito con 0,4 mL di RPMI 1640 a cui sono aggiunti 100 mu L di siero murino scomplementato (30 minuti a 56 DEG C).

I campioni di siero immune contrassegnati CA #1-#3 e CA #4-#6 sono ottenuti dagli animali appartenenti rispettivamente al Gruppo 1 e al Gruppo 2, mentre quelli usati come controllo positivo o negativo del metodo (contrassegnati CP e CN) sono prelevati agli animali del Gruppo 3. Ad ogni pozzetto sono poi aggiunti 55 ng di HMGB1r (50 mu L di una soluzione 1,1 mu g/mL in terreno RPMI 1640), ad esclusione di quello contrassegnato CN che riceve un volume equivalente di terreno di coltura. Dopo incubazione in termostato della piastra per 4 ore (37 DEG C, 5% CO 2 ), sono prelevati da ciascun pozzetto 150 mu L di terreno di coltura, evitando di rimuovere le cellule cresciute in adesione sul fondo, e il contenuto di TNF- alpha determinato con il kit commerciale human TNF- alpha Immunoassay Quantikine (R&D SYSTEM, Cat.N.

DTA50) dopo diluizione del terreno di coltura 1:5 (v:v) con il tampone diluente RD5 contenuto nel kit. Il dosaggio è effettuato in doppio seguendo le istruzioni operative fornite dal produttore e il valore medio di concentrazione di ciascun campione, ottenuto moltiplicato il risultato per il fattore di diluizione, è riportato nella tabella sottostante. La seduta analitica si considera accettabile se la concentrazione di TNF- alpha nei campioni di controllo risulta inferiore a 100 ng/mL nel campione CN e superiore a 4.000 ng/mL nel campione CP. L'indice di efficacia dei prelievi è ottenuto dal rapporto tra la misura analitica del campione in esame (CA) e quella del controllo positivo (CP).

<tb><TABLE> Columns = 4 <tb>Head Col 1: CA <tb>Head Col 2: TNF- alpha (ng/ml) <tb>Head Col 3: CA/CP <tb>Head Col 4: Indice <tb><SEP> # 1<SEP> 3450<SEP> 0.80<SEP> 1+ <tb><SEP> # 2<SEP> 2030<SEP> 0,47<SEP> 3+ <tb><SEP> # 3<SEP> 4410<SEP> 1,02<SEP> 0 <tb><SEP> # 4<SEP> 2380<SEP> 0,55<SEP> 2+ <tb><SEP> # 5<SEP> 3075<SEP> 0,71<SEP> 2+ <tb><SEP> # 6<SEP> 515<SEP> 0,12<SEP> 4+ <tb><SEP> CN<SEP> 55 <tb><SEP> CP<SEP> 4.320 <tb></TABLE> Esempio 3 Efficacia della immunoprofilassi nello shock settico indotto.

Questo esempio mostra gli effetti della somministrazione di una quantità letale di endotossina agli animali preliminarmente sottoposti a trattamento profilattico con la molecola HMGB1r o con il complesso MAP derivato dal peptide con SEQ.N. 1.

Gli animali indicati in Esempio 1 e appartenenti al Gruppo 1 (somministrazione di HMGB1r), Gruppo 2 (somministrazione di MAP) e Gruppo 3 (somministrazione del solo adiuvante), sono trattati con una dose letale di endotossina LPS (SIGMA-ALDRICH Cat. N. L2262), mediante inoculazione in sede intraperitoneale di 1 mg di LPS in 1 mi di soluzione PBS. Dopo la somministrazione gli animali sono mantenuti alle normali condizioni climatiche con alimentazione standard e la loro sopravvivenza valutata al termine delle successive 72 ore. I risultati sperimentali ottenuti sono inclusi nella tabella sottostante.

<tb><TABLE> Columns = 4 <tb>Head Col 1: Gruppo 1 <tb>Head Col 2: Gruppo 2 <tb>Head Col 3: Gruppo 3 <tb><SEP> Immunogeno<SEP> HMGB1r<SEP> Peptide 1<SEP> - <tb><SEP> N. animali<SEP> 8<SEP> 8<SEP> 8 <tb><SEP> N. decessi<SEP> 2<SEP> 3<SEP> 7 <tb><SEP> Sopravvivenza %<SEP> 75<SEP> 63<SEP> 13 <tb></TABLE> Appendice

SEQ. ID. No. 1-13 amino acidi

Met-Gly-Lys-Gly-Asp-Pro-Lys-Lys-Pro-Arg-Gly-Lys-Met

MGKGDPKKPRGKM-OH

SEQ. ID. No. 2-13 amino acidi

Cys-Arg-Glu-Glu-His-Lys-Lys-Lys-His-Pro-Asp-Ala-Ser-OH

CREEHKKKHPDAS

SEQ. ID. No. 3-13 amino acidi

Met-Ala-Lys-Ala-Asp-Lys-Ala-Arg-Tyr-Glu-Arg-Glu-Met-OH

MAKADKARYEREM

SEQ. ID. No. 4-11 amino acidi

Ile-Pro-Pro-Lys-Gly-Glu-Thr-Lys-Lys-Lys-Phe-OH

IPPKGETKKKF

SEQ. ID. No. 5-15 amino acidi

Lys-Gly-Glu-Thr-Lys-Lys-Lys-Phe-Lys-Asp-Pro-Asn-Ala-Pro-Lys-OH

KGETKKKFKDPNAPK

SEQ. ID. No. 6-15 amino acidi

Glu-Lys-Lys-Ala-Ala-Lys-Leu-Lys-Glu-Lys-Tyr-Glu-Lys-Asp-Ile-OH

EKKAAKLKEKYEKDI

SEQ. ID. No. 7-13 amino acidi

Arg-Ala-Lys-Gly-Lys-Pro-Asp-Ala-Ala-Lys-Lys-Gly-Val-OH

RAKGKPDAAKKGV

SEQ. ID. No 8-15 amino acidi

Glu-Asp-Glu-Glu-Asp-Glu-Asp-Glu-Glu-Glu-Asp-Asp-Asp-Asp-Glu-OH

EDEEDEDEEEDDDDE

Claims

1. Un prodotto farmaceutico per la terapia o la profilassi immunologia attiva delle malattie derivate da una presenza significativa e anomala della proteina HMGB1 nei fluidi biologici, in particolare nel compartimento vascolare, caratterizzato dal fatto di contenere una formulazione accettabile di immunogeni derivati dalla molecola HMGB1 o da sue porzioni;

2. Un prodotto come nella rivendicazione 1 in cui gli immunogeni sono presenti in quantità sufficiente per determinare il rilascio di anticorpi specifici capaci di neutralizzare l'attività biologica della molecola HMGB1 endogena presente nel compartimento vascolare, in particolare la capacità di promuovere e sostenere il rilascio della citochina pro-infiammatoria TNF- alpha ;

3.

Un prodotto come nella rivendicazione 1 in cui le porzioni della molecola HMGB1 sono peptidi naturali o sintetici da essa derivati, che risultano per loro natura immunogenici o resi tali mediante opportune modificazioni o trasformazioni;

4. Un prodotto come nella rivendicazione 3 in cui i peptidi immunogenici, o resi tali, sono derivati dalla molecola HMGB1 di origine umana o da quella di altri mammiferi che con la molecola umana ha una identità del 50%, preferibilmente del 70%, più preferibilmente del 90%;

5. Un prodotto come nella rivendicazione 4 in cui i peptidi hanno le sequenze uguali a SEQ. ID. No. 1-8, o modificate in modo da risultare una variante del peptide naturale indicato;

6.

Un prodotto come in una delle rivendicazioni da 3 a 5, in cui i peptidi sono coniugati, trasformati o legati ad un supporto proteico immunologicamente inerte in modo da ottenere un aggregato supermolecolare di per sé immunogenico;

7. Un prodotto come in una delle rivendicazioni da 3 a 6, in cui é presente anche una sostanza immuno stimolante o adiuvante con una formulazione farmaceutica accettabile per l'uso nei primati, preferibilmente nell'uomo;

8. Un prodotto come in una delle rivendicazioni da 3 a 7 in cui sono presenti sostanze accettate dalla Farmacopea Internazionale ed espressamente indicate allo stato dell'arte nelle tecniche di preparazione dei vaccini per animali a sangue caldo, preferibilmente per gli umani;

9.

Un prodotto come in una delle rivendicazioni da 2 a 8 in cui la patologia oggetto del trattamento immunoprofilattico è la sepsi, lo shock settico, lo shock endotossico o le malattie ad esse correlate;

10. Un procedimento per determinare in vitro l'efficacia del trattamento di immunoprofilassi attiva ottenuto con la somministrazione del prodotto secondo una delle rivendicazioni da 1 a 9, che prevede: a. la determinazione del livello di citochina pro-infiammatoria rilascia dalle cellule competenti dopo stimolazione con HMGB1 in presenza del siero del soggetto trattato, b. il confronto dei livelli misurati con livelli predeterminati in assenza di siero, c. la determinazione di un indice parametrico di efficacia.

11.

Un procedimento come nella rivendicazione 10 il cui le cellule competenti sono monociti umani e la citochina pro-infìammatoria è rappresentata dalla molecola TNF- alpha .